FI90092B

FI90092B - Foerfarande foer framstaellning av r-2,2-r1,r2-1,3-dioxolan-4-metanol

Info

Publication number: FI90092B
Application number: FI872018A
Authority: FI
Inventors: Mauro Attilio Bertola; Arthur Friedrich Marx; Gareth Thomas Phillips; Hein Simon Koger; Volkert Paul Claassen
Original assignee: Shell Int Research; Gist Brocades Nv
Priority date: 1986-05-08
Filing date: 1987-05-06
Publication date: 1993-09-15
Also published as: CA1334082C; NO168714C; FI90092C; NO871903L; DK231587D0; IE60197B1; AU595028B2; IL82416A0; AU7253887A; NO871903D0; NZ220208A; ZA873274B; EP0244912B1; GB8611238D0; PT84830B; GR3000591T3; ES2019618B3; DK231587A; ATE54141T1; IE871162L

Description

9 0 092

Menetelmä R-2,2-Rj^,R2-l,3-dioksolaani-4-metanolin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av £-2,2-R1,R2-l,3-dioxolan- 4-metanol Tämä keksintö koskee menetelmää 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaa-ni-4-metanolin valmistamiseksi, joka koostuu etupäässä tai oleellisesti katsoen kokonaan R-isomeeristä.

R-2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani-4-metanoli on tärkeä lähtöaine valmistettaessa maanviljelyssä käytettyjä ja farmaseuttisia tuotteita, katso esimerkiksi J. Jurczak et ai., Tetrahedron voi. 42, no. 2, sivut 447-488 (1986).

Viime vuosina R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanoli on muodostunut mielenkiintoiseksi aineeksi, sen ollessa tärkeä lähtöaine monien, biologisesti aktiivisten aineiden ja erityisesti kiraalisten lääkeaineiden valmistuksessa. Biologisesti aktiivisten tuotteiden valmistus optisesti puhtaassa muodossa käyttäen kiraalisia lähtöaineita on hyvin edullista, sen tehdessä mahdolliseksi synteesin kulun tarkan suunnittelun ja tehokkaan toteuttamisen, E-l,l-dimetyyli-3-dioksolaani-4-metanoli on tärkeä esimerkki C3-syntonista ja sitä käytetään lähtöaineena monien muiden C3-syntonien valmistuksessa, joita käytetään laajasti orgaanisissa synteeseissä kiraalisena rakenneosana. Esimerkiksi R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani- 4-metanolia voidaan käyttää muiden kiraalisten syntonien, monosakkaridien, niiden johdannaisten ja muiden polyhyd-roksyylisysteemien ja vielä kompleksisemman rakenteen .. . omaavien, biologisesti aktiivisten tuotteiden synteeseis sä. Vielä kompleksisemman rakenteen omaavien synteesien esimerkkejä ovat 0-salpaajien tai optisesti puhtaiden /3-laktaami-systeemien valmistus.

Tämän vuoksi on yhä edelleen suuri tarve menetelmälle, : joka on käyttökelpoinen teollisessa mittakaavassa tuotta- 2 c' Π 0 f 2 en enemmän taloudellisesti kannattavia saantoja 2,2-dime-tyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolin R-stereoisomeerin ste-reoselektiivisessa valmistuksessa. Tämä keksintö koskee tällaista menetelmää. On todettu, että R-stereoisomeerin stereoselektiivinen valmistus voidaan edullisesti suorittaa käyttäen mikro-organismeja tai niistä peräisin olevia entsyymejä. Lisäksi on todettu, että 2,2-R1,R2-dioksolaa-ni-2-metanolin S-stereoisomeeri voidaan edullisesti muuttaa R-2,2-R-l , R2“l, 3-dioksolaani-4-karboksyylihapoksi käyttäen näitä mikro-organismeja tai niistä peräisin olevia entsyymejä.

Tämä keksintö koskee menetelmää 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaa-ni-4-metanolin valmistamiseksi rikastettuna R-isomeerin suhteen, jossa Rj^ ja R2 tarkoittavat vetyä tai alkyyli-ryhmiä, joissa on vähemmän kuin 6 hiiliatomia, ja jotka mahdollisesti ovat haarautuneita, tai jossa Rj^ ja R2 yhdessä hiiliatomin kanssa, johon ne liittyvät muodostavat karbosyklisen renkaan, joka sisältää vähemmän kuin 8 hiiliatomia, jossa menetelmässä R-ja S-2,2-RlfR2-dioksolaa-ni-4-metanolin seos saatetaan alttiiksi mikro-organismin, joka on bakteeri, hiiva tai sieni, tai siitä peräisin olevien entsyymien vaikutukselle, joilla on kyky stereo-selektiivisesti kuluttaa S-2,2-RlfR2-l,3-dioksolaani-4-metanolia sellaisen ajanjakson ajan, että S-2,2-Rj,R2-l,3-dioksolaani-4-metanoli on seoksesta kulutettu, jolloin saadaan 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaani-4-metanoli, joka on rikastunut R-isomeerin suhteen. Sopivasti ainakin 80 painoprosenttia, edullisesti 90 painoprosenttia ja mieluimmin olellisesti kaikki S-2,2-RlfR2-l,3-dioksolaani-4-metanoli kulutetaan, jolloin saadaan 2,2-R1,R2-l,3-diokso-laani-4-metanoli rikastettuna R-isomeerina tai se muodostuu olennaisesti puhtaasta B-isomeerista. Rikastettu 2,2-R^,R2~l,3-dioksolaani-4-metanoli rikastettuna R-isomeerin suhteen eristetään ainakin osittain ja/tai käytetään lähtöaineena muiden optisesti aktiivisten yhdis- 3 0 n n S' 2 teiden valmistuksessa. Mieluimmin Rx ja R2 ovat identtiset. Tällä tavalla yhdisteisiin ei muodostu ylimääräistä asymmetriaa. Vielä mieluummin Rj^ ja R2 ovat 1-3 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai yhdessä hiiliatomin kanssa, johon ne liittyvät, muodostavat 5 tai 6 hiiliatomia sisältävän karbosyklisen renkaan.

Kuten edellä esitettiin 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaani-4-meta-nolin R- ja S-isomeerien seos voidaan muuttaa 2,2-R1,R2- 1.3- dioksolaani-4-metanoliksi rikastettuna R-isomeerin suhteen. Tällä tavalla ainoastaan osa seoksesta voidaan käyttää edelleen reaktioissa, esimerkiksi lähdettäessä seoksesta, jossa on 50 painoprosenttia R-muotoa ja 50 painoprosenttia S-muotoa, ainoastaan puolet 2,2-RlfR2- 1.3- dioksolaani-4-metanolista tulee käytetyksi hyödyllisesti. Tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti £-2,2-Rl,R2-l,3-dioks°laani-4-metanoli muutetaan edullisesti s-2,2-Rj^, R2-l, 3-dioksolaani-4-karboksyylihapoksi.

Tällä tavalla ei ole mahdollista valmistaa ainoastaan 2.2- R1,R2-l,3-dioksolaani-4-metanolia (rikastettuna R-isomeerin suhteen) vaan voidaan samanaikaisesti saada 2.2- Rj^, R2-l, 3-dioksolaani-4-karboksyylihappoa rikastettu-na R-isomeerin suhteen. Tällä tavalla oleellisesti kaikki B” ja S-2,2-R1,R2-l,3-dioksolaani-4—metanoli voidaan erottaa ja voidaan käyttää. 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaani'-4-karboksyylihappoa, rikastettuna R-isomeerin suhteen, voidaan käyttää lähtöaineena valmistettaessa monia biologisesti aktiivisia tuotteita tai se voidaan muuttaa 2,2-R1,R2-l,3-dioksolaani-4-metanoliksi, rikastettuna S-iso-meerin suhteen, joka myös on tärkeä lähtöaine.

Käsitteellä "mikro-organismit, joilla on kyky stereose-lektiivisesti kuluttaa" tarkoitetaan esimerkiksi bakteereita, hiivoja, sieniä. Sopivia bakteereita ovat esimerkiksi mikro-organismit, jotka kuluvat Nocardia-sukuun, 4 '< Γ) n 5 2

Rhodococcus-sukuun. Mvcobacterium-sukuun tai Corvnebacte-rium-sukuun.

Myös mikro-organismit, jotka ovat saaneet kyvyn kuluttaa S-2,2—,R2“1i3-dioksolaani—4—metanolia uuden geneettisen materiaalin liittämisen kautta, kuuluvat käsitteeseen "mikro-organismit, joilla on kyky stereoselektiivisesti kuluttaa".

Tämä voidaan suorittaa siirtämällä kloonattu geeni, joka koodittaa stereoselektiivisestä kulutuksesta vastaavaa polypeptidiä, entsyymiä, mistä tahansa testatusta mikro-organismista toiseen mikro-organismiin, erityisesti Escherichia coliin. Muita mikro-organismeja voi kuulua sukuihin Saccharomvces. Kluvveromvces. Bacillus. Nocar-dia, Rhodococcus. Escherichia ja Corvnebacterium. Kloonatut geenit voidaan valita siten, että niillä on kyky koodittaa entsyymiä, joka pystyy kuluttamaan 8-2,2-1^,1^- 1.3- dioksolaani-4-metanolia, mieluimmin S-2,2-dimetyyli- 1.3- dioksolaani-4-metanolia.

Vaihtoehtoisesti ne voidaan valita ristikkäishybridisaa-tiolla jo valitun geenin kanssa, joka koodittaa entsyymiä stereoselektiivistä kulutusta varten.

Mikro-organismit voidaan edullisesti immobilisoida esimerkiksi polymeerigeelillä. Tämä voidaan tehdä elävillä soluilla, tapetuilla soluilla ja/tai lepotilassa olevilla soluilla, tai vaihtoehtoisesti niistä peräisin olevilla, sopivilla entsyymeillä, jotka voidaan puhdistaa tiettyyn määrään asti, tarvittaessa suurempaa spesifistä aktiivisuutta .

Tämän vuoksi käsitteellä "mikro-organismit tai niistä peräisin olevat entsyymit" tarkoitetaan mikro-organismeja, tapettuja, elossa olevia tai lepotilassa olevia, niistä 5 μπΠ:2 saatavia entsyymiuutteita, mahdollisesti konsentroituina tai puhdistettuina. Esimerkiksi voidaan käyttää entsyymejä mahdollisesti yhdessä esimerkiksi keinotekoisten tai luonnollisten kofaktoreiden kanssa. Fermentatiivisesti aktiivisia soluja ei voida käyttää S-2,2-R1,R2-l,3-diok-solaani-4-metanolin kulutukseen. On todettu, että entsyymit, jotka ovat peräisin soluista tai tapetuista soluista, voivat kuluttaa S-isomeeria sopivissa olosuhteissa. Mikro-organismeja tai niistä peräisin olevia entsyymejä voidaan käyttää useita kertoja ja ne ovat aktiivisia ainakin kahden viikon ajan. Jopa ilman ko-substraattia (esimerkiksi glukoosia) mikro-organismit voivat pysyä aktiivisina. R-2,2-R1,R2~l,3-dioksolaani-4-metanolin rikastaminen E-isomeerin suhteen voi tapahtua sopivissa puskureissa (esimerkiksi 3-(N-morfolino)propaani-sulfonihapos-sa, tris(hydroksimetyyli)aminometaanissa tai kaliumfosfaatissa) sekä fysiologisissa suoloissa. Varastoinnin jälkeen indusoitujen solujen on todettu olevan suoraan kykeneviä muuttamaan seosta R-isomeerin rikastumiseksi.

