WO2003085108A1 - Adn recombinant presentant un gene d'hydantoinase et un gene de carbamylase et procede de production d'acide amine - Google Patents

Adn recombinant presentant un gene d'hydantoinase et un gene de carbamylase et procede de production d'acide amine Download PDF

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WO2003085108A1
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gene
recombinant dna
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nucleotide sequence
amino acid
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PCT/JP2003/004553
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Ikuo Kira
Yasuhiro Takenaka
Hiroyuki Nozaki
Kunihiko Watanabe
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant DNA and a method for producing an amino acid using the same, and more particularly, to a recombinant DNA in which the hydantoinase gene and the rubbamilase gene are efficiently co-expressed and a method for producing an amino acid with high productivity using the same.
  • a method is known in which a 5-substituted hydantoin compound that is chemically synthesized at a low cost is used as a starting material and is asymmetrically decomposed into optically active amino acids.
  • the method for producing an optically active amino acid from the pentasubstituted hydantoin compound is an important method for producing pharmaceuticals, chemical products, food additives and the like.
  • One of the methods for producing an optically active amino acid from a 5-substituted hydantoin compound includes a method using the following enzymes (A) and (B).
  • an enzyme having optical selectivity may be used for at least one of the above (A) HHase and (B) CHase.
  • the genes encoding HHase and CHase Into a host such as Escherichia coli to produce a transformant, and culturing the transformant to produce amino acid from 5-substituted hydantoin and accumulate it in the medium.
  • a method for producing an amino acid using a recombinant DNA for example, WO 001/23582, TO 05/8449 and the like have been reported.
  • a rhamnose promoter is used as a promoter for expression of Hase or the like. Disclosure of the invention
  • the techniques related to the production of amino acids include, for example, the techniques described in the above two gazettes.
  • the rhamnose promoter is used; In order for the rhamnose promoter to function, it is necessary to add rhamnose as an inducer at a predetermined time.
  • the setting of the time of addition of rhamnose is extremely important. In the case of producing amino acids industrially, the process of adding a derivatizing agent is increased, and the timing of the addition is required to be delicate, which complicates the production process.
  • a well-known promoter is the lac promoter:>
  • the lac promoter when industrially producing large quantities of amino acids using recombinant microorganisms, it is necessary to keep the microorganisms at a high density, so that glucose is used as a nutrient source. May be added and cultured. However, since the addition of glucose leads to suppression of the 1 ac promoter, it may not be preferable to use the lac promoter in industrial production of amino acids.
  • the present invention has been made from the above-mentioned viewpoints, and is intended to produce a recombinant DNA in which an enzyme gene such as Hase is efficiently co-expressed. Further, the present invention utilizes such a recombinant DNA. And to efficiently produce amino acids from hydantoin.
  • the present inventors have conducted intensive studies to obtain a recombinant DNA capable of efficiently co-expressing HHase and CHase genes, and among the many promoters, the trp promoter has HHase, CH ase, and also hydantoinracemase (hereinafter also referred to as “HRase”), were found to be efficient promoters and suitable promoters for the industrial production of amino acids. Furthermore, the present inventors have found that when HHase and CHase are inserted into recombinant DNA, a large difference in enzyme activity appears depending on the orientation and the order of insertion of these genes. The invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • (I) a gene region comprising a nucleotide sequence encoding a hydantoinase gene and a trp promoter sequence located upstream of the nucleotide sequence encoding the hydantoinase gene and regulating the expression of the hydantoinase gene
  • the transcription sequence of the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the nucleotide sequence encoding the gene region of (II) are in the same direction, and the nucleotide sequence of (I) is oriented in the same direction as the transcription direction.
  • the transcription direction of the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the nucleotide sequence encoding the gene region of (II) are in the same direction, and in the same direction as the transcription direction.
  • the recombinant DNA according to any one of [1] to [5] above is a low-copy recombinant DNA, and is located at the base sequence encoding the hydantoin racemase gene and at the upstream of the hydantoin racemase gene.
  • the transformed cell according to [7], wherein the recombinant DNA having a trp promoter sequence that regulates the expression of the hydantoin racemase gene is a high-copy recombinant DNA.
  • the transformed cell according to [7] is cultured in a medium, and the protein having hydantoinase activity, the protein having carbamylase activity and the hydantoin racemase activity are cultured in the medium and / or in the transformed cell.
  • the transformed cell according to any of [6] to [9] above is cultured in a medium to obtain a culture, and the culture is mixed with a 5-substituted hydantoin to produce an amino acid.
  • a method for producing an amino acid comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the positions and directions of insertion of HHase and CHase on the plasmid.
  • FIG. 2 is a diagram showing trp promoter cassettes 1 and 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing the production of pTrpHfCf.
  • FIG. 4 is a diagram showing the production of pTrpCrHf.
  • FIG. 5 is a diagram showing the production of pTrpHrCr.
  • FIG. 6 shows the production of; pT r p 4R.
  • FIG. 7 is a diagram showing the production of pTrp8CH. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the recombinant DNA of the present invention has a base sequence encoding the following gene regions (I) and (II).
  • the recombinant DNA of the present invention employs the trp promoter as a promoter for expressing each of HHase and CHase.
  • the trp promoter is a promoter located upstream of a group of genes encoding several enzymes involved in tryptophan biosynthesis, and is present in Escherichia coli and the like.
  • a promoter already known as a trp promoter may be used.
  • the trp promoter is commercially available in the form of a clawing vector containing the trp promoter or cells containing such a vector. By using a trp open-ended motor, the expression levels of HHase and CHase can be sufficiently obtained.
  • the trp promoter does not require the addition of an inducer such as the rhamnose-added kamul in the rhamnose promoter. Therefore, in the production process for producing amino acids, various steps or treatments associated with the addition of the ft conductor can be omitted. Furthermore, since the trp promoter is not repressed by glucose, the expression level of the enzyme does not need to be repressed even when dalcos is used for high-density cultivation of transformed microorganisms for production of amino acids on an industrial scale.
  • DNA having a base sequence encoding HHase (hereinafter referred to as “DNA encoding HHase” has the same meaning. The same applies to CHase and the like) and CHase.
  • the transcription direction of the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the nucleotide sequence encoding the gene region of (II) are in the same direction, and are directed in the same direction as the transcription direction (
  • the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the gene region of (II) Incorporate them in the order of the base sequences to be encoded ((1) in Figure 1).
  • the transcription direction is from left to right in both the “trp + HHase J gene region and the“ trp + Chase ”gene region, and the order is“ trp + HHase ”from the left.
  • the gene region is arranged in the order of the "trp + CHase" gene region.
  • both HHase and CHase exemplify DHHase and DCHase that use the D-form specifically as a substrate.
  • the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the nucleotide sequence encoding the gene region of (II) are integrated so that the transcription directions are opposite (2 in FIG. 1). That is, in (1) of FIG. 1, the transcription direction of the “trp + CHa se” gene region is from right to left, and the transcription direction of the “trp + HHa se” gene region is from left to right.
  • the transcription direction of the nucleotide sequence encoding the gene region of (I) and the transcription sequence of the nucleotide sequence encoding the gene region of (II) are in the same direction, and are directed in the same direction as the transcription direction.
  • the base sequence encoding the gene region of (II) and the base sequence encoding the gene region of (I) in this order (3 in Figure 1).
  • the transcription direction of the “tr p + HHase” gene region is from right to left
  • the transcription direction of the “tr p + CHa se” gene region is “tr p + CHa se” gene region.
  • + HHase ” are arranged in the order of the gene regions.
  • Ptrp refers to the trp promoter.
  • DHHa se is HHa se having D-hydantoinase activity
  • DCHa se is CH Ha se having D-carpamylase activity.
  • the arrow indicates that the transfer proceeds in the direction of the arrow.
  • the third form (3 in Fig. 1) has the strongest co-expression of HHas'e and CHase.
  • the third form is one in which two types of enzyme genes are contained in one recombinant, and the co-expression of these is performed in the most balanced and efficient manner.Industrial mass production of amino acids It is particularly suitable for
  • one recombinant DNA When using a transformant to express two or more enzymes, one recombinant DNA may have only one gene and multiple recombinant DNAs may be introduced into the host. However, the expression level of multiple genes may fluctuate due to the high or low copy number in the host or the loss of recombinant DNA. However, in the present invention, since two enzyme genes can be efficiently co-expressed by mounting one enzyme DNA on one recombinant DNA, the expression levels of HHase and CHase are biased due to division and growth of the host. Is less likely to occur.
  • HHase may be a protein having a hydantoinase activity
  • CHAse may be a protein having a catalyzing activity.
  • an amino acid having optical activity that is, one of L-amino acid and D-amino acid
  • at least one of HHase and CHase may have optical selectivity.
  • the optical selectivity of the enzyme means that the reaction is catalyzed by using either the L-form or the D-form specifically as a substrate.
  • HHase which optically hydrolyzes a 5-substituted hydantoin compound
  • a bacterium having a DHHase that produces N-potassium-D-amino acid it is known that a bacterium belonging to the genus Bacillus has a heat-resistant enzyme.
  • Bacillus stearothermophilus has been known.
  • An LHHase that specifically acts on an L-hydantoin compound is known to exist, for example, in Bacillus sp. AJ12299 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-24894, Koyuki Utara). Batinoles SP AJ12992 was deposited on July 5, 1986 with the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, under the accession number FE RM—P 8837, and became independent on June 27, 2001.
  • HHase having no optical selectivity is known to exist in Microbacterium liquefaciens AJ 3912 strain, for example, in Arthrobacter aurescens, for example (J. Biotechnol. 6). 1 volume, 1 page, 1998).
  • CHase which selectively hydrolyzes N-potassium rubamylamino acid in L form, is, for example, Flavobacterium sp. AJ3912 strain (Japanese Patent Publication No. 56-008749), Bacillus
  • B. sp. AJ3912 is currently classified as Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133), but as of June 27, 975 Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and given the accession number FERM-P3133. Based on the Budapest Treaty on June 27, 2001, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology The microorganism has been transferred and given the accession number FERM B P-7643.
  • a preferred combination of DNAs encoding HHase and CHase to be mounted on the recombinant DNA is a combination selected from the following HHase and CHase: Are mentioned. The following combinations produce D-amino acids selectively.
  • the DNA encoding HHase preferably includes a DNA selected from the following (i) to (iv). .
  • the DNA encoding CHase is a DNA selected from the following (v) to (viii).
  • Etc. can be used.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNA with high homology, for example, 50% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more homology a DN a with each other and Haiburidizu, conditions which homologous than low DN a with each other without Haiburidizu, or a washing doctor conditions typical Southern hybridization 60 ° C, 1 XS SC, 0. 1 0/0 SDS Preferably, hybridization conditions are at a salt concentration corresponding to 60 ° (0.1 XSSC, 0.1% SDS, more preferably 65 ° C, 0.1 XSSC, 0.1% SDS). .
  • severe refers to a range that does not significantly impair the tertiary structure of the protein of amino acid residues or DHHase activity or DCHase activity. Specifically, 2 to 50, preferably 2 -30, more preferably 2-10.
  • DHHase selected from the above (i) to (iv) and DCHase selected from the above (v;) to (viii) is necessary for industrial mass production of D-amino acids It is particularly advantageous for obtaining enzymatic activity.
  • Flavobacterium sp. AJ111199 (FERM_P4229) strain 56-0251 19).
  • Flavobacterium sp. AJ 1 1.1 99 (FERM—P 4 229) The strain was originally deposited as Alcaligenes aquamarinus with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry. Flavo acterium sp.).
  • Flavobacteriura sp. AJ11199 strain was deposited on September 29, 1977 at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the accession number FERM-P4229. Microorganisms that have been transferred to the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest Treaty on May 30, 2002 and have been assigned the accession number F ERM B P-8063. It is.
  • the DNA containing the genes encoding HHase, CHase and HRase is preferably a vector for introducing these genes into host cells.
  • vectors include the pHSG system
  • the “derivative” means a plasmid obtained by modifying a plasmid by substitution, deletion, insertion, addition or inversion of a base.
  • the modification includes a mutation treatment with a mutagen or UV irradiation, or a modification with a spontaneous mutation.
  • Plasmids include pSTV, pTWV, pKK233, and pBR322 plasmids.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, downstream of the protein gene.
  • terminators include rrnB terminator, T7 terminator, id phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, Escherichia coli trp A gene terminator.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene or kanamycin resistance.
  • a recombinant DNA is obtained by ligating a DNA fragment obtained by ligating a promoter, DNA encoding HHase and DNA encoding CHase, and a terminator in a predetermined arrangement to a DNA fragment of a vector.
  • a promoter DNA encoding HHase and DNA encoding CHase
  • a terminator in a predetermined arrangement to a DNA fragment of a vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant DNA obtained as described above into a host cell.
  • host cells to be transformed include bacterial cells, actinomycetes, yeast cells, mold cells, plant cells, animal cells, and the like.
  • Escherichia coli intestinal bacteria
  • Escherichia coli JM109 strain particularly (DE3) strain, is preferred.
  • another embodiment of the method for producing an amino acid of the present invention includes an embodiment in which HRase is used together with HHase and CHase.
  • HRase can also be produced by the transformant and used for amino acid production. That is, a recombinant DNA having a DNA encoding HRase is prepared, and the recombinant DNA is introduced into a host cell for transformation.
  • a known DNA encoding HRase may be used, but preferred examples include the following.
  • the DNA of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing was isolated and purified from Microbacterium liquefaciens AJ3912 strain. On June 27, 1975, Microbacterium liq uefaciens AJ3912 strain was originally designated as Flavobacterium sp. AJ3912 (FERM-P3133) strain. Deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry. As a result of re-identification, it was found to be classified as Aureobacterium liquefacie ns.
  • Aureobacterium liquefaciens is now classified as Microbacterium liquefaciens due to the change in species name, and Aureobacterium liquefaciens is classified as Microbacterium liquefaciens (J. It has been deposited with the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) as Ban No.FERM-P3133, International Deposit No. FERM BP-7643).
