WO2005054462A1 - 耐熱性を有する２，６−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼおよび２，６−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 - Google Patents

耐熱性を有する２，６−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼおよび２，６−ジヒドロキシ安息香酸の製造方法 Download PDF

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WO2005054462A1
WO2005054462A1 PCT/JP2004/016235 JP2004016235W WO2005054462A1 WO 2005054462 A1 WO2005054462 A1 WO 2005054462A1 JP 2004016235 W JP2004016235 W JP 2004016235W WO 2005054462 A1 WO2005054462 A1 WO 2005054462A1
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WO
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dihydroxybenzoic acid
producing
microorganism
reaction
decarboxylase
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/016235
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroko Shibamoto
Teruo Arii
Kiyoshi Ito
Nobuhiro Fukuhara
Tadao Oikawa
Masahiro Yoshida
Original Assignee
Mitsui Chemicals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a heat-resistant 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase that converts resorcinol to 2,6-dihydroxybenzoic acid and catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid.
  • the present invention also relates to an amino acid sequence of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase having heat resistance and a gene encoding the same.
  • the present invention relates to a recombinant plasmid containing a gene encoding a subunit of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase having heat resistance, and a transformed microorganism transformed with the plasmid.
  • a microorganism producing a heat-resistant 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase or a transformed microorganism is cultured, and the microorganism or culture supernatant thereof and the 2,6 provided as a processed product thereof are provided.
  • the present invention relates to a method for producing dihydroxybenzoic acid decarboxylase.
  • the present invention relates to a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid using the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase.
  • the present invention also relates to a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid using a microorganism or a processed product of the microorganism, and to a method for increasing the accumulated concentration of 2,6-dihydroxybenzoic acid.
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid is produced from resorcinol as a raw material
  • 2,3-dihydroxybenzoic acid is produced from catechol as a raw material by a carbonation reaction by a Kolbe-Schmidt method. That is, it is produced by a method in which carbon dioxide gas is reacted with a metal salt of resorcinol or catechol under high temperature and high pressure. According to this method, a mixture of the corresponding polyhydric alcohol aromatic carboxylic acids is formed, and the desired mixture is produced from the mixture. It is very difficult to separate and purify compounds. For this reason, various methods for selectively producing the target compound have been attempted, but have not yet been put to practical use.
  • a method for selectively introducing a carboxyl group at the 2-position of resorcin, catechol 3 As a method for regioselectively introducing a carboxyl group, a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid and 2,3-dihydroxybenzoic acid utilizing the catalytic action of microbial cells is known (Japanese Patent Application 2001-46093). No.). More specifically, as a microbial cell, a microorganism belonging to the genus Propionibacterium is used, and 2,6-dihydroxybenzoic acid is obtained by contacting with resorcinol in a carbonate buffer. This is a method for producing 2,3-dihydroxybenzoic acid by contacting with catechol.
  • the optimum temperature is as low as 40 ° C, which is unlikely to be a highly stable enzyme with excellent heat resistance.
  • Patent Document 1 JP 2001-46093 A
  • Non-patent Document 1 The 1st "Development of Basic Technology for Production Processes Utilizing Biological Functions" (Interim Evaluation) Business Ledger in Subcommittee (author New Energy and Industrial Technology Development Organization Biotechnology Development Office): HP address
  • Non-Patent Document 2 Abstracts of the 2003 Biotechnology Society of Japan Abstracts of the Japan Biotechnology Society (2003) (Issued August 25, 2003)
  • Non-Patent Document 3 Organic Synthesis (Org. Synth.) 11, P. 557 (1973)
  • Non-Patent Document 4 Journal of Chemical Society (J. Chem. Soc.) P. 3503 (1
  • Non-Patent Document 5 55th Annual Meeting of the Society of Biotechnology, Japan (issued August 25, 2003)
  • the present invention provides a 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase having heat resistance.
  • the present invention also provides an amino acid sequence of 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase having heat resistance and a gene encoding the same.
  • the present invention provides a recombinant plasmid containing a gene encoding a subunit of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase having heat resistance, and a transformed microorganism transformed with the plasmid.
  • a microorganism producing a heat-resistant 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase or a transformed microorganism is cultured, and the microorganism or its culture supernatant and the 2,6-dihydroxybenzoate provided as a processed product thereof are provided. It is intended to provide a method for producing acid decarboxylase.
  • the present invention provides a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid using the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase. Further, the present invention provides a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid which is advantageous for industrial implementation. Means for solving the problem
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid and 2,3-dihydroxybenzoic acid in order to solve the above-mentioned problems.
  • Microbial power belonging to Rhizobium) Resorcinol power It was found to have an activity of converting to 2,6-dihydroxybenzoic acid.
  • Various purification methods from microorganisms in which the activity was found The enzyme was purified by combining the enzymes, and the properties thereof were examined. As a result, it was found that the enzyme was an industrially advantageous 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase having heat resistance.
  • the amino acid sequence of the heat-resistant 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase and the gene encoding it are clarified, and the transformed microorganism transformed with a plasmid containing the gene expresses the enzyme. It was clarified that a transformed microorganism having activity could be obtained.
  • a microorganism producing heat-resistant 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase or the above-mentioned transformed microorganism is cultured, and the microorganism or its culture supernatant and the 2,6 provided as a processed product thereof are provided.
  • -A method for producing dihydroxybenzoate decarboxylase has been developed.
  • a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid using this 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase was developed.
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid, and found that a microorganism or a treated product of the microorganism was treated in an aqueous medium containing carbonate ions and Z or carbon dioxide. Regarding the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid by contacting resorcin, the following findings (1)-(3) were found.
  • the present invention provides an industrially advantageous 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase having heat resistance and a method for producing the same, whereby 2,6-dihydroxybenzoic acid, 2,3-dihydroxy
  • the present invention provides a method for producing benzoic acid.
  • the microorganism or the microorganism An object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid by adjusting reaction conditions in a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid using a treated microorganism.
  • the organic solvent to be added is one or more solvents selected from the group consisting of carbo-tolyl, alcohol, ether, ketone and sulfiel having 1 to 4 carbon atoms [1] Or the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid according to [2].
  • the organic solvent to be added is a group consisting of acetonitrile, isopropanol, butanol, geethylether, acetone, ethanol, ethylene glycolone, ethylene glycol monomethylethanol, glycerin, dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, tetrahydrofuran and methanol.
  • a method for producing benzoic acid comprising: A process for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid, which comprises allowing the reaction to proceed while suppressing resorcinol oxidation.
  • Subunit structure A homotetramer having a subunit molecular weight of about 37,500 daltons in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Substrate specificity Acts on 2,6-dihydroxybenzoic acid, but does not act on 3,4-dihydroxybenzoic acid or 3,5-dihydroxybenzoic acid.
  • Coenzyme It cannot be TPP, PLP, NAD +, NADP +, or coenzyme, and the enzyme has no coenzyme due to its absorption spectrum showing the absorption spectrum of a simple protein.
  • a 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • nucleotide sequence according to any one of [16] to [20], which belongs to the genus Rhizobium and has a nucleotide sequence at the 5′-terminal side of 16S rDNA derived from a microorganism containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase.
  • [25] Encodes a subunit of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase represented by the nucleotide sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing The gene to do.
  • nucleotide sequence according to any one of [24] to [26], which belongs to the genus Rhizobium and has a nucleotide sequence at the 5 'end of 16S rDNA derived from a microorganism containing the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. Gene encoding subunit of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase.
  • a microorganism producing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase according to any one of [16] to [23] or the transformed microorganism according to [31] is cultured, and the microorganism or a microorganism thereof is cultured.
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase produced by the method described in [32] is allowed to act on resorcinol in an aqueous solvent in the presence of carbonate ion and Z or diacid carbon in the presence of 2,2.
  • a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid comprising producing 6-dihydroxybenzoic acid and collecting 2,6-dihydroxybenzoic acid produced by the reaction from the aqueous solvent.
  • microorganism according to any one of [1] to [15], wherein the microorganism is a microorganism producing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase according to any one of [16] to [23].
  • the microorganism is a microorganism having the gene according to any one of [24] to [30] and expressing 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase based on the genetic information. [1] The method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid according to any one of [15].
  • the reaction selectivity is also utilized, and it is advantageous to carry out industrially in an extremely simple process.
  • the present invention provides a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid.
  • reaction conditions such as a solvent type and stability of a raw material during the reaction are adjusted.
  • the present invention provides a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid, which is capable of increasing the accumulated concentration of 2,6-dihydroxybenzoic acid produced thereby and which is advantageous for industrially implementing the method in a safe and simple process.
  • FIG. 1 is an electrophoretic photograph showing SDS-PAGE results of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase.
  • Lane i is the molecular weight marker
  • lane 2 is the purified enzyme solution of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase described in Example 1
  • lane 3 is the result of Example 7, and
  • lane 4 is the result of Comparative Example 4.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time in the concentration of 2,6-dihydroxybenzoic acid produced in a reaction solution.
  • diamonds indicate the results of Example 23, and squares indicate Comparative Example 8.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the concentration of 2,6-dihydroxybenzoic acid produced in the reaction solution described in Example 24.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the molar ratio (molar amount of 2,6-dihydroxybenzoic acid with respect to the sum of the molar amounts of resorcinol and 2,6-dihydroxybenzoic acid) in the reaction solution.
  • resorcinol is abbreviated as RS
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid is abbreviated as 2,6-DHBA.
  • the diamonds indicate the results of Example 33, and the squares indicate the results of Example 34.
  • the horizontal axis represents the reaction time (Hr).
  • FIG. 5 is a graph showing the change over time in the molar ratio (molar amount of 2,6-dihydroxybenzoic acid with respect to the sum of the molar amounts of resorcinol and 2,6-dihydroxybenzoic acid) in the reaction solution.
  • resorcinol is abbreviated as RS
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid is abbreviated as 2,6-DHBA.
  • the diamonds indicate the results of Comparative Example 9, and the squares indicate the results of Comparative Example 10.
  • the horizontal axis represents the reaction time (Hr).
  • the present invention relates to 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase having heat resistance.
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase refers to an enzyme that acts on 2,6-dihydroxybenzoic acid to catalyze the production of resorcinol and carbonic acid.
  • the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase of the present invention has all of the following logical properties (a) to (c).
  • Optimum temperature When a decarboxylation reaction is carried out at pH 8, the action is optimal at a temperature around 70 ° C.
  • the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase of the present invention preferably further has the following physicochemical properties (d).
  • the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase of the present invention more preferably has all of the following properties (e) to (i).
  • Substrate specificity Acts on 2,6-dihydroxybenzoic acid, but does not act on 3,4-dihydroxybenzoic acid or 3,5-dihydroxybenzoic acid.
  • the effect described in the above (a), that is, the decarboxylation activity of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase can be confirmed by measuring as follows.
  • the reaction is carried out at 30 ° C for 5 minutes in a total volume of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 100 ⁇ l of the enzyme solution and 9 mM of a substrate (eg, 2,6-dihydroxybenzoic acid) at pH 7.0.
  • the enzymatic activity can be measured by measuring the amount of a product (for example, resorcinol) generated by this reaction by HPLC.
  • HPLC method general reverse-phase chromatography using a silica gel packed column with octadecyl groups as the stationary phase and a mobile phase consisting of a mixture of water and acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid added thereto.
  • a method in which the detection is performed at a wavelength of about 280 nm by an ultraviolet partial photodetector can be exemplified.
  • the activity half-life which is one of the temperature stability indices of the enzyme according to the present invention described in (b), is defined as that the enzyme is dissolved in an aqueous medium and the enzyme is kept at a certain treatment temperature (for example, 50 ° C). In this case, the enzyme activity after treatment is 50% when the untreated enzyme activity is 100%.
  • This active half-life can be determined by performing a heat treatment under the following conditions.
  • the aqueous medium used in the heat treatment is a buffer having a salt concentration of ImM or more and 1 M or less, preferably a buffer having a salt concentration of ImM or more and 100 mM or less, more preferably 5 mM or more and 15 mM.
  • the type of the buffer is not particularly limited, but the buffer capacity is high at around pH 7!
  • An example is a potassium phosphate buffer.
  • the method of heat treatment is not particularly limited as long as it can be dissolved in an aqueous medium and the enzyme can be instantaneously treated at a specified temperature. For example, in a glass test tube with a cap of 15 mL in capacity, put the enzyme dissolved in 1.OmL of aqueous medium, immerse it in a water bath thermostat controlled at the specified temperature, and hold it for the required time while shaking. ,.
  • the activity half-life in a buffer of PH7.0 described here in a buffer solution of about 120 minutes at 50 ° C is about 20 minutes to 220 minutes, preferably 70 minutes to 170 minutes, more preferably 110 minutes to 130 minutes. It is as follows. Further, at 60 ° C, about 25 minutes means 10 minutes or more and 40 minutes or less, preferably 15 minutes or more and 35 minutes or less, and more preferably 20 minutes or more and 30 minutes or less.
  • the optimum temperature described in (c) can be easily determined by changing only the temperature in the above-described method for measuring the decarboxylation activity of 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase.
  • Around 70 ° C refers to a temperature between 45 ° C and 95 ° C, preferably between 55 ° C and 85 ° C, and more preferably between 65 ° C and 75 ° C.
  • the presence of carbonate ion and Z or diacid carbon is to allow the source of the carboxyl group to be added to resorcin to coexist in the aquatic solvent, and more specifically, sodium bicarbonate and sodium carbonate. Or a gaseous liquid or solid diacid carbon is blown into or added to the aquatic solvent. it can.
  • the presence or absence of the production of 2,6-dihydroxybenzoic acid can be measured by HPLC.
  • HPLC method general reverse-phase chromatography using a silica gel-packed column having an octadecyl group as the stationary phase and using a mixture of water and acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid as the mobile phase is used. For example, a method in which the detection is performed at a wavelength of about 280 nm by an ultraviolet partial photodetector can be exemplified.
  • the enzyme has a molecular weight of about 151,000 daltons in gel filtration chromatography.
  • About 151,000 daltons means 140,000 daltons-160,000 daltons Tons, preferably 145,000 daltons to 155,000 daltons.
  • the enzyme has a subcutaneous molecular weight of about 37,500 daltons in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • About 37,500 daltons refers to 33,000 daltons to 43,000 daltons, preferably 35,000 daltons to 40,000 daltons.
  • Molecular weight in gel filtration chromatography and molecular weight of subunit in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis It can be easily estimated that this enzyme is a homotetramer.
  • the substrate specificity described in (g) can be easily determined by changing only the substrate in the method for measuring the decarboxylation activity of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase described above. Acts on 2,6-dihydroxybenzoic acid, but not on 3,4-dihydroxybenzoic acid or 3,5-dihydroxybenzoic acid.
  • the optimal pH! / Can be easily obtained by changing only the pH in the method for measuring the decarboxylation activity of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase described above.
  • the action is optimal at a pH of about 8.0.
  • pH 8.0 means pH 6.0 or more and 9.0 or less, preferably pH 7.0 or more and 8.5 or less.
  • piperazine PH5-5.5
  • MES pH 5.5-6.5
  • potassium phosphate pH
  • Tris pH 8.0-9.0
  • CHES pH 9.0-10.0
  • the TPP and PLP were added to the reaction system. Therefore, the final concentrations of M, NAD +, and NADP + can be easily obtained by measuring the activity by adding force so that the final concentrations become ImM, and TPP, PLP, NAD +, and NADP + are all coenzymes. It was a powerful force.
  • the absorption spectrum of this enzyme is the absorption spectrum of simple protein. It is considered that there is no coenzyme from showing a tuttle.
  • the embodiment of the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase in the present invention is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • several amino acids have an amino acid sequence substituted, deleted, modified or inserted or added as long as 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase activity can be maintained.
  • the polynucleotide encoding 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase in the present invention comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 encodes the protein shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes not only the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, but also all base sequences based on different codons.
  • a polynucleotide homolog can be obtained by appropriately introducing substitution, deletion, modification, insertion or addition.
  • the homologue of the polynucleotide is the same as the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 except for substitution or deletion of a base within a range capable of maintaining the enzyme activity of 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase encoded thereby. It is obtained by loss or addition.