Erityisesti mikro-organismi, joka kuluttaa S-2,2-R1,R2- 1,3-dioksolaani-4-metanolia kuuluu viljelmiin Rhodococcus eaui. Rhodococcus rhodochrous. Rhodococcus ervthrooolis. Corvnebacterium eoui. Corvnebacterium alkamin» (näyte tästä lajista on tallennettu ATCCthen talletusnumerolla 21194), Corvnebacterium hvdrocarboclastus (näyte tästä lajista on tallennettu ATCC:hen talletusnumerolla 15108) Corvnebacterium-laii T-1300 (näyte tästä lajista on tallennettu CBS:ään talletusnumerolla 265.87), Nocardia ervthropolis. Nocardia corallina (näyte tästä lajista on tallennettu ATCC:hen talletusnumerolla 31338), Nocardia canicruria (näyte tästä lajista on tallennettu ATCC:hen 6 c> n f) f) 2 talletusnumerolla 31548), Nocardia paraffinae (näyte tästä lajista on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 11277), Nocardia species PS 5123 (näyte tästä lajista on tallennettu CBS:ään talletusnumerolla 266.87), Nocardia aurantia (näyte tästä lajista on tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 9557), Nocardia calcarea (näyte tästä lajista on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 8863), Nocardia cathaarde T 985 (näyte tästä lajista on tallennettu CBS sään talletusnumerolla 268.87), Nocardia globe-rula (näyte tästä lajista on tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 9159), Nocardia ragosa (näyte tästä lajista on tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 8926) ja Mycobacterium rhodochrous (näyte tästä lajista on tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 11061).

Rhodococcus equi -viljelmät käsittävät edullisesti lajin Rhodococcus equi (näyte tästä lajista on tallennettu IFOshon talletusnumerolla 03730) ja lajin Rhodococcus equi (näyte tästä lajista on tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 12035) . Edullisesti Rhodococcus rhodochrous-viljelmät sisältävät lajin Rhodococcus rhodochrous (näyte tästä lajista tallennettu NCIBshen talletusnumerolla 9703) ja lajin Rhodococcus rhodochrous (näyte tästä lajista tallennettu ATCCshen talletusnumerolla 21197) viljelmät. Edullisesti Rhodococcus erythropolis-viljelmät käsittävät lajin Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (näyte tästä lajista tallennettu CBS sään talletusnumerolla 179.86 18. huhtikuuta, 1986), lajin Rhodococcus erythropolis SCL 38-2R (näyte tästä lajista tallennettu CBS sään talletusnumerolla 180.86 18. huhtikuuta, 1986) ja lajin Rhodococcus erythropolis SCL 38-2S (näyte tästä lajista tallennettu CBS sään talletusnumerolla 181.86, 18. huhtikuuta, 1986) viljelmät. Edullisesti Corynebacterium equi-viljelmät käsittävät lajin Corynebacterium equi A 2362 (näyte tästä lajista tallennettu CBS sään talletusnumerol- 7 9 η π f· 2 la 267.87) ja lajin Corynebacterium equi A 2431 (näyte tästä lajista tallennettu CBS:ään talletusnumerolla 263.87) viljelmät. Edullisesti Nocardia erythropolis-vil-jelmät käsittävät lajin Nocardia erythropolis T 487 (näyte tästä lajista tallennettu NCIBthen talletusnumerolla 9158), lajin Nocardia erythropolis (näyte tästä lajista tallennettu DSMsään talletusnumerolla 743) ja lajin Nocardia erythropolis (näyte tästä lajista tallennettu ATCC:hen talletusnumerolla 4277) viljelmät.

Tämän keksinnön mukaisesti tuotettua R-2,2-Ri,R2“l#3-di-oksolaani-4-metanolia voidaan käyttää lähtöaineena muiden optisesti aktiivisten yhdisteiden valmistuksessa. Tärkeä mahdollisuus on kiraalisten lääkeaineiden valmistus.

Jokaiselle alan ammattimiehelle on selvää, että mitä tahansa sopivaa menetelmää voidaan käyttää muutettaessa S-ja R-2,2-Ri,R2~1,3-dioksolaani-4-metanoli optisesti aktiivisiksi yhdisteiksi.

Esimerkit, jotka kuvaavat S- ja R-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-metanolin käyttöä optisesti aktiivisten yhdisteiden valmistuksessa, ovat tunnettuja esimerkiksi julkaisuista J. Jurczak et ai., Tetrahedron report number 195, Tetrahedron 42^ (1986); s. 447-488 ja the Technical Information Bulletin 225, syyskuu 1983, Janssen Chimica (Belgium).

Optisesti aktiivisia yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisissa tai maanviljelytuotteissa.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaisesti mikro-organismia, jolla on kyky stereo-selekti ivisesti kuluttaa S-2,2-R]^ ,R2~1,3-dioksolaani-4-metanolia, on viljeltävä noin 0,5 - 10 päivää, jonka jäi- 8 ci η η c-2 keen mikro-organismien solut suspendoidaan nestemäiseen ravintoalustaan ja R- ja S-2,2-R^,R2-1»3-dioksolaani-4-metanolin seos saatetaan kosketukseen solujen kanssa.

Edellä mainitun noin 0,5 - 10 päivää kestävän viljelyn jälkeen solut voidaan eristää viljelyalustasta ennen kuin solut suspendoidaan nestemäiseen ravintoalustaan.

Mikro-organismin kasvattamiseksi S-2,2-r^,R2~1,3-diokso-laani-4-metanolin selektiiviseen kulutukseen, voidaan käyttää tavallisia kasvualustoja, jotka sisältävät assimiloituvan hiililähteen (esimerkiksi glukoosi, laktaatti, sakkaroosi, jne.), assimiloituvan typpilähteen (esimerkiksi ammoniumsulfaatti, ammoniumnitraatti, ammoniumklo-ridi, jne.) yhdessä orgaanisen ravintolähteen kanssa (esimerkiksi hiivauute, mallasuute, peptoni, lihauute, jne.) ja epäorgaanisen ravintolähteen kanssa (esimerkiksi fosfaatti, magnesium, kalium, sinkki, rauta ja muut metallit pieninä määrinä).

Sopivana kasvualustana voidaan käyttää Jap-kasvualustaa mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella. Voidaan käyttää Jap-kasvualustaa, jonka koostumus on seuraavas soijapapujauhoa (30 g/1), natriumnitraattia (7,5 g/1), rauta(2)-sulfaatti.7 IVOsta (0,28 g/1), nat-riumsitraattia (6 g/1) ja fruktoosia (12,5 g/1), pH säädetty arvoon 7,2. Ennen käyttöä kasvualusta tavallisesti steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa.

Toinen edullinen kasvualusta on YPD-kasvualusta, mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella. Voidaan käyttää YPD-kasvualustaa, jossa on 20 g/1 bakto-peptonia, 10 g/1 hiivauutetta ja 20 g/1 glukoosia. Ennen käyttöä kasvualusta tavallisesti steriloidaan 30 minuuttia 110°C:ssa.

9 c;i Π Π ί 2

Edelleen edullinen kasvualusta on GYMB-kasvualusta mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella. Voidaan käyttää GYMB-kasvualustaa, jonka koostumus on seuraava: glukoosia (10 g/1, peptonia (5 g/1), hiivauu-tetta (3 g/l)f mallasuutetta (3 g/1)/ tavallisesti alustaa steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa ennen käyttöä.

Toinen edullinen kasvualusta on alusta 3310, mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella. Voidaan käyttää kasvualustaa 3310, jolla on seuraava koostumus: (NH4) 2SO4 (10 g/1), Nad (1 g/1), MgS04-7H20 (1 g/1, K2HPO4 (5 g/1), MnS04-3H20 (2,5 mg/1), ZnS04-7H20 (2,5 mg/1), FeSC>4*7H20 (2,5 mg/1), CaCl2 (12,5 mg/1), CuS04*5H20 (0,75 mg/1), CoCl2*6H20 (0,75 mg/1), H3BO3 (0,25 mg/1), Na2Mo04-2H20 (0,275 mg/1), KI (0,5 mg/1), Ca-pantotenaatti (0,6 mg/1), inositoli (4 mg/1), nikotii-nihappo (0,8 mg/1), tiamiini.HCl (0,8 mg/1), pyridoksiini.HCl (0,8 mg/1) p-aminobentsoehappo (0,4 mg/1), ribo-flaviini (0,4 mg/1), foolihappo (0,02 mg/1), biotiini (4 ug/1). Ennen käyttöä kasvualusta tavallisesti steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa. Sen jälkeen lisätään glukoosia (esimerkiksi 50 g/1), jota on steriloitu 30 minuuttia 110°C:ssa.

Eräs toinen edullinen kasvualusta on kuorittu maitoalus-ta, mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella, esimerkiksi kuorittu maitoalusta, joka sisältää: 10 % kuorittua maitoa, joka on valmistettu rasvattomasta maitojauheesta, joka tavallisesti steriloidaan 30 minuuttia 110°C:ssa ennen käyttöä.

Esimerkkejä rikastuttavista aineista kuorittu maitoalus-taan ovat 0,5 %:inen laktaatti tai PSIII-suolat tai näiden yhdistelmät. Voidaan käyttää PSIII-suola-alustaa, jonka koostumus on seuraava: kaliumdivetyfosfaatti 10 - Π n 2 (2,1 g/1), anunoniummonovetyfosfaatti (1,0 g/1), ammonium-sulfaatti (0,9 g/1), kaliumkloridi (0,2 g/1), natriumsit-raatti (0,29 g/1), kalsiumsulfaatti.2H2O (0,005 g/1), magnesiumsulfaatti.7H2O (0,2 g/1), ammoniumrauta(2)sulfaatti. 6H2O (2,5 g/1), sinkkisulfaatti.7H2O (0,5 mg/1), mangaanikloridi.4H20 (0,3 mg/1), kuparisulfaatti.5H2O (0,15 mg/1), kobolttikloridi.6H2O (0,15 mg/1), orto-boo-rihappo (0,05 mg/1), natriummolybdaatti.2H2O (0,055 mg/1) ja kaliumjodidi (0,1 mg/1), pH säädetty arvoon 6,8. Ennen käyttöä PSIII-suola-alusta tavallisesti steriloidaan 30 minuuttia 120°C:ssa.

Mikro-organismin kasvatuksen aikana lämpötila pidetään mieluimmin 0-45°C:ssa ja pH 3,5-9:ssä. Mieluimmin mikro-organismi kasvatetaan lämpötilassa, joka on 20-37°C ja pH-arvo on 5-9. Aerobiset olot, jotka vaaditaan mikro-organismien kasvun aikana, voidaan aikaansaada millä tahansa hyväksi todetulla menetelmällä, edellyttäen, että hapen syöttö on riittävä tyydyttämään mikro-organismien metaboliavaatimukset. Tämä voidaan kaikkein parhaiten tehdä siten, että happea syötetään, sopivasti ilman muodossa ja mahdollisesti samanaikaisesti reaktionestettä ravistellaan tai sekoitetaan. Mikro-organismin kuluttaessa S-2,2-R^,R2-l,3-dioksolaani-4-metanolia, mikro-organismi voi olla kasvuvaiheessa käyttämällä edellä mainittua tavanomaista kasvualustaa.

Mikro-organismin kuluttaessa S-2,2-R^ ,R2-1,3-dioksolaani- 4-metanolia voidaan käyttää tavanomaista kasvualustaa, joka sisältää, tarvittaessa, assimiloituvan hiililähteen (esimerkiksi glukoosia, laktaattia, sakkaroosia, jne.), tarvittaessa assimiloituvan typpilähteen (esimerkiksi am-moniumsulfaattia, ammoiumnitraattia, ammoniumkloridia, jne.), tarvittaessa orgaanisen ravintolähteen (esimerkiksi hiivauutetta, mallasuutetta, peptonia, lihauutetta, 11 «n Of 2 jne.) ja tarvittaessa epäorgaanisen ravintolähteen (esimerkiksi fosfaattia, magnesiumia, kaliumia, sinkkiä, rautaa ja muita metalleja pieninä määrinä).

Edullisesti R-isomeeria rikastettaessa voidaan käyttää Jap-kasvualustaa, YPD-kasvualustaa, kasvualustaa 3310 tai kuorittu maito-kasvualustaa (kuten edellä kuvattiin) mahdollisesti rikastettuina yhdellä tai useammalla aineella. Mieluimmin käytetään GYMB-alustaa (kuten edellä kuvattiin) mahdollisesti rikastettuna yhdellä tai useammalla aineella.