  • trp promoter As a promoter that regulates the expression of the DNA encoding HRase.
  • a preferred terminator, a recombinant DNA as a base, a technique for selection, a host, and the like include a recombinant DNA having HHase or the like. Same as for DNA.
  • the recombinant DNA having the DNA encoding HRase can be expressed by introducing it into a host cell into which the DNA encoding HHase and the DNA encoding CHase have been introduced. By doing so, one transformant can be used to express the three enzymes required for amino acid production, which reduces the work compared to handling multiple transformants.
  • HR ase It is desirable that the recombinant DNA having the DNA encoding the DNA is prepared separately from the recombinant DNA carrying the DNA encoding the Hase or the like. Considering the size of the enzyme genes, it is not practical to produce a product in which three types of enzyme genes are mounted on one recombinant DNA. Therefore, when HRase is also expressed, it is desirable to prepare a transformant in which two kinds of recombinant DNAs have been introduced.
  • the recombinant DNA be a high-copy recombinant DNA and the other be a relatively low-copy recombinant DNA. Which of the recombinant DNAs is to be used as high-copy DNA should be determined in consideration of the amount of enzyme produced by each DNA and the stability of the plasmid.
  • a recombinant DNA having an HRase is converted to a low-copy recombinant DNA having a high-copy recombinant DNA, HHase and CHase. Is preferred. Whether the copy is high or not can be determined by preparing a transformant for each recombinant DNA and measuring the activity of the enzyme produced by each transformant.
  • HRase By culturing the cells transformed with the above-mentioned recombinant DNA, HHRase and CHase, and when HRase-encoding DNA is introduced, HRase is expressed and produced.
  • a production medium a medium usually used for culturing Escherichia coli, such as an M9-amino acid lactic acid medium or an LB medium, may be used. More specific culture conditions and production induction conditions are appropriately selected depending on the type of the vector marker, host bacteria, and the like used. After recovering the cultured transformed cells by centrifugation or the like, the transformant is disrupted or lysed, and HHase and / or CHase are recovered and used as a crude enzyme solution.
  • the protein in order to mass-produce a protein using recombinant DNA technology, it is also preferable that the protein associates in a transformant that produces the protein to form an inclusion body of the protein. No.
  • the advantages of this expression production method are that the protein of interest is protected from digestion by proteases present in the cells, and that the protein of interest can be easily purified by centrifugation following disruption of the cells.
  • the protein inclusion body obtained in this way is solubilized by a protein denaturing agent, undergoes an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent, and then is a correctly folded physiologically active protein.
  • an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent
  • a correctly folded physiologically active protein Is converted to For example, there are many examples such as the regeneration of the activity of human interleukin-12 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-25791).
  • the target protein as an inclusion body there are a method of expressing the target protein alone under the control of a strong promoter, and a method of expressing it as a fusion protein with a protein known to be expressed in large quantities There is. Furthermore, after expressing as a fusion protein, cut out the target protein Therefore, it is also effective to arrange the recognition and recognition sequences of the restriction protease at appropriate positions.
  • the protein inclusions recovered as a fusion protein are solubilized with a denaturing agent. It may be solubilized together with the bacterial protein, but it is preferable to take out the inclusion body and solubilize it in consideration of the subsequent purification operation.
  • the inclusion body may be recovered from the cells by a conventionally known method. For example, the cells are destroyed, and the inclusion body is recovered by centrifugation.
  • guanidine hydrochloride for example, 6M, pH5 ⁇
  • the dialysis solution used for dialysis may be a Tris-HCl buffer or a phosphate buffer, and the concentration may be 2 OmM to 0.5 M, and the pH may be 5 to 8.
  • the dialysis temperature is preferably 5 ° C or lower to prevent the regenerated enzyme protein from performing self-crosslinking.
  • a transformed cell obtained by introducing the recombinant DNA into which HHase or the like has been incorporated as described above was cultured in a medium to produce an enzyme such as HHase.
  • a culture is obtained, and an amino acid is produced by mixing the culture with a 5-substituted hydantoin to produce an amino acid.
  • HHase and CHase may be included.
  • HRase may be included.
  • the form of the culture is not particularly limited as long as these predetermined enzymes are contained.
  • the 5-substituted hydantoin may be directly added to the medium containing the transformant, or the cells isolated from the medium may be added.
  • a transformant a washed product of the transformant, a product obtained by crushing or lysing the transformant, a crude enzyme solution recovered from HHase, etc., and a further purified enzyme solution; and a 5-substituted hydantoin.
  • desired amino acids can be produced.
  • an optically-selective HHase is used to produce either an N-force rubamyl-L-amino acid or an N-force rubamyl-D-amino acid.
  • an optically active amino acid can be produced by further reacting CHase with a rubamyl amino acid.
  • the resulting amino acid can be obtained as a D-type or L-type optically active substance if CHase has optical selectivity.
  • the unreacted enantiomer N-potassium amino acid in the reaction mixture ie, CH-sease selectively decomposes N-potassium L-amino acid to produce L-amino acid and N-potassium.
  • dexamethasyl-D-amino acid and D-amino acid are formed, it is assumed that N-dexamerubyl-L-amino acid remains.
  • HHase catalyzes the reverse reaction of dehydrating and condensing the remaining unreacted enantiomeric N-potassium amino acid, which again forms a 5-substituted hydantoin compound.
  • Optically active amino acids can be produced in high yields (molar yields of 50% or more) by using two kinds of enzymes, or two kinds of enzymes of CHa se with high optical selectivity. Can be manufactured.
  • HRase is included in the mixed protein and catalyzes the racemization of the 5-substituted hydantoin compound.
  • D-amino acids can be produced with a molar yield of 100%.
  • a 5-substituted hydantoin compound serving as a substrate for HHase or HRase is used.
  • the 5-substituted hydantoin compound include hydantoin, 5-methylhydantoin, 5-benzylhydantoin, 5-(4-hydroxybenzyl / re) hydantoin, 5-indolylmethylhydantoin, and 5- (3 , 4—dihydroxybenzyl) hydantoin, 5— (p-hydrid xybenzinole) hydantoin, 5 1 (3,1-pyridinole) 1 methinorehydantoin, 5 —methinorechoetinorehydantoin, 5isopropi Norehydantoin, 5-isobu As represented by chinolehydantoin, 5-sec-butinolehydantoin, 5-force phenolic acid
  • 5-substituted hydantoin compounds corresponding to various natural amino acids 5-phenylhydantoin, 5- (4-hydroxyphenyl) hydantoin, 5-methoxymethylhydantoin, and 5-benzyloxymethinolehydantoin
  • 5-Substituted hydantoins corresponding to unnatural amino acids or derivatives thereof, such as (1-, 3,4-methylenedioxybenzyl) hydantoin and dihydrouracil are exemplified.
  • N-potassium amino acid using the above enzyme protein.
  • an N-potassium amino acid can be produced by adding an inhibitor of L- or D-CHase to the above mixed protein and stopping the hydrolysis reaction with the N-potassium amino acid.
  • the amino acid production reaction is allowed to proceed while culturing the cells transformed with the recombinant DNA in an aqueous medium
  • the growth of the transformed cells containing the 5-substituted hydantoin compound is required.
  • a water-soluble medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions necessary for the process is used.
  • organic micronutrients such as vitamins and amino acids often produces desirable results.
  • the 5-substituted hydantoin compound may be added in portions. It is preferable to culture the cells for 8 hours to 5 days under aerobic conditions while controlling the pH to an appropriate range of 5 to 9 and a temperature of 25 to 40 ° C.
  • the amount of D-amino acid in the culture solution or the reaction solution can be quickly measured using a well-known method.
  • a simple layer using Merck's HPTLC CHIR High-performance liquid mouth chromatography (HPLC) using an optical resolution ram such as Daicel Chemical's CHIRALPAK ⁇ can be used to improve analysis accuracy. .
  • the produced amino acid can be separated and purified by a known technique.
  • a method of adsorbing a basic amino acid by contacting it with an ion-exchange resin and eluting the basic amino acid for crystallization or a method of eluting, decolorizing and filtering with activated carbon or the like, and crystallization may be mentioned. It is also dependent on conditions for culturing the transformant, such as E. coli, as estimated by the use of recombinant DNA of the present invention using the tr P promoter, in the case of using other promoters, such as Ramunosupu port Motor Compared to this, it is possible to improve productivity by about 5 times (amino acid production per unit time).
  • Example 1 E.co of D-hydantoinase gene derived from AJ11199 strain
  • pHSG298 (Takara) was treated with EcoRI / KpnI, the obtained DNA fragment was ligated to the trp promoter cassette 1 (FIG. 2), and E.co1i was ligated with this ligation solution. JM109 was transformed. A strain having the desired plasmid was selected from the kanamycin-resistant strains, and the desired plasmid was named pTrp298298EK. It should be noted that SEQ ID NO: 21 in the sequence listing describes the upper chain of the trp promoter cassette 1 shown in FIG.
  • Flavobacteriura sp. The target gene was amplified by CR (4 types in combination with (1) to (4) and (4)). These fragments were treated with KpnI baI, and the obtained DNA fragment was ligated with pTRp298 EK treated with KpnI / XbaI. E.coliJM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from kanamycin-resistant strains, and DNA amplified with a primer of (1)-(2) and (2) Each plasmid carrying the fragment was named pTrp298 DHH asel, 2, 3, 4. Table 1. Primers used to amplify the D-hydantoinase gene from AJ111 9
  • Each E.co1iJMl09 with pT rp 298 DHHase 1,2,3 or 4 was plated on LB medium (2 ml) containing kanamycin 100 ⁇ g / ml. C, and cultured for 16 hours.
  • the obtained culture broth 1001 was added to 4 ml of medium I (casamino acid 1%, peptone 1%, glucose 1%, ammonium sulfate 0.5%, monobasic phosphate 0.1%, phosphoric acid Transfer to 0.3% dipotassium, 0.05% magnesium sulphate, 0.01% strength potassium (pH 7.0), 37. C, and cultured for 16 hours.
  • medium I casamino acid 1%, peptone 1%, glucose 1%, ammonium sulfate 0.5%, monobasic phosphate 0.1%, phosphoric acid Transfer to 0.3% dipotassium, 0.05% magnesium sulphate, 0.01% strength potassium (pH 7.0), 37. C, and cultured for 16 hours.
  • the cells are collected by centrifugation (10,000 g x 10 min) from a 1 ml culture, and the resulting cells are placed in 10 OmM potassium phosphate buffer (KPB, pH 7.5). And washed. The washed cells were suspended in 0.5 ml of the same buffer, and sonicated (2 OKH Z , 15min, Tosho Electric UCW-20 1) The sonicated solution was centrifuged (10,000 g ⁇ 10 min), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • KPB pH 7.5
  • sonicated 2 OKH Z , 15min, Tosho Electric UCW-20 1
  • E. coli JM109 having pTrp298 DHHase 3 was transformed into LB medium (2 ml) containing kanamycin 100 gZm1. C, and cultured for 16 hours.
  • the resulting culture solution 0. 5 m 1, 5 0m medium II (casamino acid 1% l, peptone 1/0, glucose 0.2%, sulfuric acid Anmoyuumu 0.5% monopotassium phosphate 0. Transfer to 1%, 0.3% diphosphorium phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% manganese sulfate, 0.01% kanamycin (pH 7.0) at 37 ° C, 24 Time culture.
  • Flavobacterium sp. (Flavobacterium sp.) AJ111
  • the chromosomal DNA of strain 199 was used as type I, and the oligonucleotides shown in Table 2 were used as primers, and PCR (a combination of either 2 or 2 and 3) was used. (2 types) amplified the target gene. These fragments were treated with KpnI / XbaI, and the obtained DNA fragment was ligated with a KpnI / XbaI treated product of pTrp298EK.
  • E.co1i JM109 is transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid is selected from the kanamycin-resistant strains, and the fragment amplified by the primer (1), (2) and (3) is mounted.
  • the respective plasmids were named pTrp298D CHases 1 and 2.
  • Trp298 DCHase 1 was treated with EcoRI / XbaI to obtain a DNA fragment in which the trp promoter and the gene for rubamylase were ligated, and this DNA fragment was ligated to the PHSG 299 (Takara)
  • E. Co-ligated with the processed product E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from kanamycin-resistant strains, and the plasmid was named: pTrp299DCHase1.
  • Table 2 Primers used to amplify AJ111199-derived D-leavamylase gene
  • the cell-free extract 101 expressing D-force rubamylase by SDS polyacrylamide gel electrophoresis was subjected to SDS polyacrylamide gel (Daiichi Pure Chemicals, Multigel 10/20), and Lameme 1 1 i Electrophoresis was performed according to these methods. As a result, only a cell-free extract of the transformant having pT rp 299DCHasel showed a protein band corresponding to D-potassium rubamylase.
  • E. coli JM109 cells having pTrp299DCHase1 was performed in the same manner as in the measurement of the enzyme activity described in Example 1.
  • the obtained washed cells were suspended in 5 ml of lO OmMKPB (pH 7.5), and 0.1 ml of the suspension was dissolved in 0.9 ml of a base solution (458 mg / dl N D—: Phe was added to 100 mM KPB (H7.5)) and reacted at 37 ° C. for 60 minutes.
  • 0.9 ml of the reaction stop solution was added to 0.1 ml of the reaction solution, and the supernatant obtained by centrifugation was subjected to HP LC to quantify the generated D-P lie. Under these conditions, the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of D-Phe per minute was defined as 1 U.
  • E. coli JM109 having pT rp 2.99DCHas e 1 showed 0.6 U of D-potassium labamylase activity per lm l of culture solution.
  • pHSG298 and pHSG299 were treated with EcoRI / XbaI, and the obtained DNA fragment was ligated to trp promoter cassette 2 (Fig. 2).
  • E. coli JM109 was transformed with this ligation solution.