  • the homolog includes, for example, a polynucleotide having a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide having a complementary sequence to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • hybridization under the stringent conditions is, for example, Molecular Cloning: old Spring Harbor Laboratory
  • the membrane to which the DNA or RNA molecule to be tested has been transferred is hybridized according to the product protocol with the labeled probe in the hybridization buffer specified in the protocol. Haiburidize - yarn ⁇ Chillon buffer, 0.1 wt 0/0 SDS, 5 wt% dextran sulfate, consisting of a blocking reagent and 2-7 X SSC for 1Z20 soluble in the kit. Blocky For example, 100 X Denhardt's solution, 2% (weight Z volume) Bovin e
  • Serum albumin, 2% (weight Z volume) Ficll TM 400, 2% (weight Z volume) polybulpyrrolidone prepared at a 5-fold concentration can be diluted and used in 1Z20.
  • 20X SSC is a 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, and SSC is used at a concentration of preferably 3-6XSSC, more preferably 415XSSC.
  • the temperature of ibridization is 40-80 ° C, more preferably 50-70 ° C, and even more preferably 55-65 ° C. After incubation for several hours to overnight, washing is performed. Wash with buffer. The washing temperature is preferably room temperature, more preferably the temperature at the time of hybridization. 6 X SSC + 0.
  • 1 wt 0 / OSDS solution composition of the cleaning bar Ffa more preferably 4 X SSC + 0. 1 wt 0 / OSDS solution, more preferably 1 X SSC + 0. 1 wt 0 / OSDS solution , Most preferably 0.1 ⁇ SSC + 0.1 weight 0 / oSDS solution.
  • the membrane is washed with such a washing buffer, and the DNA or RNA molecule hybridized with the probe can be identified using the label used for the probe.
  • the DNA encoding the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase of the present invention can be isolated, for example, by the following method. For example, use the method described below, for example, Rhizobium sp. MTP-10005 (FERM
  • BP-10122 is cultured, and a purified enzyme is obtained from the cultured cells by the purification procedure described below.
  • the obtained purified enzyme is cleaved with the N-terminus and enzymes such as lysyl endopeptidase and V8 protease, and the peptide separated by HPLC is analyzed by a protein sequencer.
  • Rhizobium sp. MTP-10005 (FERM BP-10122) is a patent issued by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology at 1-1-1, Tsukuba East, Ibaraki, Japan It has been deposited with the Organism Depositary under the above accession number on July 8, 2003 based on the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms in Kapal Patent Procedures.
  • the primers for PCR are designed based on the obtained amino acid sequence information, the chromosomal DNA or cDNA library of the enzyme-producing strain is type III, and PCR is carried out using the primers to achieve the present invention.
  • a part of DNA encoding 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase can be obtained.
  • the chromosomal DNA of the enzyme-producing strain is introduced into a vector such as a phage or a plasmid by digestion with restriction enzymes, and a library or cDNA library obtained by transforming E. coli is used.
  • DNA encoding the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase of the present invention can be obtained by colony hybridization, plaque hybridization, or the like.
  • the DNA encoding the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase of the present invention isolated as described above may be, for example, pUC18, PKK223-3, pBR322, Bluescriptn- SK (+) 2,
  • a 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase expression plasmid is provided.
  • Escherichia coli is a good example as long as the recombinant vector can be stably and autonomously proliferated and can express a foreign DNA trait. It is not particularly limited to E. coli.
  • the transformed microorganism obtained by the transformation with the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase expression plasmid can be cultured based on known information. By having 6-dihydroxybenzoate decarboxylase activity, it can be confirmed that the plasmid contains DNA encoding 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase. By analyzing the base sequence of the plasmid, the base sequence of the DNA encoding the desired 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase was determined, and the base sequence of the DNA was encoded. The amino acid sequence of benzoate decarboxylase can be deduced.
  • the transformed microorganism it is possible to increase the amount of the expressed 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase enzyme.
  • Increase the amount of enzyme Means include improving the transcriptional regulatory region of the gene, increasing the copy number of the gene, increasing the efficiency of translation into protein, and selecting a suitable host. Improving the transcriptional regulatory region refers to reducing alterations that increase the amount of gene transcription. For example, there is a method in which a mutation is introduced into a promoter to strengthen the promoter and increase the transcription amount of a downstream gene. Other examples include a method of introducing a promoter that is strongly expressed in the host.
  • promoters such as lac, tac, trp, and T7 can be used.
  • the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase gene may be inserted into a multicopy type vector, and the obtained recombinant DNA may be retained in a host cell.
  • Methods for increasing the translation efficiency of a protein include, for example, introducing and modifying an SD sequence in prokaryotes and a consensus sequence in eukaryotes.
  • the SD sequence and consensus sequence refer to the ribosome binding site of each organism.
  • the method for increasing the amount of these 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase enzymes is not particularly limited to the above.
  • the origin of 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase in the present invention is not particularly limited, but is preferably derived from a microorganism, and more preferably a microorganism capable of cultivating under aerobic conditions. And more preferably derived from a microorganism belonging to the genus Rhizobium, and more preferably the base sequence at the 5 'end of the 16S rDNA of a microorganism belonging to the genus Rhizobium is a sequence listing.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is derived from a microorganism. More specifically, Rhizobium sp. MTP-10005 (FERM BP-10122) can be mentioned as a suitable example.
  • the present invention also encompasses known 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase modified by genetic recombination.
  • the base sequence at the 5 'end of the 16S rDNA of the microorganism belonging to the genus Rhizobium from which 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase is derived in the present invention is the same as that of the microorganism belonging to the genus Rhizobium by LB.
  • genomic DNA is extracted from the cells obtained using the PrepMan Method (Applied Biosystem) and extracted. PCR was performed for 5 of 16S rDNA and about 500 bp The region can be determined by amplifying the region and sequencing the amplified base sequence.
  • a culture of a microorganism necessary for obtaining 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase in the present invention can be obtained by employing a method according to a culture method of a microorganism generally used in the art. It is possible, but more specifically, under the following conditions.
  • the culture medium is a medium which usually uses the microorganism in this field, for example, organic nutrients such as meat extract, yeast extract, malt extract, peptone, NZamine, glucose, maltose, sucrose, starch, and the like.
  • organic nutrients such as meat extract, yeast extract, malt extract, peptone, NZamine, glucose, maltose, sucrose, starch, and the like.
  • the carbon source such as organic acid
  • the nitrogen source such as ammonium sulfate, urea, and ammonium chloride
  • the inorganic nutrients such as phosphate, magnesium, potassium, and iron, and vitamins can be used in appropriate combination.
  • the culture temperature is 20 to 40 ° C, more preferably 25 to 35 ° C, and the culture pH is pH 5.0 to 10.
  • the cultivation can be carried out at pH 6.0 and more preferably at pH 6.0-9.0.
  • the cultivation can be carried out under any conditions under anaerobic or aerobic conditions. Usually, shaking culture under aerobic conditions with a high growth rate is preferable.
  • the number of culture days is not particularly limited, but preferably, the culture should be performed within the range of 17 days until the desired activity is maximized.
  • a medium containing 2,6-dihydroxybenzoic acid is effective in a medium for growing bacterial cells. It is preferable that the amount of addition be 1 to 100 mM, preferably 10 to 50 mM, in the medium.
  • the transformed microorganism obtained by transformation with the plasmid can be cultured by a method known per se, and the 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase of the present invention can be cultured. Can also be produced. In this case, any medium containing an appropriate amount of a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and other nutrients can be used even if the medium is a synthetic medium or a natural medium.
  • the cultivation can be carried out in a liquid medium containing the above-mentioned cultivation components using a conventional culturing method such as shaking culture, aeration and stirring culture, continuous culture, and fed-batch culture. Culture conditions are not particularly limited as long as the strain can grow and produce 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase, which is appropriately selected according to the type of culture and the culture method.
  • the above culture conditions can be changed according to the microorganism used, the composition of the medium, and the like. It is natural that it is important to set the activity to convert resorcinol to 2,6-dihydroxybenzoic acid to convert catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid to the maximum.
  • 2,6-Dihydroxybenzoic acid decarboxylase can be purified by the following method.
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase is secreted into the culture supernatant, the crude enzyme solution obtained by removing the microbial cells by centrifugation or the like can be used. If 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase accumulates in the cells, the microorganisms are collected by filtration, centrifugation, etc. after the culture, and the cells are washed with a buffer, saline, etc.
  • microorganisms can be crushed, the crushed cell fluid can be suspended in a buffer solution or the like, and the insoluble matter removed by centrifugation or the like can be used as a crude enzyme solution.
  • a crude enzyme solution can be prepared in the same manner as in the case where it is accumulated in the cells as described above.
  • the crude enzyme solution thus obtained is subjected to salting out, fractional precipitation using an organic solvent, etc., separation by various types of chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, and isoelectric point. It can be purified by a single or a combination of means such as electrophoresis and separation by electrophoresis such as native-electrophoresis, and can be purified electrophoretically to a single band.
  • the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid and 2,3-dihydroxybenzoic acid in the present invention refers to the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid and 2,3-dihydroxybenzoic acid in an aqueous solvent in the presence of carbonate ion and Z or diacid carbon.
  • Dihydroxybenzoate decarboxylase is caused to act on resorcinol or catechol to produce 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid, and the resulting 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxyl
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid There is no particular limitation as long as it is a method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid, wherein benzoic acid is collected from the aqueous solvent. Therefore, the culture solution itself obtained by culturing the microorganism as described above, or centrifugation and filtration from the culture solution, etc.
  • Dry cells obtained by subjecting the cells to freeze-drying or acetone-drying treatments various physical methods such as ultrasonic crushing, French press, osmotic pressure, freeze-thaw, lytic enzymes, surfactants and organic compounds
  • Conventional methods such as ammonium sulfate fractionation, ion-exchange chromatography, gel filtration, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, etc. are used to obtain cell lysates obtained by solvent treatment, for example, cell lysates and culture supernatants.
  • the active fraction that converts 2,6-dihydroxybenzoic acid to resorcin was identified and purified.
  • the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid is characterized in that the produced 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid is collected from the aqueous solvent. Included in this manufacturing method.
  • Cultures, processed products, crudely purified enzymes, purified enzymes, and immobilized products of these microorganisms can be used by reacting immediately after their production, or they can be stored after storage under low-temperature conditions, for example. The required amount can be used if necessary.
  • the aqueous medium containing carbonate ion and Z or carbon dioxide is not particularly limited as long as it serves as a source of a carboxyl group added to resorcin or catechol.
  • the aqueous medium containing carbonate ions and Z or carbon dioxide is Specifically, a bicarbonate or a carbonate is added to the above-mentioned aqueous solvent, or a gas' liquid-solid diacid carbon is blown into or added to the aqueous solvent. Can be done.
  • the cation species of bicarbonate and carbonate include various metal ions, organic compound cations, and ammonia ions.
  • the concentration of carbonate ion and z or carbon dioxide in the aqueous medium is not particularly limited, but may be, for example, a concentration of 50 to 5000 mM. In addition, reaction under CO supercritical conditions is also possible.
  • the aqueous medium is not particularly limited
  • 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid may be a homogeneous mixed system or a two-phase system.
  • the method of collecting 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid from an aqueous solvent refers to the produced 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid.
  • the method for separating and purifying the reaction solution For example, the reaction solution is pretreated by filtration or centrifugation, and then the resulting supernatant is added to an acid solution such as hydrochloric acid and sulfuric acid.
  • a preferred example is a method of recovering crude crystals of 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid by squeezing and acidifying the mixture. Further, it can be recovered by a method such as solvent extraction or the like, and a known purification method such as chromatography can be appropriately used in combination.
  • the microorganism used in the method for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid is preferably a microorganism that expresses the above-mentioned 2,6-dihydroxybenzoic acid decarboxylase having heat resistance.
  • it is not limited to such microorganisms, but any microorganism capable of producing 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcin in an aqueous medium containing carbonate ions and Z or carbon dioxide.
  • any microorganism can be used as long as it expresses an enzyme that produces 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcin in an aqueous medium containing carbonate ions and Z or carbon dioxide.
  • microorganisms capable of producing 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcinol in an aqueous medium containing carbonate ions and Z or carbon dioxide may be simply referred to as a microorganism.
  • Examples of the taxonomic group of microorganisms include microorganisms belonging to bacteria, actinomycetes, yeasts, molds, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Agrobacterium, Campylobacter Jdium, Clostridium rot, Enterobacter J U, Propionibacterium, Rhizobium, preferably, Propionibacterium ⁇ Rhizobium Microorganisms belonging to the genus include, in particular, Propionibacterium freudenreichii (representative example MT-10883) and Rhizobium sp. (Representative example MTP-10005).
  • MT-10883 was granted a patent number on June 8, 1999 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba East, 1-chome, Ibaraki Prefecture, Japan, with accession number FERM BP-10121. It has been deposited under the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Procedural Microorganisms.
  • the microorganism to be used is a microorganism that expresses an enzyme that generates 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcin in an aqueous medium containing carbonate ions and / or carbon dioxide. It may be a microorganism or an artificially produced recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism described herein is one in which a host cell has been transformed with a DNA sequence encoding an enzyme involved in 2,6-dihydroxybenzoic acid production, and is constitutively or The enzyme can be produced efficiently inductively.
  • mutant microorganism that retains some useful traits obtained by subjecting a natural or recombinant microorganism to a method of contacting with a mutagen such as -trosogazine or performing a mutagenesis treatment such as a UV irradiation method.
  • the traits obtained by such mutant microorganisms include, for example, mutant strains having improved resistance to resorcin, carbonate, carbon dioxide, 2,6-dihydroxybenzoic acid, and the ability to degrade 2,6-dihydroxybenzoic acid. Mutants and mutants with high productivity of an enzyme relating to 2,6-dihydroxybenzoic acid are exemplified.
  • microorganism used in the present invention or a processed product of the microorganism is not particularly limited as long as it has an ability to generate an aromatic carboxylic acid from an aromatic compound. Therefore, microorganisms or processed products of the microorganisms include cell culture broth, cultured cells, crushed cells, cell extracts, dried cells, cells treated with organic solvents, crude enzymes, purified enzymes, immobilized substances, etc. is there. These microorganisms or processed products of the microorganisms can be used for the reaction immediately after production, or can be stored after production and used as needed.
  • any organic solvent may be used as long as it is used for ordinary organic synthesis.
  • it is an organic solvent which shifts the equilibrium of the reaction for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcinol to an 2,6-dihydroxybenzoic acid side in an aqueous medium containing carbonate ion and Z or diacid carbon.
  • the equilibrium here means carbonate ion and Z or carbon dioxide 2,6-dihydroxybenzoic acid, which is the reaction to form 2,6-dihydroxybenzoic acid from resorcinol and its inverse reaction, the chemical affinity of carbonate ion and Z or diacid carbon to form resorcinol is balanced Refers to the state.
  • the shift of the reaction equilibrium to the 2,6-dihydroxybenzoic acid side as used herein means that the reaction is performed by adding an organic solvent to a different equilibrium state compared to the reaction without the addition of an organic solvent.
  • the molar ratio of resorcinol and 2,6-dihydroxybenzoic acid in the reaction solution is V without adding an organic solvent.
  • organic solvent to be added include an organic solvent having a selected power among carbon-tolyl, alcohol, ether, ketone, and sulfiel having 1 to 4 carbon atoms. More specifically, examples include acetonitrile, isopropanol, butanol, getyl ether, acetone, ethanol, ethylene glycolone, ethylene glycol monomethylethanol, glycerin, dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, tetrahydrofuran, methanol and the like.
  • the organic solvent that shifts the reaction equilibrium to the 2,6-dihydroxybenzoic acid side without being limited to these specific examples is preferably an organic solvent compatible with water and / or an aprotic organic solvent. And the like.
  • the organic solvent compatible with water refers to an organic solvent that freely mixes with water. Specific examples include acetonitrile, isopropanol, acetone, ethanol, ethylene glycol, monomethylethanol, glycerin, dioxane, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, tetrahydrofuran, methanol and the like.
  • the aprotic organic solvent is an organic solvent having an extremely low ability to donate a proton, and specific examples thereof include acetonitrile, getyl ether, acetone, dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, and tetrahydrofuran. Is mentioned. These organic solvents may be used alone or in combination of two or more. In addition, it is also possible to add the calories at the start of the reaction or to add them during the reaction.