Mikro-organismi voidaan pitää kasvamattomassa tilassa esimerkiksi poistamalla assimiloituva hiililähde tai poistamalla assimiloituva typpilähde. Tässä tilassa lämpötila voidaan pitää 0-45°C:ssa ja pH-arvo 3,5-9:ssä.

Mieluimmin mikro-organismeja pidetään lämpötilassa, joka on 20-37°C ja pH-arvo on 5-9. Aerobiset olot, jotka tämä tila vaatii, voidaan aikaansaada millä tahansa hyväksi todetulla menetelmällä edellyttäen, että hapen syöttö on riittävä tyydyttämään mikro-organismien metaboliavaati-mukset. Tämä voidaan kaikkein parhaiten tehdä siten, että happea syötetään sopivasti ilman muodossa ja mahdollisesti samanaikaisesti reaktionestettä ravistellaan tai sekoitetaan. Edellä mainitun muutoksen jälkeen R- ja kaikki jäljellä oleva S-2,2-R^,R2-l,3-dioksolaani-4-metanoli voidaan ottaa talteen ja puhdistaa minkä tahansa, tällaisille tuotteille esitetyn, sinänsä tunnetun menetelmän mukaisesti.

Mikro-organismeja voidaan pitää agarvinopinnoilla, jäädytettynä 50 %:isessa glyserolissa tai lyofilisoituina. Tarvittaessa, näiden mikro-organismien esikasvatukset voidaan suorittaa minkä tahansa hyväksi todetun menetel- 12 Q f) Q ( 2 män mukaisesti, esimerkiksi (Brain-Heart-infuusio) mikro-organismeja voidaan inkuboida lihaliemessä tai BHI:ssä 24 tuntia 30°C:ssa pyöröravistelijassa. Voidaan käyttää lihalientä, jonka koostumus on seuraava: Lab Lemco L 29 (lihauute, Oxoid®) (9 g/1), baktopeptoni (10 g/1) ja nat-riumkloridi (5 g/1), pH-säädetty arvoon 7,6. Ennen käyttöä tämä kasvualusta tavallisesti steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa.

Voidaan käyttää BHI (Brain Heart lnfusion)-kasvualustaa, joka sisältää 0,037 g/1 BHl:tä (Oxoid®), pH säädetty arvoon 7,0. Ennen käyttöä tämä kasvualusta tavallisesti steriloidaan 20 minuuttia 120°C:ssa.

Mieluimmin käytetään mikro-organismia, joka S-2,2-Ri,R2~ 1,3-dioksolaani-4-metanolin kulutuksen aikana käyttää S- 2,2-Ri,R2~1r 3-dioksolaani-4-metanolia.

Tätä keksintöä kuvaavat edelleen seuraavat esimerkit.

Esimerkki 1

Kantaa Rhodococcus equi NCIB 12035 kasvatettiin 48 tuntia 30°C:ssa useissa 500 ml:n väliseinäpulloissa (baffle flask), jotka sisälsivät 100 ml 10 %;ista kuorittua maito-alustaa. Sen jälkeen 120 yl RS-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-metanolia lisättiin jokaiseen pulloon ja inku-boitiin edelleen 24, 48 ja 96 tuntia. Jokaisena esitettynä ajankohtana 3 pulloa (300 ml viljelmää) uutettiin käyttäen jatkuvaa uuttomenetelmää. Uutteet puhdistettiin piihappogeelipylväässä ja optinen kierto mitattiin pola-rimetrilla 1 tai 10 cm:n kyvetissä (tilavuus 0,5 - 5 ml), lämpötila pidettiin 22°C:ssa ja liuottimena oli etanoli.

Kierrot rekisteröitiin aallonpituudella 589 nm (natrium-D-viiva). Enantiomeeriset jakaantumiset mitattiin, jossa käytettiin europium (HFC)3-siirtymäreagenssia.

13 9 η ΠΓ 2

Tulokset on esitetty Taulukossa 1.

Taulukko 1 inkubointi- 2,2-dimetyyli-l,3- (aD) enantiomeerinen aika (h) dioksolaani-4-meta- jakaantuminen

_nolin määrä (mg)_% R_% S

24 95,5 -5 75 25 48 61,1 -9,7 100 0 96_54,0_-10,1 100_0_

Esimerkki 2

Kantaa Rhodococcus erythropolis SCL38-2 (CBS 179,86) kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on esitetty ja sen jälkeen kun oli lisätty 120 μΐ RS-2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani- 4-metanolia inkuboitiin edelleen 12, 24 ja 48 tuntia.

2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin uuttaminen, puhdistaminen ja mittaukset suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Tulokset on esitetty seuraavassa Taulukossa 2.

Taulukko 2 inkubointi- 2,2-dimetyyli-l,3- (aD) enantiomeerinen aika (h) dioksolaani-4-meta- jakaantuminen

_nolin määrä (mg)_% R_% S

12 93,6 -8,8 93 7 24 77,8 -10,4 100 0 48_69,1_-9,8 100_0_ i4 D! 2

Esimerkki 3

Kantaa Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179,86) kasvatettiin ensin 48 tuntia 30°C:ssa useassa 100 ml:n väliseinäpullossa, jotka sisälsivät 25 ml 10 %:ista kuorittua maito-alustaa, jonka jälkeen viljelmiin lisättiin RS-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanoli. Jokaiseen pullosarjaan lisättiin erilaiset lähtökonsentraatiot RS- 2.2- dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia, 1,2, 2,4, 4,8 ja vastaavast 9,6 g/1. Tietyin ajoin jokaisen sarjan pullosta otettiin näytteet, uutettiin ja analysoitiin. Kävi selville, että aina 4,8 g/l:aan asti puolet lisätystä RS- 2.2- dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolista on kulutettu 48 tunnin sisällä. Pitoisuudella 9,6 g/1 kesti yli 96 tuntia ennen kuin puolet RS-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaa-ni-4-metanolista oli kulutettu. Koska oletettiin, että suurin osa kulutetusta 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolista oli S-konfiguraation omaavaa, uusi koe, joka perustui edellä saatuun kokemukseen, asetettiin suurempien määrien R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia valmistamiseksi.

Kaikkiaan 5,76 g RS-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-meta-nolia jaettiin kahteentoista 500 ml:n väliseinäpulloon, jotka sisälsivät 100 ml 10 %:ista kuorittua maitoa, jossa kantaa Rhodococcus erythropolis SL 38-2 oli kasvatettu 48 tuntia. Viljelmiä inkuboitiin edelleen 30°C:ssa 96 tuntia. Noin 1,2 litran kokonaistilavuudesta jäljellä oleva 2.2- dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanoli uutettiin ja puhdistettiin esimerkeissä 1 ja 2 kuvatulla tavalla.

1,5 g 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia eristettiin ja NMR-mittaukset osoittivat sen olevan R-konfigu-raatiota, enantiomeerisesti 100 %:isen puhdasta.

15 o n Of 2

Esimerkki 4

Kokeessa kantaa Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS

179,86) kasvatettiin 30°C:ssa 48 tuntia kolmessa 2 litran väliseinäpullossa, jotka sisälsivät 500 ml 10 %:ista kuorittua maitoa. Kaikkiaan 7,2 g RS-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-metanolia jaettiin viljelmiin ja inkuboitiin edelleen 96 tuntia.

Jäljellä olevan 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin uuttaminen ja puhdistaminen suoritettiin esimerkeissä 1, 2 ja 3 kuvatulla tavalla.

1,4 g R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia otettiin talteen, NMR-mittausten perusteella se oli 100 %: sesti enantiomeeripuhdasta.

Esimerkki 5

Kolmea erilaista muotoa Rhodococcus erythropolista SCL 38-2:ta, SCL 38-2S:ää ja vastaavasti SCL 38-2R:ää kasvatettiin jokaista kahdessa 100 ml:n annoksessa kuorittua maitoa, kuten esimerkissä 1 kuvataan, 48 tunnin ajan. Biomassan kuivapainot määritettiin ja niiden todettiin olevan samanlaiset kaikilla kolmella muodolla. Viljelmät jaettiin 30 ml:n annoksiin ja laitettiin 100 ml:n väli-seinäpulloihin. Tällä tavalla jokaisen muodon viljelmät jakaantuivat viiteen eri viljelmään, joista jokainen 30 ml. Näihin viljelmiin lisättiin 60 μΐ RS-2,2-dimetyy-li-1,3-dioksolaani-4-metanolia ja inkuboitiin edelleen. Eri ajankohtina (katso taulukko 3) otettiin yksi viljelmä jokaisesta muodosta, uutettiin ja jäljellä oleva 2,2-dimetyyli-l, 3-dioksolaani-4-metanoli analysoitiin. Enantio-meerinen jakaantuminen määritettiin muodostamalla diaste-reoisomeerit N,0-bis-(trimetyylisilyyli)-trifluoriaset- 16 ·· < η Π Γ 2 amidin (BSTFA) kanssa, jotka erotettiin kiraali-komplek-sointipylväässä. Mitään selviä eroja ei havaittu näiden kolmen muodon välillä.

Taulukko 3 SCL 38-2R SCL 38-2S SCL-38

Enantio- Enantio- Bnantio- Jäljellä meerinen Jäljellä meerinen Jäljellä meerinen

Koe- oleva jakaan- oleva jakaan- oleva jakaan- aika määrä g/1 tuminen määrä q/1 tuminen määrä q/1 tuminen

tunti RS %R %S R S %R %S R S %R %S

0 0,55 0,55 50 50 0,57 0,54 50 50 0,55 0,55 50 50 3 0,57 0,57 50 50 0,55 0,55 50 50 0,54 0,53 50 50 6 0,57 0,49 54 46 0,57 0m52 53 47 0,56 0,47 55 45 8 0,57 0,38 60 40 0,57 0,39 59 41 0,57 0,35 62 38 24 0,46 0,00 100 0 0,49 0,00100 0 0,45 0,00100 0

Esimerkki 6 Tämä esimerkki kuvaa S-metoprololin valmistusta, beta-salpaaja R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolista. Tämä esimerkki kuvaa R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin käyttömahdollisuutta lähtöaineena muiden optisesti aktiivisten aineiden synteeseissä.

S-2,2-dimetyyli-4-(metaanisulfonyylioksimetyyli)-l,3-di-oksolaanin valmistus R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolista_

Seos, jossa oli 1,2 ml (15,5 mmoolia) metaanisulfonyyli-kloridia ja 4 ml metyleenikloridia, lisättiin 5 minuutissa sekoitettuun ja jäähdytettyyn seokseen, jossa oli 7 ml i7 "n Of 2 metyleenikloridia, 2,6 ml (18,7 mmoolia) trietyyliamiinia ja 1,81 g (13,7 mmoolia) R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani- 4- metanolia (joka oli NMR:llä todettu optisesti puhtaaksi). Tämä R-isomeeri valmistettiin esimerkeissä 1-5 kuvatulla tavalla.

Sekoittamista jatkettiin 22°C:ssa 1 1/2 tunnin ajan ja sen jälkeen lisättiin metaanisulfonyylikloridia (0,15 ml) ja trietyyliamiinia (0,5 ml). Seisotettiin jääkaapissa yön yli, jonka jälkeen seos ravisteltiin metyleeniklori-dilla ja 1 N natriumbikarbonaatti-liuoksella. Orgaaninen kerros pestiin 1 N natriumbikarbonaatti-liuoksella, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 2,78 g S-2,2-dimetyy-li-4-(metaanisulfonyylioksimetyyli)-1,3-dioksolaania ruskeana öljynä, joka käytettiin sellaisenaan.

5- 2,2-dimetyyli-4-[p-(2-metoksietyyli)-fenyylioksimetyy li ]-l,3-dioksolaanin valmistus S-2,2-dimetyyli-4-(metaa-nisulfonyylioksimetyyli)-1,3-dioksolaanista_ p-(2-metoksietyyli)-fenolia (2,2 g, 14,47 mmoolia) lisättiin jäähdytettyyn (reaktioseos pidettiin alle 100°C) ja sekoitettiin seokseen, jossa oli 10 ml kuivaa N,N-dime-tyyliformamidia ja 0,38 g (15,8 mmoolia) natriumhydridiä.