  • Strains having the desired plasmid were selected from kanamycin-resistant strains, and the respective plasmids were named pTrp298EX and pTrp299E. Note that SEQ ID NO: 22 in the sequence listing describes the upper chain of the trp promoter cassette 2 shown in FIG.
  • Microbacterium liquefaciens AJ391 Two types of chromosomal DNA of AJ3912 were used as the chromosomal DNA and the oligonucleotides shown in Table 3 were used as primers for PCR (combination of either 1, 2 and 3) ) To amplify the target gene. These fragments were treated with XbaI / PstI, and the obtained DNA fragments were ligated with pTrp298EX and XBa1PstI treated pTrp299EX. E. c o 1 i with this ligation solution
  • Transform JMl09 select a strain having the desired plasmid from kanamycin-resistant strains, and clone each plasmid containing the fragment amplified with either (1) or (2) and (3) primers. They were named p T rp 298 HR asel, 2, and p T rp 299 HR ase 1, 2.
  • E. coli JM109 cells having p T rp 298 HR asel or 2, p T rp 299 HR ase 1 or 2, or p T rp 29 HRase was performed in the same manner as in the measurement of the enzyme activity described in Example 1. went.
  • the mixture was added to mM KPB (pH 7.5) and reacted at 37 ° C for 15 minutes.
  • PCR was carried out using pT rp 299DCHasel as type I and oligonucleotides (1) and (2) shown in Table 5 as primers.
  • pTrp298DHH3 Ligation with XbalZP stl processed product.
  • E. coli J Ml09 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from among the kanamycin-resistant strains, and the plasmid was named pTr pHfCf ( Figure 3). ).
  • PCR was performed using T r ⁇ 299DCHase 1 as a mirror-type and the oligonucleotides (1) and (2) shown in Table 5 as primers, and the obtained DNA fragment was ligated to pGEM-T easy vector (Promega). .
  • E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pGEMDCHase1.
  • this plasmid was treated with EcoRI to obtain a DNA fragment in which the trp promoter and the ribonuclease gene were ligated, and this DNA fragment was ligated to a pTrp298DHHase3 EcoRI-treated product.
  • E. coli JMl09 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from kanamycin-resistant strains, and the plasmid was named pTrpCrHf (FIG. 4).
  • PCR was performed using PT rp 298 DHHase 3 as type I and oligonucleotides (1) and (3) shown in Table 5 as primers.
  • the resulting DNA fragment was treated with XbaI / PstI, and then pTr p 299DCHase 1 XbaI / PstI treated product.
  • the Raigeshiyon solution E. coli JM109 was transformed with, and selecting a strain having a plasmid of interest from the kanamycin resistant strains, a plasmid of its was named P T r pHr C r (FIG. 5). Table 5.
  • E. coli JM109 cells having pTr pH fCf, pTrpCrHf, and pTrpHrCr plasmids was performed in the same manner as in the measurement of the enzyme activity in Example 1. .
  • 0.2 ml of the obtained cell suspension was added to 0.8 ml of the substrate solution (0.125 g / ⁇ 1 DL-benzinorehydantoin, 1.25 mM Mn SO u 100 mM
  • E. coli JM109 with PT r pHr Cr, pT rp 29HR a By introducing se, transformants having two types of plasmids were prepared. The transformant was cultured at 30 ° C. for 16 hours in an LB medium (4 ml) containing 100 ⁇ g / m1 of kanamycin and 50 ⁇ g of Zm1.
  • the m1 was transferred to 50 ml of Medium II and cultured for 24 hours at 35 ° C After the culture, the cells were collected from the 1 ml culture by centrifugation (10,000 g x 10 min), The obtained cells were washed with 10 OmM KPB (pH 7.5), and the washed cells were suspended in 1 ml of the same buffer solution, and 0.1 ml of the cell suspension was dissolved in 0.9 ml. l substrate solution (0 ⁇ 1 1 g / d 1 L one 5-benzyl hydantoin, 1. ImM Mn S0 4, 0. 1 1% T riro nX- 1 00, 1 0 OmM KPB (p H 7.
  • the obtained culture broth 15 ni1 was added to 300 ml of medium III (casamino acid 1%, peptone 1%, glucose 2%, ammonium sulfate 0.5%, monopotassium phosphate 0.1%, phosphoric acid 0.3% diammonium, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% manganese sulfate, 0.01% kanamycin, 0.005% chloramphenicol (pH 7.0))
  • the culture was performed at 35 ° (for 15 hours) using a Jar culture device (; pH 7.0 control) .30 ml of the obtained culture solution (dry cell weight: 300 mg) was added to a 270 ml substrate solution.
  • E.co1i JM109 containing two plasmids, pTr pHrCr and pTrp29 HRase was cultured in LB medium (50 ml) without kanamycin and Kokumuku feniconore at 30 ° C for 16 hours. did.
  • the obtained culture solution (15 ml) was cultured for 15 hours at 35 ° C. in a medium III (30 Om1) containing no kanamycin and chloramphenicol using a Jar culture apparatus (pH 7.0 control).
  • 30 ml of the obtained culture 300 mg dry cell weight
  • was added to a 270 ml substrate solution 5.5 g / d1
  • Escherichia coli W3110 containing plasmid with one tr ⁇ promoter and one rrnB terminator The promoter region of the trp operon on the chromosome DNA was determined by PCR using the oligonucleotides shown in Table 7 as primers. The target gene region was amplified by (2) combination), and the obtained DNA fragment was ligated to pGEM-T easy vector (Promega). E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, and a strain having the desired plasmid having the trp promoter inserted in the opposite direction to the lac promoter was selected from ampicillin-resistant strains.
  • pKK223-3 (manufactured by Amersham Pharmacia) was treated with HindIII / HincII, and the obtained DNA fragment containing the rrnB terminator and the Hind of pTrp1 were treated. Ligation with III / Yvu II treatment. E. coli JMl09 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pTrp2.
  • the trp promoter region was amplified by PCR (combination of (1) and (3)) using pTrp2 as the type II oligonucleotide and the oligonucleotides shown in the table as primers.
  • This DNA fragment was treated with EcoO109I / NdeI, and ligated with pTrp2 treated with EcoO1091ZNdeI.
  • E.co1iJMl09 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and this plasmid was named pTrp4.
  • Micronokuterium Riku The target gene was amplified by PCR using the chromosome DNA of Faciens (Microbacterium liquefaciens) AJ3912 strain as type I and the oligonucleotides shown in Table 8 as primers. This fragment was treated with NdeI / EcoRI, and the obtained DNA fragment was ligated to the NdeI / EcoRI-treated product of pTrp4. E. coli JM109 was transformed with this ligation solution, a strain having the desired plasmid was selected from ampicillin-resistant strains, and the plasmid was named pTrp4R (FIG. 6). In FIG. 6 and FIG. 7, the rrnB terminator is indicated as “Tri-nB”.
  • the target gene was amplified by PCR using pTrpHrCr as a type III and oligonucleotides shown in Table 9 as primers. This fragment was treated with NdeI / EcoRI, and the obtained DNA fragment was ligated to the pTrp8 NdeI / EcoRI-treated product. Transform E. coli JM109 with this ligation solution and select strains with the desired plasmid from chloramphenicol resistant strains The plasmid was named pTrp8CH (FIG. 7). Table 9. Primers used to amplify D-hydantoinase and D-leavylamylase genes
  • pTrp8CH was introduced into £ coliJM109 having pTrp41 to prepare a transformant having two types of plasmids. This transformant was cultured at 30 ° C. for 16 hours in an LB medium (5 Oml) containing 100 g / m 1 of ampicillin and 50 ⁇ g / m 1 of Kokumichi Ramenikonori.
  • the cells were cultured at ° C for 24 hours. 15 ml of the obtained culture solution is added to 300 ml of medium V (glucose 2.5%, ammonium sulfate 0.5%, phosphoric acid 0.3%, trisodium citrate dihydrate 0.23%, sulfuric acid Magnesium heptahydrate 0.1%, iron (II) sulfate heptahydrate 0.000
  • Obtained culture solution 15 ml (dry cell weight 60 Omg) was added to 285 ml of a substrate solution (5.3 g / d1 DL-5-benzylhydantoin, 1.05 mM manganese sulfate, 21 mM KPB (H7.5)), and the pH of the reaction solution was adjusted to pH7. . while maintaining the 5 (hands adjustment iN Na OH and 2N H 2 S_ ⁇ 4), was carried out 48 hours at 37 ° C. As a result, generation of 4.15 g / d 1 (molar yield 95%) of D—P Lie was observed.
  • E.co1 iJM109 having two plasmids, pT rp 4R and p T rp 8 CH, is cultured in LB medium (50 ⁇ 1) without ampicillin and chloramphenicone at 30 ° C for 16 hours. did. Transfer 1 ml of the obtained culture solution to a 300 ml medium IV containing no ampicillin and chloramphenicol, and control the pH to 7.0 and the dissolved oxygen concentration to 1.5 ppm or more using a Jar culturing apparatus. The cells were cultured at ° C for 24 hours.
  • a recombinant DNA in which the hydantoinase gene and the rubbamilase gene are efficiently co-expressed. Also, according to the present invention, a highly productive It is possible to perform the Roh acid production (
  • Microbacterium FERM BP-7643 Original Deposit Name:
  • Flavobacterium sp. FERM BP-8063 Original Deposit 13 Name:

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Description

明 細 書 ヒダントイナーゼ遺伝子及び力ルバミラーゼ遺伝子を有する組換え D N A、 並びにアミノ酸製造方法 技術分野 '
本発明は、 組換え D N Aおよびこれを用いたアミノ酸製造方法に関し、 詳しく は、 ヒダントイナーゼ遺伝子および力ルバミラーゼ遺伝子が効率良く共発現する 組換え D N Aおよびこれを用いた生産性の高いアミノ酸製造方法に関する。 背景技術
酵素を用いたアミノ酸製法の一つとして、 化学的に安価に合成される 5置換ヒ ダントイン化合物を出発物質として、 これを光学活性なアミノ酸に不斉分解する 方法が知られていも。 この 5置換ヒダントイン化合物から光学活性ァミノ酸を製 造する方法は、 医薬品、 化学工業品、 食品添加物などの製造に重要な方法である。
5置換ヒダントイン化合物から光学活性ァミノ酸を製造する方法の一つとして、 以下の（A)、 （B)の酵素を用いる方法がある。
(A) 5置換ヒダントイン化合物に作用し、 当該物質を加水分解することにより N— 力ルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒する酵素： ヒダントイナーゼ (ヒダン トインハイドロラーゼともいわれる。 以下 Γΐ-I H a s e J とも記す)。
(B)生成した N—力ルバミノレアミノ酸に作用し、 当該物質を加水分解することによ りァミノ酸を生成する反応を触媒する酵素：力ルバミラーゼ (N—力ルバミルァ ミノ酸ハイド口ラーゼともいわれる。 以下 「C H a s e」 とも記す)。
ここで、 5置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、 上記（A) HH a s eおよび (B) C H a s eのうち、 少なくとも一方に光学選択性の 酵素を用いればよい。
上記のように酵素を用いる場合、 HH a s e、 C H a s eをコードする遺伝子 を大腸菌などの宿主に導入して形質転換体を作製し、 この形質転換体を培養して 5置換ヒダントインからァミノ酸を生成させて培地中に蓄積させるという方法を とり得る。 組換え D N Aを利用してアミノ酸製造を行う方法としては、 例えば、 W0 01/23582号公報、 TO 05/8449号公報等が報告されている。 これらに記載の技術 では H H a s e等の発現用プロモーターとしてラムノースプロモーターが用いら れている。 発明の開示
外来遺伝子を組換えベクターに搭載して微生物などの細胞に導入し、 その細胞 内で発現させることは既に様々な実用技術が開発されている。 ァミノ酸製造に関 連したものとしては、 例えば、 上記 2公報に記載された技術があるが、 これらに おいてはラムノースプロモーターが用いら;^ている。 ラムノースプロモーターを 機能させるためには所定の時期に誘導剤としてラムノースを添加することを要す るが、 ラムノースの添加についてはその添加時期などの設定が極めて重要となる。 工業的にアミノ酸を製造する場合、 誘導剤の添加という工程が増える上に、 その 添加時期の調節は繊細さが要求され、 製造工'程を複雑化してしまうことになる。 また、 周知のプロモーターとして、 lacプロモーターがある: > しかし、 組換え微 生物を用いて工業的にアミノ酸を大量生産する場合、 微生物を高密度に保つ必要 性があり、 そのために栄養源としてグルコースを添加して培養することがある。 しかるにグルコースの添加は、 1 a cプロモーターを抑制することにつながるため、 工業的なアミノ酸製造をするにあたっては、 lacプロモーターを採用することが好 ましくない場合がある。
このように、 どのようなプロモーターを組み合わせるか、 また宿主に何を選ぶ かなどは、 具体的な状況に応じて適^に選択する必要がある。 実験室レベルで可 能であることが工業的にも有利であるとは限らず、 単に発現量を強化できるプロ モーター等として知られているものを利用すればよいというものではない。 さら に、 上記のように複数の酵素を発現させることを要する場合、 最終的な目的に応 じて複数の遺伝子をバランス良く共発現させる必要がある。
本発明は、 上記のような観点からなされたものであり、 HH a s e等の酵素遺 伝子が効率よく共発現される組換え D N Aを作製すること、 さらにはこのような 組換え D N Aを利用してヒダントインからのァミノ酸製造を効率よく行うことを 課題とする。
本発明者らは、 HH a s eおよび C H a s e遺伝子の共発現を効率よく行うこ とができる組換え D N Aを得るため鋭意研究を進めたところ、 数あるプロモータ 一の中でも t r pプロモーターが、 HH a s e、 C H a s e、 さらにはヒダント インラセマーゼ （以下 「H R a s e」 とも記す） を効率よく発現させることがで きると共に、 アミノ酸の工業的製造上も好適なプロモーターであることを見出し た。 さらに、 本発明者らは、 HH a s eおよび C H a s eを組換え D N Aに挿入 するにあたり、 これらの遺伝子の向きおよぴ揷入順序などの配置によっても酵素 活性に大きな差が現れることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下のとおりである。
〔1〕 下記 （I) および （II) の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する組換 え D N A。
(I) ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、 当該ヒダントイナーゼ遺 伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現 を調節する t r pプロモーター配列とを含む遺伝子領域
(II) 力ルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、 当該力ルバミラーゼ遺伝 子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該力ルバミラーゼ遺伝子の発現を調 節する t r pプロモーター配列とを含む遺伝子領域
〔2〕 (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコード する塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ当該転写方向と同じ方向に向か つて （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （II) の遺伝子領域をコードする 塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、 上記 〔1〕 に記載の組換え D
N A。 〔3〕 (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコード する塩基配列の転写方向が逆方向であることを特徴とする、 上記 〔1〕 に記載の 組換え D N A。
〔4〕 (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコード する塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ、 当該転写方向と同じ方向に向 かって （II) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （I) の遺伝子領域をコードす る塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、 上記 〔1〕 に記載の組換え D N A。
〔5〕 組換え D N Aが、 プラスミドである、 上記 〔1〕 から 〔4〕 のいずれか に記載の組換え D N A。
〔6〕 上記 〔1〕 から 〔5〕 のいずれかに記載の組換え D N Aにより形質転換 された形質転換細胞。
〔7〕 上記 〔1〕 から 〔5〕 のいずれかに記載の組換え D N Aと、
ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列おょぴ当該ヒダントインラ セマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調 節する t r pプロモーター配列を有する組換え D N Aと、
によつて形質転換された形質転換細胞。
〔8〕 上記 〔1〕 から 〔5〕 のいずれかに記載の組換え D N Aが低コピーな組 換え D NAであり、 ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および 当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマー ゼ遺伝子の発現を調節する t r pプロモーター配列を有する組換え D NAが高コ ピーな組換え D N Aである 〔7〕 に記載の形質転換細胞。
〔9〕 組換え D NAの宿主がェシエリヒア コリである、 上記 〔6〕 から 〔8〕 のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔1 0〕 上記 〔6〕 に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、 培地中および Z または形質転換細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質およぴカルバ ミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、 混合タンパク 質の製造方法。 .