  • the amount of the auxiliary pulp is 1 to 80 (volZvol)%, preferably 10 to 60%.
  • the resorcinol oxidation is suppressed by suppressing the resorcinol radical generated by the resorcinol oxidation into an oligomer, which inhibits the production of 2,6-dihydroxybenzoic acid. That's why. Resorcinol with suppressed acidification is contained in the reaction solution.
  • the resorcinol is stable and the selectivity for 2,6-dihydroxybenzoic acid is remarkably improved to 97-100%.
  • the selectivity of 2,6-dihydroxybenzoic acid means the ratio of the molar amount of 2,6-dihydroxybenzoic acid formed to the reduced molar amount of resorcinol in the reaction solution.
  • the method of inhibiting resorcinol oxidation is not particularly limited as long as it does not affect the production of 2,6-dihydroxybenzoic acid.
  • a representative example is a method for suppressing acidity by reducing the oxygen concentration in the reaction system.
  • the oxygen concentration in the reaction system is not particularly limited as long as it can suppress resorcinol oxidation, but is preferably 10 ppm or less of dissolved oxygen in the reaction solution. It is more preferably at most 8 ppm, further preferably at most 4 ppm.
  • the method for adjusting the oxygen concentration in the reaction system to the above range is not particularly limited. 1S Specifically, a method in which the gas phase in the reaction system is set to an inert atmosphere or a carbon dioxide atmosphere, Examples of the method include a method of reducing the pressure in the system, and the addition of an antioxidant.
  • the inert atmosphere means that the gas phase of the reaction vessel does not react with a rare gas such as argon or a system substance such as V or nitrogen. It refers to a gaseous phase that has been replaced with an inert gas and has no harmful effects such as oxygen gas.
  • the rare gas or inert gas used may be used alone or in combination of two or more.
  • the carbon dioxide atmosphere refers to a state in which the gas phase in the reaction system is replaced with carbon dioxide. Further, the state may be a mixture of carbon dioxide and a single or a plurality of rare gases or inert gases.
  • dissolved oxygen concentration of the reaction solution cannot be adjusted to the above range by simply replacing the gas phase with a small capacity of the gas phase, a rare gas as a gaseous 'liquid' solid, an inert gas, or diacid
  • a method of reducing dissolved oxygen by blowing or adding carbon into an aqueous solvent is also acceptable.
  • the method of reducing the pressure in the reaction system is a method of reducing the oxygen concentration in the reaction system by degassing the reaction system with the reduced pressure.
  • the pressure in the reaction system is not particularly limited as long as the oxygen concentration is within the above-mentioned range, but is specifically lower than normal pressure, preferably less than 0.51 ⁇ 10 5 Pa.
  • the addition of the antioxidant has an effect of reducing oxidized resorcinol in addition to the effect of reducing the oxygen concentration in the reaction system described above.
  • the antioxidant to be added is to suppress resorcinol oxidation.
  • it is 2-mercaptoethanol.
  • the addition amount of the antioxidant is not particularly limited as long as it is a concentration capable of suppressing the resorcinol oxidation.
  • it is a suitable amount which does not affect the production of 2,6-dihydroxybenzoic acid, and this suitable amount can be easily determined by those skilled in the art by simple preliminary experiments.
  • the amount of 2-mercaptoethanol added is preferably lppm-2000ppm power from preliminary experiments. More preferably, it is 200 ppm from 20 ppm.
  • the resorcinol concentration during the reaction is not particularly limited, but is preferably 1 to 2000 mM.
  • Resorcinol may be added as a solid, or dissolved or dispersed in a solvent and added to the mixture at the beginning of the reaction, or a required amount may be added sequentially according to the progress of the reaction. Preferably, it is a sequential addition.
  • the amount of resorcinol to be added sequentially but more desirably, the amount of resorcinol is successively added such that the resorcinol concentration during the reaction does not hinder the maintenance of the maximum reaction rate.
  • the microorganism or the processed product of the microorganism is added all at once at the beginning of the reaction, or an appropriate required amount is divided into two or more times in accordance with the progress of the reaction, and the required amount is divided into two portions. I do.
  • an appropriate required amount is sequentially added according to the progress of the reaction.
  • An appropriate required amount is an amount (effective amount) that exhibits a desired effect, and this effective amount can be easily determined by a person skilled in the art by simple preliminary experiments.
  • the conditions for producing 2,6-dihydroxybenzoic acid or 2,3-dihydroxybenzoic acid are as follows: the reaction pH is pH 3-12, preferably p H6—9.
  • the reaction temperature is in the range of freezing point-60 ° C, preferably 20-40 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, but is more specifically about 1 minute to 120 hours.
  • the pressure during the reaction is not particularly limited, it is usually preferable that the pressure be in the range of normal pressure of 1 lOOkg / cm 2 .
  • the reaction is under stirring! / ⁇ can be left standing, can be shifted, and can be either a Notch system or a continuous system using an appropriate bioreactor.
  • the decrease in oxygen concentration in the reaction system, the addition of an organic solvent, the sequential addition of resorcinol during the reaction, and the sequential addition of microorganisms or a processed product of the microorganisms are all 2 times. It has the effect of increasing the accumulated concentration of, 6-dihydroxybenzoic acid, and these methods can be used alone or in combination. Preferably, a plurality is combined.
  • the N-terminal sequence of the purified enzyme obtained in Example 1 and the purified enzyme were deleted with lysyl endopeptidase, and the sequence of the peptide separated by HPLC was analyzed using a protein sequencer.
  • the sequences obtained by the analysis are shown in SEQ ID NOs: 3 to 7 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 3 shows the N-terminal sequence.
  • the substrate specificity of this enzyme was confirmed by measuring the decarboxylation activity shown in Example 1 using the purified enzyme obtained in Example 1.
  • As substrates 2,6-dihydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, and 3,5-dihydroxybenzoic acid were used. As a result, it acted on 2,6-dihydroxybenzoic acid, but not on 3,4-dihydroxybenzoic acid or 3,5-dihydroxybenzoic acid.
  • Example 1 Dissolve the purified enzyme obtained in Example 1 in 10 mM potassium phosphate buffer solution (pH 7.0) 1.
  • 10 mM potassium phosphate buffer solution pH 7.0
  • OmL put it in a glass test tube with a cap of 15 mL in volume, and bring it to the specified temperature (50 ° C '70 ° C).
  • Heat treatment was performed while immersing in a controlled water bath constant temperature bath and shaking, and 1001 samples were taken at predetermined time intervals. Thereafter, the decarboxylation activity was measured by the method described in Example 1.
  • the activity half-life was calculated from the obtained results. As a result, the activity half-life of this enzyme was 122 minutes at 50 ° C. It was 25.5 minutes at 60 ° C.
  • Example 2 Using the purified enzyme obtained in Example 1 and measuring only the temperature in the range of 20 ° C to 90 ° C using the method for measuring decarboxylation activity described in Example 1, the optimum enzyme was measured. The temperature was estimated to be around 70 ° C.
  • Example 1 The N-terminal sequence of the purified enzyme purified in Example 1 and the purified enzyme were digested with lysyl endopeptidase.
  • Rhizobium.sp MTP-10005 cells obtained by centrifugation were washed with a phosphate buffer, and then collected by centrifugation. From the collected washed cells, "Basic Biochemical Experiment Method 2 Extraction, Separation and Purification
  • Genomic DNA was prepared according to the method for separating bacterial genomic DNA described in Koichi Anan et al., Published by Maruzen Co., Ltd.
  • the amplified gene was TA-cloned using pT7Blue T-Vector, and Amersham Pharmacia was determined according to the nucleotide sequence of the inserted fragment.
  • the genomic DNA prepared above was completely digested with restriction enzymes (EcoRI, SalI). According to the protocol of the TaKaRa La PCR Tm in vitro cloning Kit, the digested genomic DNA linked to the EcoRI cassette was used as a template.
  • the primer for the 1st PCR was the primer described in SEQ ID NO: 11, and the sequence for the 2nd PCR was When amplified using the primer described in SEQ ID NO: 12, an amplified fragment (about 3000 bp) was obtained.
  • the amplified gene was TA-cloned using pT7Blue T-Vector, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined by the above method.
  • the amplified fragment (about 1200 bp) was obtained by using the above primers.
  • the amplified gene was TA-cloned using pT7Blue T-Vector, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined by the above method.
  • amplification was performed using primers having the sequences described in SEQ ID NOs: 15 and 16 in the Sequence Listing, which were designed based on the results of gene walking on the 5 terminal side and the above results. .
  • the amplified gene was TA-cloned using pT7Blue T-Vector, and the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined by the above method. As a result, SEQ ID NO: The target gene shown in 2 was obtained.
  • Escherichia coli (BL21) transformed with DNA containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene derived from Rhizobium.sp MTP-10005
  • the primers described in SEQ ID NOs: 17 and 18 in the Sequence Listing were used to connect to the vector (pET-3b, pET-l lb) (Novegen) of the pET expression system.
  • the amplified gene was linked to the restriction enzyme sites (Ndel, BamHl) of the above vector to construct an expression vector.
  • the competent cell BL21 Star TM (Invitrogen) included in the kit was transformed to obtain transformed E. coli.
  • LB liquid medium 100 ml of LB liquid medium was prepared in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes.
  • the cells were further cultured at 30 ° C for 15 hours. Only the cells were recovered from the culture solution by centrifugation (5000 G x 15 minutes), and then the cells were resuspended in 50 ml of physiological saline, followed by centrifugation again to obtain wet cells. Was. Then, 0.02% of the 1Z20 amount of the culture solution
  • the suspension was suspended in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2-mercaptoethanol.
  • the suspension was disrupted by sonication, and after centrifugation (15000 rpm, 10 minutes), the supernatant was recovered and used as an enzyme solution.
  • 0.05 M2,6-dihydroxybenzoic acid 180 n11.0 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) 100 n1 deionized water 6.20 n1 diluted enzyme solution 1 0 0 n 1
  • Rhizobium.sp Decarboxylation of 2,6-dihydroxybenzoic acid using Escherichia coli transformed with DNA that does not contain the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene from MTP-10005
  • Escherichia coli transformed with a vector (pET-3b, pET-lb) that does not contain the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 4, and an enzyme solution was obtained. An attempt was made to decarboxylate 2,6-dihydroxybenzoic acid, and the reaction mixture was analyzed. However, no activity of decarboxylating 2,6-dihydroxybenzoic acid and producing resorcin was found.
  • Example 4 using the enzyme solution obtained in the same manner as in Example 4, 1 ml of the reaction solution having the reaction composition shown in Table 6 was used. The reaction was carried out while shaking at 30 ° C for 5 minutes in a screw volume centrifuge tube of ml volume. The reaction was stopped by pouring 200 ⁇ l of 5N hydrochloric acid.
  • Escherichia coli transformed with a vector (pET-3b, pET-lb) not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 5, and an enzyme solution was obtained. Attempts to convert resorcinol to 2,6-dihydroxybenzoic acid Analyzed power No conversion of resorcinic acid to 2,6-dihydroxybenzoic acid was observed.
  • the reaction was carried out using 1 ml of the reaction solution having the reaction composition shown in Table 7 in the same manner as in Example 5. was detected. Analysis of this peak by LC / MS confirmed that it was 2,3-dihydroxybenzoic acid.
  • Escherichia coli transformed with a vector (pET-3b, pET-lb) not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 6, and an enzyme solution was obtained. Attempts to convert catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid and analysis of the reaction mixture No conversion of catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid was observed o
  • a vector (pET-3b, pET-lb) not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 6, and an enzyme solution was obtained. Attempts to convert catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid and analysis of the reaction mixture No conversion of catechol to 2,3-dihydroxybenzoic acid was observed o
  • a vector (pET-3b, pET-lb) not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 6, and
  • Example 4 competent cell B L21 (DE3) (Novagen) was transformed with the expression vector constructed using pET-3b to obtain transformed E. coli.
  • Prepare 5 ml of LB liquid medium in a test tube and 1 L of LB liquid medium in a 2 L Sakaguchi flask, sterilize in an autoclave at 121 ° C for 20 minutes, and add ampicillin to each to 100 gZml for culture. did. Inoculate the test tube with the above transformant, and inoculate at 37 ° C with OD 0.
  • the culture was continued for a while. Only the cells were recovered from the culture solution by centrifugation (15000 rpm, 1 hour), and the cells were resuspended in 50 ml of physiological saline, followed by centrifugation again to obtain wet cells.
  • the wet cells were suspended in a 10 mM potassium phosphate buffer solution (PH 7.0) containing 0.02% 2-mercaptoethanol in 1Z20 amount of the culture solution.
  • the suspension was disrupted by sonication, and after centrifugation (15000 rpm, 10 minutes), the supernatant was recovered and dialyzed to obtain a crude enzyme solution. Using this, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed by the Laemmli method. Precision as a molecular weight marker
  • Escherichia coli BL21 (DE3) transformed with a vector (pET-3b) not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene was cultured in the same manner as in Example 7 to obtain an enzyme solution. Using it, SDS-PAGE by Laemmli method was performed. The results are shown in Figure 1. 2,6-Dihydroxybenzoic acid decal from Rhizobium.sp MTP-10005 in lane 3 In the crude enzyme solution obtained from Escherichia coli (BL21 (DE3)) transformed with the DNA containing the boxylase gene, a dark band was observed at the same position as the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase purified enzyme solution in lane 2 at the same position. Was. Also, Rhizobium.sp in Lane 4
  • the crude enzyme solution obtained from Escherichia coli (BL21 (DE3)) transformed with DNA not containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene derived from MTP-10005 was the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase in lane 2. Almost no band was found at the same position as the purified enzyme solution.
  • Escherichia coli (BL 21 (DE3)) transformed with DNA containing the 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase gene derived from Rhizobium.sp MTP-10005 expressed large amounts of 2,6-dihydroxybenzoate decarboxylase was confirmed.
  • Example 7 using the enzyme solution obtained in Example 7, carbonation of resorcin was attempted in the same manner as in Example 5, and the reaction solution was analyzed. As a result, the activity to generate 2,6-dihydroxybenzoic acid was confirmed. The yield of 2,6-dihydroxybenzoic acid was 14 ⁇ g &).
  • the collected cells were washed with physiological saline (NaCl 9gZD) and stored frozen. Using a part of the frozen cells obtained as described above, a 10 ml volume of the reaction solution shown in Table 8 was used. After transferring the liquid to a screw test tube and replacing the gas phase with 100% CO, react while shaking at 25 ° C for 24 hours.
  • physiological saline NaCl 9gZD
  • reaction was stopped by adding 1200 1 of a mixture of equal volumes of 5N hydrochloric acid and ethanol.
  • Example 9 Using the cryopreserved cells described in Example 9, a reaction was carried out in the same manner as in Example 9 under a nitrogen atmosphere. Table 9 shows the results.
  • Example 9 Using the cryopreserved cells described in Example 9, the reaction was carried out in an air atmosphere in the same manner as in Example 9 to obtain the desired product. Table 9 shows the results.
  • Example 9 Using the cryopreserved cells described in Example 9, the reaction solution shown in Table 13 was transferred to a 50-ml Nervical bottle and reacted at 40 ° C. As shown in Table 14, resorcin and cells were added in portions. At each time, 200 1 of the reaction solution was collected, and the reaction was stopped by adding 80 1 of a mixture of equal volumes of 5N hydrochloric acid and Z ethanol. After stopping the reaction, the analysis was performed in the same manner as in Example 9. The result is shown in figure 2
  • reaction was carried out. At the end of the reaction, the reaction was stopped by adding 400 1 of a mixture of equal volumes of 5N hydrochloric acid and ethanol.
  • Dihydroxybenzoic acid conversion rate refers to the limited reaction substrate of 2,6-dihydroxybenzoic acid, and is the amount of unit substance of 2,6-dihydroxybenzoic acid present in the reactor at the start of the reaction. The ratio of the amount of reacted 2,6-dihydroxybenzoic acid per (mol) is shown in%.