Seuraavaksi lisättiin 2,78 g raakaa S-2,2-dimetyyli-4-(metaanisulfonyylioksimetyyli)-l,3-dioksolaania ja seosta sekoitettiin ja kuumennettiin öljyhauteessa, joka oli 100°C, 1 1/2 tunnin ajan.

Jäähdytettiin 22°C:seen, jonka jälkeen seos kaadettiin 1 M natriumbikarbonaattiin ja uutettiin eetterillä. Eet-teriuute pestiin 1 N natriumhydroksidilla, 1 M natriumbi-karbonaatilla, suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 3,20 g is °ηπΓ2 S-2,2-dimetyyli-4-[p-(2-metoksietyyli) fenyylioksimetyy-li]-l,3-dioksolaania öljynä, joka käytettiin sellaisenaan .

S-3-[p-(2-metoksietyyli)-fenoksi]-l,2-propaanidiolin valmistus S-2,2-dimetyyli-4-[p-(2-metoksietyyli)-fenyyliok-simetyyli]-l,3-dioksolaanista_

Seosta, jossa oli 3,20 g raakaa S-2,2-dimetyyli-4-[p-(2-metoksietyyli)-fenyylioksimetyyli]-l,3-dioksolaania, 15 ml metanolia, 10 ml vettä ja 0,5 ml 36 %:ista kloori-vetyhappoa, sekoitettiin 22°C:ssa 1 tunti. Lisättiin vielä toiset 0,5 ml 36 %:ista kloorivetyhappoa, jonka jälkeen sekoittamista jatkettiin 1/2 tunnin ajan ja seuraa-vaksi lisättiin 10 ml 1 M natriumkarbonaattia ja seos konsentroitiin tyhjössä.

Jäännös uutettiin eetterillä ja uute pestiin suolaliuoksella, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 2,60 g raakaa, otsikossa mainittua yhdistettä öljynä, joka käytettiin sellaisenaan.

R-l-bromi-2-asetoksi-3-[p-(2-metoksietyyli)-fenyylioksi]-propaanin valmistus S-3-[p-(metoksietyyli)-fenoksi]-l,2-propaanidiolista_

Seosta, jossa oli 2,6 g raakaa S-3-[p-(metoksietyyli)-fe-nyylioksi]-l,2-propaanidiolia ja 10 ml 33 % lista bromive-tyhappoa etikkahapossa, sekoitettiin 22°C:ssa 1 1/4 tuntia.

Seuraavaksi seos kaadettiin 100 mitään 1 M natriumkarbonaattia ja uutettiin dietyylieetterillä. Uute pestiin 1 M natriumkarbonaatilla, suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin, 19 «n or 2 saatiin 3,65 g raakaa, otsikossa mainittua yhdistettä öl jynä, joka käytettiin sellaisenaan.

S-p—(2-metoksietyyli)—fenyyli-glysidyylieetterin valmistus R-l-bromi-2-asetoksi-3-[p-(2-metoksietyyli)fenyyli-oksi]-propaanista_

Seosta, jossa oli 3,65 g raakaa R-l-bromi-2-asetoksi-3-Ip—(2-metoksietyyli)-fenyylioksi]-propaania, 65 ml kuivaa 1,2-dimetoksietaania ja 2,2 g (39,3 mmoolia) jauhemaista kaliumhydroksidia, sekoitettiin 22°C:ssa 20 tuntia. Seisotettiin kaksi päivää jääkaapissa, jonka jälkeen lisättiin 1 M natriumbikarbonaattia (50 ml) ja seos konsentroitiin tyhjössä ja uutettiin eetterillä.

Uutteet pestiin 1 M natriumbikarbonaatilla ja suolaliuoksella ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla.

Suodatuksen jälkeen suodos haihdutettiin, saatiin 2,04 g öljyä. Tämä puhdistettiin Merckin valmiiksipakatulla pii-happogeelipylväällä (Merck Fertigsäule C), eluointiainee-na eetteri/heksaani = 1:1 ja eetteri/etanoli = 20:1. Fraktiot, jotka sisälsivät epoksidin, yhdistettiin ja haihdutettiin, saatiin 1,31 g otsikossa mainittua yhdistettä öljynä.

S-l-isopropyyliamino-3-[p-(2-metoksietyyli)-fenyylioksi]- 2-propanolin (S-metoprololi) valmistus S-p-(2-metoksi-etyyli)fenyyli-glysidyylieetteristä_

Seosta, jossa oli 1,31 g (6,3 mmoolia) S-p-(2-metoksi-etyyli)fenyyli-glysidyylieetteriä, 10 ml etanolia ja 5 ml isopropyyliamiinia, kuumennettiin 55°C:n vesihauteessa 1 1/2 tunnin ajan.

20 ('ΠΠΓ2

Seos haihdutettiin, saatiin 1,67 g otsikossa mainittua yhdistettä kiinteänä aineena. Näyte derivoitiin (+)-a-me-toksi-a-trifluorimetyyli-fenyylietikkahapon happokloridin kanssa, jonka jälkeen muodostuneella amidilla havaittiin NMR:ssä ainoastaan 0,7 painoprosenttia R-isomeeria.

Esimerkki 7

Kantaa Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) kasvatettiin 3 litran fermentorissa 1,5 litrassa 5 x konsentroitua GYMB-kasvualustaa, ilman syöttö oli 90 1/h. Kasvualustaa sekoitettiin ja sen pH pidettiin arvossa 6,8 - 7,2. Ymppinä käytettiin 15 ml:aa 48 tuntia vanhaa Rhodococcus erythropolis-viljelmää, jota oli kasvatettu normaalilla GYMB-kasvualustalla. 65 tunnin kasvatuksen jälkeen viljelmä, jonka optinen tiheys aallonpituudella 600 nm oli 37 LKB Ultrospec 4050-laitteen 1 cmtn kyvetis-sä, inkuboitiin 15 g:n kanssa R,S-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-metanolia 4 tunnin ajan. Sen jälkeen pH nostettiin arvoon 7,5, joka pidettiin vakiona 4 N NH4OH:n syötöllä, lisättäessä 8 M R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani- 4-metanolia (lisäysnopeus 2,2 g/h). R- ja S-2,2-dimetyy-li-1,3-dioksolaani-4-metanolin konsentraatiot testattiin eluoimalla 3 ml käymislientä Extrelut-3-pylväässä (Merck nro 15372). Ainakin 5 minuuttia myöhemmin pylväs eluoi-tiin 12 ml s 11a etyyliasetaattia. Tämä menetelmä tuotti 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin kvantitatiivisen eluoitumisen. Tämän alkoholin diastereoisomeerit muodostettiin BSTFA:n kanssa (katso esimerkki 5). Molempien enantiomeerien suhde voitiin määrittää käyttäen kiraali-kompleksointipylvästä (taulukko 4).

21 0 n O ? 2

Taulukko 4 R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin enantiomeeri-nen ylimäärä kannan Rhodococcus erythropolis käymislie-messä, johon on lisätty tämän yhdisteen raseemista seosta tuntia lisäyksen alkamisesta_ tuntia lisäyksen R-enantiomeerin ee alkamisesta 0 0,43 20 0,94 26 0,97 29_0,97_ ee = enantiomeerinen ylimäärä (enantiomeric excess)

Lisäystä jatkettiin 29 tunnin ajan. Sillä hetkellä liemi sisälsi 24,3 g/1 R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-meta-nolia ja 0,37 g/1 S-enantiomeeria. Lisäyksen aikana havaittiin hapon vakaa tuotanto. Tuotettu happo identifioitiin 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-karboksyylihapoksi . NMR:llä. ^ C-NMR -spektrissä on seuraavat signaalit: 1 δ (ppm/TMS) COOH Cl 180,11 1 C2 77,64 2 C-0V /C5 C3 69,49 | NC4 C4 113,00 3C-0/SC6 C5, C6 27,43. 27,03 TMS = tetrametyylisilaani 22 Cf n n r 2

Esimerkki 8

Kuuden litran viljelmää Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) kasvatettiin kasvualustassa 3310 10 litran fermentorissa. Soluja kasvatettiin 30°C:ssa, kasvualustaa sekoitettiin, ilmaa syötettiin (360 1/h) ja pH säädettiin välille 6,8 - 7,2 lisäämällä 4 N H2SC>4:ää tai 4 N NH4OH:ta. Viljelmän saavuttaessa optisen tiheyden 60 aallonpituudella 600 nm lisättiin 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli- 1,3-dioksolaani-4-metanolia. Sen jälkeen kun täysin oli kulutettu S-enantiomeeri, lisättiin uudestaan 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia. Lopullisessa alkoholissa, joka saatiin, oli R-enantiomeerin enantiomeerinen ylimäärä 0,97. Lopullinen kasvuliemi (5,5 1) sisälsi 47,0 g R-2,2-dimetyyli-l, 3-dioksolaani-4-metanolia.

Esimerkki 9

Kahden litran ravistelupulloja, jotka sisälsivät 500 ml GYMB-kasvualustaa, ympättiin 10 ml:11a kannan Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179,86) 24 tunnin viljelmää, jota oli kasvatettu BHI-kasvualustalla ravistelupullois-sa. Soluja kasvatettiin 48 tuntia 30°C:ssa. Viljelmä indusoitiin inkuboimalla 5 g/1 r,S-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-metanolissa 5,5 tunnin ajan. Sen jälkeen solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja pelletit suspendoi-tiin uudestaan erilaisiin puskureihin, jolloin muodostuivat lopulliset konsentraatiot (alaviite 6) (katso taulukko 5) .

100 ml jokaista suspensiota siirrettiin 500 ml:n valisei-nälliseen ravistelupulloon ja lisättiin eri aikoina R,S- 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia. R- ja S-2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolin konsentraatiot tes- 23 c> n n r 2 tattiin suspension etyyliasetaattiuutteessa. Tämän uuton uuttotulokseksi saatiin 40 %.

Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 5, osoittavat että lepotilassa olevat solususpensiot voivat tuottaa suuria määriä R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia.

24 c»n0i'2 β 0) c 13^1 ” ^

94 o in m co «J

c 5 2m H H H 4J

>-· Ή .¾ 01 «J

Tj CD 0) φ Λ σ\ ocnov ·3 “

οι 'β . . ° οο VD 3 S

S Γπ I « ^ Ψ C ti

§ iViO H O O

,ri ® H ->-l -P +* :nS -H :rd +1 c ·η to · · · · 4J+J4J+1 <3 2 £ ,a s e « n * β H tr» >· · I· I· I· V.-rrt S» (rt 0) m Ή ©fi β fi C 3 1 S ω ui ui cd

04 S -H CD -H UI

_ ^ ^ ^ H M H (d (0 w ^ ,to ur» m -i-i -h 3 “»· άο too min »h β :io c »h Λ « t" <M ON ΙΛΟ C\l CM ΙΛ0Ο :Λ J-ι :id >1 O 3 VO ·* r rr- rr- »» P (1) P >1

rl r* H o O OH OO 00 :<d QjOfl -P

5 2 3 :nj (1) 3 ~ e * ε 2- o σ\ jt im h t— 5 S <M on on on go β <d β .·· “ <3 VO I r- |r I » I» CD CD «— H O O O O Hfl 3 3 H 3 β CO Φ 3 H 3 Ή

,Γ» W ^ ^ ·· -H

M 5 on cn 5 ^ S 3 c ω -, Ä «5 Ό to® j0 j -2 •H 3^0 . , « ΙΛ00 ΙΛ0Ο o S ο 3 0 ~ O 0 00 00 §cg i 9SSS —· +J -rH -U 0 Μ -p -p -h o s- *r 00 a fi -u e cd 30cnmj2 , ,N ,® S 1 3 1 h

