DD296922A5 - Verfahren zur herstellung von s-2,2-r[ind1], r[ind2]-1,3-dioxolan-4-methanol - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung von * worin R1 und R2 jeweils unabhaengig voneinander Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind oder R1 und R2 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring bilden, bei dem ein Gemisch aus R- und * vorzugsweise so lange der Wirkung eines Mikroorganismus oder einer daraus gewonnenen Substanz, welche(r) zum stereoselektiven Abbau von * in der Lage ist, ausgesetzt wird, bis mindestens 50 * des * abgebaut sind. Verschiedene Mikroorganismen werden als fuer den Zweck geeignet offenbart.{* * Verfahren; Herstellung; Mikroorganismus; stereoselektiver Abbau; *}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines größtenteils oder im wesentlichen völlig aus S-Isomer bestehenden 2,2-R1(R2-1,3-Dioxolan-4-methanols.
S-2,2-R1#R2-1,3-Dioxolan-4-methanol ist ein wichtiger Ausgangsstoff für die Herstellung landwirtschaftlicher und pharmazeutischer Erzeugnisse, siehe zum Beispiel J. Jurczak et al., Tetrahedron, Bd.42, Nr.2, S.447-488 (1986). S-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol gewann in den letzten Jahren Bedeutung als eine wichtige Ausgangsverbindung für die Herstellung vieler biologisch aktiver Erzeugnisse und dabei insbesondere für die Produktion chiraler Pharmaka. Der Einsatz chiraler Ausgangsstoffe für die Herstellung biologisch aktiver Produkte in optisch reiner Form ist vorteilhaft, da er eine genaue Planung und eine effiziente Gestaltung von Synthesewegen ermöglicht.
1,3-Dioxolan-4-methanol ist ein wichtiges Beispiel eines C3-Synthons und wird als Ausgangsverbindung für die Herstellung vieler weiterer C3-Synthone verwendet, die bei der organischen Synthese häufig als chiraler Baustein eingesetzt werden. Beispielsweise kann S-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol auch bei der Synthese von weiteren chiralen Synthonen, Monosacchariden, ihren Derivaten und anderen Polyhydroxyl-Systemen sowie biologisch aktiven Produkten komplizierteren Aufbaus verwendet werden.
Dazu bedarf es noch immer eines industriemäßig anwendbaren Verfahrens mit ökonomisch vertretbaren Ausbeuten zur stereoselektiven Herstellung des S-Stereoisomers von 2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit. Es erwies sich, daß die stereoselektive Herstellung des S-Isomers günstig durchgeführt werden kann, wenn dabei Mikroorganismen oder daraus gewonnene Substanzen zum Einsatz kommen. Weiter wurde festgestellt, daß das R-Stereoisomer von 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol vorteilhaft in 8-2,2-RnR2-I,S-Dioxolan^-carbonsäure umgewandelt werden kann, wenn diese Mikroorganismen oder daraus gewonnene Substanzen eingesetzt werden. In der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0244912 wird ein Verfahren zur Herstellung des R-Isomers von 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol ausgehend von dem Racemat beschrieben. Nach dieser Europäischen Patentanmeldung wird das S-Isomer durch Oxydation in seine entsprechende Säure umgewandelt. Das Enzymsystem, das an der Oxydation des (R)-Isomers beteiligt ist, unterscheidet sich völlig von dem an der Oxydation des (S)-Isomers beteiligten. Im allgemeinen verhalten sich das (R)- und (S)-Enantiomer einer Verbindung bei enzymatischen Umwandlungen wie zwei verschiedene Substrate. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hersellung von mit S-Isomer angereichertem 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol bereit, worin Ri und R2 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind, die wahlweise substituiert oder verzweigt ist, oder worin R1 und R2 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring bilden, der wahlweise substituiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch aus R- und S-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol der Wirkung eines Mikroorganismus oder einer gewonnenen Substanz, welche(r) zum stereoselektiven Abbau des R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanols in der Lage ist, für eine solche Zeitspanne ausgesetzt wird, daß das R-2,2-RnR2-1 ,S-Dioxolan^-methanol im Gemisch abgebaut wird und dabei ein mit S-Isomer angereichertes 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol entsteht. Dabei bedeutet „mit S-Isomer angereichert", daß das S-Isomer in einer Menge vorhanden ist, die größer als die racemische Menge ist. Angemessenerweise werden mindestens 50Ma.-% des R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanols abgebaut, damit mit S-Isomer angereichertes oder aus im wesentlichen reinem S-Isomer bestehendes R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol entsteht. „Im wesentlichen rein" bedeutet, daß soviel R-Isomer abgebaut wird, daß das S-Isomer im Bereich des experimentellen Fehlers zu 100% rein vorliegt. Das mit S-Isomer angereicherte 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol kann zumindest teilweise isoliert und/oder als Ausgangsstoff für die Herstellung anderer optisch aktiver Verbindungen verwendet werden. Vorteilhafterweise sind R1 und R2 jeweils eine Alkylgruppe, die weniger als 6 Kohlenstoffatome aufweist, oder sie bilden einen carbocyclischen Ring, der weniger als 8 Kohlenstoffatome enthält. Vorzugsweise sind R1 und R2 identisch. Auf diese Weise kommt keine zusätzliche Asymmetrie in die Verbindung. Besser noch sind R-i und R2 je eine Alkylgruppe, die 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist, oder bilden mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring, der 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält.
