JPS6312593B2

JPS6312593B2 -

Info

Publication number: JPS6312593B2
Application number: JP9486880A
Authority: JP
Inventors: Masao Kageyama; Hiroshi Nakajima; Kazuhiko Nagata; Toyohiko Suga; Tadao Suzuki; Kenzo Motosugi
Original assignee: Shingijutsu Kaihatsu Jigyodan
Current assignee: Shingijutsu Kaihatsu Jigyodan
Priority date: 1980-07-10
Filing date: 1980-07-10
Publication date: 1988-03-19
Also published as: JPS5718981A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規なバチルス・ステアロサーモフ
イラス（Bacillus stearothermophilus）UK788
菌株に関するものである。一般に細菌は酵母やカビなどに比べると、細胞
が小さいため培養後菌体を集菌することがむずか
しく、濾過で菌体を集めることが困難で、遠心分
離で集菌することが一般である。しかし、遠心分
離では菌体の直径の２乗に比例するので（石油発
酵、102頁、幸書房）培養液から細菌菌体を回収
することは、酵母などと比べるとコスト高であ
り、工業生産上不利である。ダニエル、I.C.ワン
によれば、酵母の回収費を１とした場合、細菌の
回収費は3.8になると試算されている（ケミカ
ル・エンジニアリング誌、15巻、99頁、1968年）。
そのため、菌体の回収については、種々の方法が
考えだされており、例えば、塩化第二鉄、塩化カ
ルシウム、高分子凝集剤などの凝集剤を用いて凝
集させる方法やPHを強酸性や強アルカリ性にした
り、または加熱するなどによつて細菌蛋白質を変
性させて集菌しやすくするなどの方法をあげるこ
とができる。しかし、これらの方法は菌体を目的
生産物としない場合は有効であるが、菌体そのも
のや菌体内成分を目的生産物とする場合は、凝集
剤が製品中に混入したり、または菌体内成分の変
性が起こるため、適当な方法とは言えない。一
方、バルチス属に属する細菌は比較的細胞壁が固
いため、破壊が不充分で菌体内成分の抽出効率が
低いなどの欠点があつた。そこで、本発明者らはこのような集菌操作の不
利な面を解決するために、細胞が沈降しやすく、
かつ細胞壁が破壊されやすい好熱性細菌を求め
て、平板希釈培養法により広く自然界を対象にス
クリーニングを行なつた結果、諸性質からバルチ
ス・ステアロサーモフイラスに属すると考えられ
るが、細胞が極端に伸長し、バージエイズ・マニ
ユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオ
ロジーに記載されている通常のバルチス・ステア
ロサーモフイラスよりも数倍〜数十倍大きな細胞
を持つ新菌株を京都府宇治市小倉町の堆肥中より
発見し、この新菌株は細胞が沈降しやすく、かつ
細胞壁が破壊されやすい好熱性細菌であることを
見い出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、バルチス・ステアロサー
モフイラス（Bacillus stearothermophilus）に
属し、10ミクロン以上の細胞の長さを有し、標準
菌株バルチス・ステアロサーモフイラス
IAM11001株と比べて菌体内成分の流出しやすい
UK788菌株である。本発明の菌株の菌学的性質を示す。この菌学的
性質の検討には、マニユアル・オブ・マイケロバ
イオロジカル・メソツズ（Manual of
Microbiological Methods；Society of
American Bacteriologists、Mc Graw―Hill
Book Compamy）、微生物の分類と同定（長谷
