PT94527A - Processo para a preparacao de um s-2, 2-r indice 1, r indice 2-1,3-dioxolano-4-metanol - Google Patents
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Description
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Descrição referente à patente de invenção de SHELL IHTERIATIOHALE RESEARCH IAATSCHAPPIJ B.V*, holandesa, industrial e comercial, com sede em 0arei van Bylandtlaan 30» 2596 HR The Hague, Países Baixos, .(inventores? Maria- José de Smet e Lex de Boer, residentes na Holanda), Para: "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM S-2,2-R-l ,R2-1 .5-DIQX0LAN0-4--ME1AIQL"
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um 2,2-R-^ ,Rg-l »3-dioxolano-4-metanol constituído predominante ou eompletamente pelo is<5-mero-S. 0 8-2,2-R^,Rg-l,3-dioxolano-4—metanol I um importante material de partida para a preparação de produtos agrícolas e farmacêuticos, ver por exemplo J. Jurczak al., Tetrahe-dron νοί* 42, n2 2, págs 447-488 (1986).
Hos últimos anos, o S-2,2-R·^ jRg-l,3-dioxolano-4-metanol tornou-se um composto de partida importante para a preparação de muitos produtos biologicamente activos e, em especial, para a preparação de fármaoos quirais A utilização de materiais de partida quirais para preparar produtos biologicamente activos na forma opticamente pura é vantajosa, permitindo um planeamento exacto e a realização eficiente de percursos sintéticos. 0 S-2,2-R-^ ,Rg-l,3-dioxo- - 1 - lano-4-metanol é um exemplo importante de um sintão-C3 e uti liza-se como composto de partida para a preparação de muitos outros sintão-C3 que são muito utilizados nas sínteses orgânicas como um bloco de formação quiral.
Por exemplo, o S-2,2-R1,R2-l,3-dio-xolano-4-metanol pode utilizar-se na síntese de outros sin-tãos quirais, monossacarídeos,seus derivados e outros sistemas poli-hidroxilo, e produtos biologicamente activos de estrutura mais complexa. Hã, assim, ainda uma grande necessi dade de um processo, utilizável numa escala industrial que proporciona rendimentos economicamente atractivos para a pre paração estereo-selectiva do estereo-isómero-S de 2,2-1^,1^--1,3-dioxolano-4-metanol. A presente invenção proporciona um tal processo. Verificou-se que a preparação estereo-selectiva do isómero-S pode efectuar-se com vantagem, utilizan do microganismos ou substâncias derivadas deles. Além disso verificou-se que o estero-isoméro-R de 2,2-RlfR2-l,3-dioxola no-4-metanol pode converter-se, com vantagem no ácifo S-2,2--R1,R2-dioxolano-4-carboxílico, utilizando estes microganismos ou substâncias deles derivadas. 0 pedido de patente Europeia EP-A-- 0244912 descreve um processo para a preparação do isómero-R de 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol partindo com o racema to. De acordo com este pedido de patente Europeia o isómero--S é oxidado no seu ácido correspondente. O sistema enzima envolvido na oxidação de isómero (R) é completamente diferen te do envolvido na oxidação do isómero (S) . Regra geral, o enantiómero (R) e (S) de um composto comportam-se como dois substratos diferentes em conversões enzimáticas. A presente invenção proporciona um processo para a preparação de 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-meta nol enriquecido em isómero-S em que R^ e R2 são individual e independentemente H ou um grupo alquilo, opcionalmente substituídos ou ramificados,ou em que R1 e R2 em conjunto com um átomo de carbono aos quais estão ligados formam um anel car-bocíclico, opcionalmente substituído, no qual se submete uma mistura de R- e S-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol à acção 2
de um microrganismo ou substância dele derivada que é suscep tível de consumo estero-selectivo de R-2f2-RlfR2-l/3-dioxola no-4-metanol durante um período de tempo tal que o R-2,2-Rla. R2-l,3-dioxolano-4-metanol na mistura é consumido para proporcionar um 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol enriquecido e isómero-S. "Enriquecido em isómero-S" significa que está pre sente mais do que uma quantidade racémica de isómero-S. Ade quadamente consome-se, pelo menos 50% em peso de R-Z^-R^-R2~l,3-dioxolano-4-metanol para proporcionar 2,2-R^,R2~l,3--dioxolano-4-metanol enriquecido em isómero-S ou constituído de isómero-S essencialmente puro. "Essencialmente puro" significa que o isómero-R é consumido numa extensão tal, que o isómero-R é 100% puro dentro do erro experimental. 0 2,2--R^,R2_l,3-dioxolano-4-metanol enriquecido em isómero-S pode ser pelo menos parcialmente isolado e/ou utilizado como mate rial de partida para a preparação de outros compostos óptica mente activos. Com vantagem R-j^ e R2 são cada um, um grupo alquilo contendo menos do que 6 átomos de carbono ou formam um anel carbocíclico contendo menos do que 8 átomos de carbono. De preferência R1 e R2 são idênticos. Deste modo não é levada nenhuma assimetria extra aos compostos .