Wie zuvor beschrieben, kann das Gemisch aus R- und S-Isomeren von 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol in 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol, das mit S-Isomer angereichert ist, umgewandelt werden. Auf diese Weise kann lediglich ein Teil des Gemisches für weitere Reaktionen verwendet werden; beginnt man zum Beispiel mit einem Gemisch aus 50Ma.-% R- und 50 Masseprozent S-Isomer, so wird nur die Hälfte des 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanols für eine sinnvolle Nutzung verfügbar. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird R-2,2-RnRr1,3-Dioxolan-4-methanol vorteilhaft in S-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure umgewandelt.
Auf diese Weise ist nicht nur die Herstellung von mit S-Isomer angereichertem 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol möglich, sondern man kann zugleich mti S-Isomer angereicherte 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure erhalten. Damit kann im wesentlichen sowohl das R- als auch das S-2,2-RnR2-1 ,S-Dioxolan^-methanol genutzt werden. Die mit S-Isomer angereicherte 2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure kann als Ausgangsverbindung für die Herstellung vieler biologisch aktiver Produkte verwendet werden oder in mit R-Isomer angereichertes 2,2-RnR2-I ,S-Dioxolan^-methanol umgewandelt werden, das ebenfalls eine wichtige Ausgangsverbindung ist.
Unter dem Ausdruck „Mikroorganismen, die zu einem stereoselektiven Abbau in der Lage sind" werden zum Beispiel Bakterien, Hefen und Pilze verstanden. Vorzugsweise kommen Hefen und Pilze zum Einsatz, besser noch Mikroorganismen, die zur Gattung Absidia, zur Gattung Branhamella, zur Gattung Graphium, zur Gattung Trichosporon oder zur Gattung Arthrobacter gehören. Diese Mikroorganismen werden wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt, R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methano! stereoselektiv abzubauen. Im allgemeinen können die Mikroorganismen solche sein, die
a) in der Literatur als Organismen beschrieben werden, die in der Lage sind, andere Verbindungen zu oxydieren als die untersuchte;
b) zur selben Spezies gehören wie unter a) beschrieben, aber aus anderen Stammsammlungen kommen und aus einer anderen Quelle isoliert wurden;
c) zur selben Gattung gehören wie unter a) beschrieben, ohne daß bisher jedoch bekannt ist, daß sie zur Oxydation in der Lage sind;
d) nachweislich in der Lage sind, sich in Substraten zu vermehren, die zu ihrem Abbau zunächst einer Stufe der Oxydation oder Hydroxylierung bedürfen.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung können die Mikroorganismen, die zum stereoselektiven Abbau von R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol in der Lage sind, unter Verwendung eines R-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanols als C-Quelle in einem geeigneten Medium selektiert werden.
Eine Reihe von aus natürlichen Quellen, insbesondere aus Bodenproben, isolierten Mikroorganismen wurden nach obengenanntem Screeningverfahren selektiert und zeigten bei weiteren Tests, die nachfolgend beschrieben werden, daß sie in der Lage sind, R-2,2-RnR2-1,3-Dioxolan-4-methanol stereoselektiv zu oxydieren. Die Mikroorganismen können aus verschiedenen Milieus isoliert werden wie:
- Ölpfützen,
- Stellen, die mit organischen chemischen Verbindungen verunreinigt sind,
- wachsartige Flächen, zum Beispiel Oberflächen von Pflanzen,
- verwesendes natürliches organisches Material,
- Umgebungen in der Natur, wo die untersuchte Verbindung (bzw. eine verwandte Verbindung) vorkommt.