ΗΕ-Η S- l~ lr I·· I# (0 M· CD M1 .H

31« O O O O £1 Ή I I -H

• 3 T T -Η β -H -P -P rH

„ βίΟβίΟβο ' j h _ to . · · · 0 co (d -r-« cd β ____ 2 ^ O HH .Β Η Θ m+Jidcdid

2 CA ^ · I I I· I· H Cl H id H 4J

J2 2 <M fi β β fi 3 E Ο ·Η O CD

' ·. (^ w ui o w -P ui E

9 2 I βχβϋ 1 2 2 in on ο <m ή -π ο -π 0 *=*

* * CM ON H 5 « β E -H O H I

23 ·** I»' I* I r I ,-' A (ΟΌΛΌ ·Η

Γ^·Η o O O o T3 :rd (d ^ I 3 I C

' .. ? 0 w φ μ ft-HM ϋη id 'S M Λ O H - β * (d

-X CM t- 00 °° ffl e a ^7 H V T

r: j n-, o _i . ui b ft >1 1 i o

Tj (M I r. I#* I r 1 ,, *0 "H ^ +· ·Η O -H UI

' H ™ 'o ' oT ' -Γ 1 Q Φ Ή <J CD Ή Ή Λί ^ 0 ° °Ε>ι3Ε>ι<0>,0 T.-2 'H -Η >ι·π >. ·Η

>· -Ρ β H CO -Ρ -P TI

rf :2 a a a JOCDOJCHMIffl ΙΟ

m '2 a Ml. ιλΒ w*B 0 β β 4-1 O E E cn-P

c5 0 #Sn« t? r to · — -h p p -h β-n -β e h ροβ m β on β wc noddiDd r-u 3 0) S »n I Ό I I (0 -.?* -μ a» I Ä CM -H (N -H en

-v g ps— - o - -HO

' . . CM 3 eONlfflNHfN >1-P

* * , -P -H I -H I UI I >, -P

T tl ,, *7* 4J § -H Jj ^ M 4J H+IOHUlfiOll 4)3 1,2 -P d ΙΛ φ 3 -P inr CM IA rn CM O m e β — -p - <U ~ CD 3 j 2 ΪΡ^01* T3 u> * *0 r ui · ®0*·υι· 2 051 O* 041 s r^i'd 3 Oi fr- X « T 2 J «1 HS H OO V 4)H β I I β -H β «ΐε 2 O >,· 5.10 >1* β! 05 >,.CD(D β Μ β £ 3 ·· I *l!2- λ«·:3· •‘ϊ· *,:5··ι2η|·3|οΛ*’

» 5α 3 5S3 ..ggSSS^'S

m ., cd o o o Cohn me if\vo 25 f» n n f-'2

Esimerkki 10

Kantaa Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) kasvatettiin 10 litran fermentorissa kuudessa litrassa 5 x konsentroitua GYMB-kasvualustaa. Kasvualustaa sekoitettiin, ilmastettiin (360 1/h), lämpötila pidettiin 30°C:ssa ja pH välillä 6,8 - 7,2. 48 tunnin kasvatuksen jälkeen viljelmää, jonka optinen tiheys oli 30, indusoitiin 5 tuntia inkuboimalla 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli,l,3-dioksolaani-4-metanolia. Solut indusoidusta viljelmästä otettiin talteen sentrifugoimalla. Osa saadusta pelletistä suspendoitiin 1,5 litraan fysiologista suolaliuosta (optinen tiheys 62), jonka pH oli säädetty arvoon 7,5 4 N NaOHtlla. Suspensio siirrettiin 3 litran fermentoriasti-aan ja inkuboitiin 30°C:ssa, sekoitettiin ja ilmastettiin 90 1 ilmaa/tunti. Lisäämällä 1 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia aikaansaatiin hapottuminen. Kahta lisäystä, jotka sisälsivät 4 N NaOH:ta ja vastaavasti 8 M R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia, säädettiin automaattisesti seuraavalla tavalla: lisäykset tapahtuivat samalla nopeudella, jos pH laski alle 7,5 ja pysäh-.. tyivät, jos pH nousi yli 7,5. Prosessi jatkui 99 tuntia.

Sen jälkeen solut painuivat pohjaan ja suspendoitiin uudestaan 1,5 litraan uutta fysiologista suolaliuosta ja R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin ja NaOH:n lisäyksiä säädettiin samalla tavalla kuin edellä ensimmäisen lisäyksen yhteydessä on esitetty, nyt 142 tunnin ajan. Kolmas lisäys tehtiin samoissa olosuhteissa 92 tunnin ajan, paitsi viimeiset 21 tuntia, jolloin ainoastaan NaOH:ta lisättiin sen jälkeen kun pH laski alle 7,5.

Tulokset on esitetty taulukossa 6, ne osoittavat, että lepotilassa olevat solut voivat tuottaa enantiomeerista, puhdasta R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia.

26 Γ;'ΐΠΓ2

Taulukko 6 R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin ja 2,2-dime-tyyli-1,3-dioksolaani-4-karboksyylihapon konsentraatiot ja optiset puhtaudet_ 2,2-dimetyyli- 2.2- dimetyyli- 1,3-dioksolaa- 1.3- dioksolaa- ee ni-4-karbok- kesto ni-4-metanolia (R-muoto) syylihappo lisäys_h_g/1-^ *_q/l·1 *_ 1 99 60,7 0,81 73,5 2 142 38,6 0,90 ei mitattu 3 _92_13,2_0,99_ei mitattu ee = enantiomeerinen ylimäärä 1) 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin konsentraa-tio määritettiin kuten esimerkissä 7.

2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-karboksyylihapon kon-sentraatio määritettiin sen jälkeen kun tämä happo oli kvantitatiivisesti muutettu qlyserolihapoksi. Tämä tehtiin inkuboimalla 1 tunti käymislientä, joka sisälsi 2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani-4-karboksyylihapon, yhdessä HClO^n kanssa. Sentrifugoinnin jälkeen glyserolihapon konsentraatio supernatantissa testattiin, sen jälkeen kun supernatantti oli eluoitu HPLC-kationinvaihtajalla (pylväs: Aminex HPX 87 H Bio-Rad 125-0140).

Esimerkki 11 6 litraa kannan Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) 48 tuntia vanhaa viljelmää saatiin kuten esimerkissä 10 kuvattiin ja sitä inkuboitiin yhdessä 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia 6 tunnin ajan.

27 ft Π f) f'2

Indusoituun viljelmään lisättiin 30 g R,S-2,2-dimetyyli- 1,3-dioksolaani-4-metanolia ja sen jälkeen kun pH oli säädetty arvoon 7,5, kaksi lisäystä, jotka sisälsivät vastaavasti 4 N NaOHsta ja 8 M R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia, suoritettiin joka kerta kun pH meni alle 7,5 kuten esimerkissä 10 esitettiin.

Prosessia jatkettiin 52 tunnin ajan. Lopullinen kasvulie-mi sisälsi 54,4 g/1 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-kar-boksyylihappoa R-isomeerina (ee = 0,92). Hapon konsen-traatio testattiin kuten esimerkissä 10 kuvattiin.

2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-karboksyylihapon enantio-meerisen puhtauden mittaaminen perustui -CH3~signaalien jakaantumiseen hapon NMR-spektrissä ylimäärän R-(+)-l-(l-naftyyli)etyyliamiinia läsnäollessa. Spektrissä esiintyi kaksi metyylisignaalia 1,30 ja 1,15 ppm (johtuen S-enan-tiomeerista) ja kaksi metyylisignaalia esiintyi vastaavasti 1,10 ja 1,05 ppm (johtuen R-enantiomeerista). -CH3-resonanssien jakautuminen S- ja R-2,2-dimetyyli-l,3-diok-solaani-4-karboksyylihappoihin perustuu muutetun R- ja . . S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin suhteeseen.

-CH3~resonanssien tarkka asema voi vaihdella lisätyn ki-raalisen, liuottavan aineen määrän vaikutuksesta.

Esimerkki 12 6 litraa 48 tuntia vanhaa Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) viljelmää saatiin kuten esimerkissä 10 kuvattiin, ja sitä inkuboitiin 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l , 3-dioksolaani-4-metanolin kanssa 6 tunnin ajan.

Sen jälkeen kun inkuboidut solut ja viljelyneste oli ero-: : : tettu sentrifugoimalla ja solut oli suspendoitu uudestaan 28 f- · Π Π f 2 6 litraan fysiologista suolaliuosta, jonka pH oli säädetty arvoon 7,5 ja joka sisälsi 15 g/1 R ,S-2,2-dimetyyli- 1.3- dioksolaani-4-metanolia. Kaksi lisäystä, vastaavasti 4 N NaOH ja 8 M R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-meta-noli, suoritettiin 29 tuntia kestävän ajan kuluessa joka kerta kun pH laski alle 7,5, kuten esimerkissä 10 kuvattiin.

Lopullinen solususpensio sisälsi 27,9 g/1 2,2-dimetyyli- 1.3- dioksolaani-4-karboksyylihappoa enantiomeerisen ylimäärän ollessa 0,88. Hapon konsentraatio ja optinen puhtaus testattiin kuten esimerkissä 11 kuvattiin.

Esimerkki 13

Kahden litran ravistelupullot, jotka sisälsivät 500 ml GYMB-kasvualustaa, ympättiin 10 ml:11a 24 tuntia vanhaa Rhodococcus erythropolis SCL-38-2 (CBS 179.86) viljelmää, jota oli kasvatettu BHI-alustalla ravistelupulloissa. Soluja kasvatettiin 48 tuntia 30°C:ssa. Viljelmä indusoitiin inkuboimalla 5 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaa- 4- metanolin kanssa 6 tuntia.

Solut, jotka olivat alunperin 1 litrasta viljelmää, sus-pendoitiin uudestaan joko 250 ml:aan 1 M MOPS-puskuria (pH = 7,5) tai 250 ml:aan 1 M kaliumfosfaattipuskuria (pH = 7,5). Saadut suspensiot siirrettiin 2 litran väli-seinällisiin ravistelupulloihin ja R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia lisättiin eri ajankohtina. R- ja 5- 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-karboksyylihapon kon-sentraatiot testattiin kuten esimerkissä 11 kuvattiin.

Tulokset on esitetty taulukossa 7 ja ne osoittavat, että lepotilassa oleva solususpensio voi tuottaa suuret määrät R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-karboksyylihappoa.

29 c* η ο Γ 2 α

(D

C

-H

"1 CNJ O

Ή r.

00“ " H

S3 o S , & HO. 'S ' o o ai ta h o o 0) Λ ε ·η 0 Ή •n >ι _ -P >1 _ CO o

c ca on 00 ON

(O Ai 00 I * I ' CO 00 ω λ 1 n P$ (0

Ai bO · ·

rO I e , B

•n^1 (M vO · I · 1 1- ·“ e c O Ή f—1 h c > <0 (0 (0 ro Ή M) · · ai o m “'e e tn tn -p /->00 m · 1 .