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Abstract

　本発明の課題は微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する工業的に有利な方法を提供することにある。 　リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物よりレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する耐熱性の高い酵素を見出す。該酵素をコードする遺伝子で形質転換された形質転換微生物を取得する。該形質転換微生物により製造された当該酵素を炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する。 　また、微生物又は該微生物の処理物を利用して炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造するに際して、有機溶媒を水性溶媒に添加する、レゾルシンの酸化を抑制する、或いは、レゾルシン、微生物又は該微生物の処理物の何れかを逐次添加することにより蓄積濃度を向上させる。その際上述の形質転換微生物を用いると更に良好な結果が得られる。上記製造方法はカテコールを用いた２，３−ジヒドロキシ安息香酸の製造に応用することが出来る。

Description

明 細 書
耐熱性を有する 2， 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼおよび 2， 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、レゾルシンから 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸、カテコールから 2, 3-ジヒド ロキシ安息香酸に変換する耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシ ラーゼに関するものである。また、耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカル ボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子に関するものである。さらに、 耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコー ドする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換した形 質転換微生物に関するものである。さらには耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または形質転換微生物を培養し、該微生 物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該 2, 6-ジヒドロキシ安 息香酸デカルボキシラーゼの製造方法に関するものである。そして本発明は、この 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いた 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸ま たは 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に関するものである。また、本発明は微 生物又は該微生物の処理物を利用した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法お ヽ て、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高める方法に関するものである。
背景技術
[0002] 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸はレゾルシンを原料として、 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸 は、カテコールを原料としてコルべ-シュミット法による炭酸ィ匕反応により製造されて ヽ る。すなわちレゾルシン、カテコールの金属塩に炭酸ガスを高温高圧下で反応させる 方法により製造されているが、この方法によれば対応する多価アルコール芳香族力 ルボン酸の混合物が生成し、該混合物から目的化合物を分離精製するには非常な 困難が伴う。そのため、選択的に目的化合物を製造する方法がいろいろ試みられて いるが、実用化するまでには至っていない。
[0003] 一方、レゾルシンの 2位選択的にカルボキシル基を導入する方法、カテコールの 3 位選択的にカルボキシル基を導入する方法として、微生物菌体の触媒作用を利用し た 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸と 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製法が知られている（特 開 2001-46093号公報)。より具体的には、微生物菌体としてはプロピオ-バタテリ ゥム (Propionibacterium)属に属する微生物を使用し、炭酸緩衝液中にぉ ヽてレゾル シンと接触させることにより 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸をカテコールと接触させること により 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法である。
[0004] また、第 1回「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発」（中間評価)分科 会における事業原簿 (作成者新エネルギー ·産業技術総合開発機構バイオテクノロ ジー開発室）によるとェンテロパクター（Enterobacter)属、ァグロバクテリウム（ Agrobacterium)属細菌力 レゾルシンを 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に変換する触媒 作用を持つと記載されて 、るが、それ以上の詳細な記載は無 、。
[0005] さらに、平成 15年度 日本生物工学会要旨集の桐村らの発表によると桐村らは
Rhizobium radiobacterに属する微生物に炭酸カリウム緩衝液中にお!、てレゾルシン と接触させることにより 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を、カテコールと接触することにより 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を製造する微生物を見出している。また、その無細胞抽 出液を用い最適反応条件を検討している。さらに、無細胞抽出液より本反応を触媒 する酵素を精製することにより本反応が 1種類の酵素によって触媒され、脱炭酸酵素 の逆反応により進行することを推定している。しかしながら、その耐熱性については何 ら言及しておらずその最
適温度は 40°Cと低ぐ耐熱性に優れた安定性の高い酵素とは考えにくい。
[0006] そして 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコード する遺伝子はこれまでに明らかにされたことはない。したがって、その遺伝子を含む プラスミドにより形質転換された形質転換微生物、さらにその遺伝子を含むプラスミド により形質転換された形質転換微生物が本酵素を発現し、活性を有する形質転換微 生物が得られることも全く知られて 、な 、。
[0007] 以上のように本発明者が知る限り、レゾルシンを 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に、カテ コールを 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸に変換する触媒作用を有する微生物およびその 触媒本体である酵素に関する報告は限られている。また、 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子は全く知られて!/ヽな い。さらにその遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された形質転換微生物が本酵 素を発現し、活性を有する形質転換微生物が得られることも全く知られて!/ヽな ヽ。
[0008] また、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法については、特開 2001-46093号公 報において反応は二酸ィ匕炭素雰囲気で行われているものの、二酸化炭素雰囲気に より生成する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることについては何ら 記載されていない。反応は水性溶媒中で行われており、有機溶媒の添カ卩による 2, 6 -ジヒドロキシ安息香酸蓄積濃度向上の効果にっ 、ても何ら言及されて 、な 、。反応 は原料、微生物を反応開始時に一括添加しており、レゾルシン 10mM力も得られる 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸は 3. 3mMと蓄積濃度が低い。桐村らの報告では、反応は 水性溶媒を用いて空気雰囲気で行われ、有機溶媒の添加に関しては何ら言及され ていない。力！]えて、原料、微生物又は該微生物の処理物を反応開始時に一括添カロ しており、結果的にレゾルシン 25mMから得られる 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸は 10 mMであり、蓄積濃度は十分でない。
[0009] 以上のように、本発明者が知る限りは、微生物又は該微生物の処理物を利用した 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する報告は限られている。
[0010] 特許文献 1 :特開 2001 -46093公報
非特許文献 1：第 1回「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発」（中間評 価)分科会における事業原簿 (作成者新エネルギー ·産業技術総合開発機構バイオ テクノロジー開発室）： HPアドレス
http：〃 www.nedo.go.jp/iinkai/hyouka/nittei/150512.html (平成 15年 5月 12日公開） 非特許文献 2：平成 15年度日本生物工学会要旨集日本生物工学会要旨集 (2003 ) (平成 15年 8月 25日発行）
非特許文献 3 :オーガニックシンセシス（Org. Synth. ) 11、 P. 557 (1973) 非特許文献 4:ジャーナルォブケミカルソサイエティー (J. Chem. Soc. ) P. 3503 (1
952)
非特許文献 5 :第 55回日本生物工学会大会（平成 15年 8月 25日発行）
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0011] 微生物菌体が有する酵素の触媒作用を利用して産業上の有用物質を工業的に製 造するにお 、て耐熱性の有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用 いると耐熱性に応じて酵素の耐久性が向上し、経済的に有利である。また、 2, 6-ジ ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現し活性を有する形質転換微生物を作 製し、さらに該形質転換微生物を用い該酵素を製造することは概酵素の製造コストを 下げることが可能になるため有用である。
[0012] また、微生物又は該微生物の処理物を利用した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造 において、反応条件を調製することにより生成する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積 濃度を高めることは、工業的に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する際に有利であ る。
[0013] 本発明は、耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを提供 するものである。また、耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子を提供するものである。さらに、耐熱性を 有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺 伝子を含んでいる組換えプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換した形質転換微 生物を提供するものである。さらには耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼを産生する微生物または形質転換微生物を培養し、該微生物または その培養上清およびこれらの処理物として提供される該 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼの製造方法を提供するものである。そして本発明は、この 2, 6- ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いた 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。さらには、工業的に実 施するのに有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。 課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは上記の課題を解決すべく 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸、 2, 3-ジヒドロ キシ安息香酸の製造方法につ!、て鋭意研究を重ねた結果、新規にリゾビゥム（ Rhizobium)属する微生物力 レゾルシン力 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に変換する 活性を有することを見出した。当該活性が見出された微生物より種々の精製方法を 組合わせることにより酵素を精製しその性質を調べたところ耐熱性を有する工業的に 有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであることを見出した。また、こ の耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、そ れをコードする遺伝子を明らかにし、その遺伝子を含むプラスミドにより形質転換され た形質転換微生物が本酵素を発現し、活性を有する形質転換微生物が得られること を明らかにした。さらには、耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシ ラーゼを産生する微生物または上記形質転換微生物を培養し、該微生物またはその 培養上清およびこれらの処理物として提供される該 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼの製造方法を開発した。さらに、この 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼを用いた 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香 酸の製造方法を開発した。
[0015] また、本発明者らは 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法について鋭意検討を行 つたところ、炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素を含む水性媒体中で、微生物又は該 微生物の処理物とレゾルシンを接触させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方 法にぉ 、ては、以下の（1)一 (3)の知見を見出した。
(1)水性媒体に有機溶媒を添加することにより、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃 度を高め得ることを見出した。
(2)レゾルシンの酸ィ匕を抑制しつつ反応を進行させることにより、 2, 6-ジヒドロキシ安 息香酸の蓄積濃度を高め得ることを見出した。
(3)レゾルシン、又は、微生物又は該微生物の処理物を逐次添加することにより、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることを見出した。
[0016] そして更に（1)一（3)の組み合わせ及び（1)一（3)と上述の耐熱性を有する 2, 6- ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの組み合わせにより、その効果をさらに高 め得ることを見出した。
[0017] 以上の知見力 本発明を完成するに至った。
[0018] すなわち、本発明は、耐熱性を有する工業的に有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼおよびその生産方法を提供し、もって、 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸、 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製造法を提供するものである。また、微生物又は該 微生物の処理物を利用した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法において、反応 条件を調整することにより工業的に有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を 提供するものである。
より具体的には、以下の通りである。
[1] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は 該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素を含む水性媒 体中で接触させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、有機溶媒を 水性媒体に添加することを特徴とする製造方法。
[2] 有機溶媒の添カ卩によって反応の平衡が 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する 側へ移動することを特徴とする [1]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[3] 添加する有機溶媒の 1種類以上が水に対して相溶性を有することを特徴とする 請求項 [1]又は [2]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[4] 添加する有機溶媒の 1種類以上が非プロトン性溶媒であることを特徴とする [1] は [2]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[5] 添加する有機溶媒が炭素数 1から炭素数 4のカルボ-トリル、アルコール、エー テル、ケトン及びスルフィエルより成る群力 選ばれた 1種以上の溶媒であることを特 徴とする [1]又は [2]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[6] 添加する有機溶媒が、ァセトニトリル、イソプロパノール、ブタノール、ジェチルェ 一テル、アセトン、エタノール、エチレングリコーノレ、エチレングリコールモノメチルエタ ノール、グリセリン、ジォキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒ ドロフラン及びメタノールより成る群力も選ばれた単一或いは複数の溶媒である [5]に 記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[7] [1]一 [6]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であつ て、反応系内のレゾルシンの酸ィ匕を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[8] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は 該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素を含む水性媒 体中で接触させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、反応系内の レゾルシンの酸ィ匕を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする 2, 6-ジヒドロキ シ安息香酸の製造方法。
[9] レゾルシンの酸ィ匕を抑制する手法として、反応系内気相部を不活性雰囲気又は 二酸化炭素雰囲気とすることを特徴とする [7]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の 製造方法。
[10] 不活性雰囲気が窒素雰囲気であることを特徴とする [9]に記載の 2, 6-ジヒドロ キシ安息香酸の製造方法。
[11] レゾルシンの酸化を抑制する手法として、反応系内を減圧し脱気することを特 徴とする [7]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[12] レゾルシンの酸ィ匕を抑制する手法として、水性媒体中へ酸化防止剤を添加す ることを特徴とする [7]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[13] 添加する酸ィ匕防止剤として、水性媒体中へ 2-メルカプトエタノールを添加する ことを特徴とする [12]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[14] 反応の進行に応じて水性媒体中へレゾルシンを 2回以上に分けて必要量を分 割して添加することを特徴とする、 [1]一 [13]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキ シ安息香酸の製造方法。
[15] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又 は該微生物の処理物を 2回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とす る [1]一 [14]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[16] 下記の（a)—（c)の全ての理化学的性質を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼ。
(a)作用： 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒す る。
(b)温度安定性: pH7.0の緩衝液中での活性半減期が 50°Cにおいて約 120分、 60 °Cにおいて約 25分。
(c)至的温度: pH8で脱炭酸反応をさせる場合、温度 70°C付近において作用が至 的である。
[17] 下記の全ての理ィ匕学的性質をさらに有する、 [16]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ 安息香酸デカルボキシラーゼ。
(d)炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でレゾルシンに作用させ て 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。
[18] 下記の理化学的性質をさらに有する、 [16]又は [17]に記載の 2, 6-ジヒドロキ シ安息香酸デカルボキシラーゼ。
(e)分子量：ゲルろ過クロマトグラフィーでの分子量は約 151000ダルトン。
(f)サブユニット構造： SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分 子量は約 37500ダルトンからなるホモテトラマー。
(g)基質特異性： 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、 3, 4-ジヒドロキシ安息香酸、 3, 5-ジヒドロキシ安息香酸には作用しな 、。
(h)至的 pH : 30°Cで脱炭酸反応をさせる場合 pH約 8. 0において作用が至的である
(i)金属イオンの影響: Mg2+、 Ni2+、 Co2+、 Fe3+、 Zn n Ca2+金属イオンのい ずれも脱炭酸活性を活性化しな 、。
(j)補酵素： TPP、 PLP、 NAD+、 NADP+、補酵素にはなり得ず、また本酵素の吸収スぺ タトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素はない。
[19] 配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼ。
[20] 配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列の一部を置換、欠失、削除または挿 入して得られるアミノ酸配列を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ
[21] Rhizobium属に属する微生物に由来する [16]— [20]のいずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[22] Rhizobium属に属し、 16SrDNAの 5 '末端側の塩基配列が配列表の配列番号 : 8記載の塩基配列を含む微生物に由来する [16]— [20]のいずれか一項に記載の 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[23] 微生物が Rhizobium.sp MTP-10005 (FERM BP-10122)である、 [22]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。 [24] 配列表の配列番号： 2記載の塩基配列で表される 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[25] 配列表の配列番号 : 2記載の塩基配列の一部を置換、欠失、削除または挿入 して得られる塩基配列で表される 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの サブユニットをコードする遺伝子。
[26] 配列表の配列番号： 2記載の塩基配列とストリンジ ントな条件下でハイブリダ ィズする 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする 遺伝子。
[27] Rhizobium属に属する微生物に由来する [24]— [26]のいずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[28] Rhizobium属に属し、 16SrDNAの 5 '末端側の塩基配列が配列表の配列番号 : 8記載の塩基配列を含む微生物に由来する [24]— [26]のいずれか一項に記載の 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[29] 微生物が Rhizobium.sp MTP-10005 (FERM BP-10122)である、 [28]に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[30] [24]— [29]のいずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキ シラーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる糸且換えプラスミド。
[31] [30]に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換微生物。
[32] [16]— [23]のいずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシ ラーゼを産生する微生物または [31]に記載の形質転換微生物を培養し、該微生物 またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸デカルボキシラーゼの製造方法。
[33] [32]に記載の方法により製造した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラ ーゼを、炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシン に作用させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した 2, 6-ジヒド ロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸の製造方法。