Unter „Mikroorganismen, die zum stereoselektiven Abbau in der Lage sind", werden auch solche Mikroorganismen verstanden, die durch die Einführung neuen genetischen Materials befähigt worden sind, R-2,2-R,,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol abzubauen.
Dies kann durch Übertragung des geklonten Gens, das ein für den stereoselektiven Abbau verantwortliches Polypeptid, ein Enzym, codiert, von einem beliebigen der gescreenten Mikroorganismen auf einen anderen Mikroorganismus, insbesondere auf Escherichia coli, erfolgen.
Weitere Mikroorganismen können zu den Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces, Bacillus, Nocardia, Rhodococcus, Escherichia oder Corynebacterium gehören. Geklonte Gene können entsprechend ihrer Fähigkeit selektiert werden, ein Enzym zu codieren, das in der Lage ist, R-2,2-R1rR2-1,3-Dioxolan-4-methanol vorzugsweise zu S-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol abzubauen. Als weitere Möglichkeit können sie durch Kreuzhybridisierung mit einem bereits selektierten Gen, das ein Enzym für den stereoselektiven Abbau codiert, selektiert werden.
Die Mikroorganismen können vorteilhafterweise immobilisiert werden, zum Beispiel auf einem Polymer-Gel. Dies kann mit wachsenden Zellen, nicht wachsenden Zellen und/oder abgetöteten Zellen, alternativ jedoch auch mit geeigneten, daraus gewonnenen Enzymen erfolgen, die bis zu einem bestimmten Grad gereinigt werden können, falls eine größere spezifische Aktivität verlangt wird.
Insofern bedeutet der Ausdruck „Mikroorganismen oder daraus gewonnene Substanzen" Mikroorganismen in einem Wachstumsstadium, Mikroorganismen, die sich nicht im Wachstumsstadium befinden oder abgetötet sind, sowie Extrakte davon, gegebenenfalls in konzentrierter oder gereinigter Form. Beispielsweise können Enzyme verwendet werden, die gegebenenfalls beispielsweise mit künstlichen oder natürlichen Cofaktoren kombiniert sind. Für den Abbau von R-2,2-R,,R2-1,3-Dioxolan-4-methanoI können keine fermentativ aktiven Zellen verwendet werden. Es wurde festgestellt, daß unter geeigneten Bedingungen Enzyme, die aus Zellen gewonnen wurden, oder abgetötete Zellen das R-Isomer abbauen können. Die Mikroorganismen oder die daraus gewonnenen Substanzen können mehrfach eingesetzt werden und sind für mindestens 2 Wochen aktiv. Auch ohne Cosubstrat (beispielsweise Glucose) können die Mikroorganismen aktiv bleiben. Die Anreicherung mit dem S-Isomer von 2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol kann in einem geeigneten Puffer (zum Beispiel 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder Kaliumphosphat) wie auch in physiologischen Salzen erfolgen. Nach einer Lagerung sind die induzierten Zellen erwiesenermaßen direkt zur Anreicherung mit S-Isomer in der Lage.
Der Mikroorganismus für den Abbau von R-2,2-R1rR2-1/3-Dioxolan-4-methanol kann insbesondere eine Kultur von Absidia glauca (eine Probe dieser Spezies wurde beim CBS unter der Zugangsnummer 306.89 hinterlegt), Branhamella catarrhalis (eine Probe dieser Spezies wurde beim CBS unter der Zugangsnummer 307.89 hinterlegt) oder Graphium penicillioides (eine Probe dieser Spezies wurde beim CBS unter der Zugangsnummer 318.72 hinterlegt), Trichosporon adeninovorans (eine Probe dieser Spezies wurde beim CBS unter der Zugangsnummer 8244 hinterlegt) und Bacterium F-7 (eine Probe dieser Spezies wurde beim CBS unter der Zugangsnummer 238.90 hinterlegt) sein. Bacterium F-7 ist wahrscheinlich eine Spezies der Gattung Arthrobacter oder Actinomycetes.
Das erfindungsgemäß hergestellte S-2,2-R|,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol kann als Ausgangsstoff für die Herstellung anderer optisch aktiver Verbindungen verwendet werden. Eine wichtige Möglichkeit besteht in der Herstellung chiraler Pharmaka.