〔1 1〕 上記 〔7〕 に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、 培地中および/ または形質転換細胞中に、 ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、 カルバミ ラーゼ活性を有するタンパク質およびヒダントインラセマーゼ活性を有するタン パク質を蓄積させることを特徴とする、 混合タンパク質の製造方法。
〔1 2〕 上記 〔6〕 から 〔9〕 のいずれかに記載の形質転換細胞を培地中で培 養して培養物を得、 当該培養物に 5置換ヒダントインを混合してァミノ酸を生成 させることを特徴とするアミノ酸の製造方法。 図面の簡単な説明
第 1図は、 HHa s eと CHa s eのプラスミド上での挿入位置および方向を 示す図である。
第 2図は、 t r pプロモータカセット 1および 2を示す図である。
第 3図は、 p T r pH f C f の作製を示す図である。
第 4図は、 p T r p C r H f の作製を示す図である。
第 5図は、 p T r p H r C rの作製を示す図である。
第 6図は、 ； pT r p 4Rの作製を示す図である。
第 7図は、 p T r p 8 CHの作製を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について、 1. 組換え DNA等、 2. 酵素タンパク質の製造、 3. アミノ酸の製造方法、 の順により詳細に説明する。
1. 組換え DNA等
本発明の組換え D N Aは以下の（I)および（II)の遺伝子領域をコードする塩基配 列を有する。
(I) HHa s e遺伝子をコードする塩基配列と、 当該 HH a s e遺伝子をコード する塩基配列の上流部に位置し当該 HHa s e遺伝子の発現を調節する t r pプ 口モーター配列とを含む遺伝子領域 （以下 「t r p+HHa s e J と記載する場 合がある。 また図面においては t r pプロモーターを 「P t r p」 と表示する。） (II) CHa s e遺伝子をコードする塩基配列と、 当該 CHa s e遺伝子をコー ドする塩基配列の上流部に位置し当該 CH a s e遺伝子の発現を調節する t r p プロモーター配列とを含む遺伝子領域 （以下 「t r p+CHa s e」 と記載する 場合がある。）
すなわち、 本発明の組換え DN Aは、 HHa s eおよび CHa s eのそれぞれ を発現させるためのプロモーターとして、 t r pプロモーターを採用したもので ある。 t r pプロモーターは、 トリプトファンの生合成に関与するいくつかの酵 素をコードする遺伝子群の上流に存在するプロモーターであり、 大腸菌などに存 在する。 本発明では、 t r pプロモーターとして既に知られているものを用いて もよい。 t r pプロモーターは、 t r ρプロモーターを含むクローユング用べク ターあるいはこのようなベクターを含む細胞の形態で市販されている。 t r pプ 口モーターを用いることにより、 HHa s eおよび CHa s eの発現量を十分に 得ることができる。 また、 t r pプロモーターはラムノ一スプロモーターにおけ るラムノース添カ卩のような誘導剤を添カ卩を要しない。 したがって、 アミノ酸製造 を行う生産工程において ft導剤添加に伴う種々の工程または処理を省くことがで きる。 さらに、 t r pプロモーターは、 グルコースによって抑制されないので、 工業的規模でのァミノ酸製造で形質転換微生物を高密度培養するためにダルコ一 スを用いても、 酵素の発現量が抑制されずにすむ。
ベクターなどの組換え DNAに、 HHa s eをコードする塩基配列を有する D NA (以下 「HHa s eをコードする DNA」 と表記しても同じ意味である。 C Ha s e等について同じ） および CHa s eをコードする D N Aを組み込む際に は ·、 その挿入向きと順序に関し以下の 3種の形態がある。
(第 1の形態） （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領 域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ当該転写方向と同じ 方向に向かって （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （II) の遺伝子領域を コードする塩基配列の順になるように組み込む （図 1の①)。 すなわち、 図 1の① では、 「 t r p+HHa s e J 遺伝子領域、 「t r p + CHa s e」 遺伝子領域と もに転写方向が左から右向きであり、 その順序が左から 「t r p+HHa s e」 遺伝子領域、 「t r p + CHa s e」 遺伝子領域の順に配置される。 なお、 図 1に おいては、 HHa s e、 CHa s e共に、 D体を特異的に基質とする D HH a s eおよび DCHa s eを例示している。
(第 2の形態） （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領 域をコードする塩基配列の転写方向が逆方向になるように組み込む （図 1の②）。 すなわち、 図 1の②においては、 「t r p+CHa s e」 遺伝子領域の転写方向が 右から左であり、 「t r p+HHa s e」 遺伝子領域の転写方向が左から右である。
(第 3の形態） （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領 域をコードする塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ、 当該転写方向と同 じ方向に向かって (II) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （I) の遺伝子領域 をコードする塩基配列の順となるように組み込む （図' 1の③）。 すなわち、 「t r p+HHa s e」 遺伝子領域おょぴ 「t r p+CHa s e」 遺伝子領域の 転写方向が共に右から左方向であり、 右から 「t r p+CHa s e」 遺伝子領域、 「t r p+HHa s e」 遺伝子領域の順に配置されている。
図 1に示す例において、 「P t r p」 とは t r pプロモーターのことである。 ま た、 「DHHa s e」 は D—ヒダントイナーゼ活性を有する HH a s eであり、 「DCHa s e」 は D—カルパミラーゼ活性を有する C H a s eである。 また、 矢印は、 矢印の方向に転写が進むことを意味する。
これら 3形態のうち、 最も HHa s'eおよび CHa s eの共発現が強いのは第 3 (図 1の③） の形態である。 すなわち、 第 3の形態は、 1つの組換え体の中に 2種の酵素遺伝子を有していながらこれらの共発現が最もバランス良く効率的に 行われる形態であり、 工業的にアミノ酸を大量生産するに特に好適である。
形質転換体を使つて 2種以上の酵素を発現させる場合、 1つの組換え D N Aに 1種の遺伝子のみのせ、 複数種の組換え DN Aを宿主に導入することも考えられ るが、 宿主でのコピー数の高低や組換え DNAの消失等により、 複数の遺伝子の 発現量にばらつきが生じる場合がある。 し力 し、 本発明では 1つの組換え DNA に 2つの酵素遺伝子を搭載して効率よく共発現させることができるため、 宿主の 分裂 ·増殖などによって HHa s eと CHa s eの発現量に偏りが生じたりする おそれが少ない。
また、 HHa s eおよび CHa s eを用いてアミノ酸を生産する場合、 両方の 発現量が高いことが望ましいが、 その反応系からすると、 1111& 3' 6と〇11& 3 eとを対比した場合、 相対的には CHa s eの活性がより高いことが効率よぃァ ミノ酸生産のためには望ましい。 このように 1つの組換え体に HHa s eおよび CH a s eをコードする 2種の遺伝子を搭載した場合、 それぞれの発現がァミノ 酸の工業的製造に適するようなバランスで生じることが望ましく、 この点におい ても第 3の形態が最も優良である。
本発明の組換え DNAに搭載される、 HHa s e、 CHa s eをコードする D NAは、 既知のものを用いてよい。 HHa s eは、 ヒダントイナーゼ活性を有す るタンパク質であればよく、 また CHa s eは、 力ルバミラーゼ活性を有するタ ンパク質であればよい。 光学活性を有するアミノ酸、 すなわち L一アミノ酸また は D—アミノ酸のいずれか一方を選択的に製造する場合には、 HHa s eおよび CHa s eのうち少なくとも一方に、 光学選択性を有するものを用いればよい。 酵素について光学選択性とは、 L体または D体のいずれか一方を特異的に基質と して反応を触媒するということである。
5置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する HHa s eは次のよう にして入手できる。 たとえば、 N—力ルバミル一 D—アミノ酸を生成する DHH a s eを有する菌としては、 バチルス属細菌に耐熱性の酵素の存在が知られてお り、 例としてバチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilu s)ATCC 3 1 1 95株等から HHa s eまたは、 HHa s e含有画分を調製す 31 /ばよレヽ（Appl. Microbiol. Biotechnol.43卷 270ページ、 199 5年）。 ATCC 3 1 1 95株は、 ァメリカン · タイプ - カルチャー · コレクション (Am erican Type Culture Collection^ 住所 12301 Parkla n Drive, Rockville, Mar yland 20852, United States of America) から入手することができる。 また、 L 体ヒダントイン化合物に特異的に作用する LHH a s eは、 例えばバチルス ェ スピー （Bacillus sp. ) A J 1 2299株にその存在が知られている （特開昭 6 3— 24894号公幸艮）。 バチノレス エスピー A J 1 2299株は、 1986年 7月 5日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、 受託番号 F E RM— P 8837が付与され、 2001年 6月 27日に独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) にブタペス ト条約に基づき移管され、 受託番号 FERM BP- 764 6が付与された微生物である。
光学選択性のない HH a s eは、 マイクロバクテリゥム リクエファシエンス (Microbacterium liquefaciens) A J 3912株のほか、 例えばアースロバクタ 一 オーレセンス (Arthrobacter aurescens) にその存在が知られている (J. Bi otechnol.6 1卷、 1ページ、 1 998年）。
N—力ルバミルァミノ酸を D体選択的に加水分解する C H a s eは、 たとえば シユードモナス エスピー （Pseudomonas sp. ) A J 1 1 220株にその存在が 知られて.いる（特公昭 56— 003034号公報）。 再同定の結果、 シユードモナ ス エスピー (Pseudomonas sp. ) A J 1 1 220株は、 ァグロパクテリゥム エスピー （Agrobacterium sp. ) に属することが判明している。 ァグロパクテリ ゥム エスピー A J 1 1220株は 1 977年 12月 20日に通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、 受託番号 FERM—； Ρ 4347が付 与され、 2001年 6月 27日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託 センターにブタペスト条約に基づき移管され、 受託番号 FERM BP- 7645 が付与された微生物である。 また N—力ルバミルァミノ酸を L体選択的に加水分 解する CHa s eは、 たとえばフラボバタテリゥム エスピー. （Flavobacteriu m sp.) AJ 39 1 2株 （特公昭 56— 008749号公報）、 バチルス
エスピー. (Bacillus sp. ) A J 12299株にその存在が知られている。 フラポ バクテリゥム エスピー. A J 39 12株は、 上述の通り現在ではマイクロバタ テジクム Vクェファシエンス (Microbacterium liquefaciens ) A J 391 2 株 （FERM—P 3133) に分類されているが、 1 975年 6月 27日に通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、 受託番号 FERM— P 3 133が付与され、 2001年 6月 27日に独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、 受託番号 FERM B P-7643が付与された微生物である。 またバチルス エスピー A J 12299 株は、 1986年 7月 5日に、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に 寄託され、 受託番号 FERM— P 8837が付与され、 200 1年 6月 27日に 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタぺスト条約に基づ き移管され、 受託番号 FERM B P- 7646が付与された微生物である。 また、 本発明の組換え DNAを用いたアミノ酸製造において、 組換え DNAに 搭載する HHa s eおよび CHa s eをコードする D N Aの好適な組み合わせと しては、 以下の HHa s eおよび CHa s eから選ばれる組み合わせが挙げられ る。 以下の組み合わせにより、 D—アミノ酸が選択的に生産される。
HHa s eをコードする DNAとして好ましくは、 以下の（i)から（iv)から選ば れる DN Aが挙げられる。 .