Mais preferivelmente R1 e R2 são um grupo alquilo contendo de 1-3 átomos de carbono ou em conjun to com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um a-nel carbocíclico contendo 5-6 átomos de carbono.
Como descrito anteriormente a mistu ra de isómeros R e S 2,2^^^3-1,3-dioxolano-4-metanol pode ser convertida em 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol enriquecida no isómero-S. Desta forma apenas parte da misturas se pode utilizar em reacções posteriores, por exemplo partindo com uma mistura de 50% em peso de R e 50% em peso de S apenas metade de 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol se torna dis ponível duma forma adequada. De acordo com uma forma de rea lização desta invenção,o R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol é convertido, com vantagem, no ácido S-2,2-R1,R2_l,3-dioxola no-4-carboxílico.
Desta forma não apenas a preparação de 2,2-R^,R2“l, 3-dioxolano-4-metanol enriquecido no isómero- 3
-S é possível, mas, pode-se obter, ao mesmo tempo, ácido 2,-2-R^,R2“l,3-dioxolano-4-carboxílico enriquecido no isómero--S. Desta forma pode utilizar-se essencialmente o R assim como o S-2,2-R^,R2~l,3-dioxolano-4-metanol. 0 ácido 2,2-R^ R2-l,3-dioxolano-4-carboxílico enriquecido no isômero-S pode utilizar-se como composto de partida para a preparação de muitos produtos biologicamente activos ou pode converter-se no 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol enriquecido no isõmero--R, e é também um importante composto de partida. 0 termo "microrganismos susceptí-veis de consumo estereo-selectivo" significa, por exemplo, bactérias, leveduras, fungos. Utilizam-se, de preferência, leveduras e fungos,mais preferivelmente podem utilizar-se microrganismos pertencentes ao género Absidia. ao género Branhamella.ao género Graphium ao género Trichosporon. ou ao género Arthrobacter.
Estes microrganismos são seleccio-nados pela sua capacidade para o consumo estereo-selectivo de R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol. Regra geral os microrganismos podem ser aqueles que: A temham sido descritos na literatura como organis mos susceptíveis de oxidarem compostos diferentes do composto sob investigação, B pertençam às mesmas espécies das escritas sob A, mas de colecções de espécies diferentes isoladas de uma fonte diferente, C pertençam ao mesmo género do descrito sob A; mas dos quais é ainda desconhecido o que é que podem oxidar, D tenham mostrado ser susceptíveis de crescerem em substratos que exigem uma primeira fase de oxida ção ou hidroxilação na degradação destes substratos .
Numa forma de realização desta invenção os microrganismos possuindo a capacidade para consumo etereo-selectivo de R-2,2-R1,R2“l/3-dioxolano-4-metanol podem ser seleccionados utilizando um R-2,2-dimetil-l,3-dioxo-lano-4-metanol como a fonte C num meio adequado. 4 í r
Seleccionaram-se vários microrganismos isolados de fontes naturais, particularmente de amostras de solo, de acordo com o procedimento de rastreio anterior, e quando submetido a outros ensaios como adiante descrito, mostraram a sua capacidade para oxidação estereo--selectiva de R-2,3-dioxolano-4-metanol.
Os microrganismos podem isolar-se de ambientes diferentes, por exemplo:
Derrames de petróleo Áreas poluídas com compostos químicos orgânicos. Áreas cerrosas tal como, por exemplo, superfícies plantadas.