[34] [32]に記載の方法により製造した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラ ーゼを、炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でカテコールに作 用させて 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した 2, 3-ジヒドロキ シ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 3-ジヒドロキシ安息香 酸の製造方法。
[35] 微生物が [16]— [23]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼを産生する微生物であることを特徴とする [1]一 [15]の何れか一項に 記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[36] 微生物が [24]— [30]の何れか一項に記載の遺伝子を保持し、該遺伝子情報 に基づく 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生物であること を特徴とする [1]一 [15]の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方 法。
[37] 微生物が [31]記載の形質転換微生物であることを特徴とする [1]一 [15]の何れ か一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
発明の効果
[0020] 本発明により提供される耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラ ーゼを用いることにより、その反応選択性も利用し、極めて単純な工程で工業的に実 施するのに有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製 造法が提供される。
[0021] また、微生物又は該微生物の処理物を触媒とした 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製 造方法にお!ヽて、反応時の溶媒種や原料の安定性などの反応条件を調整すること により生成する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め、安全かつ簡単な工程 で工業的に実施するのに有利な 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法が提供され る。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]2, 6—ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの SDS— PAGE結果を示す電 気泳動写真である。レーン iは分子量マーカー、レーン 2は実施例 1記載 2, 6—ジヒド ロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製酵素液、レーン 3は実施例 7の結果を、レー ン 4は比較例 4の結果をそれぞれ示す。 [図 2]反応液中の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸生成濃度の経時変化を示すグラフであ る。図中、ひし形は実施例 23の結果を、四角は比較例 8をそれぞれ示す。
[図 3]実施例 24に記載の反応液中の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸生成濃度の経時変 化を示すグラフである。
[図 4]反応液中のモル比（レゾルシンと 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸のモル量の和に対 する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸のモル量）の経時変化を示すグラフである。図中、レ ゾルシンを RS、 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を 2, 6— DHBAと略記する。ひし形は実 施例 33の結果を、四角は実施例 34の結果をそれぞれ示す。横軸は反応時間（Hr) を表す。
[図 5]反応液中のモル比（レゾルシンと 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸のモル量の和に対 する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸のモル量）の経時変化を示すグラフである。図中、レ ゾルシンを RS、 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を 2, 6— DHBAと略記する。ひし形は比 較例 9の結果を、四角は比較例 10の結果をそれぞれ示す。横軸は反応時間（Hr)を 表す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、耐熱性を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼに関す る。本発明において 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼとは、 2, 6-ジヒド ロキシ安息香酸に作用してレゾルシン、炭酸の生成を触媒する酵素を指す。本発明 の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは以下の（a)—（c)の全ての理ィ匕 学的性質を有する。
(a)作用： 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒す る。
(b)温度安定性: pH7.0の緩衝液中での活性半減期が 50°Cにおいて約 120分、 60 °Cにおいて約 25分。
(c)至的温度: pH8で脱炭酸反応をさせる場合、温度 70°C付近において作用が至 的である。なお本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは好ましくは 以下の (d)の理化学的性質をさらに有する。
(d)炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性溶媒中でレゾルシンに作用させ て 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼはさらに好ましくは以下の（e)— (i)の全ての性質を持つ。
(e)分子量：ゲルろ過クロマトグラフィーでの分子量は 151000ダルトン。
(f)サブユニット構造： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分 子量は約 37500ダルトンからなるホモテトラマー。
(g)基質特異性： 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、 3, 4-ジヒドロキシ安息香酸、 3, 5-ジヒドロキシ安息香酸には作用しな 、。
(h)至的 pH : 30°Cで脱炭酸反応をさせる場合 pH約 8. 0において作用が至的である
(i)金属イオンの影響: Mg2+、 Ni2+、 Co2+、 Fe3+、 Zn n Ca2+金属イオンのい ずれも脱炭酸活性を活性化しな 、。
(j)補酵素： TPP、 PLP、 NAD+、 NADP+のいずれも補酵素にはなり得ず、また本酵素の 吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素はない。
[0024] 本発明にお 、て、上記の（a)記載の作用、つまりは 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼの脱炭酸活性は次のようにして測定することにより確認できる。例え ば 100 μ 1の酵素液と 9mMの基質（例えば 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸）を含む 100 mM燐酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)総量 lml中で、 30°C、 5分間で反応させる。この 反応によって生成する生成物（例えばレゾルシン）量を HPLC法によって測定するこ とにより酵素活性を測定できる。 HPLC法としては、ォクタデシル基を有したシリカゲ ルパックドカラムなどを固定相に用い、水とァセトニトリルの混合物に 0. 1 %トリフルォ 口酢酸を添加したものを移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィー、検出は紫外 部分光検出器によって波長 280nm付近で行う方法が例示できる。
[0025] (b)記載の本発明における酵素の温度安定性指標の 1つである活性半減期とは、 水性媒体中に溶解して 、る酵素をある処理温度 (例えば 50°C)で保持した際、未処 理の酵素活性を 100%とした時に処理後の酵素活性が 50%になる時間のことである 。本活性半減期を求めるには以下の条件にて熱処理を行うことにより求められる。熱 処理において使用される水性媒体とは ImM以上 1M以下の塩濃度の緩衝液、望ま しくは ImM以上 lOOmM以下の塩濃度の緩衝液、より望ましくは 5mM以上 15mM 以下の塩濃度の緩衝液である。ここで ヽぅ緩衝液の種類は特に制限は無 ヽが pH7 付近で緩衝能が高!ヽ燐酸カリウム緩衝液を例示できる。熱処理する方法としては水 性媒体中に溶解して 、る酵素を瞬時に指定の温度にお 、て処理できる方法であれ ば特に制限はない。例えば容量 15mLの蓋付きガラス製試験管に 1. OmLの水性媒 体に溶解している酵素を入れ、指定の温度に制御した水浴恒温槽に浸漬し、振とうし ながら必要時間保持すれば良 、。ここで述べる PH7.0の緩衝液中での活性半減期 が 50°Cにおいて約 120分とは、 20分以上 220分以下、望ましくは 70分以上 170分 以下、より望ましくは 110分以上 130分以下のことである。また、 60°Cにおいて約 25 分とは 10分以上 40分以下、望ましくは 15分以上 35分以下、より望ましくは 20分以 上 30分以下のことである。
[0026] (c)記載の至的温度については上記の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラ ーゼの脱炭酸活性の測定方法において温度のみを変化させることにより容易に求め られる。 70°C付近とは 45°C以上 95°C以下、望ましくは 55°C以上 85°C以下、望ましく は 65°C以上 75°C以下のことを指す。
[0027] (d)記載の性質につ!、ては、炭酸イオン及び Zまたは二酸化炭素の存在下に水性 溶媒中でレゾルシンに本酵素を作用させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成の有無 を測定すれば確認できる。
炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素の存在下とは、レゾルシンに付加されるカルボ キシル基の供給源を水生溶媒中に共存させるためであり、より具体的には、重炭酸 ナトリウム、炭酸ナトリウムに代表される炭酸塩を上述の水生溶媒中に添加し、もしく は、気体'液体 ·固体のニ酸ィ匕炭素を該水生溶媒中に吹き込み、または、添加するこ とで調製することができる。 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成の有無は HPLC法によ つて測定することが測定できる。 HPLC法としては、ォクタデシル基を有したシリカゲ ルパックドカラムなどを固定相に用い、水とァセトニトリルの混合物に 0. 1%トリフルォ 口酢酸を添加したものを移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィー、検出は紫外 部分光検出器によって波長 280nm付近で行う方法が例示できる。
[0028] (e)に記載しているように本酵素はゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量は約 151000ダル卜ンを示す。約 151000ダルトンとは、 140000ダル卜ンー 160000ダル トン、好ましくは 145000ダルトン一 155000ダルトンを指す。
[0029] (f)に記載しているように本酵素は SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサ ブュ -ッ卜分子量は約 37500ダル卜ンを示す。約 37500ダルトンとは 33000ダル卜ン 一 43000ダルトン好ましくは 35000ダルトン一 40000ダルトンを指す。 (e)〖こ記載し ているゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量と SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動におけるサブユニット分子量力 本酵素はホモテトラマーであることが容易に推 定できる。
[0030] (g)に記載して 、る基質特異性につ!、ては上記の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において基質のみを変えることにより容易 に求められ、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、 3, 4-ジヒドロキシ安息香酸、 3, 5 -ジヒドロキシ安息香酸には作用しな 、。
[0031] (h)に記載して!/、る至的 pHにつ!/、ては上記の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボ キシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において pHのみを変えることにより容易に求め られ、 30°Cで脱炭酸反応をさせる場合 pH約 8. 0において作用が至的である。約 pH 8. 0とは pH6. 0以上 9. 0以下、望ましくは pH7. 0以上 8. 5以下のことを指す。使用 する緩衝液に特に制限は無いがピペラジン（PH5— 5. 5)、MES (pH5. 5-6. 5)、リ ン酸カリウム (pH
6. 5—8. 0)、Tris (pH8. 0—9. 0)、 CHES (pH 9. 0— 10. 0)濃度としては lOOmM を例示できる。
[0032] (i)に記載して 、る金属の影響にっ 、ては上記の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法にぉ 、て反応系に各種金属の終濃度が 1 mMになるように添加し活性を測定することにより容易に求められ、 Mg2+、 Ni2+、 Co2+、 Fe3+、 Zn2+、
Figure imgf000016_0001
Ca2+金属イオンのいずれも脱炭酸活性を活性ィ匕しない。
[0033] (j)に記載して 、る補酵素の影響にっ 、ては上記の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デ カルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法にぉ 、て反応系に TPP、 PLPにつ 、て は終濃度 M、 NAD+、 NADP+については終濃度が ImMになるように添力卩し活 性を測定することにより容易に求められ、 TPP、 PLP、 NAD+、 NADP+はいずれも補 酵素にはなり得な力つた。また本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スぺ タトルを示すことより補酵素は無いと考えられる。
[0034] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのー態様は、配列 表の配列番号： 1に記載のアミノ酸配列、ある 、は配列番号： 1に記載のアミノ酸配列 に 1もしくは 2以上、好ましくは数個のアミノ酸が 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボ キシラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加され たアミノ酸配列を有する。
[0035] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌ クレオチドは配列表の配列番号： 2に記載の塩基配列を含む。配列番号： 2に示す塩 基配列は、配列番号： 1に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号： 1に示す アミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号： 2に示す塩基配列のみならず、 異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾また は挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能であ る。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号： 2に示す塩基配列に対し て、これによりコードされる 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの酵素活 性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。 このホモログには、例えば、配列番号： 1の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオ チドとストリンジェントな条件でノ、イブリダィズできる塩基配列を有するポリヌクレオチド を挙げることができる。
[0036] このストリンジェントな条件でのハイブリダィゼ-シヨンは、例えば Molecular Clonin g：し old Spring Harbor Laboratory
Press, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscience【こ g己載 の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、 Genelmageシステム（アマ シャム社製)を挙げる事ができる。
[0037] 具体的には以下の操作によってノ、イブリダィゼ-シヨンを行なう事ができる。試験す べき DNAまたは RNA分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプロ 一ブとプロトコール指定のハイブリダィゼ-シヨンバッファ一中でハイブリダィズさせる。 ハイブリダィゼ-シヨンバッファーの糸且成は、 0. 1重量0 /0SDS、 5重量％デキストラン 硫酸、 1Z20溶のキット添付のブロッキング試薬及び 2— 7 X SSCからなる。ブロッキ ング試薬としては例えば、 100 X Denhardt ' s solution, 2% (重量 Z容量） Bovin e
serum albumin, 2% (重量 Z容量） Ficll™400、 2% (重量 Z容量）ポリビュルピロリ ドンを 5倍濃度で調整したものを 1Z20に希釈して使用する事ができる。 20 X SSC は、 3M塩化ナトリウム、 0. 3Mクェン酸溶液であり、 SSCは、より好ましくは 3— 6 X S SC、更に好ましくは 4一 5 X SSCの濃度で使用する。ノ、イブリダィゼ-シヨンの温度は 40— 80°C、より好ましくは 50— 70°C、更に好ましくは 55— 65°Cの範囲であり、数時 間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温 度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダィゼーシヨン時の温度である。洗浄バ ッファーの組成は 6 X SSC + 0. 1重量0 /oSDS溶液、より好ましくは 4 X SSC + 0. 1 重量0 /oSDS溶液、更に好ましくは 1 X SSC + 0. 1重量0 /oSDS溶液、最も好ましくは 0. 1 X SSC + 0. 1重量0 /oSDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、 プローブがハイブリダィズした DNA分子または RNA分子をプローブに用いた標識を 利用して識別する事ができる。
[0038] 本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードする DNAは、例 えば以下のような方法によって単離することができる。下記に述べる方法により例え ばリゾビゥム スピーシズ（Rhizobium sp) MTP- 10005 (FERM
BP-10122)を培養し、培養した菌体より下記に述べる精製操作により精製酵素を得る 。得た精製酵素の N末端およびリジルエンドぺプチダーゼ、 V8プロテアーゼなどの 酵素により切断後 HPLCによって分取したペプチドをプロテインシーケンサ一により 解析する。その結果、リゾビゥム
スピーシズ（Rhizobium sp) MTP-10005 (FERM BP-10122)においては配列表の配列 番号 3から 7に示す部分アミノ酸配列を有することが判明した。
[0039] 尚、上記リゾビゥム スピーシズ (Rhizobium sp) MTP- 10005 (FERM BP- 10122)は、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6にある独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センターに、平成 15年 7月 8日カゝら特許手続上の微生物の寄 託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて上記受託番号にて寄託されて いる。 [0040] なお、得られたアミノ酸配列情報を元に PCR用のプライマーを設計し、酵素生産株 の染色体 DNAもしくは、 cDNAライブラリーを铸型とし、本プライマーを用いて PCR を行うことにより本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードする DNAの一部を得ることができる。さらに得られた DNA断片をプローブとして、酵素生 産株の染色体 DNAを制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどのベクターに導入 し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーや cDNAライブラリーを利用して、コ ロニーハイブリダィゼーシヨン、プラークハイブリダィゼーシヨンなどにより、本発明の 2 , 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードする DNAを得ることが可能で ある。また、 TaKaRa— La PCRTm
in vitro cloning Kit (タカラバイオ社製）を用いることにより、本発明の 2, 6-ジヒドロキ シ安息香酸デカルボキシラーゼをコードする DNAを得ることが可能である。
[0041] 上記のようにして単離された本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼをコードする DNAを、例えば宿主が大腸菌の場合、 pUC18や PKK223- 3、 pBR 322、 Bluescriptn- SK ( + )ゝ pSC101、 pET— 3b、 pET— l ibなどに代表される発 現用のプラスミドに組み込むことにより、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換え ベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性 DNAの形質が発現でき るものであればよぐ例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるもので はない。そして、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現プラスミドで形 質転換して得られた形質転換微生物を公知の情報に基づ!ヽて、培養することができ 、培養した形質転換微生物が 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性を 有することにより 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードする DNAが 含まれて ヽるプラスミドであることが確認できる。さらにそのプラスミドの塩基配列を解 析することによって、 目的の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコード する DNAの塩基配列が判明し、 DNAの塩基配列力 コードされている 2, 6-ジヒド ロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を推定することができる。
[0042] また、形質転換微生物を利用することによって、発現する 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸デカルボキシラーゼの酵素量を増加させることが可能となる。酵素量を増加させ る手段としては、遺伝子の転写調整領域の改良、遺伝子のコピー数の増カロ、蛋白へ の翻訳の効率化、好適な宿主の選択などが挙げられる。転写調整領域の改良とは、 遺伝子の転写量を増カロさせる改変をカ卩えることをいう。例えば、プロモーターに変異 を導入しプロモーターを強化し、下流にある遺伝子の転写量を増加させる方法が挙 げられる。その他にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入する方法が挙 げられ、例えば宿主が大腸菌においては、 lac、 tac、 trp、 T7などのプロモーターが 挙げられる。遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 デカルボキシラーゼ遺伝子を多コピー型ベクターに挿入し、得られた組み換え DNA を宿主細胞に保持させればよい。蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例え ば原核生物では SD配列、真核生物ではコンセンサス配列を導入、改変することなど が挙げられる。ここでいう SD配列、コンセンサス配列とは、各生物のリボソーム結合 部位を言う。これら 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの酵素量を増加さ せる方法としては特に上述に限定されるものではない。
[0043] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの由来に特には制 限はないが、好ましくは微生物に由来するものであり、さらに好ましくは好気下での培 養ができる微生物に由来するものであり、さらに好ましくはリゾビゥム（Rhizobium)属に 属する微生物に由来するものであり、さらに好ましくはリゾビゥム（Rhizobium)属に属 する微生物の 16SrDNAのうち 5 '末端側の塩基配列が配列表の配列番号： 8記載 の塩基配列である微生物に由来するものである。より具体的には、リゾビゥム スピーシズ（Rhizobium sp) MTP-10005 (FERM BP-10122)を好適な事例として挙げる 事ができる。また、公知の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを遺伝子組 換えによって改変したものであっても、本発明に包含される。
[0044] なお、本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが由来する Rhizobium属微生物の 16SrDNAの 5'末端側の塩基配列は Rhizobium属に属する微 生物を LB
Broth(Becton Dickinson社製)寒天培地に塗抹後、 30°C、 2日間培養して得られた菌 体より PrepMan Method(Applied Biosystem社製)を用いてゲノム DNAを抽出し、抽 出したゲノム DNAを铸型として PCRにより 16SrDNAのうち 5，末端側約 500bpの領 域を増幅し、増幅された塩基配列をシーケンシングすることにより決定できる。
[0045] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを得るために必要 な微生物の培養物は、当該分野で一般的な微生物の培養方法に準拠した方法を採 用することにより得ることができるが、より具体的には、以下のような条件である。
[0046] 培養用の培地は、当該微生物を通常この分野において用いる培地、例えば、肉ェ キス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、 NZァミン等の有機栄養源、グルコース、マ ルトース、しょ糖、でんぷん、有機酸等の炭素源、硫酸アンモ-ゥム、尿素、塩化アン モ -ゥム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン 類を適宜組み合わせて使用すればょ ヽ。
[0047] 培養温度は、 20— 40°C、より好ましくは 25— 35°Cで、培養 pHは、 pH5. 0— 10.