川武治編著、東京大学出版会）および培地学各論
（坂崎利一著、納谷書店）に記載されている方法、
培地組成を用いた。また、寒天培地の場合には、
寒天を３％（重量）加えた。〔形態的所見〕 60℃、24時間培養１細胞の形および大きさ；著しい長桿状、糸
状。0.8〜1.2×10〜百数十ミクロン、時に数
百ミクロンを超すこともある。２多形性；なし。３運動性；なし。４胞子；円筒形の内生胞子を細胞中央ないしは
先端に形成する。胞子のうはふくれない。５グラム染色；陽性。６抗酸性；なし。〔生育状態〕 60℃、24時間培養。１肉汁寒天平板培養。形状；円形。周縁；波状。降起；扁平。光沢；なし。表面；粗雑。色調；半透明。２肉汁寒天斜面培養。生育度；良好。形状；糸状。３肉汁液体培養。表面生育；わずかに菌環を形成する。濁度；混濁。沈渣；少量。着色、脱色；なし。４肉汁ゼラチン穿刺培養。ゼラチン30％添加、60℃で適時培養した後、
冷却して固化状態を判定；ゼラチン液化。５肉汁寒天穿刺培養。形状；念珠状。表面生育；良好。６リトマス、ミルクリトマス退色PH6.0、ミルクは固化された後
液化される。〔生理学的性質〕 60℃、１〜２日培養。１硝酸塩の還元；あり。２脱窒反応；陰性。３ MRテスト；陽性。４ VPテスト；陽性。５インドールの生成；なし。６硫化水素の生成；なし。７デンプンの加水分解；あり。８クエン酸の利用；なし。９硝酸塩の利用；あり。 10 アンモニウム塩の利用；あり。 11 色素の生成；なし。 12 ウレアーゼ活性；なし。 13 オキシダーゼ活性；あり。 14 カタラーゼ活性；あり。 15 生育PH；5.0〜8.5。至適PH；6.0〜7.5。 16 生育温度；40〜70℃。至適温度；50〜63℃。 17 酸素に対する態度；好気的で良く生育するが、嫌気下でも弱い生
育が見られる。 18 Ｏ―Ｆテスト；陰性。 19 フエニルアラニンの脱アミノ反応；陰性。 20 塩化ナトリウムの耐性；５％では生育するが、７％では生育できな
い。 21 ビタミン要求性；なし。 22 チロジンの分解性；なし。〔炭素源からの酸およびガスの生成〕 60℃、１
〜２日培養。酸ガス１Ｌ―アラビノース − − ２Ｄ―キシロース＋ − ３Ｄ―グルコース＋ − ４Ｄ―マンノース＋ − ５Ｄ―フラクトース＋ − ６Ｄ―ガラクトース − − ７麦芽糖＋ − ８シヨ糖 − − ９乳糖 − − 10 トレハロース＋ − 11 Ｄ―ソルビツト − − 12 Ｄ―マンニツト − − 13 イノシツト − − 14 グリセリン − − 15 デンプン − − 以上の菌学的性質から、バージイのマニユアル
オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー第
８版（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology 8ed.）に基づき検索した結果、バ
ルチス・ステアロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）に大略一致した。そこでバ
ルチス・ステアロサーモフイラスの標準菌株、
TAM 11001、11002、11003、11004（以上東京大
学応用微生物研究所保管株）、IFO12550（財団法
人発酵研究所保管株）との対比を行つたところ、
２、３の生理学的性質において、上記標準菌株と
異なつており、特に第１表および第１図の写真か
ら明らかなように、細胞の大きさにおいて明確な
差を有している。本発明において、第１図の写真は、本発明の菌
株と標準菌株バルチス・ステアロサーモフイラス
IAM11001とを60℃、24時間寒天斜面培養したと
きの細胞の顕微鏡写真（150倍）であつて、線状
に大きく伸長してみえる細胞が本発明の菌株で、
点短桿状にみえる細胞が標準菌株である。本発明の菌株は、標準菌株に比べ、著しく伸長
した細胞を持ち、前記のバージイズ・マニユアル
および種々の報文にも巨大に伸長した細胞を持つ
バルチス・ステアロサーモフイラスの記載はまつ
たく見られないことから、本発明の菌株は、まつ
