WO2000063354A1

WO2000063354A1 - Nouveau gene amidase

Info

Publication number: WO2000063354A1
Application number: PCT/JP2000/002492
Authority: WO
Inventors: Tetsuji Nakamura; Fujio Yu
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2000-10-26
Also published as: EP1174499A4; EP1174499A1; US6617139B1; DE60042364D1; JP4094232B2; EP1174499B1

Description

明細書新規なアミダーゼ遺伝子

技術分野

本発明は、 α—アミノ酸アミド及び α —ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダ一ゼ活性を有する新規なタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。

背景技術

微生物あるいは微生物由来の酵素を α—アミノ酸アミド及び α —ヒドロキシ酸ァミドの加水分解触媒として用いることにより、光学活性な α—アミノ酸や α _ ヒドロキシ酸を製造できることが知られている。例えば、光学活性な α—ァミノ酸については、特開昭 6 1— 2 9 3 3 9 4号公報、特開昭 6 2— 5 5 0 9 7号公報、光学活性な α—ヒドロキシ酸については、特開平 2— 8 4 1 9 8号公報等が挙げられる。

発明の開示

遺伝子組換えの方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子は、菌体内に多コピ一存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させることができる。

本発明者らは、より高い触媒活性を有する微生物触媒を調製する目的で、 α— アミノ酸アミド及び α —ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

( 1 ) 以下の（a ) 又は（b ) のタンパク質。

( a ) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質。

( b ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列において 1個若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、 α—アミノ酸アミド及び α —ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するァミダ一ゼ活性を有する (2) ( 1 ) 記載のタンパク質をコードする遺伝子。

(3) 配列番号 2で表される塩基配列を含む、（2) 記載の遺伝子。

( 4 )配列番号 2で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイプリダイズし、且つ、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダ一ゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

(5) (2) 〜（4)のいずれか 1つに記載の遺伝子をベクターに連結した組換えベクター。

(6) (5) 記載の組換えベクターを宿主微生物に導入した形質転換体。

(7) (6)記載の形質転換体を培養することを含む、アミダ一ゼ活性を有するタンパク質を産生させる方法。

上記形質転換体を培養して得られるアミダ一ゼ活性を有するタンパク質は、 α —アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性 α—アミノ酸を、また、 α—ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性 α—ヒド口キシ酸を製造することができる。

本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第 11 - 109328号の明細書及び Ζ又は図面に記載される内容を包含する。

図面の簡単な説明

図 1は、 p L A 002の制限酵素地図を示す。

図 2は、 p LA 002から p LA 205に至るプラスミド作製過程を示す。図 3は、 p L A 205の制限酵素地図を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明を詳細に説明する。

1. 本発明のタンパク質及び遺伝子

本発明のタンパク質は、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する。このようなアミダーゼ活性により、本発明のタンパク質は、 α—アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性 α— アミノ酸を、また、 α—ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性ひーヒドロキシ酸を製造することができる。前記 α—アミノ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは t e r t —口イシンアミドである。前記 α—アミノ酸アミドが t e r t—ロイシンアミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのは D体又は L体の t e r t 一口イシン、好ましくは L— t e r t —口イシンである。前記 α—ヒドロキシ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは乳酸アミドである。前記 α—ヒドロキシ酸アミドが乳酸アミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのは D体又は L体の乳酸、好ましくは L一乳酸である。従って、上記アミダ一ゼ活性は、好ましくは t e r t—ロイシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性であり、より好ましくは t e r t —口イシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解して、それぞれ L— t e r t—ロイシン及び L一乳酸を生成させるアミダーゼ活性である。

また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は配列番号 1で表される配列に限定されるものではなく、上記アミダ一ゼ活性を有する限り、該アミノ酸配列において 1又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加等の変異が生じていてもよい。変異するアミノ酸の数は特に制限されないが、好ましくは 1〜 3 0個、より好ましくは 1〜数個、最も好ましくは 1〜 3個である。