0でより好ましくは pH6. 0-9. 0で行いうる。また、嫌気下、好気下でいずれの条件 下でも行うことができるが、通常は増殖速度が速い好気下での振盪培養が好ましい。 培養日数は、特に制限されるものではないが、好ましくは、 1一 7日の範囲で目的の 活性が最大になるまで培養すればょ ヽ。
[0048] また、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性を高めるためには、菌体 を増殖させるための培地に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の添カ卩が有効である。添加量 は、培地中に 1一 100mM、好ましくは 10— 50mMとなるように添加することが好まし い。
[0049] そして、本発明にお ヽては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換微生物を それ自体公知の方法により培養することができ、本発明の 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸デカルボキシラーゼを産生させることもできる。この場合使用される培地としては炭 素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地ま たは天然培地の!/ヽずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体 培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を 用いて行う事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すれば よぐ菌株が生育し 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生できる条件 であれば特に制限はない。
[0050] 尚、以上の培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じて変更することは可 能である力 レゾルシンを 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸にカテコールを 2, 3-ジヒドロキ シ安息香酸に変換する活性が最大になるように設定することが重要であることは当然 である。
[0051] 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは次のような方法で精製することが 可能である。 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが培養上清中に分泌さ れる場合は遠心分離等を用い微生物菌体を除いたものを粗酵素液とすることができ る。 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが菌体内に蓄積される場合には 、培養終了後、微生物をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で 菌体を洗浄後、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理 などの物理処理や、リゾチームなどの細胞溶解酵素処理のような生化学的処理もしく は界面活性剤との化学的処理を組み合わせて行うことにより微生物を破砕し、破砕し た菌体液を緩衝液等に懸濁し、不溶物を遠心分離等で除去したものを粗酵素液とす ることができる。また植物や動物組織に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼが含まれる場合も上に述べたような菌体内に蓄積される場合と同様に粗酵素液を 調製することが可能である。こうして得られた粗酵素液を、塩析、有機溶媒などによる 分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグ ラフィー、ァフィユティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーによる分離お よび等電点電気泳動、 native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単 独もしくは組合わせることにより精製し電気泳動的に単一のバンドに精製することが できる。
[0052] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸および 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製 造方法とは炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素存在下において水性溶媒中にて該 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをレゾルシンまたはカテコールに作 用させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、 反応により生成した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を 該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3- ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であれば特に制限はない。したがって、上記のよう に微生物を培養して得た培養液自体、もしくは、該培養液から遠心分離 ·濾過等の 操作により分離される該微生物菌体、上記の微生物菌体の洗浄物、破砕物、または 、抽出物等、菌体を生理食塩水などで洗浄して得られる洗浄菌体、菌体ゃ洗浄菌体 を凍結乾燥、アセトン乾燥処理することなどにより得られる乾燥菌体、種々の物理ィ匕 学的方法、例えば超音波破砕、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、溶菌酵素、界 面活性剤及び有機溶媒処理等により得られる菌体破砕物、例えば菌体破砕物や培 養上清等から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトダラ フィ一、ァフィニィティークロマトグラフィー等の常法 (これらの組み合わせを含む）に より、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸をレゾルシンに変換する活性画分を特定 '分離して 得た粗精製酵素および精製酵素、上述の微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、 精製酵素をポリアクリルアミド法、アルギン酸法、カラギーナン法、または適当な坦体 に共有結合法、吸着法等公知の方法で固定化することにより得た固定化物を、炭酸 イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素の存在下にて水性溶媒中でレゾルシンに作用させ て 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸をまたはカテコールに作用させて 2, 3-ジヒドロキシ安 息香酸を生成させ、反応により生成した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒド ロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法は本製造法に含まれる。
[0053] これら微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、精製酵素および、固定化物は、そ の製造直後に反応して用いることはもちろん、たとえば低温条件下等にて製造後一 且保管し、必要に応じて必要量を使用することもできる。
[0054] このように調製された微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、精製酵素および固 定ィ匕物を炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素の存在下にて水性溶媒中でレゾルシ ンに作用させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸またはカテコールに作用させて 2, 3-ジヒ ドロキシ安息香酸を生成させるが、その際の培養物、処理物や固定化物の使用量は 、通常、目的とする効果を発揮する量 (有効量)であれば良ぐこの有効量は当業者 であれば簡単な予備実験により容易に求められる。
[0055] 本発明にお ヽて、炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素を含む水性媒体は、レゾルシ ンまたはカテコールに付加されるカルボキシル基の供給源となるのであれば特に制 限はない。すなわち、炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性媒体とは、具 体的には、重炭酸塩、炭酸塩を上述の水性溶媒中に添加し、もしくは、気体'液体- 固体の二酸ィ匕炭素を該水性溶媒中に吹き込み、又は添加することで調製することが できる。重炭酸塩、炭酸塩のカチオン種としては、各種金属イオン、有機化合物の力 チオン、アンモニアイオンなどが挙げられる。尚、炭酸イオン及び zまたは二酸化炭 素の水性媒体中での濃度は特に制限はないが、 50— 5000mMの濃度が例示でき る。また、 CO超臨界条件下での反応も可能である。尚、水性媒は特に制限がなぐ
2
2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の生成に影響を及ぼさ ない限りは、均一混合系でも二相系でもよい。
[0056] 本発明における水性溶媒中より 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ 安息香酸を採取する方法とは、生成した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒ ドロキシ安息香酸を反応液力 分離，精製する方法であれば特に制限はないが、たと えば、反応液を濾過や遠心分離等により前処理した後、得られた上清液に塩酸ゃ硫 酸等の酸溶液をカ卩えて酸性ィ匕することにより、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3 -ジヒドロキシ安息香酸の粗結晶を回収する方法を好適な例として挙げることができる 。また、溶剤抽出等の方法により回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知 の精製方法を適宜併用することもできる。
[0057] 本発明において 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に使用される微生物は、上 述の耐熱性を有する 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生 物が好ましい。し力しながら、このような微生物に限定されることなぐ炭酸イオン及び Z又は二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 を生成する能力を有する微生物であればよい。詳しくは、炭酸イオン及び Z又は二 酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する 酵素を発現する微生物であればよい。以後、炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素を含 む水性媒体中でレゾルシンから 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する 微生物を単に微生物と呼ぶことがある。微生物の帰属分類群としては、細菌、放線菌 、酵母、かび等に属する微生物が挙げられる。より具体的には、 Agrobacterium属 、 Campylobacter J¾、 Clostridium腐、 EnterobacterJ禹、 Propionibacterium属 、 Rhizobium属に属する微生物、好ましくは、 Propionibacterium属ゃ Rhizobium 属に属する微生物が挙げられ、特に Propionibacterium freudenreichii (代表例 MT-10883)、 Rhizobium sp. (代表例 MTP- 10005)が例示できる。 MT- 1088 3は受託番号 FERM BP— 10121として日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番号中央 第 6にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 11年 6 月 8日から特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基 づいて寄託されている。
[0058] 使用される微生物は、炭酸イオン及び/又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾ ルシンから 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する酵素を発現する微生物であれば、 自然界に存在する天然の微生物でも人為的に作製された組換え微生物でもよい。こ こで述べる組換え微生物とは、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸生産に関与する酵素をコ ードする DNA配列により宿主細胞を形質転換したものであり、この組換え微生物に より、構成的或いは誘導的に該酵素を効率的に生産し得るものである。また、天然の 微生物又は組換え微生物に-トロソグァ-ジンのような変異導入剤と接触させる手法 や UV照射法などの変異導入処理を施すことにより得られる何らかの有用な形質を保 持した突然変異微生物でもよ!/、。このような突然変異微生物が取得した形質としては 、例えば、レゾルシンや炭酸塩、二酸化炭素、 2, 6_ジヒドロキシ安息香酸に対する 耐性の向上した変異株、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を分解しなくなった変異株、 2, 6 -ジヒドロキシ安息香酸に関与する酵素の生産性の高い変異株等が挙げられる。
[0059] 本発明で使用する微生物又は該微生物の処理物とは、芳香族化合物から芳香族 カルボン酸を生成する能力を有するものであれば、特に制限はない。したがって、微 生物又は該微生物の処理物は、菌体培養液、培養菌体、破砕菌体、菌体抽出物、 乾燥菌体、有機溶媒処理菌体、粗酵素、精製酵素、固定化物等である。これら微生 物又は該微生物の処理物は、製造直後に反応に用いることは勿論、製造後に保管 し、必要に応じて使用することもできる。
[0060] 本発明において、有機溶媒は通常の有機合成に使用されるものであればよい。好 ましくは炭酸イオン及び Z又は二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから 2, 6 ージヒドロキシ安息香酸を生成させる反応の平衡を 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸側へ 移動させる有機溶媒である。ここでいう平衡とは、炭酸イオン及び Z又は二酸化炭素 とレゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する反応とその逆反応である 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸力 炭酸イオン及び Z又は二酸ィ匕炭素とレゾルシンを生成 するの化学親和力がつり合った状態のことをいう。ここでいう反応の平衡が 2, 6—ジヒ ドロキシ安息香酸側へ移動するとは、有機溶媒の添加し反応を行うことによって、有 機溶媒を添加しない場合の反応と比較して異なる平衡状態へと達し、その結果、反 応液中のレゾルシンと 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸のモル比力 有機溶媒を添加しな V、場合の反応平衡と比較して 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸側へ傾くことを 、う。
[0061] 添加する有機溶媒として、具体的には炭素数 1から炭素数 4のカルボ-トリル、アル コール、エーテル、ケトン、スルフィエルのうち力も選ばれた有機溶媒などである。より 具体的にはァセトニトリル、イソプロパノール、ブタノール、ジェチルエーテル、ァセト ン、エタノール、エチレングリコーノレ、エチレングリコールモノメチルエタノール、グリセ リン、ジォキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、メタ ノールなどが挙げられる。またこれら具体例だけに限定されることなぐ反応平衡を 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸側へ移動させる有機溶媒として、好ましくは水に対して相溶 性の有機溶媒や及び/又は非プロトン性有機溶媒などが挙げられる。ここでいう水に 対して相溶性の有機溶媒とは、水と自由に混合する有機溶媒をいう。具体例としては 、ァセトニトリル、イソプロパノール、アセトン、エタノール、エチレングリコール、モノメ チルエタノール、グリセリン、ジォキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド 、テトラヒドロフラン、メタノールなどが挙げられる。
[0062] また、非プロトン性有機溶媒とは、プロトンを供与する能力が著しく低い有機溶媒で あり、具体例としては、ァセトニトリル、ジェチルエーテル、アセトン、ジォキサン、ジメ チルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これら 有機溶媒は、単一でも 2種以上の混合使用でも構わない。また、反応開始時に添カロ しても、反応途中に添カ卩しても構わない。添力卩量は 1一 80 (volZvol) %、好ましくは 10— 60%である。
[0063] 本発明にお 、て、レゾルシンの酸化を抑制するのは、レゾルシンの酸化により生成 するレゾルシンラジカルがオリゴマーとなり、これらが 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の生 成を阻害することを抑制するためである。酸ィ匕を抑制されたレゾルシンは、反応液中 でレゾルシンとして安定して存在するため、 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸の選択率は 9 7— 100%と著しく向上する。ここでいう 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の選択率とは、反 応液中の減少したレゾルシンのモル量に対する生成した 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸 のモル量の割合をいう。レゾルシンの酸化抑制方法としては、 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸の生成に影響を及ぼさない限りは特に制限はない。代表例として、反応系内の 酸素濃度の低下による酸ィヒ抑制方法が挙げられる。反応系内の酸素濃度はレゾル シンの酸ィ匕を抑制し得る濃度であれば特に制限はな 、が、好ましくは反応液の溶存 酸素濃度 lOppm以下である。より好ましくは 8ppm以下、さらに好ましくは 4ppm以下 である。
[0064] 反応系内の酸素濃度を上述の範囲内に調整する方法については特に制限はない 1S 具体的には、反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気にする方 法や、反応系内を減圧する方法、酸ィ匕防止剤の添加などが挙げられる。
[0065] 反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気にする方法において不 活性雰囲気とは、反応容器の気相をアルゴンなどの希ガス又は系の物質と反応しな V、窒素などの不活性ガスで置換し、酸素ガスなどによる有害な影響を与えな 、ように した気相の状態を指す。使用する希ガスや不活性ガスは単独でも複数を混合して使 用しても良い。これに準じて、二酸化炭素雰囲気とは、反応系内気相部を二酸化炭 素で置換した状態を指す。また、二酸ィ匕炭素と単独又は複数の希ガス又は不活性ガ スを混合した状態でもよ 、。気相部の容量が小さく気相部の置換だけでは反応液の 溶存酸素濃度を上述範囲内に調整できない場合は、気体 '液体'固体の希ガス、又 は不活性ガス、又は二酸ィ匕炭素を水性溶媒中に吹き込むことや添加することにより 溶存酸素を低下させる方法でも良 ヽ。
[0066] 反応系内を減圧にする方法とは、減圧により反応系内を脱気することによって反応 系内の酸素濃度を低下させる方法である。反応系内の圧力は酸素濃度が上述範囲 内となれば特に制限はないが、具体的には常圧未満、好ましくは 0. 51 X 105Pa未 満である。
[0067] 酸化防止剤の添加は、上述の反応系内酸素濃度を低減する効果の他に、酸化し たレゾルシンを還元する効果もある。添加する酸化防止剤は、レゾルシンの酸ィ匕抑制 する効果があれば特に制限はないが、具体的には、 2-メルカプトエタノール、硫ィ匕水 素、チォ硫酸ナトリウム、過酸化水素、ハイドロキノン、トコフエロール、ノルジヒドログ アイァレチン酸、没食子酸エステル、 t-ブチルヒドロキシァ-ソール、 2, 6-ジ -t-メチ ルフエノール、 L-ァスコルビン酸、イソァスコルビン酸、クェン酸、ジブチルヒドロキシト ルェン、ジフエ-ルァミン、フエ-レンジァミン誘導体、ホスホン酸エステルなどが挙げ られる。好ましくは、 2-メルカプトエタノールである。
[0068] 酸ィ匕防止剤の添加量はレゾルシンの酸ィ匕を抑制し得る濃度であれば特に制限は ない。好ましくは、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の生成に影響を及ぼさない適当な所要 量であり、この適当な所要量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求めら れる。例えば、 2-メルカプトエタノールの添カ卩量は、予備実験より lppm— 2000ppm 力 S好まし ヽ。より好ましく ίま、 20ppm力ら 200ppmである。
[0069] また、反応の間レゾルシンの酸ィ匕を抑制し続けるには、低下させた酸素濃度を維持 することが重要である。その方法として、密閉性の高い反応器を使用するなど、外部 力もの酸素の侵入を防げばよい。 DO計などを使用すれば、より厳密に反応系内の 酸素濃度を制御できる。
[0070] 本発明にお!/、て、反応時のレゾルシン濃度は特に制限されな 、が、 1一 2000mM が望ましい。レゾルシンは、固体のまま、あるいは、溶媒に溶解または分散させ添カロ すればよぐ反応開始当初に一括添加、又は、反応の進行に応じて所要量を逐次添 加する。好ましくは逐次添加である。逐次添加するレゾルシン量に特に制限はないが 、より望ましくは反応時のレゾルシン濃度が最大反応速度の維持を阻害しない程度 の濃度となるようなレゾルシン量を逐次添加する。