Jeder Fachmann wird erkennen, daß jedes geeignete Verfahren angewandt werden kann, um das S- und R-2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol in andere optisch aktive Verbindungen umzuwandeln.
Beispiele, die die Verwendung von S- und R-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol zur Herstellung optisch aktiver Verbindungen veranschaulichen, sind unter anderem durch J. Jurczak et al., Tetrahedron-Bericht Nummer 195, Tetrahedron 42 (1986), S.447-488, und durch das Technical Information Bulletin (Technisches Informationsblatt) 225, September 1983, von Janssen Chimica (Belgien) bekannt.
Die optisch aktiven Verbindungen können für pharmazeutische oder landwirtschaftliche Produkte verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Mikroorganismus, der zum stereoselektiven Abbau von R-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol in der Lage ist, etwa 0,5 bis 10 Tage kultiviert, wonach die Zellen des Mikroorganismus in einem flüssigen Nährmedium suspendiert werden und das Gemisch von R- und S-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol der Wirkung der Zellen ausgesetzt wird.
Nach der obengenannten Kulturzeit von etwa 0,5 bis 10 Tagen können die Zellen aus dem Kulturmedium isoliert werden, bevor sie im flüssigen Nährmedium suspendiert werden.
Zur Vermehrung des für den selektiven Abbau von R-2,2-Ri,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol eingesetzten Mikroorganismus können gewöhnliche Kulturmedien, die eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (beispielsweise Glucose, Lactat, Sucrose usw.), eine assimilierbare Stickstoffquelle (beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.) mit einem Agens für eine organische Nährstoffquelle (beispielsweise Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt usw.) und eine anorganische Nährstoffquelle (beispielsweise Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen sowie Spuren weiterer Metalle) enthalten, verwendet werden.
Ein weiteres bevorzugtes Kulturmedium ist ein YPD-Medium, das mit einem oder mehreren Bestandteilen angereichert sein kann. Es kann ein YPD-Medium verwendet werden, das aus 20g/l Bactopepton (TM), 10g/l Hefeextrakt und 20g/l Glucose besteht. Vor der Verwendung wird das Medium zweckmäßigerweise 30 Minuten bei 1100C sterilisiert.
Ein weiteres bevorzugtes Kulturmedium ist ein Magermilchmedium, das mit einem oder mehr Bestandteilen angereichert sein kann, zum Beispiel ein Magermilchmedium, das 10% Magermilch aus Magermilchpulver enthält und vor der Verwendung zweckmäßigerweise 30 Minuten bei 1100C sterilisiert wird.
Beispiele für Anreicherungen des Magermilchmediums schließen Maxatase (TM) (Gist-Brocades) ein.
Während der Vermehrung des Mikroorganismus werden vorzugsweise eine Temperatur von 0 bis 45 °C und ein pH-Wert von 3,5 bis 9 aufrechterhalten. Der Mikroorganismus wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 20 und 37°C und einem pH-Wert
zwischen 5 und 9 vermehrt. Die während der Vermehrung der Mikroorganismen erforderlichen aeroben Bedingungen können durch alle bekannten Verfahren geschaffen werden, vorausgesetzt, die Sauerstoffversorgung ist ausreichend gut, um den Stoffwechselbedürfnissen des Mikroorganismus zu entsprechen. Dies wird am besten durch die Zufuhr von Sauerstoff, geeigneterweise in Form von Luft und gegebenenfalls unter gleichzeitigem Schütteln oder Rühren der Reaktionsflüssigkeit, erreicht.
Während des Abbaus von R-2,2-R,,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol durch den Mikroorganismus kann dieses bei Verwendung eines gewöhnlichen Kulturmediums, wie oben angeführt, im Wachstumsstadium sein.
Während des Abbaus von R-2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol durch den Mikroorganismus kann ein gewöhnliches Kulturmedium verwendet werden, welches erforderlichenfalls eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (beispielsweise Glucose, Lactat, Sucrose usw.) erforderlichenfalls eine assimilierbare Stickstoffquelle (beispielsweise Ammoniumsulphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.), erforderlichenfalls mit einer organischen Nährstoffquelle (beispielsweise Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton, Fleischextrakt usw.) und erforderlichenfalls einer anorganischen Nährstoffquelle (beispielsweise Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen und Spuren weiterer Metalle) enthält.