Decomposição natural de matéria orgânica. Ambientes naturais em que o composto sob investi gação (como um composto relacionado) pode ocorrer.
Também os microganismos,que se tornaram susceptíveis de consumo do R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol através da intro dução de novo material genético estão incluídos no ermo "microrganismos, susceptível de consumo estereo-selectivo"
Isto pode-se efectuar-se por transferência do gene clonado que codifica um polipeptídeo respon sável pelo consumo estereo-selectivo, uma enzima de qualquer um dos microorganismos de rastreio para outro microrganismo, particularmente para Escherichia coli.
Os outros microrganismos podem pertencer aos géneros Saccharomvces. Kluweromvces. Baccillus. Nocardia. Rhodococcus. Escherichi. Corvnebacterium. Os genes clonados podem seleccionar-se pela sua capacidade em codificar uma enzima susceptível de consumir, de preferência, R--2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol em vez de £3-2,2^3^2-1,3. -dioxolano-4-metanol. Alternativamente podem seleccionar-se pela hibridização transversal com um gene já seleccionado que codifica uma enzima para o consumo estereo-selectivo.
Os microrganismos podem com vantagem, serem imobilizados, por exemplo, no gel de um polímero. Isto pode fazer-se com células de crescimento células de não crescimento e/ou células mortas, alternativamente com enzi- 5
mas adequadas delas derivadas, as quais se podem purificar até uma determinada extensão se se necessitar de uma activi-dade específica mais elevada.
Assim o termo "microrganismos ou substâncias deles derivadas" significa os microrganismos numa fase de crescimento, numa fase de não crescimento ou mortos, os seus extractos, opcionalmente concentrados ou purificados. Por exemplo, podem utilizar-se enzimas opcionalmente em combinação com,por exemplo, co factores artificiais ou naturais. Não se podem utilizar células com actividade de fermentação para o consumo R-2,3-dioxolano-4-metanol. Verificou-se que as enzimas derivadas de células ou células mortas podem consumir o isómero-R sob condições adequadas. Os microrganismos ou substâncias deles derivadas podem utilizar-se várias vezes e são activas durante pelo menos 2 semanas. Mesmo sem co substrato (por exemplo, glucose) os microrganismos podem permanecer activos. O enrique cimento em isómero-S de 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol po de efectuar-se num tampão adequado (por exemplo, 3-ácido (N--morfolino) propano sulfónico, tris (hidroximetil)-amino-me-tano ou fosfato de potássio,assim como em sais fisiológicos. Verificou-se que as células induzidas depois de armazenadas são directamente susceptíveis enriquecimento no isómero-S.
Mais particularmente os microrganismos para o consumo de R-2,2^.^^2-1,3-dioxolano-4-metanol podem ser uma cultura de Absidia. alauca. (1 amostra desta espécie está depositado com a CBS sob o número de adesão 306.89), Branhamella. catarrhalis. (1 amostra desta espécie está depositada com a CBS sob o número de adesão de 307.89) ou Graohium. penicillioides. (uma amostra desta espécie está depositada com a CBS sob o número de adesão de 318.72), Tri-chosporon f adeninovorans. (1 amostra destas espécies está de positada com a CBS sob o número de adesão de 8244) e Bactéria F-7 (uma amostra desta espécie está depositada com a CBS sob o número de adesão de 238,90). A bactéria F-7 é provavelmente uma espécie do género Arthrobacter. ou Actinomvcetes. O S-2,2-κ1'κ2-1'S-dioxolano^-metanol produzido de acordo com a pre- 6
sente invenção pode ser utilizado como material de partida para a produção de outros compostos ópticamente activos. Uma possibilidade importante é a produção de fármacos quirais. É evidente para os especialistas que qualquer processo adequado se pode utilizar para converter o S e R-2,2-R^/R2“lr3-dioxolano-4-metanol noutros compos tos ópticamente activos.
Os compostos que ilustram a utiliza ção de S e R-2,2-R1/R2“l/3-dioxolano-4-metanol para a preparação de compostos ópticamente activos são conhecidos e, por exemplo J. Jurczak et al, Tetrahedron report number 195, Te-trahedron 42 (1986), p. 447-488 e do Technical Information Bulletin 225, Setembro de 1983 de Janssen Chimica Bélgica).
