DE2461188A1

DE2461188A1 - Verfahren zur herstellung von aminosaeuren

Info

Publication number: DE2461188A1
Application number: DE19742461188
Authority: DE
Inventors: Koji Mitsugi; Konosuke Sano
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-12-29
Filing date: 1974-12-23
Publication date: 1975-07-10
Also published as: FR2256243B1; JPS5095484A; US3929573A; FR2256243A1; JPS5137353B2; GB1473244A; DE2461188C2

Description

Priorität: 29. Dezember 1973, Nr. 455/1974, Japan

Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einiger Aminosäuren, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von !-Tryptophan und 5-Hydroxy-L-tryptophan (nachstehend als Tryptophan und Hydroxytryptophan bezeichnet).

Tryptophan ist als Zusatz zu Futtermitteln und Nahrungsmitteln geeignet und sowohl Tryptophan als auch Hydroxytryptophan werden als Arzneimittel verwendet.

Es ist bekannt, daß Tryptophan oder Hydroxytryptophan aus Indol oder 5-Hydroxyindol und einerc&-Aminosäure, wie Serin oder Cystein unter der Wirkung eines Enzyms gebildet wird, das durch einen Mikroorganismus der Genera Proteus, Ervinia, Escherichia, Pseudomonas und Aerobacter gebildet wird (Japanische Auslegeschrift 46348/1972)

Es wurde nun gefunden, daß das gleiche Enzym die Bildung von Tryptophan aus Indol und (3 -Halogenalanin und die Bildung von Hydroxytryptophan aus 5-Hydroxyindol und ß>-Halogenalanin katalysiert.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, bei dem ein wässriges Gemisch, das Tryptophanase,

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Indol oder 5-Hydroxylndol und /#-Halogenalan in enthält, bei 5 bis 60 C gehalten wird, bis das Indol oder 5-Hydroxyindol im wesentlichen in !-Tryptophan oder 5-Hydroxy-I-tryptophan übergeführt ist, und das gebildete !-Tryptophan oder 5-Hydroxy-I-tryptophan aus dem wässrigen Gemisch gewonnen wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Ausbeute an Tryptophan oder Hydroxytryptophan höher als bei bekannten Verfahren und darüber hinaus ist die Reaktionsrate im Vergleich mit bekannten Verfahren sehr hoch.

Die zur Bildung dieses Enzyms befähigten Mikroorganismen gehören dem Genus Proteus, Ervinia, Escherichia, Pseudomonas oder Aerobacter an. Die Mikroorganismen werden in völlig üblichen Medien gezüchtet. Die Medien enthalten eine Kohlenstoffquelle, Stickstoff quelle, anorganische Ionen und wünschenswert organische Spurennährstoffe. Die Zugabe einer geringen Menge an Tryptophan oder 5-Hydroxytryptophan fördert die Ausbildung der enzymatischen Aktivität.

Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Kohlenhydrate oder Zuckeralkohole, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Maltose, Mannit, Xylose, Galactose, Stärke, Melassen, Sorbit oder Glycerin, organische Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Fumarsäure oder Maleinsäure und Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol. Die verwendete Stickstoffquelle ist eine übliche Stickstoffquelle, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Harnstoff, Ammoniakwasser oder gasförmiges Ammoniak. Manchmal fördern organische Spurennährstoffe das Mikrobenwachstum und die Enzymproduktion. Zu diesen organischen Spurennährstoffen gehören Vitamine, Aminosäuren und Rohmaterialien, welche diese organischen Spureniiährstoffe enthalten, wie Maisquellwasser, Rindfleischextrakt, Peptone, Kasein-Hydrolysat, Sojaprotein-Hydrolysat, Malzextrakt oder Hefeextrakt. Es werden übliche anorganische Ionen verwendet, wie Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium, Ferroion, Mangan, Kupfer, Phosphat,

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Sulfat.

Es ist wünschenswert, daß 0,01 bis 0,5 g/dl Tryptophan oder Hydroxytryptophan dem Medium zugesetzt werden, um die enzymatische Aktivität zu erhöhen.

Wenn die Mikroorganismen in dem vorstehend angegebenen Medium zwei bis sieben Tage bei pH 4 bis 9 und bei 27 bis^40 C gezüchtet werden, reichert sich die Aktivität des zur Bildung von Tryptophan und Hydroxytryptophan befähigten Enzyms in den Zellen oder in der Brühe an.