上記のような本発明のタンパク質は、ぺプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする D N Aを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。この遺伝子組換え技術では、例えば、以下に詳述するように、本発明の遺伝子を含む組換えプラスミド（組換えベクター）で形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のタンパク質を調製することができる。

本発明の遺伝子は、上記の本発明のタンパク質をコードするものである。従つて、その塩基配列は特定の配列に限定されるものではないが、好ましくは配列番号 1で表されるァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列、より好ましくは配列番号 2 で表される塩基配列である。本明細書中で用いられる「遺伝子」という用語は、遺伝情報をコードする核酸を意味する。該核酸は D N Aであっても R N Aであつてもよいが、好ましくは D N Aである。

本発明の遺伝子は、化学的合成法、 P C R法又は当該塩基配列を有する遺伝子断片をプローブとして用いるハイプリダイゼーシヨン法によって得ることができる。このような化学的合成法、 P C R法及びハイブリダィゼ一シヨン法は、当業者に公知の方法によって行うことができる。 P C R法及びハイブリダィゼーション法では、本発明の遺伝子を有する微生物（本発明における D N A供与体微生物）から得られる D N Aライブラリーを用いることができる。該微生物は特定の属又は種に限定されるものではないが、例えば、前記特開昭 6 2— 5 5 0 9 7号公報記載のェンテロバクタ一 ' クロアツセィ (Entero¾acter cloacae) N— 7 9 0 1 株（F E R M B P— 8 7 3 ; 1985年 8月 16日付；工業技術院生命工学工業技術研究所，日本国茨城県つくば市東 1— 1一 3 ) を挙げることができる。その菌学的性質は同公報に記載されている。上記 P C R法は、例えば、上記 D N Aライブラリーを錡型とし、配列番号 2を参照して設計した適切なプライマーを用いて行うことができる。 P C R法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。上記ハイブリダィゼーシヨン法は、例えば、上記 D N Aライブラリ一に対し、配列番号 2で表される塩基配列を有するプローブをハイプリダイズさせることにより行うことができる。ハイブリダィゼ一シヨン法としては、当業者に公知の方法、例えば、コロニーハイブリダィゼーシヨン法、プラークハイブリダィゼーシヨン法等が挙げられる。このときのハイブリダィズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。このようなストリンジェントな条件は、例えば、コロニー又はプラーク由来の D N Aを固定化したフィルタ一を用いて、 0. 5〜1Mの NaCl存在下 42〜68°Cで（又は 50%ホルムアミド存在下 42°Cで、又は水溶液中 65〜68°Cで）ハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.：!〜 2倍濃度の SS C(saline-sodium citrate)溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成： 150mM 塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム）を用いて室温〜 68°Cでフィルタ一を洗浄することにより達成することができる。ハイブリダイゼーション法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。化学的合成法としては、核酸の合成法として知られる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。化学的合成法によれば、所望の塩基配列を有する遺伝子を得ることが可能である。なお、配列番号 2で表される塩基配列を有する D N Aを含むプラスミド p L A 2 0 5で形質転換したェシェリシァ ' コリ J M 1 0 9株（E. coli JM109/pLA 205) は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日木国茨城県つくば市東 1 一 1 — 3 ) に、 1 9 9 9年 1月 2 6日付けで国際寄託されている（F E R M B P— 7 1 3 2 )。従って、配列番号 2で表される塩基配列を有する本発明の遺伝子（D N A ) は、この菌株に含まれるプラスミド p L A 2 0 5から得ることができ、その他の本発明の遺伝子も、部位特異的変異誘発法 (Nucleic Acids Res. 10, 6487 - 6500, 1982)によって得ることができる。