(i)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列を有する DNA、
(ii)配列表の配列番号 1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aと ストリンジヱントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する DNA、
(iii)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列をコードする DNA、
(iv)配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ 酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードする D NA、
などである。
CHa s eをコードする DNAとして好ましくは、 以下の（v)から（viii)から選 ばれる D N Aが挙げられる。 (v)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列を有する D N A、
(vi)配列表の配列番号 3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aと ストリンジェントな条件でハイブリダィズする塩基配列を有する DNA、
(vii)配列表の配列番号 4に記載のアミノ酸配列をコードする DNA、
(viii)配列表の配列番号 4に記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミ ノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付カ卩または逆位を含むアミノ酸配列をコードする DNA、
などを使用できる。
ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイプリッドが形 成され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に 数値化することは困難であるが、 一例を示せば、 相同性が高い DNA同士、 例え ば 50%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上の相同 性を有する DN A同士がハイブリダィズし、 それより相同性が低い DN A同士が ハイブリダィズしない条件、 あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗 いの条件である 60°C、 1 X S SC、 0. 10/0SDS、 好ましくは、 60° ( 、 0. 1 X S SC、 0. 1%SDS、 さらに好ましくは 65°C、 0. 1 XS SC、 0. 1 % S D Sに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件があげられる。
また、 「数個」 とは、 アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、 DHHa s e活 性または DCHa s e活性を大きく損なわない範囲のものであり、 具体的には、 2〜50個、 好ましくは 2〜30個、 さらに好ましくは 2〜 10個である。
上記の（i)〜（iv)から選ばれる DHHa s eと、 上記（v；)〜（viii)から選ばれる DCHa s eとの組み合わせは、 工業的に D—アミノ酸を大量生産すために必要 となる酵素活性を得るために特に有利である。
なお、 配列表配列番号 1および 3の DNAは、 フラボバクテリゥム エスピー (Flavobacterium sp. ) A J 1 1 199 (F E RM_ P 4229 ) 株の染色体 D N Aより単離、 取得されたものである （特公昭 56— 0251 19号公報）。 フラボ パクテリゥム エスピー（Flavobacterium sp.) A J 1 1.1 99 (FERM—P 4 229) 株は、 当初アル力リゲネス アクアマリヌス（Alcaligenes aquamarinu s)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された微生物であ るが、 再同定の結果、 ブラボパクテリゥム エスピー（Flavo acterium sp.)に分 類されることが判明した。 フラボパクテリゥム エスピー（Flavobacteriura sp.) A J 1 1 1 99株は、 昭和 52年 9月 29日に、 独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センターに寄託され、 受託番号 FERM—P 4229が付与され、 さらに 2002年 5月 30日に、 ブタぺスト条約に基づき、 独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センターに移管されて受託番号 F ERM B P-806 3が付与された微生物である。
HH a s e、 CH a s eおよび HR a s eをコードする遺伝子を搭載する組 3奐 え DNAは、 宿主細胞にこれらの遺伝子を導入するためのベクターであることが 望ましい。 そのようなベクターとしては、 具体的な例を挙げると、 pHSG系
(宝酒造 (株)製）、 pUC系 （宝酒造 （株） 製）、 p PROK系 （クローンテック 社製）、 p STV系 （宝酒造 (株)製）、 pTWV系 （宝酒造 (株)製)、 pKK233 一 2 (クローンテック社製）、 p BR 322系のプラスミ ド、 あるいはその誘導体 などが挙げられる。 ここで 「誘導体」 とは、 塩基の置換、 欠失、 挿入、 付加また は逆位などによってプラスミ ドに改変を施したものを意味する。 なお、 ここでい う改変とは、 変異剤や UV照射などによる変異処理、 あるいは自然変異などによ る改変をも含む。 上記プラスミ ド並びにその誘導体は、 複製開始点の種類により、 宿主細胞内でのコピー数が異なり、 高コピープラスミ ドとしては、 pHSG系、 pUC系、 p PROK系のプラスミ ドが挙げられ、 低コピープラスミ ドとしては、 p STV系、 p TWV系、 pKK233系、 p B R 322系のプラスミ ドが挙げ ら る。
また、 生産量を増大させるためには、 タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列 であるターミネータ一を連結することが好ましい。 このようなターミネータ一と しては、 r r nBターミネータ一、 T7ターミネータ一、 i dファージターミネ 一ター、 T 4ターミネータ一、 テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ一、 大腸菌 t r p A遺伝子のターミネータ一、 などが挙げられる。 また、 r r ιιΒタ 一ミネ一ターなどは、 プラスミ ドの安定性を良くするという点でも好ましレ、。 また、 形質転換体を選別するために、 該ベクターはアンピシリン耐性遺伝子、 カナマイシン耐性などのマーカーを有することが好ましい。
プロモーター、 HH a s eをコードする DNAおよび CH a a s eをコードす る DNA、 ターミネータ一を所定の配置になるように連結した DNA断片と、 ベ クタ一 DN Aとを連結して組換え DN Aを得ることができる。
上記のようにして得られた組換え DNAを宿主細胞に導入して形質転換体が得 られる。 組換え DNA技術を用いてタンパク質を大量生産する場合、 形質転換さ れる宿主細胞としては、 細菌細胞、 放線菌細胞、 酵母細胞、 カビ細胞、 植物細胞、 動物細胞などを用いることができる。 一般には、 大腸菌 （腸内細菌） を用いてタ ンパク質を大量生産する技術について数多くの知見があるため、 大腸菌 （腸内細 菌）、 好ましくはェシエリヒア コリが用いられる。 特に、 ェシエリヒア コリ J M 109株、 特に （DE 3) 株が好ましい。
下記にて詳説するが、 本発明のアミノ酸製造方法における他の形態としては、 HH a s eおよび CH a s eと共に、 HR a s eも用いる形態が挙げられる。 こ の場合、 HRa s eも形質転換体によって生成させ、 アミノ酸の製造に用いるこ とができる。 すなわち、 HR a s eをコードする DNAを有する組換え DNAを 作製し、 当該組換え DNAを宿主細胞に導入して形質転換させる。 ' 本発明においては、 HR a s eをコードする DNAとして公知のものを用いて もよいが、 好ましいものとしては、 以下のものが挙げられる。
(ix)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列を有する D N A、-
(X)配列表の配列番号 5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有する D N Aとス トリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する D N A、
(xi)配列表の配列番号 6に記載のアミノ酸配列をコードする DNA、
(xii)配列表の配列番号 6に記載のァミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ 酸を残基の置換、 欠失、 揷入、 付加または逆位を含むアミノ酸をコードする DN A、
などが挙げられる。 「ス トリンジェントな条件」、 「数個」 の意味は上記 HHa s e 等をコードする D N Aについて説明したものと同様である。
なお、 配列表の配列番号 5の DN Aは、 マイクロバクテリゥム リクエファシ エンス （Microbacterium liquefaciens ) A J 39 1 2株から単離'精製された ものである。 マイクロバタテリゥム リクエファシエンス （Microbacterium liq uefaciens ) A J 39 1 2株は、 当初フラボパクテリゥム エスピー. (Flavoba cterium sp. ) A J 3912 (FERM— P 31 33) 株として 1975年 6月 27日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、 再同定 の結果オーレ才 / クテリクム リクエファヽン : ンス (Aureobacterium liquefacie ns ) に分類されることが判明した。 さらに現在では、 種名変更により、 オーレォ パクテリゥム リクエファシエンス (Aureobacterium liquefaciens ) はマイク ロバクテリウム リクエファシエンス （Microbacterium liquefaciens ) に分類 され、 マイクロノくクテリゥム リクエファシエンス (Microbacterium liquefaci ens ) A J 391 2 (国内寄託蕃号 F E RM— P 3 1 33、 国際寄託番号 F E R M BP— 7643) として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン ターに寄託されている。
HR a s eをコードする DNAを搭載する組換え DNAにおいても、 HR a s eをコードする DNAの発現を調節するプロモーターとして、 t r pプロモータ 一を用いることが好ましい。 また、 HR a s eが組み込まれた組換え DN Aにお いても、 好ましいターミネータ一、 ベースとなる糸且換え DNA、 選択のためのマ 一力一、 宿主などは、 HHa s e等を搭載する組換え DNAの場合と同様である。
HRa s eをコードする DNAを有する組換え DNAは、 HHa s eをコード する DNAおよび CH a s eをコードする DNAが導入された宿主細胞に導入し て、 発現させることができる。 このようにすることにより、 1つの形質転換体を 用いて、 アミノ酸生産に必要となる 3種の酵素を発現させることができ、 複数の 形質転換体を扱うよりも作業が軽減される。 ただし、 この場合には、 HR a s e をコードする DNAを有する組換え DNAは、 HH a s e等をコードする DNA を搭載する組換え DN Aとは別個に作製することが望ましい。 酵素遺伝子の大き さなどからすると、 3種の酵素遺伝子を 1つの組換え D N Aに搭載したものを作 製することは実用性が低い。 したがって、 HR a s eも発現させる場合には、 2 種の組換え DN Aが導入された形質転換体を作製することが望ましい。
また、 一般に、 2種以上の高コピー組換え DNAを 1つの宿主細胞内で同時に 発現させることは困難であるため、 2種の組換え DN Aを導入する場合には、 い ずれか一方の組換え DNAを高コピー性の組換え DNAとし、 他方は相対的に低 コピー性の組換え DN Aとすることが好ましい。 どちらの組換え DN Aを高コピ 一性の組換え DNAとするかは、 各 DNAによって生産される酵素量、 プラスミ ドの安定性等を勘案し、 決定する。 本発明の組換え DNAを用いてアミノ酸生産 をするにあたっては、 HR a s eを有する組換え DNAを高コピーな組換え DN A、 HH a s eおよび CH a s eを有する組換え D N Aを低コピーな組換え D N Aとすることが好ましい。 高コピーか否かは、 各組換え DN Aごとに形質転換体 を作製し、 それぞれの形質転換体により生成される酵素の活性を測定して判断す ることができる。
なお、 本発明におけるプラスミド、 DNA断片、 種々の酵素、 形質転換体の作 製、 形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、 MOLECULAR CLONING, A LAB ORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、 1 9 8 9、 COLD SPRING HARB OR LABORATORY PRESS等の既知の手法に従って行うことができる。
2. 酵素タンパク質の製造方法
上記のような、 糸且換え DNAにより形質転換された細胞を培養することにより、 HH a s eおよび CH a s e、 さらに HR a s eをコードする D N Aを導入した 場合には HR a s eが発現生産される。 生産培地としては、 M9—力ザミノ酸培 地、 LB培地など、 大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。 よ り具体的な培養条件、 生産誘導条件は、 用いたベクターのマーカー、 宿主菌など の種類に応じて適宜選択する。 培養した形質転換細胞を遠心分離操作などにより回収した後、 形質転換体を破 砕あるいは溶菌させ、 HH a s eおよび/または C H a s eを回収し、 粗酵素液 として使用することができる。 破砕には超音波破碎、 フレンチプレス破砕、 ガラ スビーズ破砕などの方法を用いることができ、 また溶菌させる場合には卵白リゾ チームや、 ぺプチターゼ処理、 または、 これらを適宜組み合わせた方法が用いら れる。 さらに、 必要に応じて、 通常の沈澱、 濾過、 カラムクロマトグラフィーな どの手法により、 これらの酵素を精製して用いることも可能である。 この場合、 これらの酵素の抗体を利用した精製法も利用できる。
また、 タンパク質を組み換え D N A技術を用いて大量生産するには、 該タンパ ク質を生産する形質転換体内で該タンパク質が会合し、 タンパク質の封入体 （in elusion body) を形成させることも好ましい形態として挙げられる。 この発現生 産方法の利点は、 目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化 から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって 簡単に精製できる点等である。
このようにして得られるタンパク質封入体は、 タンパク質変'ト生剤により可溶化 され、 主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、 正しく折り 畳まれた生理的に活性なタンパク質に変換される。 例えば、 ヒトインターロイキ ン一 2の活性再生 （特開昭 6 1— 2 5 7 9 3 1号公報） 等多くの例がある。
タンパク質封入体から活性型タンパク質を得るためには、 可溶化 ·活性再生等 の一連の操作が必要であり、 直接活性型タンパク質を生産する場合よりも操作が 複雑になる。 しかし、 菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパク質を菌体内で大 量に生産させる場合は、 不活性なタンパク質封入体として菌体内に蓄積させるこ とにより、 その影響を抑えることができる。