Os compostos ópticamente activos po dem utilizar-se em produtos farmacêuticos ou agrícolas .
De acordo com uma forma de realização preferida do processo da presente invenção faz-se a cultura de um microrganismo suscetível de consumo estereo-se-lectivo, de R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol, durante a-proximadamente 0,5 a 10 dias, faz-se a suspensão das células microrganismos, a seguir, num meio líquido nutriente e subme te-se a mistura de R e S-2,2-R1;R2-l,3-dioxolano-4-metanol à acção das células.
Depois da cultura atrás mencionada durante, aproximadamente 0,5 a 10 dias, as células podem iso lar-se do meio de cultura antes de se fazer a suspensão das células no meio líquido nutriente.
Para o crescimento dos microrganis mos utilizados para o consumo selectivo de R-2,2-R1,R2“l,3--dioxolano-4-metanol podem utilizar-se meios de cultura ordi nários contendo uma fonte de carbono assimilável (por exemplo, glucose, lactato, sacarose, etc.),uma fonte de azoto as similável (por exemplo, sulfato de amónio, nitrato de amónio, cloreto amónio, etc.), com um agente para uma fonte nutriente orgânica (por exemplo extracto de levedura extrac-to de malte, pepetona, extracto de carne, etc) e uma fonte nutriente inorgânica (por exemplo fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro e outros metais em quantidades traço). 7
Outro meio de cultura preferido é um meio-YPD opcionalmente enriquecido com um ou vários ingre dientes. Pode utilizar-se um meio YPD constituído por 20 g/1 de Bactopeptone (TM) 10 g/1 de extracto de levedura e 20 g/1 de glucose. Antes da utilização, o meio é conveni-entemente esterilizado durante 30 minutos a 110sc.
Outro meio de cultura preferido é um meio de leite desnatado opcionalmente enriquecido com um ou vários ingredientes, por exemplo, um meio de leite desnatado contendo; 10% de leite desnatado proveniente de leite em pó desnatado, que é convenientemente esterilizado durante 30 minutos a 1102C antes de utilização.
Os exemplos de enriquecimento do meio de leite desnatado incluem Maxatase (TM) (Gist-broca-des) .
Mantém-se de preferência, uma temperatura de 0 a 45sc e um pH de 3,5 a 9 durante o crescimento dos microrganismos. De preferência, os microrganismos crescem a uma temperatura de 20 a 37SC e um pH de 5 a9. Podem proporcionar-se as condições aeróbicas necessárias duran te o crescimento dos microrganismos, por meio de qualquer um dos procedimentos bem conhecidos, desde que o fornecimento de oxigénio seja suficiente para as exigências metabólicas dos microrganismos. Isto consegue-se, mais convenientemente, fornecendo oxigénio, adequadamente na forma de ar e, opcionalmente, ao mesmo tempo que se agita o líquido de reac-ção. Durante o consumo de R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-meta-nol pelos microrganismos, os microrganismos podem estar numa fase de crescimento, utilizando um meio de cultura ordinário atrás referido.
Durante o consumo de R-2,2-R^,R2--1,3-dioxolano-4-metanol pelos microrganismos pode utilizar--se um meio de cultura ordinário contendo uma fonte de carbono assimilável,quando necessário (por exemplo glucose, laç tato, sacarose, etc.), uma fonte de azoto assimilável, quando necessária, (por exemplo, sulfato do amónio, nitrato de amónio, cloreto de amónio etc), com uma fonte nutriente orgâ nica quando necessária, (por exemplo extracto de levedura, 8
extracto de malte, peptona,extracto de carne, etc.)/ © uma fonte nutriente inorgânica, quando necessária, (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro e outros metais em quantidades traço).
Pode utilizar-se, com vantagem, durante o enriquecimento de isómero-S um BHI, um meio de sal PSIU, um meio de leite desnatado hidrolizado, um meio YPD (como atrás descrito), um meio de leite desnatado (como a-trás descrito) opcionalmente enriquecido com um ou vários ingredientes.
Pode utilizar-se um meio BHI (infusão brain-heart) contendo 0,037 g/1 de BHI (Oxoid (TM), com o pH ajustado a 7,0. Antes da utilização este meio é, conve nientemente, esterilizado durante 20 minutos a 1202C.