[0071] 本発明において、微生物又は該微生物の処理物は、反応開始当初に一括添加、 又は、反応の進行に応じて適当な所要量を 2回以上に分けて必要量を分割して添カロ する。好ましくは反応の進行に応じて適当な所要量を逐次添加する。適当な所要量 とは、目的とする効果を発揮する量 (有効量)であり、この有効量は当業者であれば 簡単な予備実験により容易に求められる。
[0072] 本発明における 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸または 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を生 成（以後、単に反応と呼ぶ）させる条件は、反応 pHとしては、 pH3— 12、好ましくは p H6— 9である。また、反応の進行により反応液の pHが変化する場合は pHを至適 pH に調節するのが好ましい。反応温度は、氷点一 60°C、好ましくは 20— 40°Cの範囲 である。反応時間については、特に制限されるものではないが、より具体的には、 1分 間から 120時間程度である。反応時の圧力も特に制限されるものではないが、通常、 常圧一 lOOkg/cm2の範囲が好適である。反応は攪拌下ある!/ヽは静置下 、ずれで もよぐまた、ノ ツチ式または適当なノ ィオリアクターを用いた連続式のいずれでも可 能である。
[0073] 本発明にお 、て、反応系内の酸素濃度の低下、有機溶媒の添加、反応時のレゾル シンの逐次添加、微生物又は該微生物の処理物の逐次添カ卩は、いずれも 2, 6-ジヒ ドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高める効果があり、これらの手法は単独でも複数を組 み合わせてもその効果を発揮する。好ましくは、複数を組み合わせる。
[0074] 次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限 定されるものではない。
実施例 1
[0075] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの 精製
LB培地（イーストエキス： 5g/l、ポリペプトン： 10g/l、 NaCl: 10g/l pH7. 0)を所定 濃度に調整したものを、口径 2 lmmの試験管に 5ml入れ、 121°C、 15分間オートク レーブ殺菌を行った。これに LB培地に 1. 5%の寒天を加えたスラント培地で継代培 養して 、る菌体（リゾピウムスピーシス MTP-10005)を 1白金耳接種した。 25°Cの 恒温室にて 1日間振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。その 0. 5mlを、終濃度 20 mMの 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を含む、表 1に示す組成（pH8. 5に、 5N KOH にて調整）でオートクレーブ殺菌済みの培地 50mlが入った 500mlバッフル付き三角 フラスコに接種した。 25°Cで 2日間振盪培養し菌体を遠心分離（3000rpmで 10分 間）によって回収した (乾物重換算で約 50mg)。
[0076] [表 1] 酵母エキス 1. 0〜5. 0 g/1
(NH2) 2CO 0. 1— 10.0 g/1
K2HP04 0. 1 ~ 10.0 g/1
KH2P04 0. 1 ~ 10.0 g/1
Mg S04 · 7H20 0. 1 ~ 10.0 g/1
C a C 12 · 2H20 0. 001〜 1. 0 g/1
N a F e— EDT A · 3 H20 1〜： L 00
Figure imgf000030_0001
Mn S04 · 4H20 1〜： L 00 m g/ 1
Z n S04 · 7H2〇 1〜： L 00 m gZ 1
H3B03 1〜： L 00 m g/ 1
N i C 12 · 6H20 1〜： L 00 U g/1
N a 2Mo 04 · 2 H20 10〜500 β g/1
C u S04 · 5H20 1〜 100 g/1
C o C 12 · 6 H20 1〜： L 00 g/1 ニコチン酸 1〜100 m g/ 1 グリシン 1〜； L 00 m gZ 1 塩酸ピリ ドキシン 0. 1〜； L 00 m gZ 1 塩酸チアミン 0. 1〜： L 00 m g/ 1 葉酸 0. 1〜： L 00 m gZ 1 ビォチン 1〜 100 β /1 パントテン酸 C a 0. 1〜： L 00 m g/ 1 ビタミン B12 0. 1〜： L 00 m g/ 1 回収した菌体は生理食塩水 (NaCl 9g/l)で洗浄後、培養液の 1 20量の 0.02 % 2-メルカプトエタノール入りの lOmM燐酸カリウム緩衝液 (pH7.0)に懸濁した。 この懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、遠心分離後（15000rpm、 10分間）上 澄みを回収し酵素液とした。本酵素溶液を DEAE_TOYOPEARL、 Butyl-TOYO PEARL, SuperQ- TOYOPEARL、 TOYOPEARL HW- 55の順に通すことによ りポリアクリルアミドゲル電気泳動（Native PAGE)的に単一に精製することができ た。なお活性画分の同定には次に記載する脱炭酸活性を測定する反応方法を用い 行った。表 2の反応組成の反応液 lmlを 10ml容のネジロ式遠沈管にて 30°C、 5分 間振とうしながら反応した。反応停止は 5N塩酸 200 1を加えることにより行った。
[0078] [表 2]
表 2
0. 05M2, 6—ジヒ ドロキシ安息香酸 180 1
1. 0Μ燐酸カリウム緩衝液 （ρΗ7. 0) 100 1
脱イオン水 620 1
希釈酵素液 100 1
[0079] 遠心分離（15000rpm、 10分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体 クロマトグラフィーにより分析した。
[0080] カラム： Inertsil ODS- 2(GLSciencesInc.製）
移動相：水：ァセトニトリル（85： 15)、 0.1 % (v/v)トリフルォロ酢酸
揿'：0.6ml/ min
カラム温度： 40°C
検出方法： UV吸収波長 280nm
[0081] また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一に精製した酵素を用い表 3の反応組 成の反応液 lmlを 10ml容のネジロ式遠沈管にて 30°C、 5分間振とうしながら反応し た。反応停止は 5N塩酸 200 1をカ卩えることにより行った。
[0082] [表 3]
表 3
0. 5 Mレゾノレシン 240 Id 1
1. 0M炭酸水素ナトリウム 500 11 1
1. 0M燐酸カリウム緩衝液 （pH7. 0) 100 11 1 脱イオン水 1 50 11 1 精製酵素液 10 11 1
[0083] 遠心分離（15000rpm、 10分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体 クロマトグラフィーにより分析した。この反応液を分析した結果、原料に用いたレゾル シンのピーク以外は標品の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出 された。このピークを LCZMSで分析した結果、確力に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸で あることが確認された。
[0084] カラム： Inertsil ODS- 2 (GLSciencesInc.製）
移動相：水：ァセトニトリル（85： 15)、 0.1 % (v/v)トリフルォロ酢酸
揿'：0. 6ml/ min.
カラム温度： 40°C
検出方法： UV吸収波長 280nm
[0085] また同様に表 4の反応組成の反応液 lmlを用い反応を行ったところ、原料に用いた カテコールのピーク以外は標品の 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみ が検出された。このピークを LCZMSで分析した結果、確かに 2, 3-ジヒドロキシ安息 香酸であることが確認された。
[0086] [表 4]
表 4
0 . 5 Mカテコール 2 4 0 1
1 . 0 M炭酸水素ナトリウム 5 0 0 11 1
1 . 0 M燐酸カリウム緩衝液 （p H 7 . 0 ) 1 0 0 a 1 脱イオン水 1 5 0 11 1 精製酵素液 1 0 1 実施例 2
[0087] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの 性質
1.サブユニット分子量とタンパク質全体の分子量の測定
実施例 1で取得した精製酵素を用い、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果、本 酵素の全体の分子量は約 151000であった。また、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動の結果よりサブユニットの分子量は約 37500であった。これらの結果より、本酵 素はホモテトラマーの構造を持つと判断される。 [0088] 2. N末端配列および部分アミノ酸配列
実施例 1で取得した精製酵素の N末端配列と精製酵素をリジルエンドぺプチダー ゼにより消ィ匕し、 HPLCによって分取したペプチドの配列をプロテインシーケンサー により解析した。解析により得られた配列は配列表の配列番号 3から 7に示す。なお 配列番号 3が N末端配列を示す。
[0089] 3.基質特異性
本酵素の基質特異性を実施例 1で得た精製酵素を用い実施例 1に示した脱炭酸 活性を測定することにより確認した。基質としては、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸、 3, 4 -ジヒドロキシ安息香酸、 3, 5-ジヒドロキシ安息香酸を用いた。その結果、 2, 6-ジヒド ロキシ安息香酸に作用し、 3, 4-ジヒドロキシ安息香酸、 3, 5-ジヒドロキシ安息香酸 には作用しなかった。
[0090] 4.酵素の熱安定性
実施例 1で得た精製酵素を 10mM燐酸カリウム緩衝液 (pH7. 0) 1. OmLに溶解し 容量 15mLの蓋付きガラス製試験管に入れ、指定の温度（50°C ' 70°C)に制御した 水浴恒温槽に浸漬し振とうしながら熱処理を行い、所定時間ごとに 100 1ずつサン プリングし、その後、実施例 1に記載した方法によって脱炭酸活性を測定した。取得 した結果より活性半減期を計算した。その結果、本酵素の活性半減期は 50°Cにおい て 122分。 60°C【こお!ヽて 25. 5分であった。
[0091] 5.至的反応温度
実施例 1で得た精製酵素を用い実施例 1に記載した脱炭酸活性を測定する方法に て温度のみを 20°C— 90°Cの範囲で変えて、測定したところ、本酵素の至的温度は 7 0°C付近であると推定された。
[0092] 6.至的反応 pH
実施例 1で得た精製酵素を用い実施例 1に記載した脱炭酸活性を測定する方法に て pHのみ 5— 10の範囲で変えて、測定したところ、本酵素の至的 pHは約 8付近で あると推定された。使用した緩衝液はピペラジン (pH5— 5. 5)、MES (pH5. 5-6. 5 )、リン酸カリウム（pH6. 5—8. 0)、Tris (pH8. 0—9. 0)、CHES (pH9. 0— 10. 0) であり反応中の最終濃度としては lOOmMになるように調製した。 [0093] 7.各種金属塩の影響
実施例 1で得た精製酵素を用い、
Figure imgf000034_0001
Ca2+の 塩化物塩を実施例 1に記載した脱炭酸活性を測定する反応系に終濃度 ImMになる ように添加し、その影響を調べたところ供試した全ての金属塩は!、ずれも脱炭酸活性 を活性ィ匕しなカゝつた。
[0094] 8.補酵素の影響
実施例 1で得た精製酵素を用い、 TPP、 PLP、 NAD+、 NADP+を実施例 1に記載した 脱炭酸活性を測定する反応系に終濃度 10 Mになるように添加し、その影響を調 ベたところ供試した全ての化合物はほとんど影響を及ぼさなく補酵素にはなり得なか つた。また、本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことよ り補酵素は無いと考えられる。
実施例 3
[0095] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子取得
実施例 1で精製した精製酵素の N末端配列と精製酵素をリジルエンドぺプチダー ゼにより消化した。
1.部分アミノ酸配列の取得
HPLCによって分取したペプチドの配列をプロテインシーケンサ一により解析した。 その結果、リゾビゥムスピーシズ（Rhizobium sp) MTP- 10005 (FERM BP- 10122)に おいては配列表の配列番号 3から 7に示す部分アミノ酸配列を取得した。
[0096] 2.ゲノミック DN Aの調製
培養後遠心分離により取得した Rhizobium.sp MTP-10005菌体を燐酸緩衝液で洗 浄後、遠心分離により回収した。回収した洗浄菌体より「基礎生化学実験法 2抽出 · 分離，精製
阿南功一他著丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノム DNAの分離方法に 従い、ゲノム DN Aを調製した。
[0097] 3. TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kit (タカラバイオ社製）を用いるための部分遺 伝子配列の取得 上記で調製したゲノミック DNAとアミノ酸部分配列により設計した配列表の配列番号 ： 9, 10記載のプライマーを用いて増幅したところ増幅断片 (約 250bp)を得た。
[0098] 次に、 pT7Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子を TAクローユングし、その揷 入断片の塩基配列にっ 、て Amersham Pharmacia
Biotech社製 Vistra Thermo Sequenase Pre— mixed Cycle Sequencing Kitと Hitachi Electronics Engineering社製、 Hitachi DNA sequencer SQ5500Eを用 ヽたフフイマ—ェ タステンション法によって決定した。
[0099] 4. TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitによる遺伝子配列の取得
上記で調製したゲノミック DNAを制限酵素（EcoRI,SalI)で完全消化した。 TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitのプロトコールに従い、完全消化したゲノミック DNAに EcoRIカセット連結したものをテンプレートとして用い、 1st PCRには配列表の 配列番号： 11記載のプライマ-、 2nd PCRには配列表の配列番号： 12記載のプライ マ-を用いて増幅したところ増幅断片 (約 3000bp)を得た。
[0100] 次に、 pT7Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子を TAクローユングし、その揷 入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。
[0101] 次に、 TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitのプロトコールに従い、完全消化したゲ ノミック DNAに Sailカセット連結したものをテンプレートとして用い、 1st PCRには配列 表の配列番号： 13記載のプライマ-、 2nd PCRには配列表の配列番号： 14記載の配 列
のプライマーを用いて増幅したところ増幅断片 (約 1200bp)を得た。
[0102] 次に、 pT7Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子を TAクローユングし、その揷 入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。
[0103] 5.全遺伝子配列の取得
全配列の決定については、 5末端側についての gene walkingの結果と上記の結果 より設計した、配列表の配列番号： 15、 16記載の配列のプライマーを用いて増幅し たところ増幅断片を得た。
[0104] 次に、 pT7Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子を TAクローユングし、その揷 入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。その結果、配列表の配列番号： 2に示した目的遺伝子を取得した。
実施例 4
[0105] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌（BL21
Star™)の 2,6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性の確認
1. pET発現システムを利用した発現用ベクターの構築
上記塩基配列決定により取得した配列をもとに pET発現システムのベクター (pET- 3b、 pET-l lb) (Novegen)に繋ぎ込むために配列表の配列番号： 17、 18記載のプラ イマ-によりゲノミックをテンプレートとして用い、増幅した遺伝子を上記ベクターの制 限酵素サイト (Ndel、 BamHl)に繋ぎ込み発現ベクターを構築した。
このベクターによりキットに含まれるコンビテントセル BL21 Star™ (Invitrogen)を形質 転換し形質転換大腸菌を取得した。
[0106] 2.上記形質転換体の 2,6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性の確認
500mlのバッフル付き三角フラスコに 100mlの LB液体培地を調製し、 121°C、 20 分間のオートクレープにより滅菌した。上記形質転換体を一白菌耳植菌し、 37°C、 1 30rpmにて培養 OD =0. 6になるまで培養し、試験管に ImMになるように IPTGを
600
加えさらに 30°Cで 15時間培養した。遠心分離（5000G X 15分間）により菌体のみを 培養液より回収し、続いて、 50mlの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠 心分離を行って湿菌体を得た。その後、培養液の 1Z20量の 0. 02%
2-メルカプトエタノール入りの 10mM燐酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)に懸濁した。この 懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、遠心分離後（15000rpm、 10分間）上澄み を回収し酵素液とした。
[0107] その後、次に記載する脱炭酸活性を測定する反応方法を用い酵素活性に確認行 つた。表 5の反応組成の反応液 lmlを 10ml容のネジロ式遠沈管にて 30°C、 5分間 振とうしながら反応した。反応停止は 5N塩酸 200 1を加えることにより行った。
[0108] [表 5] 表 5
0 . 0 5 M 2 , 6—ジヒ ドロキシ安息香酸 1 8 0 n 1 1 . 0 M燐酸カリウム緩衝液 （p H 7 . 0 ) 1 0 0 n 1 脱イオン水 6 2 0 n 1 希釈酵素液 1 0 0 n 1
[0109] 遠心分離（15000rpm、 10分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体 クロマトグラフィーにより分析した。
その結果、確かに 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を脱炭酸しレゾルシンを生成する活 性を確認した。レゾルシンの生成量は 1 μ gであった。
[0110] カラム： Inertsil ODS- 2 (GLSciencesInc.製）
移動相：水：ァセトニトリル（85： 15)、 0.1 % (v/v)トリフルォロ酢酸
揿'：0. 6ml/ min.
カラム温度： 40°C
検出方法： UV吸収波長 280nm
[0111] [比較例 1]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含まな ヽ DNAによって形質転換した大腸菌を用いた 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸の脱炭酸
2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET- 3 b、 pET-l lb)によって形質転換した大腸菌を実施例 4と同様に培養し、酵素液を取 得しそれを用いて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の脱炭酸を試み、反応液の分析を行つ たが、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を脱炭酸しレゾルシンを生成する活性は認められ なかった。
実施例 5
[0112] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌を用いたレゾルシンからの 2, 6-ジヒド ロキシ安息香酸への変換
また、実施例 4と同様に取得した酵素液を用い表 6の反応組成の反応液 lmlを 10 ml容のネジロ式遠沈管にて 30°C、 5分間振とうしながら反応した。反応停止は 5N塩 酸 200 μ 1をカ卩えることにより行った。
[0113] [表 6]
表 6
0 . 5 Μレゾノレシン 2 4 0 II 丄 1 . 0 Μ炭酸水素ナトリウム 5 0 0 11 丄 1 . 0 Μ燐酸カリウム緩衝液 （ρ Η 7 . 0 ) 1 0 0 11 丄 脱イオン水 1 5 0 11 丄
1 0 0 11 丄
[0114] 遠心分離（15000rpm、 10分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体 クロマトグラフィーにより分析した。この反応液を分析した結果、原料に用いたレゾル シンのピーク以外は標品の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出 された。このピークを LCZMSで分析した結果、確力に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸で あることが確認された。
[0115] カラム： Inertsil ODS- 2 (GLSciencesInc.製）
移動相：水：ァセトニトリル（85： 15)、 0.1 % (v/v)トリフルォロ酢酸
揿'：0. 6ml/ min.