目的タンパク質を封入体として大量生産させる方法として、 強力なプロモータ 一の制御下、 目的のタンパク質を単独で発現させる方法の他、 大量発現すること が知られているタンパク質との融合タンパク質として発現させる方法がある。 さらに、 融合タンパク質として発現させた後に、 目的のタンパク質を切り出す ため、 制限プロテア一ゼの認、識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。 タンパク質封入体が形成される場合には、 変性剤で融合タンパク質として回収 されたタンパク質封入体を可溶化する。 菌体タンパク質とともに可溶化してもよ いが、 以降の精製操作を考慮すると、 封入体を取り出して、 これを可溶化するの が好ましい。 封入体を菌体から回収するには、 従来公知の方法で行えばよい。 例 えば、 菌体を破壊し、 遠心分離操作等によって封入体を回収する。 タンパク質封 入体を可溶化させる変性剤としては、 グァニジン塩酸 （例えば、 6M、 pH5〜
8) や尿素 （例えば 8M) などが挙げられる。
これらの変性剤を透析等により除くと、 活性を有するタンパク質として再生さ れる。 透析に用いる透析溶液としては、 トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを 用いればよく、 濃度としては 2 OmM〜0. 5M、 p Hとしては 5〜 8が挙げら れる。
再生工程時のタンパク質濃度は、 500 μ gZm 1程度以下に抑えるのが好ま しい。 再生した酵素タンパク質が自己架橋を行うのを抑えるために、 透析温度は 5°C以下であることが好ましい。 また、 変性剤除去の方法として、 この透析法の ほか、 希釈法、 限外濾過法などがあり、 いずれを用いても活性の再生が期待でき る。 '
3. アミノ酸の製造方法
本発明のァミノ酸製造方法では、 上記のように HH a s e等が組み込まれた組 換え DNAを導入して得た形質転換細胞を培地中で培養して、 HHa s e等の酵 素を生成させた培養物を得、 当該培養物に 5置換ヒダントインを混合してァミノ 酸を生成させることによりアミノ酸を製造する。 培養物は、 HHa s eおよび C Ha s eをコードする DNAを導入した場合には、 HHa s eおよび CHa s e が含まれるようにすればよレ、。 また、 加えて HR a s eをコードする DNAを導 入した場合には HR a s eも含まれるようにすればよい。 これらの所定の酵素が 含まれていれば、 培養物の形態は特に限定されない。 すなわち、 形質転換体を含 む培地に 5置換ヒダントインを直接添加してもよいし、 培地から分離された菌体 などの形質転換体、 形質転換体の洗浄物、 形質転換体を破碎処理あるいは溶菌処 理等した処理物、 HHa s e等を回収した粗酵素液、 さらに精製した酵素液など と、 5置換ヒダントインとを混合することにより、 所望のアミノ酸を生産するこ とができる。
HHa s eおよび CHa s eを用いて、 5置換ヒダントインからアミノ酸を生 成する反応工程を下記化学式 （I) に示す。
Figure imgf000020_0001
5置換ヒダントイン N-力ルバミルアミノ酸 アミノ酸
… (I) 光学活性を有するアミノ酸を製造するには、 光学選択性を有する HHa s eを 用いることにより、 N—力ルバミル一 L一アミノ酸または N—力ルバミル一 D— アミノ酸のいずれかを生成させ、 さらに力ルバミルアミノ酸に CHa s eを作用 させて、 光学活性アミノ酸を製造することができる。
また、 HHa s eに光学選択的加水分解活性がなくとも、 CHa s eに光学選 択性があれば、 生成ァミノ酸は D型もしくは L型の光学活性体を得ることができ る。 この場合、 反応液中には未反応のェナンチォマーである N—力ルバミルアミ ノ酸、 すなわち CHa s eが N—力ルバミル一L一アミノ酸を選択的に分解し L —アミノ酸を生成させる場合には N—力ルバミル一 D—アミノ酸が、 また逆に D 一アミノ酸を生成させる場合には N—力ルバミル一 L一アミノ酸が、 それぞれ残 存することが想定される。 しかしながら、 このような場合において HHa s eは、 残存する とになる未反応ェナンチォマーの N—力ルバミルアミノ酸を脱水縮合 させ、 再度 5置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒 するので、 HHa s e、 光学選択性の高い CHa s eの 2種の酵素、 もしくは 2 種の酵素含有物により、 高収率 （モル収率 50 %以上） で光学活性ァミノ酸を製 造することが可能となる。
H H
次に、 D L 5置換ヒダントインから光学活性ァミノ酸を生成する反応の例とし て、 HR a s CNI e o Hを用いて D—アミノ酸を光学選択的に生成する反応を、 化学式（I I)に示す。
し体
Figure imgf000021_0001
L - 5置換ヒダントイン ヒダントイン
フセマ一セ
HRase
R N-カルパミルアミノ酸
D-ヒダントイナーゼ
HC— COOH -D -ハイドロラーゼ
D体 ► ： - HC— COOH
D-HHase HN— C— NH2 D-CHase
ヽ II NH2
0
0
D-5置換ヒダントイン N -力ルバミル一 D—アミノ酸 D -アミノ酸
( Π )
H R a s eを用いた場合、 下記反応式 （II) に示すように、 混合タンパク質に 含まれ H R a s eが 5置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、 D L 体の 5置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率 1 0 0 %で D—アミノ酸 を製造することが可能となる。
本発明のアミノ酸製造においては、 HH a s eまたは HR a s eの基質となる 5置換ヒダントイン化合物が用いられる。 5置換ヒダントイン化合物の具体例と しては、 ヒダントイン、 5—メチルヒダントイン、 5—ベンジルヒダントイン、 5 -- ( 4—ヒ ドロキシベンジ /レ) ヒダントイン、 5—インドリルメチルヒダント イン、 5— ( 3 , 4—ジヒ ドロキシベンジル） ヒダントイン、 5— （p—ハイ ド口 キシベンジノレ） ヒダントイン、 5 一 ( 3，一ピリジノレ) 一メチノレヒダントイン、 5 —メチノレチォェチノレヒダントイン、 5ーィソプロピノレヒダントイン、 5—イソブ チノレヒダントイン、 5— s e c—ブチノレヒダントイン、 5—力ノレボキシェチノレヒ ダントイン、 5一カルボキシメチルヒダントイン、 5— ( 4—アミノブチル） ヒ ダントイン、 5—ヒドロキシメチルヒダントインなどに代表されるような天然型 アミノ酸に対応する 5置換ヒダントイン化合物の他、 5—フエニルヒダントイン、 5一 ( 4ーヒ ドロキシフエ-ル) ヒダントイン、 5—メ トキシメチルヒダントイ ン、 5一べンジロキシメチノレヒダントイン、 5一 ( 3， 4—メチレンジォキシベン ジル） ヒダントイン、 ジヒドロウラシルなどに代表されるような非天然型のァミ ノ酸若しくはその誘導体に対応する 5置換ヒダントインなどが挙げられる。
なお、 上記の酵素タンパク質を用いて N—力ルバミルアミノ酸を製造すること も可能である。 例えば、 上記混合タンパク質に、 L—又は D— C H a s eの阻害 剤等を添加して加水分解反応を N—力ルバミルアミノ酸で止めることにより、 N —力ルバミルアミノ酸を製造できる。
組換え D N Aによって形質転換された細胞の培養液、 分離菌体、 洗浄菌体、 菌 体処理物、 当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてァミノ 酸生成反応を進行させる場合には、 5置換ヒダントイン化合物と培養液、 分離菌 体、 洗浄菌体、 菌体処理物、 粗酵素液、 または精製酵素を含む反応液を 2 5〜4 0 °Cの適当な温度に調整し、 p H 5〜9に保ちつつ、 8時間〜 5日静置または攪 拌すればよレ、。
また、 組換え D N Aによつて形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しなが ら、 アミノ酸生成反応を進行させる場合には、 5置換ヒダントイン化合物を含み、 かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機イオンなどの栄養 ' 素を含む水溶性媒体が用いられる。 さらにビタミン、 アミノ酸等の有機微量栄養 素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。 5置換ヒダントイン化合物 は分割添加してもよレ、。 好気的条件下で p H 5〜 9、 温度 2 5〜 4 0 °Cの適当な 範囲に制御しつつ、 8時間〜 5日培養することが好ましい。
培養液あるいは反応液中の D—ァミノ酸の定量は周知の方法を用いて速やかに 測定することができる。 即ち、 簡便には Merck製の HPTLC CHIRなどを利用した薄層 ク.口マトグラフィーを利用することができ、 より分析精度を高めるには、 ダイセ ル化学工業製の CHIRALPAK丽などの光学分割力ラムを利用した高速液体ク口マト グラフィー （HPLC) を用いればよい。
生成したアミノ酸は、 公知の手法により分離精製することができる。 例えば、 イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、 これを溶離後晶析する 方法または溶離後、 活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。 大腸菌などの形質転換体を培養する条件にも左右されるが、 概算として、 t r Pプロモータを用いた本発明の組換え DNAを用いることにより、 ラムノースプ 口モーターなどの他のプロモーターを用いた場合に比べて、 約 5倍程度の生産性 (単位時間あたりのアミノ酸の生産量） の向上が可能である。 実施例
以下、 実施例 1〜実施例 8を参照して本発明をさらに説明する。 尚、 本発明は 実施例の記載に限定されない。
(実施例 1) A J 1 1 1 99株由来 D—ヒダントイナーゼ遺伝子の E. c o
1 iにおける発現
1. 発現プラスミ ドの構築
1 - 1. t r pプロモーター搭載プラスミ ドの構築
p HS G 298 (T a k a r a社製） を E c o R I /Kp n Iにて処理し、 得 られた DNA断片と t r pプロモーターカセット 1 (図 2) をライゲーションし、 このライゲーシヨン溶液で E. c o 1 i JM109を形質転換した。 カナマイ シン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 目的のプラスミ ドを pT r p 298EKと命名した。 なお、 配列表配列番号 21には、 図 2に示され る t r pプロモーターカセット 1の上側の鎖について記載した。
1一 2. D—ヒダントイナーゼ遺伝子搭載プラスミ ドの構築
フラボバタテリゥム エスピー (Flavobacteriura sp. ) A J 1 1 1 99株の染 色体 DN Aを鎵型として、 表 1に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして P CR (①〜④のいずれかと⑤との組み合わせで、 計 4種） により目的遺伝子を増 幅した。 これらの断片を Kp n I b a Iにて処理し、 得られた DNA断片と p T r p 2 9 8 EKの Kp n I /X b a I処理物をライゲーションした。 このラ ィゲーション溶液で E. c o 1 i JM1 0 9を形質転換し、 カナマイシン耐性 株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 ①〜④のいずれかと⑤とのプ ライマーで増幅した DNA断片を搭載する、 それぞれのプラスミ ドを p T r p 2 9 8 DHH a s e l、 2、 3、 4と命名した。 表 1. A J 1 1 1 9 9由来 D—ヒダントイナーゼ遺伝子の増幅に用いたプライ マ.一
Figure imgf000024_0001
2. 無細胞抽出液の調製
p T r p 2 9 8 DHH a s e 1、 2、 3または 4を有する各 E. c o 1 i J Ml 0 9を、 カナマイシン 1 0 0 μ g/m 1を含む L B培地 (2m l ) で 3 0。C、 1 6時間培養した。 得られた培養液 1 0 0 1を、 4m lの培地 I (カザミノ酸 1 %、 ぺプトン 1 %、 グルコース 1 %、 硫酸ァンモニゥム 0. 5 %、 リン酸一力 リウム 0. 1%、 リン酸二カリウム 0. 3 %、 硫酸マグネシウム 0. 0 5%、 力 ナマイシン 0. 0 1 % (pH7. 0)) に移し、 3 7。C、 1 6時間培養した。 培養 後、 1 m 1の培養液から遠心分離 （1 0， 000 g X 1 0m i n) により集菌し、 得られた菌体を 1 0 OmMリン酸カリウム緩衝液 （KPB、 pH7. 5) にて洗 浄した。 この洗浄菌体を 0. 5m l の同緩衝液に懸濁し、 超音波破砕 (2 OKH Z、 1 5m i n、 東湘電気製 UCW— 20 1) を行った。 この超音波破砕液を遠 心分離 （1 0， 0 00 g X 1 0m i n) し、 得られた上清を無細胞抽出液とした。
3. SD Sポリアタリルァミ ドゲル電気泳動による D—ヒダントイナーゼ遣伝 子発現の確認
無細胞抽出液 1 0 μ 1を S D Sポリアクリルアミドゲル （第一化学薬品製、 マ ルチゲル 1 0/20) に供し、 L a eme 1 1 iらの方法に従い、 電気泳動を行 つた。 その結果、 p T r p 2 9 8 DHHa s e 3を有する形質転換体の無細胞抽 出液のみに、 D—ヒダントイナーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
4. D—ヒダントイナーゼ活性測定
p T r p 2 9 8 DHH a s e 3を有する E. c o l i JM1 0 9を、 カナマ イシン 1 0 0 gZm 1を含む LB培地 （2m l ) で 30。C、 1 6時間培養した。 得られた培養液 0. 5 m 1を、 5 0m lの培地 I I (カザミノ酸 1 %、 ぺプトン 1。/0、 グルコース 0. 2 %、 硫酸アンモユウム 0. 5%、 リン酸一カリウム 0. 1 %、 リン酸ニ力リウム 0. 3 %、 硫酸マグネシゥム 0. 0 5 %、 硫酸マンガン 0. 0 1%、 カナマイシン 0. 0 1% (pH7. 0)) に移し、 3 7°C、 24時間 培養した。
'培養後、 5 m 1 の培養液から遠心分離 （1 0， 000 g X 1 0m i n) により集 菌し、 得られた菌体を 1 0 OmM KPB ( p H 7. 5) にて洗浄した。 この洗 浄菌体を 5 m 1の同緩衝液に懸濁し、 その 0. 1m lを 0. 9m lの基質溶液 ( 1 3 3 m g ./ d 1 D- 5—ベンジノレヒダントイン、 1. 1 mM Mn S〇4、 1 0 OmM KPB (pH7. 5)) に添カ卩し、 3 7 °Cにて 6 0分反応を行った。 反応後、 0. 1m l の反応液に、 0. 9m lの反応停止溶液 （1. 1 mM C u S04) を添加し、 遠心分離にて得られた上清を HP LC (カラム：キラルパック WH, 0. 4 6 X 2 5 c m, 溶出液： 1 mM C u S 04、 流速： 1. 5m l / i n、 温度： 5 0°C、 検出波長： 2 1 0 nm) に供し、 生成した N—力ルバミル — D— Pli eを定量した。 この条件にて、 1分間に 1 μモルの N—力ルバミル一 D— Ph eを生成する酵素量を 1 Uと定義した。 その結果、 T r p 298 DHH a s e 3を有する E. c o 1 i JM1 09 は、 培養液 lm l当り、 1. 5 Uの D—ヒダントイナーゼ活性を示した。
(実施例 2) A J 1 1 1 99株由来 D—力ルバミラーゼ遺伝子の E. c o 1 i における発現
1. D—力ルバミラーゼ遺伝子搭載プラスミ ドの構築