さらに、本発明の遺伝子は、配列番号 2で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイブリダィズし、且つ、 α —アミノ酸アミド及び一ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するァミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記ハイブリダィズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。ストリンジェントな条件は、例えば、 0.5 〜1Μの NaCl存在下 42〜68°Cで（又は 50%ホルムアミド存在下 42°Cで、又は水溶液中 65〜68°Cで）ハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0.：！〜 2倍濃度の SS C(saline-sodium citrate)溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成： 150mM 塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム）を用いて室温〜 68°Cでフィルタ一を洗浄することにより達成することができる。

さらに、本発明の遺伝子は、配列番号 2で表される塩基配列と少なくとも 90% 以上、好ましくは 95%以上、さらに好ましくは 98%以上の相同性を有し、且つ、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するァミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアである D N A S I S (日立ソフトウェアェンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメ一タは、デフォルトの設定（初期設定）とする。

上記のような、配列番号 1以外のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号 2以外の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質が上記アミダーゼ活性を有するか否かは、例えば、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有するェシエリシァ ' コリ JM 1 09株を上記アミダーゼ活性について試験することにより確認することができる。形質転換体の作製については後に詳述する。また、形質転換された上記菌株は、培養した後に菌を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の 5 OmM KH₂P0₄— Na₂HP0₄緩衝液（p H8.0) で 2回洗浄した後、 50m 1の前記緩衝液に懸濁して菌体懸濁液としておく。

上記のアミダ一ゼ活性についての試験は、 2重量。/。一アミノ酸アミド又は 2 重量％α—ヒドロキシ酸アミドを含む上記緩衝液 0.5m 1、上記緩衝液 0.3m 1及び上記菌体懸濁液 0.2m 1からなる反応液を 40°Cで 1時間振とうし、その上清を光学分割カラムを備えた H PLCにより分析して、対応する光学活性 α—アミノ酸又は光学活性 α—ヒドロキシ酸が検出されるかどうかを調べることにより行うことができる。上記ひ一アミノ酸アミドとしては所望のものを用いることができる、好ましくはラセミ体 t e r t—ロイシンアミドを用い、その場合の上記光学活性 ct—アミノ酸は D体又は L体の t e r t—ロイシン、好ましくは L— t e r t一口イシンとなる。上記 α—ヒドロキシ酸アミドとしては所望のものを用いることができる力好ましくはラセミ体乳酸アミドを用い、その場合の上記光学活性 —ヒドロキシ酸は D体又は L体の乳酸、好ましくは L一乳酸となる。 2. 組換えべクタ一及び形質転換体

( 1 ) 組換えベクターの作製

本発明の組換えベクターは、適当なベクタ一に本発明の遺伝子（DNA) を連結（挿入）することにより作製することができる。

本発明の遺伝子を挿入するためのベクタ一は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド DNAは、大腸菌、ァグロパクテリゥム等の微生物からアルカリ抽出法（Birnboim，H. C. and Doly, J. 1979. Nucleic Acid Res. 7: 1513)又はその変法により調製することができる。また、市販のプラスミドベクタ一として、例えば、 pBluescript II SK+ (Stratagene社）、 pUC18、 pUC19、 pUC118、 pUC 119 (宝酒造社）、 GEX4T-1 (Pharmacia社）等を用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフエニコ —ル耐性遺伝子等が含まれていることが好ましい。ファージベクターとしては、例えば、 gtll. M13mpl8、 M13mpl9等が挙げられる。

ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製された DNAを適当な制限酵素で消化し、適当なベクター DN Aの制限酵素部位又はマルチクロー二ングサイトに挿入してベクターに連結することができる。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば、揷入すべき DNAの具体的な塩基配列に従って適切に行うことができる。

また、本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるように、すなわち発現可能なようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクタ一には、プロモーター及び本発明の遺伝子のほか、ターミネータ一、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば適切に行うことができる。

(2) 形質転換体の作製

本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによリ得ることができる。

宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、細菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、大腸菌 (Escherichia coli) 等のエツシェリシァ属に属する細菌、及びバチルス · ズブチリス (Bachillus subtilis) 等のバチルス属に属する細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロミセス ' セレビシェ (S_accharom_yces cerevisiae) 力挙げられる。上記エツシエリシァ ' コリとしては、特に、 JM 1 09株、 C 600株、 I F O 330 1株等が好ましい。