たく新しい菌株と考えられるので、バルチス・ス
テアロサーモフイラスUK788と命名し、昭和54
年８月10日に通産省工業技術院微生物工業研究所
へ寄託した。その微生物受託番号は微工研菌寄第
5141号である。【表】の細胞の大きさを示す。
本発明のUK788株を培養するに際して用いら
れる培地としては、細菌の一般的培地であればよ
く、特に液体培地を用いることが好ましい。この
培地の栄養源において炭素源として、例えば、グ
ルコース、シユークロス、フルクトース、殿粉加
水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等の糖類、酢
酸、乳酸等の有機酸類、さらにはUK788株が資
化しうるアルコール類、油脂、脂肪酸およびグリ
セリン等が使用でき、窒素源として、例えば硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、尿素、アンモニア、硝酸塩アミノ酸、ペ
プトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有
機物が使用できる。さらに無機塩類として、例え
ばカリウム、ナトリウム、リン酸亜鉛、鉄、マグ
ネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト
等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン、
ステーブ・リカー、ビタミン類、核酸等を使用し
てもよく、細菌の一般的栄養源が使用できる。こ
れらの培地を用いて、UK788株を20℃〜80℃、
好ましくは40℃〜70℃、最適には50℃〜63℃で約
２〜６時間、好気的に培養すればよい。この場
合、回分培養法および連続培養法のどちらでも菌
体を得ることができる。本発明の菌株を用いて取得する菌体内成分とし
ては、例えば、糖類、蛋白質、脂質、核酸、ビタ
ミン等をあげることができる。また、蛋白質のう
ち有用なものとして、例えば、酵素、補酵素類を
あげることができ、これらのうち、アセテートキ
ナーゼ、ATPエース、DNAポリメラーゼ、エノ
ラーゼ、グルコキナーゼ、ベターガラクトシダー
ゼ、グルコースイソメラーゼ、ラクテートデヒド
ロゲナーゼ、ミオキナーゼ、６―フオスフオグル
コネートデヒドロゲナーゼ、フオスフオグリセレ
イトキナーゼ、ポリヌクレオチドフオスフオリラ
ーゼ、ピルベートキナーゼ、スーパーオキシドデ
イスミーテースなどは試薬として有望である。本発明のUK788株の培養物から菌体を集菌す
るのは非常に容易で、遠心分離する場合には標準
菌株IAM11001が8000G10分間要していたのが、
その約１／５の時間で行うことができ、一方、従
来実行不可能であつた濾材による濾過でも集菌が
可能になるなど、この面でのメリツトも測りしれ
ないものがある。また菌体の破壊も従来10KHz
の超音波を出力200Wで15分間照射していたのが、
その約１／５の時間で同程度にまで破壊すること
ができ工業的に大きな利点がある。次に本発明を実施例により具体的に説明する。実施例１、比較例１グルコース2g、（NH₄）₂SO₄2g、酵母エキス
（デイフイコ製）1g、KH₂PO₄1g、Na₂HPO₄・
12H₂O1g、MgSO₄・7H₂O0.1gを水道水１に溶
解した培地100mlを、500ml容三角フラスコに入れ
綿栓後、10分間加圧蒸気殺菌（121℃、１気圧）
した。次に培地を50℃に冷却後、同組成の寒天斜
面培地に生育したバルチス・ステアロサーモフイ
ラスUK788（微工研菌寄第5141号）株を植菌し、
55℃で回転振盪培養（高崎製作所RGRNo.２型
180rpm）を開始した。約５時間で菌の増殖が対
数増殖後期となつたので、培養を中止し、
8000G、２分間遠心分離（トミー製作所RS71型）
を行つて菌体を集菌し、回収率を求めるととも
に、こうして得られた湿菌体1gを20mlの0.1Mリ
ン酸緩衡液（PH7.0）に懸濁し、超音破砕機（久
保田商事、200M型）を用いて破砕した時の漏出