Die Zellen oder die Brühe werden als solche als Enzym verwendet. Gefriergetrocknete Zellen, Zellhomogenisat, ultraschallbehandelte Zellen (sonicate of cells), Zellautolysate, mit Aceton behandelte Zellen und Enzympräparate werden ebenfalls als Enzym eingesetzt. In dieser Beschreibung und den Patentansprüchen sollen unter der Bezeichnung "Zellen" auch Zellhomogenisate und von Zellen abgeleitete Materialien verstanden werden.

Isolierungs- und Reinigungsverfahren für das Enzym und die enzymologischen Eigenschaften des Enzyms wurden von H. Yoshida et al in PEBS-letters 48(1) 56 (1974) beschrieben.

Das Enzym sollte als Tryptophanase bezeichnet werden, da es den Abbau von Tryptophan in Indol, Pyruvat und Ammoniak katalysiert.

Das Reaktionsgemisch enthält das Enzym oder die Ausgangsmaterialien für das Enzym, wie sie vorstehend gezeigt wurden, β-Chlorälanin und Indol oder 5-Hydroxyindol. Wenn gereinigtes Apoenzym verwendet wird, ist Pyridoxal-5-phosphat als Coenzym erforderlich. Es ist wünschenswert, dem Reaktionsgemisch ein Reduktionsmittel, wie ein Thiosulfat, zuzusetzen, um die Ausbeute an Tryptophan oder Hydroxytryptophan zu vergrössern.

Das Reaktionsgemisch wird bei 5 bis 60° C und einem pH-Wert von 5 bis 10 gehalten, bis Indol oder 5-Hydroxyindol im wesentlichen

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in Tryptophan oder Hydroxytryptophan übergeführt ist.

Das-in dem Reaktionsgemisch gebildete Tryptophan oder Hydroxytryptophan kann in üblicher Weise isoliert und gereinigt werden, wie mit Hilfe von Ionenaustauschchromatographie oder Ausfällung am isoelektrischen Punkt.

Die in den nachstehenden Beispielen erhaltenen Produkte Tryptophan und Hydroxytryptophan wurden durch Prüfung im Gemisch mit authentischen Proben von L-Tryptophan und 5-Hydroxy-l-tryptophan identifiziert.

Beispiel 1

Proteus morganii IFO 3848 wurde in 60 ml-Anteilen der nachstehend angegebenen Medien, die in 500 ml-Kolben gehalten wurden, unter Schütteln 20 Stunden bei 30⁰C gezüchtet.

Medium^

L-Tryptophan

KH₂PO₄

MgSO₄ . 7 H₂O FeSO₄ · 7 H₂O MnSO₄ · 4 H₂O Maisquellflüssigkeit

Hefeextrakt

Kaseinhydrolysat

Leitungswasser pH (KOH)

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus 1 1 der so erhaltenen kombinierten KuI tür brühe gewonnen und zu 11 0,1 Seiger NH₄Cl-NH₄OH-Pufferlösung (pH 8,0) gegeben, die 20 g Indol und 20 g β-Chlor-L-alanin-enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden unter Rühren bei 37° C gehalten. Dabei wurden 24 g L-Tryptophan gebildet(aufgrund der mikrobiologischen Bestimmungsmethode).

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2	g	0
0,	5 g
0,	5 g
10	mg
7	mg
20	ml
2	g
VJl	g
1	1
7,

Nach dem Auflösen von ausgefälltem Tryptophan mit NaOH wurde das Reaktionsgemisch zur Entfernung der Zellen filtriert, der pH-Wert wurde mit HCl auf 4 eingestellt und das Reaktionsgemisch wurde durch eine mit Aktivkohle gefüllte Kolonne geleitet. !-Tryptophan wurde mit 2n NH.OH eluiert, das Eluat wurde konzentriert und es wurden 20,2 g L-Tryptophan-Kristalle erhalten.

Zellen von Aerobacter aerogenes ATGC 7256 oder Pseudomonas perlurida ATCC 490, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt wurden, wurden anstelle der Zellen von Proteus morganii IJ¹O 3848 verwendet. Bei Verwendung von ATCC 7256 wurden 9,0 g L-Tryptophan gebildet und bei Verwendung von ATCC 490 wurden 19,1 g L-Tryptophan gebildet.