>iAi -H V 5 - C C

:rtJ 0 O C H

U] -H -r|

•H Ό M

—I I t- fO

n a) λ; P C > Q. -rl Λ1 , M ^73 * H ,<* , «? CO -n ui ** ’-Γ _

-H G H 3 ° C O

C t0 >iH p, rt -P >1 O 1 O, . . . E-t tu -M tn ! »o fea . to · to ^

Tfl-0 H «SI ONB g c Λ ω «HO HC s ro - i-i I 3 • - (0 fN c ' — 01

rl AI Ό «U -H

003 to· t0 · Q) i-l C

tn n) 3 ^E _B m :t0 to AI -P Q. H ON· 0 * 3 :nj (0 0 tn - c x c m g a

• -H 3 C H fNI (OHO

Ό -P tl) <D rH M

' ?} +J ε >1 a

co -P M

-O-H bO « to · -U C O

•-CrO g EOOJC

1 -P Ή H · H · c C -H

•H -H O - C »HH

Ή :r0 n VO vo no >1 n a) 3 <0 ή

>.:r0 .μ Q) H

P :<3 <β o E O

• ' e H S Ό o ε

ε -H 01 | 4J -H I

::: -n »h a> -p ε -h +» -h -p is O>1(0 UNtUC-PliNO g C ">4 1, .-p -p to >-<η· -h-P »01· toi

M 3Ή O 04 t- A!e> r-H (0 t—- Ai 0) . -H CM

'PO -H Q >1. rd r0 >1 · Qi Q> —

cvi -P -Q tn «* a .'(0 m AI Ή -‘(0 O

I fOC C 01 0101 Mil

t(l|-P Ai O) «ct* -H v- O -r* -H I

'•H c 0. H O. H H ·Ρ O.-1 .W

* I ε -h 01 g φ e*

rn* * · * O

w <d λ I e «as

Esimerkki 14 30 f: η 0 f 2

Kannan Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) ravistelupulloviljelmiä kasvatettiin GYMB-kasvualustalla 48 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 5 g/l:n kanssa R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia 5 tunnin ajan. Muodostuneet viljelmät sentrifugoitiin ja solupel-letit jaettiin neljään osaan. Osat A, B ja C suspendoitiin erikseen fysiologiseen suolaliuokseen, yksi osa D suspendoitiin fysiologiseen suolaliuokseen, joka sisälsi 10 % glyserolia. Suspensio C lyofilisoitiin. Näytteitä A ja C inkuboitiin 28 päivää 4°C:ssa, Bstä ja D:tä -18°C:ssa. Inkuboinnin jälkeen näyte C suspendoitiin uudestaan alkuperäiseen tilavuuteen fysiologista suolaliuosta. Muut suspensiot sulatettiin. Kaikkien saatujen suspensioiden solujen annettiin laskeutua ja ne suspendoitiin uudestaan 100 ml saan 1 M MOPS-puskuria (katso esimerkki 9) pH = 7,5, joka sisälsi 10 g/1 R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaa-ni-4-metanolia. Kaikkien suspensioiden optinen tiheys aallonpituudella 600 nm oli 28. Suspensiot siirrettiin 500 mlsn väliseinällisiin ravistelupulloihin ja inkuboitiin ravistelijassa 30°C:ssa. R-2,2-dimetyyli-l,3-diokso-laani-4-metanolin enantiomeerisen ylimäärän kasvu osoitti, että solut yhä olivat kykeneviä muuttamaan tämän yhdisteen S-enantiomeeria (katso taulukko 8).

Taulukko 8 3i 9009 2 R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin enantiomeeri-nen ylimäärä solususpensioissa, joita on säilytetty eri tavoilla._ säilytys- edelleen R-2,2-dimetyyli-l,3-diok- lämpötila käsittely solaani-4-metanolin ee 12 3 4 tunnin tunnin tunnin tunnin ______________jälkeen T = 4°C - 0,05 0,11 0,16 0,22 T = 4°C lyofilisoitu 0,06 0,10 0,14 0,21 T = -18 °C - 0,03 0 ,08 0,11 0,15 T = -18°C 10% glyse- 0,07 0,15 0,23 0,34 _rolia_

Esimerkki 15

Taulukossa 9 lueteltuja mikro-organismeja kasvatettiin 48 tuntia 30°C:ssa 100 ml:n väliseinäpulloissa, jotka sisälsivät 25 ml GYMB/MOPS-kasvualustaa. Konsentroituun GYMB-kasvualustaan lisättiin MOPS-liuos [3-(morfolino)-propaa-nisulfonihappo], pH 7,0 siten, että 100 mM puskuria saatiin alkuperäiseen GYMB-kasvualustaan.

Kasvaviin viljelmiin lisättiin noin 4,8 g/1 R,S-2,2-di-metyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolia ja viljelmiä inkuboi-tiin edelleen 8, 24 ja 48 tuntia. Jokaisena esitettynä ajankohtana kaksi viljelmää jokaisesta mikro-organismista uutettiin yhtä suurilla tilavuuksilla etyyliasetaattia. Näin toimittaessa 2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-meta-nolin uuttosaanto oli noin 40 % läsnäolevasta aineesta. Jokaisesta viljelmästä uutettu yhdiste derivoitiin erik- 32 11 n n ?· 2 seen ja sen jälkeen analysoitiin kiraali-kompleksointi-pylväässä kuten esimerkissä 5 esitettiin.

Tulokset on esitetty taulukossa 9.

33 0 n n f 2

Taulukko 9

Inkubointiaika 8 h 24 h 48 h

Mikro-organismi g/1* %R %S g/1* %R %S g/1* %R %S

Oorynebacterium spec. T 1300 / CBS 267.87 n.d. n.d. n.d. 1,3 98 2 1,2 100 0

Mycobacrteriun rhodochrous / NCIB 11061 2,3 50 50 1,4 87 13 1,0 100 0

Nocardia aurantia NCIB 9557 0,91 100 0 0,84 100 0 0,47 100 0

Nocardia calcarea NCIB 8863 1,7 76 24 1,2 100 0 0,97 100 0

Nocardia cathaarde T 985 / CBS 268.87 2,0 53 47 n.d. n.d. n.d. 1,0 99 1

Nocardia globerula NCIB 9159 1,7 59 41 1,1 100 0 1,4 100 0

Nocardia ragosa NCIB 8926 2,4 54 46 0<63 99 1 0,54 100 0

Oorynebacterium alkaman ATCC 21194 1,2 82 18 0,32 100 0 0,16 100 0

Oorynebacterium equl A 2362 (CBS 264.87) 2,2 53 47 0,95 99 1 0,86 99 1

Oorynebacterium equl A 2431 (CBS 263.87) 1,4 74 26 0,81 100 0 0,62 100 0

Oorynebacterium hydrocarboclastua ATCC 15108 1,6 61 49 0,83 100 0 0,41 100 0

Oorynebacterium sp. DS 5122 (CBS 265.87) 1,9 56 44 0,90 100 0 0,74 100 0

Nocardia canlcrurla ATCC 31548 0,91 100 0 0,50 100 0 0,27 100 0

Nocardia coralllna ATCC 31338 1,7 59 41 0,85 100 0 0,45 100 0 34 η π Γ) Γ 2

Taulukko 9 (jatk.)

Inkubointiaika 8 h 2¾ h 48 h

Mikro-organismi g/11 XR XS g/11 XR XS g/11 XR XS

Nocardia erythropolis _ Ä Ä T 487 / NCIB 9158 1.7 67 33 0,68 100 0 0,58 100 0

Nocardia erythropolis DSM 743 1,3 95 5 1,1 100 0 0,61 100 0

Nocardia erythropolis , .

ATCC 4277 1,2 98 2 0,84 99 1 0,55 99 1

Nocardia parafflnae . .. _ , NCIB 11277 2,2 53 47 0,86 99 1 0,48 99 1

Nocardia spec. Λ Λ ___Λ DS 5123 (CBS 266.87) M 63 37 0,98 100 0 0,72 100 0

Fhodococcus erythropolis , ,. _ , SCL #-2 / CBS 179.86 1,2 89 11 0,86 99 1 0,61 99 1

Fhodococcus rhodochrous Λ1 , NCIB 9703 1,2 88 12 0,59 99 1 0,24 99 1

Rhodococcue rhodochrous Λ . Λ . Λ , ATCC 21197 2,2 50 50 0,89 99 1 0,60 99 1

Esitettyjä uuttomääriä ei ole korjattu huonosta uutto-saannosta aiheutuneiden menetysten suhteen.

Esimerkki 16

Taulukossa 10 esitettyjä mikro-organismeja kasvatettiin kuten esimerkissä 15 kuvattiin. Kuitenkin R,S-2,2-dime-tyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolin sijasta kasvatettuihin viljelmiin lisättiin nyt noin 2,4 tai 4,8 g/1 R,S-2,2-pentyleeni-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaania (glyseroli-sykloheksanoni-johdannainen). Inkubointi kesti 24 tai 48 tuntia. Uutto, derivointi ja analysointi tapahtuivat kuten esimerkeissä 5 ja 11 esitettiin.

Glyseroli-sykloheksanoni-johdannaisen uuttosaannoksi ar vioitiin 100 %.

35 9 O n Γ 2 2,2-pentyleeni-4-hydroksimetyyli-1,3-dioksolaanin valmis-tus _

Sekoitettua seosta, jossa oli 100 ml (0,96 moolia) syklo-heksanonia, 130 ml (2,08 moolia) glyserolia, 300 ml hek-saania ja 5 g 4-tolueenisulfonihappomonohydraattia, keitettiin palautus jäähdyttäen, samalla siitä kondensoitunutta vesikerrosta erottaen, 20 tunnin ajan. Lisättiin 4 ml trietyyliamiinia, jonka jälkeen seos konsentroitiin tyhjössä ja jäännös ravisteltiin vesi/dietyylieetterin kanssa. Vesikerros uutettiin dietyylieetterillä ja yhdistetyt eetteriuutteet pestiin 30 %:isella natriumkloridil-la, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 153 g:n jäännös. Tämä tyhjötislat-tiin, saatiin 113,6 g otsikossa mainittua yhdistettä.

36 on nr2

Taulukko 10

Mikro-organismi substraattia inkubointi- inkubointi- lisätty g/1 aika 24 h aika 24 h uutet- uutet-

_tu q/1 %R %S tu g/1 %R %S

Corynebacter ium equi A 2431 (CBS 263.87) 4,8 n.d. 3,1 81 19

Nocardia erythro- polis ATCC 4277 2,4 n.d. 0,43 100 0

Rhodococcus equi IFO 03730 2,4 n.d. 1,4* 94 6

Rhodococcus rhodo- chrous NCIB 9703 4,8 1,5 100 0 n.d

Rhodococcus rhodo- chrous ATCC 21197 2,4_n.d._0^5_91 7

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja, paitsi *, joka arvo saatiin yksittäisestä kokeesta.

n.d. = ei määritetty (not determined)

Esimerkki 17

Taulukossa 11 esitettyjä mikro-organismeja kasvatettiin kuten esimerkeissä 15 ja 16 on esitetty. Nyt kasvatettuihin viljelmiin lisättiin 2,2-butyleeni-4-hydroksimetyyli- 1,3-dioksolaania {glyseroli-syklopentanoni- johdannainen). Viljelmiä inkuboitiin edelleen 24 ja 48 tuntia. Uutto, johdannaisen valmistus ja analysointi suoritettiin kuten edellä on esitetty.

37 (,ηΠΓ2

Glyseroli-syklopentanoni-johdannaisen uuttosaannoksi ole tettiin 100 %.

2,2-butyleeni-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaanin valmistus

Seosta, jossa oli 88 ml (1 mooli) syklopentanonia, 140 ml (2,24 moolia) glyserolia, 300 ml heksaania ja 5 g 4-tolu-eenisulfonihappo-monohydraattia, sekoitettiin ja keitettiin palautus jäähdyttäen samalla erottaen kondensoitunutta vesikerrosta 28 tunnin ajan. Jäähdytettiin ja lisättiin 4 ml trietyyliamiinia, jonka jälkeen seos konsentroitiin tyhjössä ja ravisteltiin dietyylieetteri/veden kanssa. Vesikerros uutettiin dietyylieetterillä (3 x) ja yhdistetyt eetteriuutteet pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla ja haihdutettiin, saatiin 117 g:n jäännös. Tämä tyhjötislattiin ja saatiin 105 g otsikossa mainittua yhdistettä.

38 90 nr 2

Taulukko 11

_tu q/1 %R %S tu q/1 %R %S

Corynebacter ium alkanum ATCC 21194 4,8 1,6 88 12 0,66 91 9

Nocardia paraffi- nae NdB 11277 4,8 n.d. 1,6 100 0

Rhodococcus erythro-polis SCL 38-2 / CBS 179.86 2,4 0,57 100 0 n.d.

Rhodococcus rhodo- chrous NCIB 9703 4,8 2,4 99 1 1,8 100 0

Rhodococcus rhodo- chrous ATCC 21197 4,8_n^d._2,3 97 3

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

n.d. = ei määritetty (not determined)

Esimerkki 18

Rhodococcus rhodochrous- kantaa NCIB 9703 ja kantaa ATCC 21197 kasvatettiin kuten esimerkeissä 15 ja 16 on esitetty. Nyt kasvatettuun viljelmään lisättiin 2,2-dietyyli-4-hydroksi-metyyli-1,3-dioksolaania (glyseroli-pentanoni-johdannainen) ja inkuboitiin edelleen 24 tuntia. Uutto, johdannaisen valmistus ja analysointi suoritettiin kuten edellä on esitetty.