大腸菌等の細菌を宿主とする場合には、本発明の組換えベクターは、該宿主中で自律複製可能であると同時に、プロモータ一、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。プロモータ一としては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば、 Trpプロモーター、 lacプロモータ一、 PLプロモーター、 PRプロモーターなどの、大腸菌又はファージに由来するプロモーターを用いることができる。本発明の組換えベクターはさらに、プロモータ一を制御する遺伝子を含んでもよい。細菌への本発明の組換えベクターの導入方法としては、細菌に DN Aを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、カルシウムィオンを用いる方法（Pro Natl. Acad. Sci.， USA 69: 2110-2114, 1972)等が挙げられる。

酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、 YEpl3、 Y Ep24、 YCp50等が用いられる。この場合に使用するプロモータ一としては、酵母中で発現できるものであればよく、特に限定されないが、例えば、 gallプロモ一タ一、 gallOプロモータ一、ヒートショックタンパク質プロモータ一、 MFalプロモータ一等が挙げられる。

酵母への本発明の組換えべクタ一の導入方法としては、酵母に DNAを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、エレクトロボレ一シヨン（Methods. Enzymol. , 194: 182-187, 1990)、スフエロプラスト法（Ρ roc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1929-1933, 1978)、酢酸リチウム法（ bact eriol. , 153: 163-168， 1983) 等が挙げられる。

なお、配列番号 2で表される塩基配列を有する DNAを含むプラスミド p LA 205で形質転換したェシエリシァ ' コリ J M 1 09株（E. coli JM109/pLA 205) は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1一 1 一 3) に、 1 99 9年 1月 26日付けで国際寄託されている（F E RM B P— 7 1 32)。

3. 本発明のタンパク質（アミダーゼ）の生産

本発明のタンパク質（アミダ一ゼ）は、上述のようにして作製した形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することができる。

本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法によって行われる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよレ、。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類、及び又はエタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸ァンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニゥム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカ一等が用いられる。

無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

微生物を宿主として得られた形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約 2 8 °Cで 4 8〜 6 0時間行う。培養期間中、 pHは 7. 0〜7. 5に保持する。 pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に加えてもよい。

プロモーターとして誘導性プロモータ—を有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてィンデュ一サ一を培地に添加してもよい。例えば、 Lacプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、ィソプロピル一 β—D—チォガラクトシルビラノシド（IPTG)等を、 Τ rpプロモータ一を有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、ィンドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

培養後、本発明のタンパク質を培養物から採取する。該タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕等することにより、該タンパク質を採取することができる。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用して、又は遠心分離等によリ菌体若しくは細胞を除去した後に、該酵素を採取することができる。該酵素の採取は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニゥム沈殿、ァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を、単独で又は適宜組合せて用いることにより行うことができる。

以上のようにして得られたタンパク質が上記ァミダーゼ活性を有することの確認は、一般的な酵素化学反応、 S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動法、抗原抗体反応等の免疫学的方法などにより行うことができる。以下、実施例として、ェンテロパクター ' クロアツセィ N— 790 1株のァミダーゼ遺伝子のェシェリシァ ' コリ JM 1 09株へのクローニングについて示す。

実施例 1

( 1 ) ェンテロパクター ' クロアツセィ N— 790 1染色体 DNAの調製と DN Aライブラリ一の作製：

Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)参照) の方法によリエンテロパクター 'クロアツセィ N— 790 1株の染色体 DN Aを分離し、これを制限酵素 S a u 3 A Iで部分分解後、常法によって遺伝子断片を分取し、ベクタープラスミド p UC 1 1 8にライゲーシヨンして、組換え体 DNAのライブラリーを作製した。