In einem Vergleichsversuch wurde (3 -Chlor-X-alanin durch 20 g X-Serin ersetzt. In diesem Fall wurden durch die Zellen von Proteus morganii IPO 3848, Aerobacter aerogenes ATCC 7256 bzw. Pseudomonas perlurida ATCC 490 22,3 g, 8,0 g bzw. 18,4 g L-Tryptophan gebildet.

Beispiel 2

Ervinia hervicola ATCC 21433 oder Escherichia coli ATCC 206 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet.

Jede so erhaltene Kulturbrühe wurde mit 1 g/dl β -Chlor-L-alanin und 1 g/dl Indol versetzt und 44 Stunden unter Rühren bei 37° C gehalten. In der KuItürbrühe von ATCC 21433 wurde 0,70 g/dl Tryptophan gebildet und in der Kulturbrühe von ATCC 206 wurde 0,94 g/dl Tryptophan gebildet.

Wenn ß-Chlor-1-alanin durch L-Serin in einer Menge von 1 g/dl ersetzt wurde, bildete ATCC 21433 0,62 g/dl Tryptophan und ATCC 206 bildete 0,78 g/dl Tryptophan.

Beispiel 3

Zu dem nachstehend angegebenen Grundmedium wurde 0,2 g/dl L-Trypto-

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phan (Medium A) oder 0,2 g/dl 5-Hydroxy-L-tryptophan (Medium B) gegeben; 40 ml-Anteile des Mediums wurden in 500 ml-Kolben gegeben und jeder Anteil wurde mit Proteus morganii IFO 3848 angeimpft. Danach wurden die Kolben während 20 Stunden unter

ο
Schütteln bei 31 C gehalten.

Maisquellflüssigkeit 2,0 ml/dl

KH₂PO₄ 0,05 g/dl '

MgSO₄ . 7 H₂O 0,05 "

PeSO₄ · 7 H₂O 1 mg/dl

MnSO₄ -4H0 0,7 mg/dl

Hefeextrakt 2,0 g/dl

pH (KOH) 7,5

Der so erhaltenenKuItürbrühe wurden 2 g/dl β-Chlor-L-alanin und 2 g/dl Indol sowie 0,2 g/dl Kaliumthiosulfat zugesetzt und das Gemisch wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 17° 0 gehalten.

In der Kulturbrühe aus Medium A wurden 2,3 g/dl !-Tryptophan festgestellt und 1,8 g/dl Tryptophan wurden in der Kulturbrühe aus Medium B aufgefunden.

Beispiel 4

Proteus morganii IFO 3848 wurde in 100 ml des nachstehend angegebenen Mediums 20 Stunden bei 31,5° C gezüchtet. Die kombinierte Kulturbrühe (2 1 ) wurde zentrifugiert und die so erhaltenen Zellen wurden in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert und mit Hilfe eines Ultraschalloszillators homogenisiert. Die über—" stehende Flüssigkeit des mit Ultraschall erhaltenen Homogenisats wurde mit Ammoniumsulfat versetzt und die ausgefällten Proteine wurden dialysiert und mit Protamin behandelt, mit DEAE-Sephadex und danach mit Sephadex Gr-150 fraktioniert.

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Medium:	0,2 g/dl
!-Tryptophan	0,1 "
KH₂PO₄	0,05 "
MgSO₄ . 7 H₂O	1 mg/dl
PeSO₄ . 7 H₂O	0,7 mg/dl
MnSO. · 4 H₂O	2 ml/dl
Maisquellflüssigkeit	0,5 g/dl
Hefeextrakt	0,5 "
Caseinhydrolysat	7,0
pH (KOH)

40 mg des so erhaltenen Enzymproteins (40 mg) wurden dem vorstehend angegebenen Reaktionsgemisch zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Stunden bei 37° C gehalten.

Reaktionsgemische

β -Chlor-L-alanin 2,0 g/dl

Indol . 2,0 "

Na₂SO₃ . 0,2 "

Athylendiamintetraessigsäure 0,2 "

Pyridoxal-5-phosphat 2 mg/dl

pH (KOH) 8,8

In dem erhaltenen Reaktionsgemisch wurden pro 100 ml 2 g Tryptophan aufgefunden.