Podem utilizar-se meios sal de PSIU com as composições seguintes:
Di-hidrogeno-fosfato de potássio (2,1 g/1). mono-hidrogeno-fosfato de amónio (1,0 g/1) sulfato de amónio (0,9 g/1) cloreto de potássio (0,2 g/1) citrato de sódio (0,29 g/1) sulfato de cálcio. 2H20 (0,005 g/1) sulfato de magnésio. 7H20 (0,2 g/1) sulfato de amónio e ferro. 6H20 (2,5 m/1) sulfato de zinco. 7H20 (0,5 mg/1) cloreto de manganês. 4H20 (0,3 mg/1) sulfato de cobre. 5H20 (0,15 mg/1) cloreto de cobalto. 6H20 (0,15 mg/1) ácido orto-bórico (0,05 mg/1) molibdato de sódio. 2H20 (0,055 mg/1) e iodeto de potássio (0,1 mg/1), com o pH ajustado a 6,8.
Antes da utilização o meio de sal PSIU é convenientemente, esterilizado durante 30 minutos a 120SC.
Meio de leite desnatado hidrolizado:
Leite em pó desnatado (Oxoid (TM) 100 g/1, ajustado a pH 7,8 e adicionados 25 ml de uma solu- 9
ção filtrada de maxatase (40 g/1); agita-se a solução final a 402C durante 1 hora e ajusta-se o pH a 7,0. Antes da utilização o meio é, convenientemente, esterilizado durante 30 minutos a 1102C.
Os microrganismos podem manter-se na fase de não crescimento, por exemplo, por exclusão da fon te de carbono assimilável ou por exclusão da fonte de azoto. Pode manter-se uma temperatura de 0 a 45 ec e o pH de 3,5 a 9 durante esta fase.
Os microrganismos mantêm-se, de pre ferência, a uma temperatura de 20 a 372c e um pH de 5 a 9. Podem proporcionar-se as condições aeróbicas necessárias durante esta fase por intermédio de qualquer um dos procedimen tos bem conhecidos, desde que o fornecimento de oxigénio seja suficiente para as necessidades metabólicas dos microrga nismos. Isto consegue-se, mais convenientemente, fornecendo oxigénio, adequadamente na forma de ar e, opcionalmente, com agitação, ao mesmo tempo,do líquido de reacção. O S - e qual quer R-2,2-R^,R2~l,3-dioxolano-4-metanol remanescente depois da transformação como atrás referido, pode, a seguir recuperar-se e purificar-se de acordo com qualquer um dos procedimentos conhecidos per se para tais produtos.
Os microrganismos podem manter-se em rampas de agar, congelados em 50% de glicerol ou liofi-lisados. Se necessário, podem fazer-se pré-culturas destes microrganismos de acordo com qualquer um dos procedimentos bem conhecidos, por exemplo, os microrganismos podem incubar -se em caldo de carne ou em BHI (Brain Heart infusion) duran te 24 horas a 302C num agitador rotativo. Pode utilizar-se um meio de caldo de carne com a composição seguinte:
Lab Lemco L 29 (extracto de carne, Oxoid (TM) (9 g/1), Bactopeptona (TM) 10 g/1) e cloreto de sódio (5 g/1), o pH ajustado a 7,6. Antes da utilização, es te meio é, convenientemente, esterilizado durante 20 minutos a 1202C. A presente invenção é ainda ilustra da com referência aos exemplos seguintes. EXEMPLOS 1 10
Os microrganismos (leveduras e fungos) cresceram durante 24 a 48 horas e 262C em frascos, com septos, de 125 ml contendo 25 ml do meio YPD. Depois deste período, recolheu-se a massa de células por centrifugação e fez-se de novo uma suspensão em 25 ml do meio de leite desnatado hidrolizado a 10% (meio de leite em pó desnatado hi-drolizado: leite em pó desnatado (Oxoid) 100 g/1; ajusta-se o pH 7,8 e adicionam-se 25 ml de uma solução filtrada de Maxatase (TM) (40 g/1); agita-se a solução final a 402C durante 1 hora e ajusta-se o pH a 7,0. Esterilização: 30 minutos a 1102C). Adicionou-se aproximadamente 1,5 g/1 de R.S -2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol (mistura racémica).