フラボパクテリゥム エスピー （Flavobacterium sp. ) A J 1 1 199株の染 色体 DNAを鍀型として、 表 2に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして P CR (①、 ②のいずれかと③との組み合わせで、 計 2種） により目的遺伝子を増 幅した。 これらの断片を Kp n I /X b a Iにて処理し、 得られた DNA断片と p T r p 298 EKの Kp n I /Xb a I処理物をライゲーシヨンした。 このラ ィゲーション溶液で E. c o 1 i JM1 09を形質転換し、 カナマイシン耐性 株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、 ①、 ②のいずれかと③とのプ ライマーで増幅した断片を搭載する、 それぞれのプラスミ ドを pT r p 298D CH a s e 1、 2と命名した。
次に: T r p 298 DCH a s e 1を E c o R I /X b a Iにて処理し、 t r pプロモーターと力ルバミラーゼ遺伝子が連結した DNA断片を得、 この DNA 断片を PHSG 299 (T a k a r a社製） の E c o R I ZX b a I処理物とラ ィゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM109を形質 転換し、 カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 そ のプラスミ ドを: pT r p 299DCHa s e 1と命名した。 表 2. A J 1 1 1 99由来 D—力ルバミラーゼ遺伝子の増幅に用いたプライマー
Figure imgf000026_0001
2. 無細胞抽出液の調製
pT r p 298DCHa s e 1、 2または pT r p 299DCHa s e 1を有 する各 E. c o l i JM109からの無細胞抽出液の調製は、 実施例 1記載の 無細胞抽出液の調製と同様の方法で行った。
3. S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動による D—力ルバミラーゼ発現の 無細胞抽出液 10 1を S D Sポリアクリルアミ ドゲル （第一化学薬品社製、 マルチゲル 10/20) に供し、 L a eme 1 1 iらの方法に従い、 電気泳動を 行った。 その結果、 pT r p 299DCHa s e lを有する形質転換体の無細胞 抽出液のみに、 D—力ルバミラーゼに相当するタンパク質のバンドを認めた。
4. D—力ルバミラーゼ活性測定
p T r p 299 DCH a s e 1を有する E. c o l i JM109の菌体調製 は、 実施例 1記載の酵素活性測定時と同様に行った。 得られた洗浄菌体を 5 m 1 の l O OmMKPB ( p H 7. 5) に懸濁し、 その 0. 1 m 1を 0. 9 m 1の基 質溶液 （458mg/d l N—力ルバミル一 D—： P h e、 100 mM KPB ( H 7. 5)) に添カ卩し、 37°Cにて 60分反応を行った。 反応後、 0. 1m l の反応液に、 0. 9m 1の反応停止溶液を添加し、 遠心分離にて得られた上清を HP LCに供し、 生成した D— P li eを定量した。 この条件にて、 1分間に 1 ^ モルの D— Ph eを生成する酵素量を 1Uと定義した。
その結果、 pT r p 2.99DCHa s e 1を有する E. c o l i JM109 は、 培養液 lm l当り、 0. 6 Uの D—力ルバミラーゼ活性を示した。
(実施例 3) A J 391 2由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子の E. c o l iにおける発現
1. 発現プラスミ ドの構築
1— 1. t r pプロモーター搭載プラスミ ドの構築
p HS G 298並びに pHSG299を E c oR I /X b a Iにて処理し、 得 られた DNA断片と t r pプロモーターカセット 2 (図 2) をライゲーシヨンし、 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM109を形質転換した。 カナマイ シン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 それぞれのプラスミ ドを p T r p 298 E X並びに pT r p 299 E Xと命名した。 なお、 配列表の 配列番号 22には、 図 2に示される t r pプロモーターカセット 2の上側の鎖に ついて記載した。
1 -2. ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミ ドの構築
マイクロパクテリゥム リタエファシエンス (.Microbacterium liquefaciens) A J 391 2株の染色体 DNAを铸型として、 表 3に示すオリゴヌクレオチドを プライマーとして PCR (①、 ②のいずれかと③との組み合わせで計 2種） によ り目的遺伝子を増幅した。 これらの断片を Xb a I/P s t Iにて処理し、 得ら れた DN A断片と p T r p 298 EX並びに p T r p 299 EXの Xb a lノ P s t I処理物をライゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o 1 i
J Ml 09を形質転換し、 カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有 する株を選択し、 ①、 ②のいずれかと③とのプライマーで増幅した断片を搭載す る、 それぞれのプラスミ ドを p T r p 298 HR a s e l、 2、 p T r p 299 HR a s e 1、 2と命名した。
次に、 p T r p 299HR a s e 2を E c o R I /P s t Iにて処理し、 t r pプロモーターとヒダントインラセマーゼ遺伝子が連結したひ N A断片を得、 こ の DNA断片を！） STV29 (T a k a r a社製） の E c 。R I/P s t I ^理 物とライゲーシヨンした。 このライゲーション溶液で E . c o 1 i JM 1 09 を形質転換し、 クロラムフエ二コール耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する 株を選択し、 そのプラスミ ドを; T r p 29HRa s eと命名した。 表 3. A J 391 2由来ヒダントインラセマ ^"ゼ遺伝子の増幅に用いたプライマ
5 '側 GCTCTAGAATGAGAATCCATGTCATC 配列番号 15
Xbal
5 '側 GCTCTAGAGCGATGCGTATCCATGTC 配列番号 16
Xbal
3 '側 GGCTGCAGCGCTCCTTCTCGTTAGAG 配列番号 17
Pstl
2. ヒダントインラセマーゼ活性測定
p T r p 298HR a s e lもしくは 2、 p T r p 299 HR a s e 1もしく は 2、 または p T r p 29HR a s eを有する E. c o l i JM109の菌体 調製は、 実施例 1記載の酵素活性測定時と同様に行った。 得られた洗浄菌体を 5 m lの l O OmM KPB (pH7. 5) に懸濁し、 その 0. 11111を0. 9 m 1の基質溶液 （1 33mg/d 1 D— 5—ベンジルヒダントイン、 100 mM KPB (pH7. 5)) に添カ卩し、 37 °Cにて 1 5分反応を行った。 反応後、 0 1 m 1の反応液に、 0. 9m lの反応停止溶液を添加し、 遠心分離にて得られた 上清を HP LCに供し、 生成した L一 5—ベンジルヒダントインを定量した。 こ の条件にて、 1分間に 1； uモルの L一 5—ベンジルヒダントインを生成する酵素 量を 1Uと定義した。 そのの結果を表 4に示す。 表 4. 各プラスミ ドを有する形質転換体のヒダントインラセマーゼ活性
Figure imgf000029_0001
(実施例 4) A J 1 1 999由来 D—ヒダントイナーゼ遺伝子おょぴ D—カル バミラーゼ遺伝子の E. c o l iにおける共発現
1. 共発現プラスミ ドの構築 1- 1. pTr pHf C f プラスミ ドの構築
pT r p 299DCHa s e lを铸型として、 表 5に示す①と②のオリゴヌク レオチドをプライマーとして PCRを行い、 得られた DNA断片を Xb a I /P s t I処理後、 p T r p 298 DHH a s e 3の： Xb a lZP s t l処理物とラ ィゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i J Ml 09を形質 転換し、 カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 そ のプラスミ ドを p T r pH f C f と命名した （図 3)。
■ 1— 2. p T r p C r H ίプラスミ ドの構築
T r ρ 299DCHa s e 1を鏡-型として、 表 5に示す①と②のオリゴヌク レオチドをプライマーとして P CRを行い、 得られた DNA断片を p GEM— T e a s yベクター (プロメガ社製) にライゲーションした。 このライゲーション 溶液で E. c o l i JM109を形質転換し、 ァンピシリン耐性株の中から目 的のプラスミ ドを有する株を選択し、 そのプラスミ ドを pGEMDCHa s e 1 と命名した。 次にこのプラスミ ドを E c o R Iにて処理し、 t r pプロモーター と力ルバミラーゼ遺伝子が連結した DNA断片を得、 この DNA断片を p T r p 298 DHH a s e 3の E c oR I処理物とライゲーシヨンした。 このライゲー シヨン溶液で E. c o l i J Ml 09を形質転換し、 カナマイシン耐性株の中 から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 そのプラスミ ドを pT r p C r Hf と命名した （図 4)。
1— 3. pT r pHr C rプラスミ ドの構築
P T r p 298 DHH a s e 3を铸型として、 表 5に示す①と③のオリゴヌク レオチドをプライマーとして P CRを行い、 得られた DNA断片を X b a I /P s t I処理後、 pTr p 299DCHa s e 1の Xb a I /P s t I処理物とラ ィゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM109を形質 転換し、 カナマイシン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 そ のプラスミ ドを P T r pHr C rと命名した （図 5)。 表 5. ヒダントイナーゼ遺伝子並びに力ルバミラーゼ遺伝子の増幅に用いたプラ イマ一
5 側 CGTCTAGATGTTGACAATTAATCAT 配列番号 18
Xbal
3 '側 CGCTGCAGTCAGACGGCGGCGATCAACCCGTA配列番号 1 9
Pstl
③ 3 '側 CGCTGCAGTCAGGCCGTTTCCACTTCGCCCGT配列番号 20
Pstl
2. 酵素活性測定
pT r pH f C f 、 pT r p C r Hf 、 p T r p H r C rの各プラスミ ドを有 する E. c o l i JM109の菌体調製は、 実施例 1の酵素活性測定時と同様 に行った。 得られた菌体懸濁液 0. 2m lを基質溶液 0. 8m l (0. 1 25 g / ά 1 D L—べンジノレヒダントイン、 1. 25 mM Mn S Ou 100 mM
KPB (pH7. 5)) に添加し、 37 °Cにて 60分反応を行った。 反応後、 0 1 m 1の反応液に、 0. 9m lの反応停止溶液を添加した。 遠心分離にて得られ た上清を HP L Cに供し、 生成した N—力ルバミル一 D— P h e並びに D— P h eを定量した。 その結果を表 6に示す。 いずれのプラスミ ドを有する形質転換体 においても、 D—ヒダントイナーゼ遺伝子並びに D—力ルバミラ一ゼ遺伝子の共 発現が認められた。
表 6. D—ヒダントイナーゼ遺伝子並びに D—力ルバミラーゼ遺伝子共発現菌の 各酵素活性
Figure imgf000031_0001
(実施例 5) D—ヒダントイナーゼ遺伝子、 D—力ルバミラーゼ遺伝子並びに ヒダントインラセマーゼ遺伝子の E. c o l iにおける共発現
P T r pHr C rを有する E. c o l i JM109に、 pT r p 29HR a s eを導入し、 2種のプラスミ ドを有する形質転換体を作製した。 この形質転換 体をカナマイシン 1 00 μ g/m 1、 ク口ラムフエニコ一ノレ 5 0 μ gZm 1を含 む L B培地 （4m l ) で 30 ° (、 1 6時間培養した。 得られた培養液 1 m 1を、 50m lの培地 I Iに移し、 3 5°C、 24時間培養した。 培養後、 1 m 1の培養 液から遠心分離 （1 0， 000 g X 1 0m i n) により集菌し、 得られた菌体を 1 0 OmM KPB (pH7. 5) にて洗浄した。 この洗浄菌体を 1 m 1の同緩衝 液に懸濁し、 0. 1m lの菌体懸濁液を 0. 9m lの基質溶液 （ 0 · 1 1 g/d 1 L一 5—ベンジルヒダントイン、 1. ImM Mn S04、 0. 1 1 % T r i r o nX— 1 00、 1 0 OmM KPB (p H 7. 5)) に添カ卩し、 3 7°Cにて 6 0分反応を行った。 反応後、 生成した D— P h eを定量したところ、 9 2. 7 mg/d 1の D— P h eが生成しており、 3酵素遺伝子の共発現を確認した。
(実施例 6 ) D—ヒダントイナーゼ遺伝子、 D—力ルバミラーゼ遺伝子並びに ヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いた D— P h eの生産
p T r pHr C r並びに; T r p 2 9HR a s eの 2プラスミ ドを有する E. c o l i JM1 09を、 カナマイシン 1 0 0 ^ g/m 1、 クロラムフエニコー ル 50 g / 1を含む L B培地 （50m l ) で 30 °C、 1 6時間培養した。 得 られた培養液 1 5 ni 1を 3 00 m 1の培地 III (カザミノ酸 1 %、 ぺプトン 1 %、 グルコース 2%、 硫酸アンモユウム 0. 5%、 リン酸一カリウム 0. 1 %、 リン 酸二力リウム 0. 3 %、 硫酸マグネシゥム 0. 0 5 %、 硫酸マンガン 0. 0 1 %、 カナマイシン 0. 0 1%、 クロラムフエ二コール 0. 00 5% (p H 7. 0)) に 移し、 J a r培養装置 （;pH 7. 0制御） を用いて 3 5° ( 、 1 5時間培養した。 得られた培養液 3 0m l (乾燥菌体重量 300 mg) を 2 70 m lの基質溶液
(5. 5 g/d 1 D L— 5—ベンジルヒダントイン、 1. l l mM Mn S O 4、 0. 1 1 % T r i r o nX- 1 00、 2 2 mM K P B (p H 7. 5)) に添加 し、 反応液の； Hを； H7. 5に保ちながら （I N N a OHと 2N H2S〇4に て調整）、 3 7。Cにて 44時間反応を行った。 その結果、 4. 1 3 g/d 1 (モル 収率 9 5%) の D— P h eの生成を認めた。 (実施例 7 ) D—ヒダントイナーゼ遺伝子、 D—力ルバミラーゼ遺伝子並びに ヒダントインラセマーゼ遺伝子共発現菌を用いた D— Ph eの生産 （抗生物質無 添加培養）
pT r pHr C r並びに p T r p 29 HR a s eの 2プラスミドを有する E. c o 1 i JM109を、 カナマイシン、 ク口ラムフエニコーノレを含まない L B 培地 （50m l) で 30 °C、 16時間培養した。 得られた培養液 1 5 m 1を 30 Om 1のカナマイシン、 クロラムフエ二コールを含まない培地 IIIにて J a r培養 装置 （pH7. 0制御） を用いて 35°C、 1 5時間培養した。 得られた培養液 3 0 m 1 (乾燥菌体重量 300 mg) を 270 m lの基質溶液 （ 5. 5 g / d 1
D L— 5—ベンジルヒダントイン、 1. 1 1 niM Mn S〇4、 0. 1 1 % T r i r o nX— 1 00、 22 mM K P B ( p H 7. 5)) に添加し、 反応液の p H を pH7. 5に保ちながら （IN Na〇Hと 2N H2S〇4にて調整）、 3 7 °C にて 44時間反応を行った。 その結果、 2. 06 g/d 1 (モル収率 48%) の D— P h eの生成を認めた。