Vorteilhafterweise kann während der Anreicherung des S-Isomers ein BHI-Medium, ein PSIII-Salz-Medium, ein hydrolysiertes Magermilchmedium, ein (oben beschriebenes) YPD-Medium oder ein (oben beschriebenes) Magermilchmedium, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Bestandteilen angereichert, zum Einsatz kommen.
Ein BHI-Medium (Hirn-Herz-Infusion) mit einem Gehalt von 0,037 g/l BHI (Oxoid [TM]), dessen pH-Wert auf 7,0 eingestellt wurde, kann verwendet werden. Vor dem Einsatz wird dieses Medium zweckmäßigerweise 20 Minuten bei 120°C sterilisiert.
Es kann ein PSIII-Salz-Medium folgender Zusammensetzung verwendet werden:
Kaliumdihydrogenphosphat (2,1 g/l),
Ammoniumhydrogenphosphat(1,0g/I),
Ammoniumsulfat (0,9g/l),
Kaliumchlorid (0,2g/l),
Natriumeitrat (0,29g/l)#
Calciumsulfat · 2H2O(0,005g/l),
Magnesiumsulfat · 7H2O (0,2g/l),
Ammoniumeisen(ll)-su!fat · 6H2O (2,5mg/l),
Zinksulfat· 7H2O (0,5mg/l),
Manganchlorid · 4H2O(0,3mg/l),
Kupfersulfat · 5H2O (0,15mg/l),
Cobaltchlorid · 6H2O (0,15mg/l),
Orthoborsäure (0,05 mg/l),
Natriummolybdat 2H2O (0,055mg/l), und
Kaliumiodid (0,1 mg/l), dessen pH-Wert auf 6,8 eingestellt wurde.
Vor der Verwendung wird das PSIII-Salz-Medium zweckmäßigerweise 30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Hydrolysiertes Magermilchmedium:
Magermilchpulver (Oxoid [TM]) 100g/l; der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt, und es werden 25 ml einer filtrierten Maxataselösung (40g/l) gesetzt; die fertige Lösung wird bei 400C eine Stunde gerührt, und der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.
Vor der Verwendung wird das Substrat zweckmäßigerweise 30 Minuten bei 110°C sterilisiert.
Der Mikroorganismus kann auch im nicht wachsenden Stadium gehalten werden, beispielsweise durch Entzug der assimilierbaren Kohlenstoffquelle oder durch Entzug der Stickstoffquelle. Während dieses Stadiums können eine Temperatur von 0 bis 450C und ein pH-Wert von 3,5 bis 9 aufrechterhalten werden.
Vorzugsweise werden die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20 bis 37°C und einem pH-Wert von 5 bis 9 gehalten. Die in diesem Stadium erforderlichen aeroben Bedingungen können durch alle beliebigen bekannten Verfahren geschaffen werden, vorausgesetzt, die Sauerstoffzufuhr reicht aus, um den Stoffwechselbedarf der Mikroorganismen zu decken. Dies wird am besten dadurch erreicht, daß Sauerstoff, geeigneterweise in Form von Luft, zugeführt wird, und gegebenenfalls gleichzeitig die Reaktionsflüssigkeit geschüttelt oder gerührt wird. Das S- sowie das verbleibende R-2,2-R,,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol kann nach der obengenannten Umwandlung durch jedes beliebige an sich für solche Stoffe bekannte Verfahren rückgewonnen und gereinigt werden.
Die Mikroorganismen können in Schrägagar, in 50%igem Glycerol eingefroren oder gefriergetrocknet aufbewahrt werden.
Erforderlichenfalls können nach jedem beliebigen bekannten Verfahren Vorkulturen dieser Mikroorganismen erfolgen, beispielsweise können die Mikroorganismen in Bouillon oder BHI (Hirn-Herz-Infusion) 24 Stunden bei 30°C in einem rotierenden Schüttelapparat inkubiert werden. Ein Bouillonmedium folgender Zusammensetzung kann eingesetzt werden.
Lab Lemco L29 (Fleischextrakt, Oxoid [TM] (9g/l), Bactopepton (TM) (10g/l) und Natriumchlorid (5g/l), pH-Wert eingestellt auf 7,6. Vor der Verwendung wird dieses Substrat zweckdienlicherweise 20 Minuten bei 1200C sterilisiert.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Die Mikroorganismen (Hefen und Pilze) wurden 24 bis 48 Stunden bei 26°C in 125-ml-Kolben mit Prallflächen, die25ml YPD-Medium enthielten, vermehrt. Danach wurde die Zellmasse durch Zentrifugieren gesammelt und wieder in 25ml 10%igem hydrolysiertem Magermilchmedium suspendiert.