蛋白量を測定した。また、比較のため、バルチ
ス・ステアロサーモフイラスIAM11001株（比較
例１）を用いる以外は実施例１と同様に行つた。その結果、UK788株を用いた場合、遠心分離
の回収率は98％であるのに対し、比較例１の
IAM11001株を用いた場合は42％であり、UK788
株の方が容易に培養液から回収されることが確認
された。また、第２図は超音波処理時間と蛋白漏
出量との関係を示したもので、曲線Ａが実施例
１、曲線Ｂが比較例１である。第２図から明らか
なように実施例１で用いた菌体は比較例１で用い
た菌体の約１／５の処理時間で菌体が破砕され、
菌体中の蛋白質が漏出した。なお、蛋白質の定量
にはビウレツト法（Gornall、A.G.、等、ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー177、
751頁、1949年）を用いた。実施例２実施例１と同様にして500ml容三角フラスコで
培養を行つた後、三角フラスコ10本分の培養液を
同組成の培地20を入れ、あらかじめ加圧蒸気殺
菌（121℃、１気圧、15分）した30容ジヤーフ
アーメンター（丸菱理化装置、MSJ―Ｕ型、平
羽根タービン式）に接種した。通気量20／回、
回転数400rpm、温度60℃で培養を開始したとこ
ろ、直ちに菌の生育が見られ、増殖に伴いPHの低
下が起こつたので4N―NaOHにてPH6.5に調整し
つつ３時間培養したところ、対数増殖後期に達し
たので培養を中止し、8000G、２分間の連続遠心
分離（アルフア；ラバル製LAPX202型）を行つ
た所、回収率97％で菌体が回収され、湿菌体
120gを得た。また、この湿菌体を用いて、実施
例１と同様にして超音波処理時間と菌体内蛋白質
の漏出量との相関を検討した所、３分間の処理で
相対比90％の蛋白質が漏出し、ベンチスケールで
の培養によつても、本発明の菌株が遠心分離され
やすく、かつ菌体がこわれやすい特質が失なわれ
ないことが確認された。実施例３実施例２で得られた湿菌体20gを200mlの0.1モ
ルリン酸緩衡液（PH7.5）に懸濁後、超音波破壊
機にて３分間処理し菌体破壊液を作成した。この
溶液を遠心分離（8000G、２分）し、菌体残渣を
除き、上澄液202mlを得た。これを４℃に保冷し
ながら硫酸プロタミン1.2gを加えて沈殿した核酸
を遠心分離により除き、次に硫酸アンモニウムを
75％飽和になるよう加えた所、塩析効果により蛋
白質が沈殿したので遠心分離によつて回収した。
この蛋白沈殿を上述のリン酸緩衡液20mlに溶解
後、セロフアン膜を用いて２の同上リン酸緩衡
液に対し４時間透析、脱塩を行つた。次にDEAE
セルロースカラムクロマトグラフイー、ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフイー、ウルト
ロゲルカラムクロマトグラフイーを行つて（ジヤ
ーナルオブ・バイオケミストリー84巻、１号、
193〜203頁、1978年）、アセチルキナーゼ、ATP
エースの分画精製を行つた。その結果、電気泳動
的に純粋なアセチルキナーゼ0.82mg、ATPエー
ス0.32mgが得られ、本発明の菌体は菌体内酵素の
良い供給源となることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の菌株と標準菌株バルチス・ス
テアロサーモフイラスIAM11001とを60℃、24時
間寒天斜面培養したときの細胞の顕微鏡写真
（150倍）で、第２図は超音波処理と蛋白漏出量と
の関係を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１バチルス・ステアロサーモフイラス
（Bacillus stearothermophilus）に属し、10ミ
クロン以上の細胞の長さを有し、標準菌株バチル
ス・ステアロサーモフイラスIAM11001株と比べ
て菌体内成分の流出しやすいUK788菌株。２菌体内成分が蛋白質である特許請求の範囲第
１項記載のUK788菌株。３蛋白質が酵素である特許請求の範囲第２項記
載のUK788菌株。