(2) 形質転換体の作製及び組換え体 DNAの選別：

( 1 ) で調製した組換え体ライブラリーによる形質転換体を宿主微生物としてェシエリシァ ' コリ JM 1 09株を用いて塩化カルシウム法（ Mol. Biol., 53, 154 (1970)) により作製し、その中からアミダ一ゼ活性を示すようになったものを選別した。選別は以下のようにして行った。

アンピシリンナトリウム（S O gZm l ) を含む LB培地で形質転換体を培養した後、培養液をグリセロールを炭素源とし、ロイシンアミドあるいは乳酸ァミドを窒素源とする寒天培地に塗布した。 37°Cで 1〜3日間培養して生じたコロニーを単離し、アンピシリンナトリウム（ 50 μ gZm 1 )、 I PTG ( 1 mM) を含む L B培地で 37°Cにて 1夜培養した。培養液から遠心分離で菌体を集めた後、菌体を 50mM KH₂P0₄— N a₂HP0₄緩衝液（pH 8.0) で洗浄し、同緩衝液に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を 1 %乳酸アミドを含む 50mM KH₂P〇₄— N a₂HP0₄緩衝液（pH 8.0) に懸濁し、 30°Cにてインキュべ —トした。一定時間後、生成する L一乳酸を高速液体クロマトグラフィー（カラム：スミキラル OA-5000、住友化学社製；溶離液： 1 mM硫酸銅水溶液；流速： 1. 0 ml/分；検出： UV 254nm) にて定量した。 L一乳酸を生成する形質転換体からプラスミド P L A002を得た（図 1 )。

(3) 制限酵素地図の作製とアミダーゼ遺伝子の位置の決定： (2) で得られたプラスミドについて、常法に従い、制限酵素地図を作製した。その後、より小さな DNA断片をもつプラスミドを作製した。これらのプラスミドによって（2) と同様にして形質転換した株のアミダ一ゼ活性の有無によって目的遺伝子の含まれていることを確認した。プラスミド作製の経過を図 2に示す。すなわち、 p LA002の E c o R I— S a l I断片（3. 4 k b ) を pUC 1 1 9にライゲーシヨンして P LA 20 1を作製し、さらに、このプラスミドからの B amH I— B amH I断片（2. 6 k b) を pUC l l 8にライゲーションして P L A 202を作製した。 p LA 202の P s t I - P s t I断片を削除 (0. 7 k b) することにより、 P LA 205を得た。 p LA205からさらに様々な断片を削除したプラスミドを作製して、これらによって形質転換した株のアミダ一ゼ活性の有無を調べて、目的遺伝子の含まれている箇所を推定した（図 2)。

(4) 塩基配列の決定：

( 3 ) で得られた p LA205の B amH I— N a e I部分（ 1. 4 k b ) の DNAの塩基配列をフアルマシア DNAシーケンサ一 A L FIIを用いて決定した。その結果、配列番号 3に示される塩基配列が得られ、配列番号 1に示されるアミノ酸配列をもつオープンリーディングフレーム（配列番号 2) が見出された。プラスミド P LA205の制限酵素地図及びアミダ一ゼの存在位置を図 3に示した。アミノ酸配列データーべ一ス SWISS PROTとの比較により、本遺伝子は、既知のアミダ一ゼ、具体的には、マイコバクテリゥム属細菌由来のァセトアミダーゼ（J. Gen. Microbiol., 139， 575 (1993))、メチロフイラス属細菌由来のホルムアミダ一ゼ（Eur. J. Biochem., 240, 314 (1996)) とアミノ酸配列レベルで 28 〜30%の低いホモロジ一を有しており、酵素の基質特異性が全く異なる。また、アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する既知の酵素とのホモ口ジ一はほとんどなく、従って、本酵素は新規なアミダ一ゼであると考えられた。