(Hydrolysiertes Magermilchmedium: Magermilchpulver [Oxoid] 100g/l; der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt, und es werden 25ml einer filtrierten Maxataselösung [TM] [40g/l] zugesetzt; die fertige Lösung wird bei 400C eine Stunde gerührt, und der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.
Sterilisierung: 30 Minuten bei 1100C). Etwa 1,5g/l RfS-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol (racemisches Gemisch) wurden zugesetzt. Die Gemische wurden bei 26°C 48 Stunden in 125-ml-Kolben mit Prallflächen geschüttelt. Die Gemische wurden mit
25 ml Ethylacetat extrahiert. Auf diese Weise wurden etwa 40% des 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanols rückgewonnen. Anschließend wurde eine Kultur von jeder Form genommen, extrahiert, das verbleibende 2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol wurde analysiert. Die enantiomere Verteilung wurde durch die Bildung von Diastereoisomeren mit N,O-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (BSTFA) bestimmt, die auf einer chiralen Komplexbildungssäule getrennt wurden. Die Resultate sind in Tabelle 1 angegeben.
Mikroorganismus g/l* Enantiomeres Verhältnis
%R %S
| Absidiaglauca | 1,3 | 43 | 57 |
| (CBS 306,89) | |||
| Branhamella catarrhalis | 1,9 | 33 | 67 |
| (CBS 307,89) | |||
| Graphium penicillioides | 1,1 | 29 | 71 |
| (CBS318,72) | |||
* Die hier angegebenen Werte wurden hinsichtlich der Verluste bei der Extraktion korrigiert.
Branhamella catarrhalis, CBS 307,89, wurde 24 bis 28 Stunden bei 26°C in 100-ml-Kolben mit Prallflächen, die 25 ml YPD-Medium enthielten, vermehrt. Anschließend wurde die Zellmasse durch Zentrifugieren gesammelt und wieder in 25ml 10%igem hydrolysierten Magermilchmedium suspendierten welchem 1,5g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthalten waren.
Die Gemische wurden 48 Stunden bei 26°C in 100-ml-Kolben mit Prallflächen geschüttelt.
Die Gemische wurden mit 25 ml Ethylacetat extrahiert. Auf diese Weise wurden etwa 40% des 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanols rückgewonnen. Anschließend wurde eine Kultur von jeder Form genommen, extrahiert, und das verbleibende 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol wurde analysiert. Die enantiomere Verteilung wurde durch Bildung von Diastereoisomeren mit N,0-Bis-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (BSTFA) bestimmt, die auf einer chiralen Komplexbildungssäule CP Cyclodex B 236 M mittels GC getrennt wurden. Es zeigte sich, daß die Ausbeute an S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol 67% des gesamten 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanols betrug (1,3g/l).
Trichosporon adeninovorans, CBS 8244, wurde in einem Schüttelinkubator bei 300C 24 bis 48 Stunden in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Prallflächen, der 25 ml YPD-Substrat enthielt, vorkultiviert. 1-ml-Proben der Kultur wurden in 100-ml-Erlenmeyerkolben, in denen sich 25ml BHI hydrolysiertes Magermilchmedium befanden, gegeben. R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 2,0g/l hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurde-wie in Beispiel 2 beschrieben -die enantiomere Verteilung von R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol bestimmt.
Zusammensetzung des Menge 2,2-Dimethyl- enantiomere Verteilung Mediums 1,3-dioxolan-4-methanol (g/l) %R %S
BHI 1,8 47 53
Hydrolysierte Magermilch 1,8 45 55
Graphium penicillioides CBS 318,72 wurde in einem Schüttelinkubator bei 300C 24 bis 48 Stunden in 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Prallflächen auf GSM-Medium vorkultiviert. 1-ml-Proben der Kultur wurden zur Beimpfung von 25ml BHI-, PSIII- und hydrolysiertem Magermilchmedium, die je 2g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol in 100-ml-Erlenmeyerkolben enthielten, hinzugegeben. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 300C wurde-wie in Beispiel 2 beschrieben - das verbleibende R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol gemessen.
