JPS6251590B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、耐熱性グルコキナーゼの製造法に関
するものである。 近時、酵素は、酵素反応の特徴である反応、基
質、光学の各特異性にすぐれている点などが注目
され、医療分析、食品分析等に広く触媒として利
用されている。なかでも、体液中のグルコースの
含有量の測定は、臨床検査の面で重要であること
はよく知られている。また、食品中のグルコース
の含有量の分析も転化糖工業の分野などで重要な
検査項目となつている。このような成分を分析す
るにさいし、近年、グルコキナーゼを用いる方法
が、すでに述べたとおり、酵素の非常にすぐれた
反応、基質、光学の各特異性の利点から広く利用
されている。この点でグルコキナーゼは重要な酵
素である。 酵素を用いる微量分析法には、上記の利点があ
る一方、一般に酵素は非常に不安定で、室温以下
で数日から数週間のうちに、触媒活性を失うのが
通例であり、それゆえ、この不安定性が、酵素を
用いる微量成分分析における大きな障害となつて
いる。従来、知られているグルコキナーゼも同様
不安定であつたが、その中でただ一例として、エ
フイービエス（FEBS）レターズ37巻、213頁、
1973年に記載されているグルコキナーゼは耐熱性
細菌バチルス・ステアロサーモフイルスより得ら
れたもので、熱安定性および長期安定性を有して
いる。 しかしながら、このグルコキナーゼは、菌体内
酵素であるため、酵素精製工程の第一段階で培養
した菌体を遠心分離等で集菌し、その後、超音波
処理や物理的な破壊方法にて菌体より酵素を抽出
することが必要である。この工程は細菌の比重が
小さいため、集菌に時間を労したりまた、バチル
ス属に属する細菌は比較的細胞壁が固いため、破
壊が不充分で酵素の抽出効率が低いなどの欠点が
あり、工業的な大規模生産には適さなかつた。 そこで、本発明者らは耐熱性グルコキナーゼの
工業的な大規模生産を可能にするために、細胞が
沈降しやすく、かつ細胞壁が破壊されやすい好熱
性細菌を求めて、広く自然界よりスクリーニング
を行なつた結果、諸性質からバチルス・ステアロ
サーモフイラスに属すると考えられるが、細胞が
極端に伸長し、バージエイズ・マニユアル・オブ
デイタミネイテイブ・バクテリオロジーに記載さ
れている通常のバチルス・ステアロサーモフイラ
スよりも数倍〜数十倍大きな細胞を持つ新菌株を
発見し、この新菌株が耐熱性グルコキナーゼを産
出し、しかも細胞が沈降しやすく、かつ細胞壁が
破壊されやすい好熱性細菌であることを見い出
し、本発明に到達した。 すなわち、本発明はバチルス・ステアロサーモ
フイラスに属するUK788株を培養し、得られた
培養物から耐熱性グルコキナーゼを採取すること
を特徴とする耐熱性グルコキナーゼの製造法であ
る。 本発明に用いる菌株の菌学的性質を示す。この
菌学的性質の検討には、マニユアル・オブ・マイ
クロバイオロジカル・メソツズ（Manual of
Microbiological Methods：Society of American
Bacteriologists、Mc Graw−Hill Book
Company）、微生物の分類と同定（長谷川武治編
著、東京大学出版会）および培地学各論（坂崎利
一著、納谷書店）に記載されている方法、培地組
成を用いた。また、寒天培地の場合には、寒天を
３％（重量）加えた。 〔形態的所見〕 60℃、24時間培養。 １ 細胞の形および大きさ：著しい長桿状、糸
状。0.8〜1.2×10〜百数十ミクロン、時に数百
ミクロンを超すこともある。 ２ 多形性：なし。 ３ 運動性：なし。 ４ 胞子：円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは
先端に形成する。胞子のうはふくれない。 ５ グラム染色：陽性。 ６ 抗酸性：なし。 〔生育状態〕 60℃、24時間培養。 １ 肉汁寒天板培養。 形 状：円形。 周 縁：波状。 隆 起：扁平。 光 沢：なし。 表 面：粗雑。 色 調：半透明。 ２ 肉汁寒天斜面培養。 生育度：良好。 形 状：糸状。 ３ 肉汁液体培養。 表面生育：わずかに菌環を形成する。 濁 度：混濁。 沈 渣：少量。 着色、脱色：なし。 ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養。 ゼラチン30％添加、60℃で適時培養した後、
冷却して固化状態を判定：ゼラチン液化。 ５ 肉汁寒天穿刺培養。 形 状：念珠状。 表面生育：良好。 ６ リトマス、ミルク リトマス退色PH6.0、ミルクは固化された後