Wenn anstelle vony^-Chlor-I-alanin 2,0 g/dl L-Serin verwendet wurden, wurden 1,85 g/dl !-Tryptophan angereichert.

Beispiel 5

In dem Medium gemäß Beispiel 1 wurde Tryptophan durch 2 g .5-Hydroxy-I-tryptophan ersetzt und Proteus morganii IFO 3848 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in dem Medium gezüchtet.

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Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und in 1 1 0,1 ^iger MH.Cl-NH.OH-Pufferlösung (pH 8,0) suspendiert, die 20 g 5-Hydroxyindol und 20 g ß-Chlor-L-alanin enthielt. Das Gemisch wurde 20 Stunden unter Rühren bei 37° C gehalten. Das Reaktionsgemisch enthielt 14,1 g 5-Hydroxy-L-tryptophan.

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurden aus dem Reaktionsgemisch 7,5 g kristallines β-Hydroxy-L-tryptophan gewonnen.

Wenn /3-Chlor-L-alanin durch 20 g I-Serin ersetzt wurde, wurden in dem Reaktionsgemisch 13,6 g 5-Hydroxy-l-tryptophan aufgefunden.

Beispiel 6

Eine Kulturbrühe von Proteus morganii IPO 3848 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Zu 100 ml der KuItürbrühe wurden 1 g 5-Hydroxyindol, 0,2 g Na₂SO₅, 0,5 g NH,Cl und 1 g β-Chlor-L-alanin gegeben, der pH-Wert wurde mit Ammoniakwasser auf 8,0 eingestellt und das Gemisch wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die KuItürbrühe enthielt dann 0,88 g/dl 5-Hydroxy-L-tryptophan.

Beispiel 7

In gleicher Weise wie in Beispiel 5 wurde Proteus morganii durch Ervinia herbicola ATCC 21433 oder Aerobacter aerogenes ATCC 7256 ersetzt. ATCC 21433 bildete 0,71 g/dl 5-Hydroxy-L-tryptophan, während ATCC 7256 0,41 g/dl 5-Hydroxy-L-tryptophan bildete.

Beispiel 8

Enzymprotein von Proteus morganii IPO 3648 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 4 gebildet und oO mg des Enzymproteins wurden zu dem nachstehend angegebenen Reaktionsgemisch zugemischt.

Reaktionsgemische

β -Chlor-L-alanin 2,0 g/dl

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5-Hydroxyindol 1,0 g/dl

Ammoniumacetat 1,0 "

Na₂SO₃ 0,2 »

Pyridoxal-5-phosphat 2 mg/dl

pH 8,0

Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei 37° C gehalten. Danach enthielt das Reaktionsgemisch 0,87 g/dl 5-Hydroxy-l-tryptophan .

Beispiel 9

Zellen von Proteus morganii IFO 3848, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gebildet worden waren, wurden, in 11 0,1 $iger NH₄Cl-NH₄OH-PUfferlösung (pH 8,0) suspendiert, die 20 g Indol und. 20 g ß-Brom-I-alanin enthielt. Der Puffer wurde 20 Stunden unter Rühren bei 37° C gehalten und enthielt dann 19,5 g 5-Hydroxy-l- tryptophan. "

Beispiel 10

Das in Beispiel 5 verwendete/i-Chlor-I-alanin wurde durch p-Brom-L-alanin ersetzt und 5,7 g 5-Hydroxy-L-tryptophan wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt.

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Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Tryptophan oder Hydroxytryptophan durch Umsetzung eines Indol oder 5-Hydroxyindol und eine Aminosäure enthaltenden wässrigen Gemisches in Gegenwart von Tryptophanase und Gewinnung des erhaltenen Produkts aus dem wässrigen Gemisch, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tryptophanase, Indol oder 5-Hydroxyindol sowie β-HaIogenalanin enthaltendes wässriges Gemisch bei 5 "bis 60° C hält, Ms die Bildung von L-Tryptophan oder 5-Hydroxy-l-tryptophan erfolgt ist.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Tryptophanase in Form von Zellen eines Mikroorganismus des Genus Proteus, Ervinia, Escherichia, Pseudomonas oder Aerobacter verwendet.

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