| Zusammensetzung des | Menge 2,2-Dimethyl- | enantiomere Verteilung | %S |
| Mediums | 1,3-dioxolan-4-methanol | 60 | |
| (g/l) | %R | ||
| BHI | 1,4 | 40 | 52 |
| PSIII+0,1% Glycerol + | 55 | ||
| 0,01% Hefeextrakt | 1,6 | 48 | |
| Hydrolysierte Magermilch | 1,5 | 45 | |
Mikroorganismen, die zu einer enantiospezifischen Umwandlung von in einem R,S-Gemisch von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthaltenem R-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol in die entsprechende Säure in der Lage sind, wurden nach folgendem Verfahren isoliert: 1 Gramm einer Bodenprobe wurde in PSIII suspendiert und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde zu 25 ml PSIII-Medium gegeben, in dem 1 g/l R-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methandl enthalten war. Die Kultur wurde 30 Stunden bei 300C in einem Schüttelinkubator bebrütet. Verdünnungen wurden auf Agarplatten ausgestrichen, die 1 g/l R-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthielten; nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen bei 300C wurden
Einzelzellkolonien isoliert, bis Monokulturen entstanden waren. Anschließend wurden die Isolate bei 30°C 24 Stunden auf BHI-Medium vorkultiviert, und es wurde die Fähigkeit zur spezifischen Oxydation des R-Enantiomeres in einem R,S-Gemisch von 2,2-DimethyM ,3-dioxolan-4-methanol getestet.
Es wurde 1 ml verwendet, um 25ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, in dem PSIII, 0,1 % Glycerol, 0,01 % Hefeextrakt und 1,5g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthalten waren. Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 300C wurde -wie in Beispiel 2 beschrieben - das verbleibende R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol bestimmt. Nach diesem Selektionsverfahren wurden Mikroorganismen isoliert, die zur enantiospezifischen Oxydation des R-Isomers in einem R,S-Gemisch von 2,2-Dimethyl-1 ,S-dioxolan^-methanol und somit zu einer Anreicherung des S-Isomers in der Lage sind. Als ein Beispiel wurde beim CBS das Bacterium F-7 hinterlegt.
Bacterium F-7 (CBS 238,90) wurde in 100-ml-Schüttelerlenmeyerkolben mit 25ml flüssigem BHI-Medium vorkultiviert. Zellen wurden im Verlauf von 24 Stunden bei 300C in einem Schüttelinkubator vermehrt.
Anschließend wurde 1 ml dieser Kultur verwendet, um 25 ml Medium zu beimpfen, in welchem PSIII, 0,1 % (Masse/Volumen) Glycerol 0,01 % (Masse/Volumen) Hefeextrakt sowie 1,5g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthalten waren. Nach einer48stündigen Inkubation bei 300C wurden die Gemische extrahiert und -wie in Beispiel 2 beschrieben-analysiert. Es wurde eine Menge von 0,2g/l S-Enantiomer 0,001 g/l R-Enantiomer von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol rückgewonnen, was einem enantiomeren Überschuß des S-Enantiomers in Höhe von 90% entspricht.
Bacterium F-7 (CBS 238,90) wurde, wie oben beschrieben, vorkultiviert. Nach demselben Verfahren wurden 4 Erlenmeyerkolben (ohne Prallflächen), die PSIII-Medium und verschiedene Mengen von R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthielten, beimpft. Nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden erfolgte, wie oben beschrieben, die Bestimmung des verbleibenden R- und S- Enantiomers.
Anfängliches 2,2-Dimethyl-1,3- Menge 2,2-DimethyM,3- Enantiomere Verteilung
dioxolan-4-methanol dioxolan-4-methanol
(g/l) (g/l) %R %S
1,5 0,28 15 85
2,5 0,42 24 76
5,0 0,57 33 67
Bacterium F-7 (CBS 238,90) wurde- wie in Beispiel 5 beschrieben - auf BHI-Medium vorkultiviert. 1 ml der Kultur wurde verwendet, um PSIII-Medium zu beimpfen, in welchem 2,5g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthalten waren, und in einem Schüttelinkubator 72 Stunden bei 3O0C vermehrt. Anschließend wurde-wie in Beispiel 2 beschrieben-das verbleibende R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol bestimmt, und es wurden 0,42g/l rückgewonnen. 76% des R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanols erwiesen sich als S-Isomer.