液化される。 〔生理学的性質〕 60℃、１〜２日培養。 １ 硝酸塩の還元：あり。 ２ 脱窒反応：陰性。 ３ MRテスト：陽性。 ４ VPテスト：陽性。 ５ インドールの生成：なし。 ６ 硫化水素の生成：なし。 ７ デンプンの加水分解：あり。 ８ クエン酸の利用：なし。 ９ 硝酸塩の利用：あり。 10 アンモニウム塩の利用：あり。 11 色素の生成：なし。 12 ウレアーゼ活性：なし。 13 オキシダーゼ活性：あり。 14 カタラーゼ活性：あり。 15 生育PH：5.0〜8.5。 至適PH：6.0〜7.5。 16 生育温度：40〜70℃ 至適温度：50〜63℃ 17 酵素に対する態度： 好気的で良く生育するが、嫌気下でも弱い生
育が見られる。 18 Ｏ−Ｆテスト：陰性。 19 フエニルアラニンの脱アミノ反応：陰性。 20 塩化ナトリウムの耐性： ５％では生育するが、７％では生育できな
い。 21 ビタミン要求性：なし。 22 チロジンの分解性：なし。 〔炭素源からの酸およびガスの生成〕 60℃１〜２日培養。 酸 ガス １ Ｌ−アラビノース − − ２ Ｄ−キシロース ＋ − ３ Ｄ−グルコース ＋ − ４ Ｄ−マンノース ＋ − ５ Ｄ−フラクトース ＋ − ６ Ｄ−ガラクトース − − ７ 麦芽糖 ＋ − ８ シヨ糖 − − ９ 乳 糖 − − 10 トレハロース ＋ − 11 Ｄ−ソルビツト − − 12 Ｄ−マンニツト − − 13 イノシツト − − 14 グリセリン − − 15 デンプン − − 以上の菌学的性質から、バージイのマニユアル
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版（Bergey′s Manral of Determinbtive
Bacteriology 8ed.）に基づき検索した結果、バ
チルス・ステアロサーモフイラス（Becillus
Stearothermophilus）に大略一致した。そこでバ
チルス・ステアロサーモフイラスの標準菌株、
IAM11001、11002、11003、11004（以上東京大
学応用微生物研究所保管株）IFO12550（財団法
人発酵研究所保管株）との対比を行つたところ、
２、３の生理学的性質において、上記標準菌株と
異なつており、特に第１表および第１図の写真か
ら明らかなように、細胞の大きさにおいて明確な
差を有している。 本発明において、第１図の写真は、本発明に用
いる菌株と標準菌株バチルス・ステアロサーモフ
イラスIAM11001とを60℃、24時間寒天斜面培養
したときの細胞の顕微鏡写真（150倍）であつ
て、線状に大きく伸長してみえる細胞が本発明に
用いる菌株で、点短桿状にみえる細胞が標準菌株
である。 本発明に用いる菌株は、標準菌株に比べ、著し
く伸長した細胞を持ち、前記のバージイズ・マニ
ユアルおよび種々の報文にも巨大に伸長した細胞
を持つバチルス・ステアロサーモフイラスの記載
はまつたく見られないことから、本発明に用いる
菌株は、まつたく新しい菌株と考えられるので、
バチルス・ステアロサーモフイラスUK788と命
名し、昭和54年８月10日に通産省工業技術院微生
物工業研究所へ寄託した。その微生物受託番号は
微工研菌寄第5141号である。

【表】 細胞の大きさを示す。
本発明に用いるUK788株を培養するに際して
用いられる培地としては、細菌の一般的培地であ
ればよく、特に液体培地を用いることが好まし
い。この培地の栄養源において炭素源として、た
とえば、グルコース、シユークロス、フルクトー
ス、殿粉加水分解物、糖密、亜硫酸パルプ廃液の
糖類酢酸。乳酸等の有機酸類、さらにはUK788
株が資化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸およ
びグリセリン等が使用でき、窒素源として、たと
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、尿素、アンモニア、硝酸塩アミ
ノ酸ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機ま
たは有機物が使用できる。さらに無機塩類とし
て、たとえばカリウム、ナトリウム、リン酸亜
鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシウ
ム、コバルト等の各塩類、必要に応じて微量金属
塩、コーン・ステープ・リカー、ビタミン類、核
酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄養源が使
用できる。これらの培地を用いて、UK788株を
20℃〜80℃、好ましくは40℃〜70℃最適には50℃
〜63℃で約２〜６時間、好気的に培養すればよ
い。この場合、回分培養法および連続培養法のど
ちらでも耐熱性グルコキナーゼを含有した菌体を
得ることができるが、回分培養法の場合には対数
増殖後期まで培養することが好ましくまた連続培
養法の場合には、物質環境型連続培養法（ケモス
タツト：ハルベルト、エルスワース、テリング、
ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ミクロバイオロ
ジー、14巻、８号、601〜622頁、1956年）で行な
い、希釈率（発酵槽に培地液を供給する速度およ
び同時に発酵槽より抜出す速度を発酵槽中の培養
液量で割つた値）をUK788株の最大比増殖速度
付近に制御しながら培養すれば耐熱性グルコキナ
ーゼ含有量の高い菌体を得ることができるので好
ましい。 次に得られた培養物から耐熱性グルコキナーゼ
を単離精製するには、まず得られた培養物から、
たとえば遠心分離や濾過などで菌体を集菌し、次
いで集菌した菌体を常法、すなわち菌体を破砕
後、遠心分離して得られた上澄に有機溶媒または
各種の塩類を加えて分画精製したり、担体に吸着
させて精製するなどの方法で行なうことができ
る。 これらの一例として、菌体を２倍量の50ｍＭリ
ン酸緩衝液（PH7.5）に懸濁し、フレンチプレス
を用いて細胞を充分に破壊した後、遠心分離によ
り細胞片を除去し、グルコキナーゼを含む粗抽液
を得る。この粗抽出液に3.2％の硫酸プロタミン
水溶液500mlを添加し、充分撹拌したのち、生じ
た沈殿を遠心分離で除去して、プリタミン上清を
得、この上清に固形硫酸アンモニウムを除々に加
えて50％飽和（４℃）とし、生成した沈殿を遠心
分離により集め、再び50ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.5）に溶解し、ついで20倍量の50ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.5）に対して透析、脱塩する。次に、
あらかじめ50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.5）で平衡
化したDEAE−セルロースカラムに上記の粗酵素
液を通じ、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた溶
液で溶出せしめると、塩化カリウム濃度0.13Mの
近くで目的のグルコキナーゼが溶出する。この区
分を集め、濃縮、脱塩後、さらに10ｍＭリン酸緩
衝液（PH7.5）で平衡化したヒドロキシアパタイ
トカウムに、その溶出液を通じ、10ｍＭリン酸緩
衝液から300ｍＭリン酸緩衝液の直線濃度勾配の
溶出を行なうと、120ｍＭ濃度近くに目的のグル
コキナーゼが溶出する。この活性区分を濃縮後、
50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）を溶出液に
用いたセフアデツクスＧ−100カラムクロマトグ
ラフイーにより分画する方法をあげることができ
る。 その方法に従つて精製を行ない、得られた結晶
の作用機構および物理化学的性質をバチルス・ス
テアロサーモフイラスの他の菌株から得られた標
品と比較検討したところ、前記エフイービーエス
（FEBS）レターズ37巻、212頁、1973年に記載さ
れている耐熱性グルコキナーゼとまつたく同一で
あつた。 本発明によつて培養収穫した菌体の集菌は非常
に容易で、遠心分離する場合には8000G、10分間
を要していたのが、その約1/5の時間で行なうこ
とができ、従来実行不可能であつた濾材による濾
過で集菌が可能となり、この面でのメリツトも測
りしれないものがある。また、菌体の破壊も従来
10KHzの超音波を出力200Wで15分間照射してい
たのが、その約1/5の時間で同程度にまで破壊す
ることができ、工業的に耐熱性グルコキナーゼを
生産するうえで、大きな利点がある。 次に本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例１、比較例１ グルコース２ｇ、（NH₄）₂SO₄2ｇ、酵母エキス
（デイフイコ製）１ｇ、KH₂PO₄1ｇ、Na₂HPO₄・
12H₂O1ｇ、MgSO₄・7H₂O0.1ｇを水道水１に
溶解した培地100mlを、500ml容三角フラスコに入