Agitaram-se as misturas em frascos, com septos, de 125 ml a 262C durante 48 horas.
Extrairam-se as misturas com 25 ml de acetato de etilo. Desta forma, recuperou-se aproximadamente, 40% do 2,2-dimetil-l,3-dioxolano-4-metanol. Tomou--se, a seguir, uma cultura de cada uma das formas, extraiu--se e analisou-se o 2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol remanescente. Determinou-se a distribuição enantiomérica por formação de diastereo-isómeros com N,0-bis-(tri-metilsilil)-tri-fluoro-acetamida (BSTFA) que se separaram numa coluna de complexação quiral. Os resultados apresentam-se na Tabela 1. 11
Tabela 1
Os valores apresentados foram corrigidos para a perda devida à extracção
EXEMPLO 2
Promoveu-se o crescimento de Bran-hamella catarrhalis CBS 307,89 durante 24 a 48 horas, a 26SC em frascos de 100 ml,com septos, contendo 25 ml de meio YPD. Recolheu-se, a seguir a massa de células por centrifugação e fez-se de novo a suspensão em 25 ml de meio de leite desnatado hidrolizado a 10% contendo 1,5 g/1 de R.S-2,2-di--metil-1,3-dioxolano-4-metanol. Agitaram-se as misturas em frascos de 100 ml, com septos, a 26sc durante 48 horas.
Extraíram-se as misturas com 25 ml de acetato de etilo. Desta forma recuperou-se, aproximada-mente, 40% do 2,2-di-metilo-l,3-dioxolano-4-metanol. Tomou-se, a seguir, uma cultura de cada uma das formas, extraíu-se e analisou-se o 2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol remanes cente. Determinou-se a distribuição enanteomérica por forma ção de diastereo-isómeros com N, 0-bis-(tri-metilsilil)-tri--fluoroacetamida (BSTFA) que se separaram numa coluna de com plexação quiral CP Cyclodex B 236 M por GC. Verificou-se que o S-2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol representava 67% do 2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol (1,3 g/1) total. EXEMPLO 3
Promoveu-se o pré-crescimento de Trichosporon adeninovorans CBS 8244 em erlenmeyers de 100 ml, com septos, contendo 25 ml de meio YPD num incubador com agitação a 302C durante 24 a 48 horas. Adicionaram-se amostras de 1 ml de cultura em erlenmeyers de 100 ml contendo 25 ml de BHI ou um meio de leite desnatado hidrolizado. Adicio nou-se R.S-2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol até uma concentração final de 2,0 g/1. Depois de 48 horas de incubação determinou-se a distribuição enantiomérica de R.S-2,2-di-me-til-1,3-dioxolano-4-metanol como descrito no exemplo 2. 13
Composição do meio quantidade de 2,2--dimetil-1,3-di oxo1ano-4-metano1 (g/D distribuição enantiomérica %R %S BHI 1,8 47 53 Leite desnatado hidrolisado 1,8 45 55 EXEMPLO 4
Promoveu-se o pre-crescimento de Graphium penicillioides CBS 318,72 num meio de GSM. em erlen meyers de 100 ml, com septos num incubador com agitação a 30SC durante 24 a 48 horas. Adicionaram-se amostras de 1 ml da cultura para inocular 25 ml de BHI, PSIU e do meio de leite desnatado hidrolizado contendo cada um 2 g/1 de R,S- 2.2- di- -metil-1,3-dioxolano-4-metanol em erlenmeyers de 100 ml. De-pois de 48 horas de incubação a 30sc mediu-se o R,S- 2.2- di- -metil-1,3-dioxolano-4-metanol remanescente como descrito no exemplo 2. 14
Composição do quantidade de 2,2- distribuição -diinetil-1,3-di enantiomérica meio oxolano-4-metanol (g/1) %R %S BHI 1/4 40 60 PSIU + 0,1% de glicerol + 0,01 % de extracto de levedura 1,6 48 52 Leite desnatado hidrolisado 1,5 45 55 EXEMPLO 5