Durch HPLC-Verfahren (HPLC = Hochdruckflüssigchromatografie) wurde 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure nachgewiesen. Das Inkubationsmedium wurde mit Perchlorsäure behandelt, um die 2,2-DimethyM ,3-dioxolan-4-carbonsäure in Aceton und Glycerinsäure zu hydrolysieren, was durch HPLC-Verfahren unter Verwendung eines Aminex HPX 87 H (Biorad) gemessen wurde.
Weiterhin wurde untersucht, welches Enantiomer der Säure entstand. Die Säure wurde vom angesäuerten Inkubationsmedium durch Extrahieren mit CDCI3 getrennt. Durch Versetzen mit Naphthylethylamin wurden das R-Isomer und das S-Isomer getrennt, und es entstanden Diastereomere. Eine NMR-Untersuchung mit Protonen zeigte, daß die 2,2-DimethyM,3-dioxdlan-4-carbonsäure zu 80% aus S-Enantiomer bestand.
Absidia glauca CBS 306,89 wurde in einem Schüttelinkubator bei 300C 24 bis 48 Stunden in 100-ml-Kolben mit Prallflächen, in denen 25 ml BHI-Medium enthalten waren, vorkultiviert. Kulturproben von 1 ml wurden zur Beimpfung von 25 ml BHI-Medium, in welchem 1,5g/l R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol enthalten war, hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden wurde die enantiomere Verteilung von R,S-2,2-Dimethyl-1 ,S-dioxolan^-methanol, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt, und es zeigte sich, daß das R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol zu 55% aus dem S-Enantiomer bestand.
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung eines mit S-Isomer angereicherten 2,2-R^R2-I,S-Dioxolan^-methanols, worin R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind, die wahlweise substituiert oder verzweigt ist, oder worin Ri und R2 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring bilden, der wahlweise substituiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch aus R- und 8-2,2-R^R2-1,3-Dioxolan-4-methanol der Wirkung eines Mikroorganismus oder einer daraus gewonnenen Substanz, welche(r) zum stereoselektiven Abbau des R^^-RvR^I^-Dioxolan^-methanols in der Lage ist, für eine solche Zeitspanne ausgesetzt wird, daß das R-2,2-Ri,R2-Dioxolan-4-methanol im Gemisch abgebaut wird und dabei ein mit S-Isomer angereichertes 2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol entsteht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitspanne so lang ist, daß mindestens 50% des R-2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanols abgebaut werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylgruppen weniger als 6 Kohlenstoffatome enthalten oder der carbocyclische Ring weniger als 8 Kohlenstoffatome aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R2 identisch sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R1 und R2 Wasserstoff oder eine Alkylgruppe sind, die 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweist, oder zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocyclischen Ring bilden, der 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus eine Bakterie, eine Hefe oder ein Pilz ist, der vorzugsweise der Gattung Absidia, der Gattung Branhamella oder der Gattung Graphium, der Gattung Trichosporon oder der Gattung Arthrobacter angehört.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus Absidia glauca, vorzugsweise Absidia glauca (CBS 306.89), Branhamella catarrhalis, vorzugsweise Branhamella catarrhalis (CBS 307.89), Graphium penicillioides, vorzugsweise Graphium penicillioides (CBS 318.72), Trichosporon adeninovorans, vorzugsweise Trichosporon adeninovorans (CBS 8244), Bacterium F-7 (CBS 238.90) oder eine Mutante derselben ist.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus oder die daraus gewonnene Substanz entweder als wachsende Zelle, als nicht wachsende Zelle, als abgetötete Zelle oder als Enzym immobilisiert wird.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das abgebaute R^^-RvR^ijS-Dioxolan^-methanol im wesentlichen in S^^-R^R^I^-Dioxolan^-carbonsäure umgewandelt wird.
10. Verfahren zur Herstellung von mit R-Isomer angereichertem 2,2-R1,R2-1,3-Dioxolan-4-methanol, dadurch gekennzeichnet, daß es die Umwandlung von S-2,2-R1fR2-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure, die nach dem Verfahren von Anspruch 9 hergestellt wurde, in R-2,2-R!,R2-1 ,S-Dioxolan^-methanol umfaßt.
11. Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, die aus
Absidia glauca (CBS 306.89),
Absidia glauca (CBS 306.89),
Branhamella catarrhalis (CBS 307.89),
Bacterium F-7 (CBS 238.90)
und Mutanten derselben besteht.
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