Glyseroli-pentanoni-johdannaisen uuttosaannoksi oletet tiin 100 %.

39 0 η η Γ 2

Tulokset on esitetty taulukossa 12.

2,2-dietyleeni-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaanin valmistus_

Sekoitettua seosta, jossa oli 85 ml (0,805 moolia) 3-pen-tanonia, 104 ml (1,68 moolia) glyserolia, 250 ml heksaa-nia ja 4 g 4-tolueenisulfonihappo-monohydraattia, keitettiin palautus jäähdyttäen, samalla kondensoitunutta vesi-kerrosta erottaen, 18 tuntia. Jäähdytettiin, jonka jälkeen lisättiin 4 ml trietyyliamiini ja seos konsentroitiin tyhjössä. Jäännös ravisteltiin dietyylieetteri/veden kanssa. Vesikerros uutettiin kaksi kertaa dietyylieette-rillä (3 x) ja yhdistetyt uutteet pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 48 g:n jäännös. Tämä tyh-jötislattiin, saatiin kaksi fraktiota 11,50 g ja 6,12 g, otsikossa mainittua yhdistettä.

40 <· n n f 2

Taulukko 12

Mikro-organismi substraattia inkubointi- lisätty g/1 aika 24 h

g/1 %R %S

______uutettu_

Rhodococcus rhodochrous NCIB 9703 2,4 0,8 100 0 4,8 2,2 100 0

Rhodococcus rhodochrous ATCC 21197_2jA_1^5_70 30

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

Esimerkki 19

Kantoja Corynebacterium equi A 2431, CBS 263. 87, spec.

DC 5122, CBS 265,87 ja Nocardia spec. DS 5123, CBS 266.87 kasvatettiin kuten edellä esimerkeissä 15 ja 16 on esitetty. Nyt kasvatettaviin viljelmiin lisättiin 2,4 g/1 4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaania (glyseroli-formaldehydi- johdannainen) . Sen jälkeen viljelmiä inkuboitiin 6 tuntia. Sitten solut erotettiin kasvuliemestä sentrifu-goimalla ja supernatantti eluoitiin Exterlyt-3-pylväässä (Merck nro 15372). Sen jälkeen pylväs eluoitiin etyyliasetaatilla GC-analyysiä varten. Uuttosaannon, käytettäessä tätä menetelmää, oletetaan olevan 50 %.

Tulokset on esitetty taulukossa 13.

41 o n Q C 2

Taulukko 13 GC-analyysi

Mikro-organismi g/1 %R %S

_uutettu_

Corynebacterium egui A 2431 / CBS 263.87 0,22 68 32

Corynebacterium spec.

DS 5122 / CBS 265.87 0,15 82 18

Nocardia spec. PS 5123_0,035 100_0_ (R,S)-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaanin valmistus_

Mekaanisesti sekoitettua seosta, jossa oli 104 g (0,78 moolia) (R,S)-2,2-dimetyyli-4-hydroksimetyyli-l,3-diok-solaania, 500 ml bentseeniä, 86 g (1,53 moolia) jauhettua kaliumhydroksidia ja 175 ml (1,52 moolia) bentsyyliklori-dia, keitettiin palautusjäähdyttäen 17 tuntia, samalla kondensoitunutta vesikerrosta erottaen (14 ml vettä erottui). Seos jäähdytettiin, jonka jälkeen se pestiin vedellä, 1 M natriumvetykarbonaattiliuoksella ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 287 g raakaa bentsyylieetteriä. Tätä sekoitettiin 1,5 tuntia seoksen kanssa, jossa oli 300 ml metanolia, 100 ml vettä ja 20 ml 36 %:ista kloori-vetyhappoa. Seuraavaksi seos neutraloitiin noin 10 g:lla natriumhydroksidia vedessä ja konsentroitiin tyhjössä. Jäännös uutettiin dietyylieetterillä ja uute kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 163 g:n jäännös. Tämä puhdistettiin piihappogeelil-lä, saatiin 118 g (R,S)-3-bentsyylioksi-propaani-l,2-diolia.

18,2 g (0,1 moolia) tätä sekoitettiin 50 ml:n kanssa hek-saania, 10 g:n kanssa para-formaldehydiä ja 0,5 g:n kans- 42 Ci n n f 2 sa paratolueenisulfonihappomonohydraattia ja sekoitettiin ja keitettiin palautus jäähdyttäen 4 tuntia samalla kondensoitunutta vesikerrosta erottaen. Jäähdytettiin, jonka jälkeen seos pestiin 1 M natriumvetykarbonaatti-liuoksel-la ja suolaliuoksella, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 17,78 g (R,S)-4-bentsyylioksimetyyli-l,3-diokso-laania. Tämä sekoitettiin 100 ml:n kanssa dietyylieette-riä ja 1,5 g:n kanssa 10 %:ista palladium/hiili-kataly-saattoria ja sekoitettiin vetyatmosfäärissä 4 tuntia. Seuraavaksi katalysaattori suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin ja puhdistettiin piihappogeelillä dietyyli-eetterillä, saatiin 8,07 g otsikossa mainittua yhdistettä .

Esimerkki 20

Kantoja Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) ja Rhodococcus rhodochrous ATCC 21197 kasvatettiin 48 tuntia kuten edellä on kuvattu (katso esimerkki 15). Eräisiin kasvatettuihin viljelmiin lisättiin noin 4,8 g/1 R,S,- 2.2- dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolia ja inkuboitiin edelleen noin 5 tuntia, entsymaattisen aktiivisuuden in-dusoimiseksi, joka tavallisesti vastaa R,S-2,2-dimetyyli- 1.3- dioksolaani-4-metanolin resoluutiosta. Sen jälkeen indusoidusta viljelmästä otettiin solut talteen sentrifu-goimalla, pestiin 100 mM:la MOPS-puskuria pH 7,0 ja kerättiin kaksi kertaa konsentroimalla 100 mM:ssa samaa puskuria ja 25 ml:n näytteet laitettiin 100 ml:n välisei-näpulloihin. Suspensioihin lisättiin noin 5,0 g/1 R,S- 2,2-pentyleeni-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaania (glyse-roli-sykloheksanoni-johdannainen) ja niitä inkuboitiin edelleen yön yli 30°C:ssa. Sen jälkeen suspensiot uutettiin ja analysoitiin kuten edellä on esitetty (katso esimerkki 15 ja 16). Tulokset, jotka on esitetty taulukossa 14, osoittavat, että indusoidut solut ovat kykeneviä 43 ο Π f]f 2 muuttamaan stereospesifisesti glyseroli-syklo-heksanoni-johdannaisen, kun taas ei-indusoidut solut eivät vaikuta tai vaikuttavat ainoastaan hyvin hitaasti yhdisteeseen. Kontrollikokeessa, jossa ei-indusoidut solut oli myös suspendoitu ja niitä inkuboitiin kahden mainitun yhdisteen kanssa, osoitti että mitään pilkkoutumista (degradation) ei tapahtunut.

44 C: Π Π f 2

Taulukko 14

Mikro- Olosuhteet Substraatti organismi dimetyyli- sykloheksanoni- johdannainen johdannainen (1) (2) g/1 %R %S g/1 %R %S uutettu uutettu

Normaali-koe (3) inkubointi-aika

Rhodococcus t = 5h 1,4 57 43 erythropolis SCL 38-2 t = 24h 0,96 100 0 5,4 51 49 CBS 179,86

Indusoidut solut puskurissa. Inku-bointi yön yli. 0,90 100 0 3,2 81 19

Normaali- koe (3) inkubointi- aika

Rhodococcus t = 5h 2,2 52 48 rhodochrous 25 ATOC 21197 t = 24h 1,1 100 0 6,9 52 48

Indusoidut solut puskurissa. Inku-bointi yön yli. 0,61 100 0 4,1 76 24 o n f)(·' ? 45 ' · -

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

(1) dimetyylijohdannainen = R,S-2,2-dimetyyli-l,3-diokso-laani-4-metanoli. Uuttosaannoksi on oletettu noin 40 %. Uuttomääriä ei ole korjattu huonosta uuttosaannosta johtuvien menetysten suhteen.

(2) sykloheksanonijohdannainen = R,S-2,2-pentyleeni-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaani. Uuttosaannoksi on oletettu noin 100 %.

(3) Normaalikoe on menetelmä, jota käytettiin esimerkeissä 15 ja 16.

Esimerkki 21

Samanlainen koe, joka esitettiin esimerkissä 20, suoritettiin kannalla Nocardia canicruria ATCC 31548, jossa solut indusoitiin R,S-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolilla suspendoituna MOPS-puskuriin. Nyt kuitenkin erotettava substraatti, joka lisättiin suspensioihin, oli R,S-2,2-dietyyli-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaani (gly-seroli-pentanoni-johdannainen). Tämän kokeen tulos on esitetty taulukossa 15. (Sama kontrollikoe, joka on kuvattu esimerkissä 20, on suoritettu myös käyttäen tätä substraattia).

46 e. ΠΠί'2

Taulukko 15

Mikro- Olosuhteet Substraatti organismi dimetyyli- pentanoni- johdannainen johdannainen (1) (2) g/1 %R %S g/1 %R %S uutettu uutettu

Normaali-koe (3) inkubointi-aika

Nocardia t = 5h 1,3 72 28 canicruria ATCC 31548 t = 24h n.d.(4) n.d. n.d. 6,6 47 53

Indusoidut solut puskurissa. Inku-bointi yön yli. 0,75 100 0 3,7 85 15

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

(1) dimetyylijohdannainen = R,S-2,2-dimetyyli-l,3-diokso-laani-4-metanoli. Uuttosaannoksi on oletettu noin 40 %. Uutettuihin määriin ei ole suoritettu korjausta menetyksistä, jotka aiheutuvat huonosta uuttosaannoksesta.

(2) pentanonijohdannainen = R,S-dietyyli-4-hydroksimetyy-li-1,3-dioksolääni (3) Normaalikoe on menetelmä, jota on käytetty esimerkissä 15 ja 16.

47 es n n f 2 (4) n.d. = ei määritetty (not determined) tässä tietyssä kokeessa.

Esimerkki 22

Kantoja Corynebacterium equi (CBS 263.87) ja Rhodococcus equi (IFO 0370) kasvatettiin kuten edellä esimerkissä 15 ja 16 on kuvattu. Nyt kasvatettuihin viljelmiin lisättiin 2,4 g/1 asymmetristä yhdistettä 2-metyyli-2-isobutyyli-4-hydroksimetyyli-1,3-dioksolaania (glyserolimetyyli-isobu-tyyliketonijohdannainen). Viljelmiä inkuboitiin edelleen 48 tuntia. Sen jälkeen uutto suoritettiin käyttäen me-tyylitrikloridia ja näytteet valmistettiin NMR-analyysiä varten. NMR:llä voitiin erottaa neljä enantiomeeria ja suhteet enantiomeerien välillä voitiin määrittää. Kahdesta R-isomeerista (t.s. R-johdannaisen glyseroliosan C2sn konfiguraatiosta) peräisin olevat signaalit voitiin nimetä käyttämällä vertailuaineena glyserolimetyyli-iso-butyyliketonijohdannaista, joka oli syntetisoitu R-2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolista.

Tulokset on esitetty taulukossa 16.

Tämä esimerkki osoittaa, että asymmetriset johdannaiset voidaan myös erottaa.

48 anrK'2

Taulukko 16

Mikro-organismi erilaisten esiintyvien enantiomeerinen prosenttiosuus g/1 R*/.. S*/.. R*/.. S*/..

_uutettu %_%_%_%

Corynebacterium equi / CBS 263.87 1,1 39 0 46 15

Rhodococcus equi IFO 03730_1,8 35 2_35 28

Esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

* Neljän enantiomeerin (R/R, R/S, S/R ja S/S) ensimmäinen R tai S tarkoittaa johdannaisen glyseroliosan C2:ta. Sitä, mikä signaali oli peräisin R/R-enantiomeerista ja mikä R/S-enantiomeerista, ei määritetty.