Isolaram-se microrganismos, suscep-tíveis de conversão enantio-específica de R-2,2-di-metil-l,3. -dioxolano-4-metanol no ácido correspondente,a partir de uma mistura R.S-de-2.2-dimetil-l.3-dioxolano-4-metanol. utilizando o procedimento seguinte. Fez-se a suspensão de 1 Grama de uma amostra de solo em PSIU e centrifugou-se. Adicio nou-se o sobrenadante a 25 ml do meio PSIU contendo 1 g/1 de R-2,2-dimetil-l,3-dioxolano-4-metanol. Incubou-se a cul tura num incubador com agitação durante 30 horas a 302C. Colocaram-se as diluições em placas de agar contendo 1 g/1 de R-2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol e depois de 4 dias de incubação a 302C e efectuaram-se isolamentos de colónias de células únicas até se obterem mono-culturas. Fizeram-se, em seguida, pré-culturas das colónias isoladas no meio BHI a 30 QC durante 24 horas e ensaiou-se a capacidade para a oxidação específica do enantiómero-S numa mistura R.S-de-2 f2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol. Utilizou-se 1 ml para inocular 25 ml de meio num erlenmeyer de 100 ml contendo PSIU, 0,1% de glicerol, 0,01% de extracto de levedura e 1,5 g/1 de • R,S-de-2.2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol. Depois de 48 . horas de incubação a 302C, determinou-se o R,S-de-2,2-di-me- 15
til-1,3-dioxolano-4-metanol remanescente como descrito no exemplo 2. Utilizando este procedimento de selecção, iso-laram-se microrganismos susceptíveis de oxidação enantio-es-pecífica do isómero-R numa mistura R.S-de-2.2-di-metil-1.3-dioxolano-4-metanol e assim enriquecer o isómero-S. Como e-xemplo a bactéria F-7 foi depositada com a CBS. EXEMPLO 6
Fez-se a pré-cultura da Bactéria F--7 (CBS 238,90) em 25 ml do meio liquido BHI um erlenmyers de 100 ml com agitação. Aas células cresceram durante 24 ho ras a 302C num incubador com agitação.
Utilizou-se em seguida, 1 ml desta cultura para inocular 25 ml do meio contendo PSIU, 0,1% de glicerol (P/v), 0,01%, de extracto de levedura (P/v) e 1,5 g/1 de R.S-2.2-di-metil-1.3-dioxolano-4-metanol. Depois de incubação durante 48 horas a 302C, extraíram-se as misturas e analisaram-se como descrito no exemplo 2. Recuperou-se uma quantidade de 0,2 g/1 de enantiómero-S e 0,01 g/1 de enan-tiómero-R de 2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol, correspon dente a um excesso enantiómerico de 90% do enantiómero-S. EXEMPLO 7
Fez-se a pré-cultura da Bactéria F-7 (CBS 238,90) como atrás descrito. Utilizando o mesmo procedimento, inocularam-se 4 erlenmyers (sem um septo) contendo PSIU e quantidades variáveis de R,S-2,2-di-metil--1,3-dioxolano-4-metanol. Depois de 72 horas de incubação determinou-se o enantiómero R e S remanescente como atrás descrito. 16
2,2-dimetil-l,3--dioxolano-4-me-tanol inicial (g/i) quantidade de 2,2--dimetil-1,3-di oxolano-4-metanol (g/i) distribuição enantiomérica %R %S 1,5 0,28 15 85 2,5 0,42 24 76 5,0 0,57 33 67 EXEMPLO 8
Promoveu-se o pré-crescimento da Bactéria F-7 (CBS 238,90) no meio BHI como descrito no exemplo 5. Utilizou-se 1 ml da cultura para inocular o meio PSIU contendo 2,5 g/1 de R.S-2.2-di-metil-l.3-dioxolano-4-me-tanol e cresceu num incubador com agitação a 302C durante 72 horas. Determinou-se,em seguida, o R. S-2.2-di-metil-l.3-dio xolano-4-metanol remanescente como descrito no exemplo 2 e recuperou-se 0,42 g/1. Verificou-se que 76% do R^S-2,2-di-metil-l, 3-dioxolano-4-metanol era o isómero-S. Utilizando técnicas HPLC detectou-se o ácido 2,2-di-metil-l,3-dio-xolano-4-carboxílico. Tratou-se o meio de incubação com á-cido perclórico para hidrolizar o ácido 2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-carboxílico em acetona e ácido glicérico e fez--se a medição por HPLC utilizando um Aminex HPX 87 H (Bio-rad) .