(実施例 8)
1— 1. t r ρプロモーター及び r r n Bターミネータ一搭載プラスミ ドの構 ェシエリヒア コリ （Esherichia coli) W3 1 10染色体 DNA上の t r pォ ペロンのプロモーター領域を表 7に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCR (①と②の組み合わせ） により目的遺伝子領域を増幅し、 得られた D N A 断片を p GEM— T e a s yベクター (プロメガ製) にライゲーションした。 こ のライゲーション溶液で E. c o l i JM109を形質転換し、 アンピシリン. 耐性株の中から t r pプロモーターの方向が lacプロモーターと反対向きに挿入さ れた目的のプラスミドを有する株を選択した。
次にこのプラスミドを E c oO 109 l/E c oR Iにて処理して得られる t r pプロモーターを含む DNA断片と、 pUC 19 (Ta k a r a製） の E c o 01 09 1/E c oR I処理物とライゲーシ aンした。 このライゲーション溶液 で E. c o l i JMl 09を形質転換し、 アンピシリン耐性株の中から目的の プラスミ ドを有する株を選択し、 プラスミ ドを pT r p 1と命名した。
次に p KK 223- 3 (Am e r s h am Ph a rma c i a社製） を H i n d I I I /H i n c I Iにて処理し、 得られた r r nBターミネータ一を含む DNA断片と p T r p 1の H i n d I I I /Y v u I I処理物とライゲーション した。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JMl 09を形質転換し、 アン ピシリン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 プラスミ ドを p T r p 2と命名した。
次に p T r p 2を铸型として表に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCR (①と③の組み合わせ） により t r pプロモーター領域を増幅した。 この DNA断片をE c o O 109 I /N d e Iにより処理し、 pTr p 2の E c oO 109 1 ZN d e I処理物とライゲーションした。 このライゲーシヨン溶液で E . c o 1 i JMl 09を形質転換し、 アンピシリン耐性株の中から目的のプラス ミ ドを有する株を選択し、 このプラスミ ドを pT r p 4と命名した。
p S T V 28 (T a k a 1- a社製） の E c oO 109 lZPv u I処理して得 られる 2. 4 ]£ 1)の0 八断片、 pKK223— 3 (Am e r s h am P h a r ma c i a社製） を H i n d I I I /P v u Iにて処理して得られる 0. 9 k bの DNA断片、 及び p T r p 4の E c oO 109 I / i n d I I I処理によ つて得られる 0. 3 k bの DNA断片をライゲーシヨンした。 このライゲーショ ン溶液で E. c o l i JMl 09を形質転換し、 クロラムフエニコール麵 ·性株 の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択し、 プラスミ ドを pT r p 8と命名 し 。 表 7. t r pプロモーター領域の増幅に用いたプライマー
① 5' GTATCACGAGGCCCTAGCTGTGGTGTCATGGTCGGTGATC 配列番号 23
Eco0109I
3， 側 TTCGGGGATTCCATATGATACCCTTTTTACGTGAACTTGC 配列番号 24
Ndel
③ 3， 側 GGGGGGGGCATATGCGACCTCCTTATTACGTGAACTTG 配列番号 25
Ndel
1 - 2. ヒダントインラセマーゼ遺伝子搭載プラスミ ドの構築
マイクロノくクテリウム リク：！ファシエンス (Microbacterium liquefacien s) A J 3 9 1 2株の染色体 DN Aを錶型として表 8に示すオリゴヌクレオチドを プライマーとして PCRにより目的遺伝子を増幅した。 この断片を N d e I/E c o R Iにて処理し、 得られた DN A断片と p T r p 4の N d e I /E c o R I 処理物をライゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM1 0 9を形質転換し、 アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を 選択し、 プラスミ ドを p T r p 4 Rと命名した （図 6)。 なお、 図 6、 図 7中 r r nBターミネータ一を 「T r i- nB」 と表示する。
表 8. A J 3 9 1 2株由来ヒダントインラセマーゼ遺伝子の増幅に用いたプラ ィマー
Figure imgf000035_0001
1 - 3. D—ヒダントイナーゼ遺伝子おょぴ D—力ルバミラーゼ遺伝子搭載プ ラスミ ドの構築
p T r p H r C rを錶型として表 9に示すオリゴヌクレオチドをプライマーと して PC Rにより目的遺伝子を増幅した。 この断片を Nd e I/E c o R Iにて 処理し、 得られた DN A断片と p T r p 8の N d e I /Έ c o R I処理物をライ ゲーシヨンした。 このライゲーシヨン溶液で E. c o l i JM1 0 9を形質転 換し、 クロラムフエ二コール耐性株の中から目的のプラスミ ドを有する株を選択 し、 プラスミ ドを pT r p 8 CHと命名した （図 7)。 表 9. D—ヒダントイナーゼおよび D—力ルバミラーゼ遺伝子の増幅に用いた プライマー
Figure imgf000036_0001
1 -4. D—ヒダントイナーゼ遺伝子、 D—カノレバミラーゼ遺伝子並びにヒダ ントインラセマーゼ遺伝子共発現株の作製と、 D_P h e生産
p T r p 41 を有する£. c o l i JM109に、 pT r p 8 CHを導入し、 2種のプラスミ ドを有する形質転換体を作製した。 この形質転換体をアンピシリ ン 100 g /m 1、 ク口ラムフエニコ一ノレ 50 μ g /m 1を含む L B培地 ( 5 Om l ) で 30 °C、 1 6時間培養した。 得られた培養液 1 m 1を 300 m 1の培 地 I V (グルコース 2. 5%、 硫酸アンモニゥム 0. 5%、 燐酸 2水素 1力リウ ム 0. 14%、 クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0. 23%、 硫酸鉄 （I I) 7水 和物 0. 002%、 硫酸マグネシゥム 7水和物 0. 1 %、 硫酸マンガン 5水和物 0. 002%、 チアミン塩酸塩 0. 0001%、 アンピシリン 0. 01%、 クロ ' ラムフエ二コール 0. 005% (pH 7. 0)) に移し、. J a r培養装置にて p H 7. 0、 溶存酸素濃度 1. 5 p p m以上に制御しながら 33 °Cにて 24時間培養 した。 得られた培養液 1 5m lを 300m lの培地 V (グルコース 2. 5 %、 硫 酸アンモニゥム 0. 5%、 燐酸 0. 3%、 クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0. 2 3 %、 硫酸マグネシゥム 7水和物 0. 1 %、 硫酸鉄 （I I) 7水和物 0. 00
2 %、 硫酸マンガン 5水和物 0. 002%、 チアミン塩酸塩 0. 0001 %、 ァ ンピシリン 0. 01%、 クロラムフエ二コール 0. 005% (pH7. 0)) に移 し、 J a r培養装置にてρ Η7. 0、 溶存酸素濃度 1. 5 p p m以上に制御し、 培養 9時間以降グルコース 50。/。水溶液を 3. 5m 1 /h rにて添加を行いなが ら、 35 °Cにて 24時間培養した。 得られた培養液 1 5m l (乾燥菌体重量 60 Omg) を 285m 1の基質溶液 （5. 3 g/d 1 DL— 5—ベンジルヒダン トイン、 1. 05mM 硫酸マンガン、 21mM KPB ( H 7. 5)) に添カロ し、 反応液の pHを pH7. 5に保ちながら （IN Na OHと 2N H2S〇4に て調整）、 37°Cにて 48時間反応を行った。 その結果、 4. 15 g/d 1 (モル 収率 95%) の D— P li eの生成を認めた。
1-5. D—ヒダントイナーゼ遺伝子、 D—力ルバミラーゼ遺伝子並びにヒ ダントインラセマーゼ遺伝子共発現株による D— P h e生産 （抗生物質無添カロ 系）
pT r p 4R、 p T r p 8 CHの 2プラスミ ドを有する E. c o 1 i JM1 09を、 アンピシリン、 クロラムフエニコーノレを含まない、 LB培地 （50πι 1 ) で 30 °C、 1 6時間培養した。 得られた培養液 1m lをアンピシリン、 クロ ラムフエ二コールを含まない、 300m 1の培地 I Vに移し、 J a r培養装置に て pH7. 0、 溶存酸素濃度 1. 5 p pm以上に制御しながら 33°Cにて 24時 間培養した。 得られた培養液 15m 1をアンピシリン、 クロラムフエ二コールを 含まない、 300m 1の培地 Vに移し、 J a r培養装置にて pH7. 0、 溶存酸 素濃度 1. 5 p p m以上に制御し、 培養 9時間以降グルコース 50 %水溶液を 3. 5m 1 /h rにて添加を行いながら、 35°Cにて 24時間培養した。 得られた培 養液 1 5m l (乾燥菌体重量 600mg) を 285m lの基質溶液 （ 5. 3 g Z d 1 D L— 5—ベンジルヒダントイン、 1 · 05 mM 硫酸マンガン、 21m M KPB ( H 7. 5)) に添加し、 反応液の pHを pH7. 5に保ちながら
(1 N Na〇Hと 2N H2S〇4にて調整）、 37 °Cにて 48時間反応を行った。 その結果、 抗生物質無添加培養でも、 プラスミ ドの脱落がなく、 4. 15 g/d 1 (モル収率 95%) の D— P h eの生成を認めた。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ヒダントイナーゼ遺伝子および力ルバミラーゼ遺伝子が効率よ く共発現する組換え DNAが提供される。 また、 本発明により、 生産性の高いァ ノ酸製造を行うことができる (
名 称 受託 ^ 原ノ 、害託日 寄託先名称およぴ住所 および
国際寄託
移管日
Agrobacterium sp. FERM BP - 7645 原寄託日 ： 名称：
AJ 11220 1977年 12月 20日 独立行政法人産業技術総合研 国際害託移管 - 所特許 Φ物害託 ンター
2001年 6月 27日 住所：
日本国茨城県つくば市東 1丁 目 1番地 1 中央第 6
Microbacterium FERM BP- 7643 原寄託曰 ： 名称：
liquefaciens 1975年 6月 27日 独立行政法人産業技術総合研 AJ 3912 国際寄託移管日 ： 究所特許生物寄託センター
2001年 6月 27日 住所：
日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1 中央第 6
Flavobacterium sp. FERM BP- 8063 原寄託 13 ： 名称：
AJ 11199 1981年 5月 1日 独立行政法人産業技術総合研 国際寄託移管日 ： 究所特許生物寄託センター 2002年 5月 30日 住所：
日本国茨城県つくば市東 1丁 目 1番地 1 中央第 6

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （I) および （II) の遺伝子領域をコードする塩基配列を有する組換え D N A。
(I) ヒダントイナーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、 当該ヒダントイナーゼ遺 伝子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該ヒダントイナーゼ遺伝子の発現 を調節する t r pプロモーター配列とを含む遺伝子領域
(II) 力ルバミラーゼ遺伝子をコードする塩基配列と、 当該力ルバミラ一ゼ遣伝 子をコードする塩基配列の上流部に位置し当該力ルバミラーゼ遺伝子の発現を調 節する t r pプロモータ一配列とを含む遺伝子領域
2 . (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコードす る塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ当該転写方向と同じ方向に向かつ て （I) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （II) の遺伝子領域をコードする塩 基配列の順に配列されていることを特徴とする、 請求の範囲第 1項に記載の組換 え D N A。
3 . (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコードす る塩基配列の転写方向が逆方向であることを特徴とする、 請求の範囲第 1項に記 載の組換え D N A。
4 . (I) の遺伝子領域をコードする塩基配列と （II) の遺伝子領域をコードす る塩基配列の転写方向が同じ方向であり、 かつ、 '当該転写方向と同じ方向に向か つて （II) の遺伝子領域をコードする塩基配列、 （I) の遺伝子領域をコードする 塩基配列の順に配列されていることを特徴とする、 請求の範囲第 1項に記載の組 換え D N A。
5. 組換え DNAが、 プラスミ ドである、 請求の範囲第 1項から第 4項のいず れかに記載の組換え DNA。
6. 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれかに記載の組換え DNAにより形質 転換された形質転換細胞。
7. 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれかに記載の組換え D N Aと、 ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列および当該ヒダントインラ セマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の発現を調 節する t r pプロモーター配列を有する組換え DNAと、
によつて形質転換された形質転換細胞。
8. 請求の範囲第 1項から第 5項のいずれかに記載の組 え D N Aが低コピー な組換え DNAであり、 ヒダントインラセマーゼ遺伝子をコードする塩基配列お ょぴ当該ヒダントインラセマーゼ遺伝子の上流部に位置し当該ヒダントインラセ マーゼ遺伝子の発現を調節する t r pプロモーター配列を有する組換え DNAが 高コピーな組換え DN Aである、 請求の範囲第 7項に記載の形質転換細胞。
9. 組換え DNAの宿主がェシエリヒア コリである、 請求の範囲第 6項から 第 8項のいずれかに記載の形質転換細胞。
1 0. 請求の範囲第 6項に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、 培地中およ び Zまたは形質転換細胞中にヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質および力 ルバミラーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする、 混合タン パク質の製造方法。
1 1. 請求の範囲第 7項に記載の形質転換細胞を培地中で培養し、 培地中およ び/または形質転換細胞中に、 ヒダントイナーゼ活性を有するタンパク質、 カル バミラーゼ活性を有するタンパク質およぴヒダントインラセマーゼ活性を有する タンパク質を蓄積させることを特徴とする、 混合タンパク質の製造方法。
1 2 . 請求の範囲第 6項から第 9項のいずれかに記載の形質転換細胞を培地中 で培養して培養物を得、 当該培養物に 5置換ヒダントインを.混合してアミノ酸を 生成させることを特徴とするアミノ酸の製造方法。
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