R,S-2-metyyli-2-isobutyyli-4-hydroksimetyyli-l,3-diokso-laanin valmistus_

Seosta, jossa oli 65 ml (0,517 moolia) metyyli-isobutyy-liketonia, 200 ml heksaania, 70 ml (1,12 moolia) glyserolia ja 3 g 4-tolueenisulfonihappomonohydraattia, sekoitettiin ja keitettiin palautus jäähdyttäen, samalla kondensoitunutta vesikerrosta erottaen, 48 tunnin ajan. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin trietyyliamiinia (4 ml) ja seos haihdutettiin tyhjössä ja ravisteltiin dietyyli-eetteri/veden kanssa. Vesikerros uutettiin (2 x) dietyy-lieetterillä ja yhdistetyt eetteriuutteet pestiin vedellä ja suolaliuoksella, kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 70 g:n jäännös. Tämä tyhjötislattiin, saatiin 62 g otsikossa mainittua yhdistettä.

49 ?n oi 2 2-metyyli-2-isobutyyli-4-(R)-hydroksimetyyli-l,3-diokso-laanin valmistus_

Sekoitettua seosta, jossa oli 5,48 ml (41,5 mmoolia) (R)-(-)-2,2-dimetyyli-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaania (ee = 0,9), 50 ml bentseeniä, 4,6 g jauhettua kaliumhyd-roksidia ja 10 ml bentsyylikloridia, keitettiin palautus-jäähdyttäen molekyyliseulan 4Ä päällä 23 tuntia. Seos jäähdytettiin, jonka jälkeen se pestiin vedellä, 1 M nat-riumvetykarbonaatilla ja suolaliuoksella, suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännöstä sekoitettiin seoksen kanssa, jossa oli 15 ml metanolia, 5 ml vettä ja 1 ml 36 %:ista kloorivetyhappoa, 1 1/2 tunnin ajan. Seuraavaksi seos neutraloitiin natriumhydroksidilla, haihdutettiin ja uutettiin dietyylieetterillä. Uute kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 9,40 g öljyä. Tämä puhdistettiin piihappogeelillä, saatiin 6,59 g (S)-3-bentsyylioksi-propaani-l,2-diolia.

Seosta, jossa oli 0,4 g tätä yhdistettä, 10 ml bentseeniä, 1 ml metyyli-isobutyyliketonia ja 30 mg para-toluee-nisulfonihappoa, keitettiin palautus jäähdyttäen 18 tuntia molekyyliseulan 4Ä päällä. Jäähdytettiin, jonka jälkeen lisättiin trietyyliamiinia (50 ml) ja seos pestiin vedellä, suodatettiin ja haihdutettiin. Jäännös sekoitettiin 10 mis n kanssa dietyylieetteriä, 0,1 ml:n kanssa trietyyliamiinia ja 0,2 g:n kanssa 10 %:ista palladium/hiili-ka-talysaattoria ja sekoitettiin vetyatmosfäärissä 12 tuntia. Seos suodatettiin ja suodos haihdutettiin, saatiin 0,34 g otsikossa mainittua yhdistettä, kontaminoituneena bentsyylieetterillä.

50 ° π Π Γ 2

Esimerkki 23

Kantaa Nocardia paraffinae NCIB 11277 kasvatettiin kuten edellä esimerkissä 15 ja 16 on esitetty. Nyt viljelmään lisättiin 2,4 g/1 asymmetristä yhdistettä 2-metyyli-4-hydroksimetyyli-1,3-dioksolaania (glyseroli-asetaldehydi-johdannainen) ja inkuboitiin edelleen 15 tuntia. Sen jälkeen solut erotettiin liemestä sentrifugoimalla ja super-natantti eluoitiin Exterlyt-3-pylväässä. Sen jälkeen pylväs eluoitiin etyyliasetaatilla GC-analyysiä varten, jolla neljä enantiomeeria voitiin erottaa. Käyttäen tätä menetelmää noin 80 % lisätystä substraatista saatiin uutettua. Kuten esimerkissä 22 R-isomeerit (t.s. johdannaisen glyseroliosan C2:n konfiguraation R) voitiin nimetä käyttäen vertailuyhdisteenä R-2,2-dimetyyli-1,3-dioksolaani-4-metanolista syntetisoitua glyseroli-asetaldehydi-johdannaista.

Tulos on esitetty taulukossa 17.

Kuten esimerkissä 22 myös tämä tulos osoittaa, että asymmetriset johdannaiset voidaan erottaa.

R,S-2-metyyli-4-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaanin (rasee-minen asetaldehydijohdannainen) valmistus_

Seosta, jossa oli 70 ml para-asetaldehydiä, 400 ml hek-saania, 200 ml glyserolia ja 5,4 g para-tolueenisulfoni-happomonohydraattia, sekoitettiin ja keitettiin palautus-jäähdyttäen 3 x 24 tuntia, samalla kondensoituvaa vesi-kerrosta erottaen. Jäähdytettiin, jonka jälkeen lisättiin trietyyliamiinia (5 ml) ja seos konsentroitiin tyhjössä ja jäännös tyhjötislattiin (65-84°c/l,5-3 mmHg), saatiin 129,74 g otsikossa mainitun yhdisteen ja 2-metyyli-5-hyd-roksi-l,3-dioksolaanin seosta.

51 °fiOf 2

Noin 50 g tätä kromatografoitiin kaksi kertaa piihappo-geelillä, eluointiaineena dietyylieetteri, saatiin 9,45 g raseemista, otsikossa mainittua yhdistettä kontaminoituneena 7,5 %:lla 2-metyyli-5-hydroksi-l,3-dioksolaania.

2-metyyli-4-(R)-hydroksimetyyli-l,3-dioksolaanin (R-aset-aldehydijohdannainen) valmistus__

Seosta, jossa oli 0,47 g (2,58 mmoolia) (S)-3-bentsyyli-oksi-propaani-l,2-diolia, 10 ml heksaania, 0,4 ml para-asetaldehydiä ja 15 mg para-tolueenisulfonihappomonohyd-raattia, sekoitettiin ja keitettiin palautusjäähdyttäen

O

molekyyliseulan 4a päällä 1,5 tuntia. Jäähdyttämisen jälkeen lisättiin tippa trietyyliamiinia ja seos pestiin vedellä, suodatettiin ja haihdutettiin.

Jäännös sekoitettiin 10 ml:n kanssa dietyylieetteriä ja 0,15 g:n kanssa 10 %:ista palladium/hiili-katalysaattoria ja sekoitettiin vetyätmosfäärissä 3 tuntia. Seos suodatettiin ja haihdutettiin, saatiin 195 mg otsikossa mainittua yhdistettä.

Taulukko 17 52 «nnr 2

Mikro-organismi erilaisten esiintyvien enantiomeerinen prosenttiosuus g/1 R*/.. S*/.. R*/.. S*/., uutettu % % % % _(1) (2) (2) (2) (2)

Nocardia paraffinae NCIB 11277_0,2 61 9_30 0

Kaikki esitetyt arvot ovat kahden rinnakkaiskokeen tulosten keskiarvoja.

(1) Ei korjattu talteenotettaessa tapahtuneita menetyksiä.

(2) Neljän enantiomeerin (R/R, R/S, S/R ja S/S) ensimmäinen R tai S koskee johdannaisen glyseroliosan C2:ta. Sitä, mikä GC-piikki on peräisin R/R-enantiomeerista ja mikä R/S-enantiomeerista, ei ole määritetty.

Claims

53 9 Π 092

1. Menetelmä 2,2-R,,R2-l,3-dioksolaani-4-metanolin valmistamiseksi rikastettuna E~isomeerinä, jossa R, ja R2 tarkoittavat vetyä tai alkyyliryhmiä, jotka sisältävät vähemmän kuin 6 hiiliatomia ja jotka mahdollisesti ovat haarautuneita, tai jossa R, ja Rj yhdessä hiiliatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, muodostavat karbosyk-lisen renkaan, joka sisältää vähemmän kuin 8 hiiliatomia, tunnettu siitä, että R- ja S-2,2-R,,R|-l, 3-dioksolaani-4-metanolin seos saatetaan alttiiksi mikro-organismin, joka on bakteeri, hiiva tai sieni, tai siitä peräisin olevien entsyymien vaikutukselle, joilla on kyky stereoselek-tiivisesti kuluttaa S-2,2-R,,R2-l,3-dioksolaani-4-metano-lia, sellaisen ajanjakson ajan, että S-2,2-R,,R2-l,3-diok-solaani-4-metanoli seoksessa on kulutettu ja saadaan 2,2-Ri,R2—1,3-dioksolaani-4-metanoli rikastettuna R-iso-meerin suhteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ajanjakso on sellainen, että ainakin 90 % S-2,2-Rj,R2-1,3-dioksolaani-4-metanolista kulutetaan.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan olennaisesti puhdasta R-2,2—Rj ,Rj,—1,3—dioksolaani—4—metanolia.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R, ja R2 ovat samanlaiset.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Rt ja Rj ovat H tai 1-3 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai ne yhdessä hiiliatomin kanssa, johon ne ovat liittyneet, muodostavat karbosyklisen, 5 tai 6 hiiliatomia sisältävän renkaan.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, 54 9 η n f 2 tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on bakteeri, mieluimmin sukuun Nocardia, sukuun Rhodococcus, sukuun Corynebacterium tai sukuun Mycobacterium kuuluva.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty mikro-organismi on Rhodococcus egui, mieluimmin Rhodococcus egui NCIB 12035 tai Rhodococcus egui (IFO 03730), tai Rhodococcus rhodochrous, mieluimmin Rhodococcus rhodochrous (NCIB 9703) tai Rhodococcus rhodochrous (ATCC 21197), tai Rhodococcus erythropolis, mieluimmin Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) Rhodococcus erythropolis SCL 38-2R (CBS 180.86) tai Rhodococcus erythropolis SCL 38-2S (CBS 181.86).

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty mikro-organismi on Corynebacterium egui, mieluimmin Corynebacterium egui A 2362 (CBS 264.87) tai Corynebacterium egui A 2431 (CBS 263.87), tai Corynebacterium alkanum (ATCC 21194), Corynebacterium hydrocar-boclastus (ATCC 15108), tai Corynebacterium sp. DS 5122 (CBS 265.87) tai Corynebacterium sp. T 1300 (CBS 267.87).

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty mikro-organismi on Nocardia erythropolis, mieluimmin Nocardia erythropolis T 487 (NCIB 9158), Nocardia erythropolis (DSM 743) tai Nocardia erythropolis (ATCC 4277), tai Nocardia corallina (ATCC 31338), Nocardia canicruria (ATCC 31548), Nocardia paraf-finae (NCIB 11277), Nocardia spec. DS 5123 (CBS 266.87), Nocardia aurantia (NCIB 9557), Nocardia calcarea (NCIB 8863), Nocardia cathaarde Y 985 (CBS 268.87), Nocardia globerula (NCIB 9159), tai Nocardia ragosa (NCIB 8926).

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty mikro-organismi on Mycobacterium rhodochrous (NCIB 11061). 55 90ΠΓ2

11. Minkä tahansa edellä esitettyjen patenttivaatimuksien mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että S-2,2-R, ,R2-l, 3-dioksolaani-4-metanoli muutetaan olennaisesti R-2,2-R,,R2- 1,3-dioksolaani-4-karboksyylihapoksi.

12. Mikro-organismit, tunnetut siitä, että ne ovat Rhodococcus erythropolis SCL 38-2 (CBS 179.86) Rhodococcus erythropolis SCL 38-2R (CBS 180.86) Rhodococcus erythropolis SCL 38-2S (CBS 181.86) Corynebacterium equi A 2362 (CBS 264.87) Corynebacterium equi A 2431 (CBS 263.87) Corynebacterium sp. DS 5122 (CBS 265.87) Nocardia spec. DS 5123 (CBS 266.87) Corynebacterium sp. T 1300 (CBS 267.87) ja Nocardia cathaarde T 985 (CBS 268.87).

13. Patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä valmistetun R-2,2-dimetyyli-l,3-dioksolaani-4-metanolin käyttö menetelmässä metoprololin valmistamiseksi rikastettuna g-isomeerin suhteen.