なお、配列番号 2で表される塩基配列を有する DN Aを含むプラスミド p LA 205で形質転換したェシェリシァ - コリ J M 1 09株（E. coli JM109/pLA 205) は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東 1一 1 — 3) に、 1 999年 1月 26日付けで国際寄託されている（F E RM B P— 実施例 2

( 1) E. c o l i JM 1 09/p LA205株の培養

1 %パクトトリプトン、 0. 5 %バクトイーストエキス、 0. 5%N aC l、 0. 05%Mg SO₄ ' 7H₂O、 0. 02%Mn SO₄ ' 4〜6 H₂O、 0. 00 2 % Z n S 0₄ · 7 H₂O、 0. 002 % C a C 1 ₂ · 2 H ₂ Oからなる培地（ p H 7. 2) 1 00m 1を 500m 1容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、アンピシリンナトリウム（S O ^ gZm l ) を添加し、 E . c o 1 i JM 1 09/p LA205を植菌して、 37°Cにて 1 9時間振盪培養した。

(2) ェンテロパクター ' クロアツセィ N— 790 1株の培養

比較のため当該株の培養を行った。

1 %シュ一クロース、 0. 5%肉エキス、 0. 5%プロピオンアミド、 0. 0 1 %M g S 0₄ · 7 H₂〇、 0. 00 1 %Mn S O₄ · 4〜 6 H₂O、 0. 00 1 % C a C 1₂ · 2 H₂O, 0. 00 1 %F e SO₄ ' 7 H₂O、 0. 000 1 % Z n S O₄ · 7H₂0、からなる培地（pH 6. 0) 1 00m l を 500m l容三角フラスコに入れてォ一トクレーブ滅菌した後、ェンテロパクター ' クロアツセィ N- 790 1株を植菌して、 30°Cにて 2日間振盪培養した。

(3) アミダーゼの産生及び該活性の確認

培養後、それぞれの菌体を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の 50mM K H₂PO4-N a₂HPO ₄緩衝液（pH 8.0) で 2回洗浄した後、 50 m 1の同緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。 2%ラセミ体 t e r t—口イシンアミド 0. 5m 1、 50 mM K H ₂ P O ₄— N a ₂ H P 0₄緩衝液（pH 8.0) 0. 3m 1、菌体懸濁液 0. 2 m 1からなる反応液を 40°Cで 1時間振盪した。反応液から遠心分離によって、菌体を除いた後、 HPLC (カラム：スミキラル OA-5000、住友化学社製；溶離液： 2mM硫酸銅水溶液/ IVIeOH (85:15)；流速： 1.0 ml/分；検出： UV 254nm) にて分析した。それぞれの菌体の酵素活性を比較した（表 1 )。表 1

なお、表 1中、 Uは、 L— t e r t—口イシンの生成する速度（μモル分）であり、アミダーゼ活性は、反応液中に含まれる乾燥菌体重量あたりの数値として表した。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。

産業上の利用の可能性

本発明によれば、遺伝子組換の方法でクローン化されたアミダ一ゼ遺伝子を菌体内に多数存在させることができるため、従来の方法に比して飛躍的に触媒能力を増大させた微生物の提供ができ、これにより、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドから効率的に光学活性な α—アミノ酸や α—ヒドロキシ酸を製造できる。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の（a ) 又は（b ) のタンパク質。

( b ) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列において 1個若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸ァミドを立体選択的に加水分解するァミダーゼ活性を有するタンパク質。

2 . 請求項 1記載のタンパク質をコードする遺伝子。

3 . 配列番号 2で表される塩基配列を含む、請求項 2記載の遺伝子。

4 . 配列番号 2で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイプリダイズし、且つ、 α—アミノ酸アミド及び α—ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。

5 . 請求項 2〜4のいずれか 1項に記載の遺伝子をべクタ一に連結した組換えべクタ一。

6 . 請求項 5記載の組換えべクタ一を宿主微生物に導入した形質転換体。

7 . 請求項 6記載の形質転換体を培養することを含む、アミダーゼ活性を有するタンパク質を産生させる方法。