れ綿栓後、10分間加圧蒸気殺菌（121℃、１気
圧）した。次に培地を50℃に冷却後、同組成の寒
天斜面培地に生育したバチルス・ステアロサーモ
フイラスUK788（微工研菌寄第5141号）株を植
菌し、55℃で回転振盪培養（高崎製作所
RGRNo.2型180rpm）を開始した。約５時間で菌
の増殖が対数増殖後期となつたので、培養を中止
し、8000G2分間遠心分離を行なつて菌体を集菌
した。この時の菌体は６ｇ湿菌体／であつた。
この湿菌体１ｇを20mlの0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.0）に懸濁し、超音波破砕機（久保田商事、
200M型）を用いて破砕した時の漏出蛋白量を測
定した。また、比較のため、バチルス・ステアロ
サーモフイラスIAM11001株（比較例１）を用い
る以外は実施例１と同様に行なつた。 その結果を第２図に示す。 なお、第２図は超音波処理時間と蛋白漏出量と
の関係を示したもので、曲線Ａが実施例１、曲線
Ｂが比較例１である。第２図から明らかなように
実施例１で用いた菌体は比較例１で用いた菌体の
約1/5の処理時間で菌体が破砕され、菌体中の蛋
白質が漏出した。なお、蛋白質の定量にはビウレ
ツト法（Gornall A.G.、等、ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー177、751頁、1949
年）を用いた。 次に超音波処理によつて得られた菌体破砕液の
耐熱性グルコキナーゼ含有量を測定したところ、
9.5U／ｇ湿菌体（0.12U／mg蛋白）であり、比較
例１から得られた耐熱性グルコキナーゼ含有量と
ほぼ同じであつた。 実施例 ２ 実施例１と同様にして500ml容三角フラスコで
培養を行なつた後、三角フラスコ10本分の培養液
を同組成の培地20を入れ、あらかじめ加圧蒸気
殺菌（121℃、１気圧、15分）した30容ジヤー
フアーメンター（丸葵理化装置、MSJ−Ｕ型、平
羽根タービン式）に接種した。通気量20／分、
回転数400rpm、温度60℃で培養を開始したとこ
ろ、直ちに菌の生育が見られ、増殖に伴いPHの低
下が起こつたので4N−NaOHにてPH6.5に調整し
つつ３時間培養したところ、対数増殖後期に達し
たので培養を中止し、8000G、２分間遠心分離を
行なつて湿菌体120ｇを得た。湿菌体の耐熱性グ
ルコキナーゼ含有量を実施例１と同様にして測定
したところ、10.3U／ｇ湿菌体（0.13U／mg蛋
白）であつた。 実施例 ３ 実施例２と同様にして、30容ジヤーフアーメ
ンターで回分培養を行ない、対数増殖後期に達し
培養液中の残存グルコース濃度が0.01重量％以下
になつた時、実施例１と同組成の新らしい栄養培
地を24／時間の速度で定量ポンプを用いて供給
し、同時に同速度でジヤーフアーメンターより培
養液を抜出すことで希釈率を菌の最大比増殖速度
付近に設定した物質環境型連続培養法を実施し
た。このときの培養温度は60℃で、PH6.8〜7.0
（4N NaOHで自動調整）、通気量20／分回転数
600rpmとし、発泡が見られたので、消泡剤（信
越化学KM−70）を加えた。約４時間の連続培養
を行なつた結果、連続培養開始時の菌体濃度5.8
ｇ湿菌体／（0.75ｇ乾燥菌体／）が定常的に
保たれ、96の発酵液より、遠心分離によつて
550ｇの湿菌体を得た。このようにして得た菌体
中の耐熱性グルコキナーゼ含有量を測定したとこ
ろ、12.8U／ｇ湿菌体（0.16U／mg蛋白）であ
り、連続培養法によつて収穫した菌体は単位菌体
あたりの耐熱性グルコキナーゼ含有量が回分法で
の菌体と比べて高くなつている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に用いる菌株と標準菌株バチル
ス・ステアロサーモフイラスIAM11001とを60
℃、24時間寒天斜面培養したときの細胞の顕微鏡
写真（150倍）で、第２図は超音波処理と蛋白漏
出量との関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス・ステアロサーモフイラスに属する
   UK788株を培養し、得られた培養物から耐熱性
   グルコキナーゼを採取することを特徴とする耐熱
   性グルコキナーゼの製造法。 ２ 回分法で対数増殖後期まで培養する特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。 ３ 希釈率を最大比増殖速度付近に設定して連続
   培養する特許請求の範囲第１項記載の製造法。