Além disso, verificou-se que se pro duziu o enanteómero do ácido. Separou-se o ácido do meio de incubação acidificado, por extracção, utilizando CDC13. Separaram-se os enanteómeros R e S por adição de naftil-etil--amina e formaram-se os diastero-isómeros. 17
Claims (1)
- A RMN de protão revelou que o ácido 2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-carboxílico existia para 80% do enantiómero-S. EXEMPLO 9 Promoveu-se o pré-crescimento de Absidia cflauca CBS 306,89 em 25 ml do meio BHI em frascos de 100 ml com septos num incubador com agitação a 302C durante 24 a 48 horas. Adicionaram-se amostras de 1 ml da cultura para inocular 25 ml do meio BHI contendo 1,5 g/1 de RJ3-2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol. Depois de 48 horas de incubação determinou-se a distribuição enanteomérica de R,S-2,2-di-metil-l,3-dioxolano-4-metanol como descrito no exemplo 2 e verificou-se que 55% do R,S-2.2-di-metil-l.3-dio xolano-4-metanol existia no enanteómero-S. REIVINDICAÇÕES - ia - Processo para a preparação de um 2.2- R^,R2-l,3-dioxolano-4-metanol enriquecido em isómero S na qual cada um de R1 e R2 é independentemente H ou um grupo alquilo, opcionalmente substituído ou ramificado, ou em que R-L e R2 em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel carbocíclico, opcionalmente substituído, caracterizado por se submeter uma mistura de R e S-2,2--R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol à acção de um microrganismo ou de uma substância derivada a qual é susceptível de destruição estereoselectiva de R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-me-tanol durante um período de tempo tal que R-2,2-R2,R2-l,3--dioxolano-4-metanol na mistura se consome para se obter um 2.2- R1,R2-l/3-dioxolano-4-metanol enriquecido em isómero S. 18- 2S - Processo de acordo cora a reivindica ção 1, caracterizado por o período de tempo ser tal que pelo menos 50% de R-2,2-1^,1^-1,3-dioxolano-4-metanol é consumido. _ 3a _ Processo de acordo com a reivindica ção 1 ou 2, caracterizado por os grupos alquilo conterem menos do que 6 átomos de carbono ou em que o anel carbocíclico contem menos do que 8 átomos de carbono. - 4ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3,caracterizado por R1 e R2 serem idên ticos. _ 5â _ Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por R-j^ e R2 serem H ou um grupo alquilo contendo 1 a 3 átomos de carbono ou em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel carbocíclico contendo 5 ou 6 átomos de carbono. - 6ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por o referido micro-organismo ser uma bactéria, uma levedura ou um fungo, de pre ferência pertencendo ao género Abridia. ao género Branhamel-la. ou ao género Graphium, ao género Trichosporon. ou ao género Arthrobacter. _ 7a _ Processo de acordo com a reivindica ção 8, caracterizado por o microrganismos utilizado ser Abi-dia glauca, de preferência Absidia qlauca (CBS 306.89), ser Branhamella catarrhalis. de preferência Branhamella catar-rhalis (CBS 307.89), ser Graphium penicillioides. de preferência Graphium penicillioides (CBS 318.72) ser Trichosporos adeninovorans. de preferência Trischoporam adeninovorans (CBS 8244) ou ser Bacterium F-7 (CBS 238.90) ou um seu mutante. - 8§ - 19 Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o referido microrganismos ou substância derivada ser imobilizado ou como uma célula em desenvolvimento, como uma célula não em desenvolvimento, como uma célula morta, ou um enzima. - ga - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o 1*2-1,3-dioxolano-4-metanol consumido, ser substancialmente convertido em ácido S-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-carboxílico. - 10 - - Processo para a preparação de 2,2--R^,R2-1,3-dioxolano-4-metanol enriquecido em isómero R caracterizado por se converter o ácido s-2,2-R^,R2-l,3-dioxola no-4-carboxílico,preparado de acordo com o processo da reivindicação 9, no R-2,2-R1,R2-l,3-dioxolano-4-metanol. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 29 de Junho de 1989, sob o N2. 89201733.6. Lisboa, 28 de Junho de 1990. © 41--: - ... . J.( -4 4·- ",Γ - 4‘-l -4 .· . 4. : -4-420
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