カラム温度： 40°C
検出方法： UV吸収波長 280nm
[0116] 本方法で 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の生成量を定量した結果、 4 μ gが生成して 、 ると計算された。
[0117] [比較例 2]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含まな ヽ DNAによって形質転換した大腸菌を用いたレゾルシンからの 2, 6- ジヒドロキシ安息香酸への変換
2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET- 3 b、 pET-l lb)によって形質転換した大腸菌を実施例 5と同様に培養し、酵素液を取 得しそれを用いてレゾルシンの 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の変換を試み、反応液の 分析を行った力 レゾルシン酸より 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸への変換は認められな かった。
実施例 6
[0118] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌を用いたカテコールからの 2, 3-ジヒ ドロキシ安息香酸への変換
また実施例 5と同様に表 7の反応組成の反応液 lmlを用い反応を行ったところ、原 料に用いたカテコールのピーク以外は標品の 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸と一致する ピークのみが検出された。このピークを LC/MSで分析した結果、確力に 2, 3-ジヒド ロキシ安息香酸であることが確認された。
[0119] [表 7]
表 7
0 . 5 M力テコーノレ 2 4 0 11 1
1 . 0 M炭酸水素ナトリウム 5 0 0 11 1
1 . 0 M燐酸カリウム緩衝液 （p H 7 . 0 ) 1 0 0 11 1 脱イオン水 1 5 0 11 1 精製酵素液 1 0 11 1
[0120] 本方法で 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の生成量を定量した結果、 6 μ gが生成して 、 ると計算された。
[0121] [比較例 3]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含まない DNAによって形質転換した大腸菌を用いたカテコールからの 2, 3- ジヒドロキシ安息香酸への変換
2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET- 3 b、 pET-l lb)によって形質転換した大腸菌を実施例 6と同様に培養し、酵素液を取 得しそれを用いてカテコールの 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の変換を試み、反応液の 分析を行った力 カテコールより 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸への変換は認められなか つた o 実施例 7
[0122] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )の 2,6-ジヒドロキシ 安息香酸デカルボキシラーゼ発現の確認
実施例 4にお 、て pET-3bを用 、て構築した発現ベクターにより、コンピテントセル B L21 (DE3) (Novagen)を形質転換し、形質転換大腸菌を取得した。試験管に 5mlの LB液体培地を、 2L坂口フラスコに 1Lの LB液体培地をそれぞれ調製し、 121°C、 20 分間のオートクレーブ滅菌後、それぞれにアンピシリンを 100 gZmlとなるよう添カロ し培養に使用した。試験管に上記形質転換体を一白菌耳植菌し、 37°Cで OD =0
600
. 6になるまで培養した。培養液全量を坂口フラスコに移液し、 37°C、 l lOrpmで OD 0· 4になるまで培養した。 0. 4mMとなるよう IPTGを添カ卩し、さらに 25°Cで 3時
600
間培養した。遠心分離（15000rpm、 1時間）により菌体のみを培養液より回収し、 50 mlの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。 この湿菌体を培養液の 1Z20量の 0. 02%2—メルカプトエタノール入り 10mM燐酸 カリウム緩衝液 (PH7. 0)に懸濁した。この懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、 遠心分離（15000rpm、 10分)後、上清を回収し、透析処理したものを粗酵素液とし た。これを用いて Laemmli法による SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— P AGE)を行った。分子量マーカーとしては Precision
plus protein standards all blueを、グノレ染色揿としては Coomassie brilliant blue R-250を使用した。結果を図 1に示す。
[0123] [比較例 4]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含まな ヽ DNAにより形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )を用いた 2,6-ジヒド ロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現
2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET- 3 b)によって形質転換した大腸菌 BL21 (DE3)を実施例 7と同様に培養し、酵素液を 取得した。それを用いて Laemmli法による SDS— PAGEを行った。結果を図 1に示 す。レーン 3の Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカル ボキシラーゼ遺伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )より 取得した粗酵素液は、レーン 2の 2,6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製 酵素液と同 f立置に濃いバンドが見られた。また、レーン 4の Rhizobium.sp
MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まな い DNAにより形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )より取得した粗酵素液はレーン 2 の 2,6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製酵素液と同じ位置にほとんどバ ンドが見られなかった。これより、 Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ 安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌（BL 21 (DE3) )は 2,6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを大量に発現している ことが確認された。
実施例 8
[0124] Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含む DNAによって形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )を用いたレゾルシン 力 の 2,6-ジヒドロキシ安息香酸への変換
実施例 7にお 、て取得した酵素溶液を用いて、実施例 5と同様にレゾルシンの炭酸 化を試み、反応液の分析を行った。その結果、確力〖こレゾルシン力ら 2, 6-ジヒドロキ シ安息香酸を生成する活性を確認した。 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の生成量は 14 μ gで &)つた。
[0125] [比較例 5]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺 伝子を含まな ヽ DNAによって形質転換した大腸菌（BL21 (DE3) )を用いたレゾル シンからの 2,6-ジヒドロキシ安息香酸への変換
比較例 4により取得した酵素液を用いて、実施例 5と同様にレゾルシンの炭酸ィ匕を 試み、反応液の分析を行った力 レゾルシンから 2,6-ジヒドロキシ安息香酸への変換 は認められなかった。
実施例 9
[0126] 普通ブイヨン培地 (栄研）（栄研化学株式会社製)を所定濃度に調製したものを、口 径 21mmの試験管に 5ml入れ、 121°C、 15分間オートクレーブ殺菌を行った。これ に LB培地〖こ 1. 5%の寒天を加えたスラント培地で継代培養している菌体 (Rhizobiu m
sp. MT-10005)を 1白金耳接種した。 25°Cの恒温室にて 1日間振盪培養を行い、 種菌体を増殖させた。その 0. 5mlを終濃度 20mMの 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を 含む、表 1に示す組成 (pH7. 0に、 5Nの KOHにて調整）でオートクレーブ殺菌済み の培地 500mlが入った 21バッフル付き三角フラスコに接種した。 25°Cで 2日間振盪 培養し菌体を遠心分離 (8000g、 20分間）によって回収した (乾物重換算で約 3. 2g
) o
[0127] 回収した菌体は生理食塩水 (NaCl 9gZDで洗浄後、凍結保管した。以上のように して得られた凍結菌体の一部を用いて、表 8に示す反応液を 10ml容のネジロ試験 管に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°C、 24時間振とうしながら反応
2
した。反応終了時は 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 1200 1を加え反応を停止し た。
[0128] [表 8]
表 8
1 Mレゾノレシン 3 0 0 11 1
2 M炭酸水素カリウム 1 5 0 0 a 1 脱イオン水 1 2 0 0 11 1 凍結菌体 0 . 0 8 g
[0129] 遠心分離（13000rpm、 10分間）により除菌体後、上清を下記の条件で高速液体 クロマトグラフィーにより分析した。
[0130] その結果、原料に用いたレゾルシンのピ-ク以外は標品の 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸と一致するピークのみが検出された。このピークを LCZMSで分析した結果、確か に 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。本方法で 2, 6-ジヒドロキシ安 息香酸の生成量を定量した結果を表 9に示す。
[0131] カラム： Inertsil ODS- 2 (GLSciencesInc.製）
移動相：水：ァセトニトリル（85 : 15)、 0. 1 (νΖν) %トリフルォロ酢酸
送液： 0. 8ml/min. カラム温度： 40°C
検出方法： UV吸収波長 280nm
実施例 10
[0132] 実施例 9に記載の凍結保管菌体を用いて、窒素雰囲気下で実施例 9と同様に反応 を行った。結果を表 9に示す。
実施例 11
[0133] 実施例 9記載の凍結保管菌体を用いて、表 2に示す組成液に 2-メルカプトエタノー ル（2- ME)を 20ppmの濃度となるよう添カ卩し、空気雰囲気で、実施例 9と同様にして 反応を行った。結果を表 9に示す。
[0134] [比較例 6]
実施例 9に記載の凍結保管菌体を用いて、空気雰囲気下で実施例 9と同様に反応 を行い、目的物を得た。結果を表 9に示す。
[0135] [表 9]
表 9
Figure imgf000043_0001
実施例 12
[0136] 実施例 9記載の凍結保管菌体を用いて、表 10に示す反応液を 10ml容のネジロ試 験管に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°C、 24時間振とうしながら反
2
応した。反応終了時は 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 1200 1を加え反応を停止 した。
[0137] [表 10] 表 1 0
1 Mレゾノレシン 3 0 0 Id 1
2 M炭酸水素カリゥム 1 5 0 0 11 1 脱イオン水 3 0 0 11 1 ァセトン 9 0 0 11 1 凍結菌体 0 . 0 8 g
[0138] 反応停止後、実施例 9と同様に分析したところ、生成した 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸は、 31. 2mMであった。
実施例 13
[0139] 実施例 9と同様の手順で増殖させ凍結保管された凍結菌体 (Propionibacterium freudenreichii MT- 10883)を用いて、表 11に示す反応液を 10ml容のネジロ試 験管に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°C、 24時間振とうしながら反
2
応した。反応終了時は 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 400 1を加え反応を停止し た。反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を表 12に示す。
[0140] [表 11]
表 1 1
1 Mレゾノレシン 1 0 0 11 1
2 M炭酸水素カリゥム 5 0 0 11 1 脱イオン水 3 0 0 11 1 エチレングリコーノレ 1 0 0 11 1 凍結菌体 0 . 0 2 5 g 実施例 14
[0141] 表 11記載のエチレングリコールに代えてエタノール 100 μ 1を加えた反応液を実施 例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 15
[0142] 表 11記載のエチレングリコールに代えてテトラヒドロフラン 100 1をカ卩えた反応液 を実施例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。 実施例 16
[0143] 表 11記載のエチレングリコールに代えてジォキサン 100 1をカ卩えた反応液を実施 例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 17
[0144] 表 11記載のエチレングリコールに代えてメタノール 100 1をカ卩えた反応液を実施 例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 18
[0145] 表 11記載のエチレングリコールに代えてジメチルホルムアミド 100 1をカ卩えた反応 液を実施例 5と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 19
[0146] 表 11記載のエチレングリコールに代えてジメチルスルホキシド 100 μ 1をカ卩えた反 応液を実施例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 20
[0147] 表 11記載のエチレングリコールに代えてアセトン 100 1を加えた反応液を実施例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
実施例 21
[0148] 表 11記載のエチレングリコールに代えてエチレングリコールモノェチルエーテル 10 0 1を加えた反応液を実施例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12 に示す。
実施例 22
[0149] 表 11記載のエチレングリコールに代えてグリセリン 100 1を加えた反応液を実施 例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
[0150] [比較例 7]
表 11記載のエチレンダリコールに代えて脱イオン水 100 1を加えた反応液を実施 例 13と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 12に示す。
[0151] [表 12] 表 1 2
Figure imgf000046_0001
実施例 23
[0152] 実施例 9記載の凍結保管菌体を用いて、表 13に示す反応液を 50ml容のネジロバ ィャル瓶に移液し、 40°Cで反応した。表 14に示したとおりにレゾルシン、菌体を分割 添加した。各時間に反応液 200 1を採取し、 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 80 1を加え反応を停止した。反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を図 2に示す
[0153] [表 13]
表 1 3
レゾノレンン 0 . 1 1 g
炭酸水素アンモニゥム 1 . 1 9 g
脱イオン水 9 . 8 m 1
1 % 2 ME 0 . 2 m 1
凍結菌体 0 . 5 1 g
[0154] [表 14]
表 1 4
Figure imgf000046_0002
[0155] [比較例 8] 表 15に示す反応液を用いて、実施例 23と同様に反応を行った。結果を図 2に示す
[0156] [表 15]
表 1 5
レゾノレンン 0 . 2 2 g 炭酸水素アンモニゥム 1 . 1 9 g 脱イオン水 9 . 8 m 1
1 % 2 ME 0 . 2 m 1 凍結菌体 0 . 5 0 g 実施例 24
[0157] 実施例 1記載の凍結菌体を用いて、表 16に示す反応液を 50ml容のネジ口バイャ ル瓶に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°Cで反応した。各時間に反応
2
液 200 μ 1を採取し、 5Ν塩酸 Ζエタノール等量混合液 80 μ 1を加え反応を停止した。 反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を図 3に示す。
[0158] [表 16]
2 Μレゾノレシン 1 2 m 1
2 Μ炭酸水素カリウム 5 m 1 脱イオン水 0 8 m 1 アセトン 3 m 1 凍結菌体 0 6 2
実施例 25
[0159] 実施例 9記載の凍結菌体を用いて、表 17に示す反応液を 10ml容のネジロ試験管 に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°C、 24時間振とうしながら反応した
2
。反応終了時は 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 400 1を加え反応を停止した。反 応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を表 18に示す。表 18に示すレゾルシン 転化率 (％)とは、レゾルシンという限定した反応基質に着目し、反応開始時に反応 器内に存在したレゾルシンの単位物質量（mol)当たりの反応したレゾルシンの物質 量の割合を％表示で示したものである。 [0160] [表 17]
表 1 7
レゾルシン 0 . 0 0 1 1 0 g
2 M炭酸水素カリウム 5 0 0 11 1 脱イオン水 4 0 0 11 1 ァセトニ ト リノレ 1 0 0 // 1 凍結菌体 0 . 0 2 5 g 実施例 26
[0161] 表 17記載のァセトニトリルに代えてイソプロパノール 100 1をカ卩えた反応液を実施 例 25と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表 18に示す。
実施例 27
[0162] 表 17記載のァセトニトリルに代えてブタノール 100 μ 1を加えた反応液を実施例 25 と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表 18に示す。
実施例 28
[0163] 表 17記載のァセトニトリルに代えてジェチルエーテル 100 μ 1を加えた反応液を実 施例 25と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表 18に示す。
[0164] [表 18]
表 1 8
Figure imgf000048_0001
実施例 29
[0165] 実施例 9記載の凍結菌体を用いて、表 19に示す反応液を 10ml容のネジロ試験管 に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°C、 24時間振とうしながら脱炭酸
2
化反応を行った。反応終了時は 5N塩酸 Zエタノール等量混合液 400 1を加え反 応を停止した。
[0166] 反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を表 20に示す。表 20に示す 2, 6— ジヒドロキシ安息香酸転ィ匕率（％)とは、 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸という限定した反 応基質に着目し、反応開始時に反応器内に存在した 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸の 単位物質量 (mol)あたりの反応した 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸の物質量の割合を %表示で示したものである。
[0167] [表 19]
表 1 9
2 , 6—ジヒ ドロキシ安息香酸 0 . 0 0 1 5 4 g
2 M 炭酸水素カリウム 5 0 0 11 1 脱イオン水 4 0 0 11 1 ァセトニ ト リノレ 1 0 0 // 1 凍結菌体 0 . 0 2 5 g 実施例 30
[0168] 表 19記載のァセトニトリルに代えてイソプロパノール 100 μ 1を加えた反応液を実施 例 29と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 20に示す。
実施例 31
[0169] 表 19記載のァセトニトリルに代えてブタノール 100 μ 1を加えた反応液を実施例 29 と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 20に示す。
実施例 32
[0170] 表 19記載のァセトニトリルに代えてジェチルエーテル 100 μ 1を加えた反応液を実 施例 29と同様に反応を行い、 目的物を得た。結果を表 20に示す。表 18, 19を比較 すると、各反応とも反応平衡点に達していることが分かる。
[0171] [表 20]
Figure imgf000049_0001
実施例 33
[0172] 実施例 9記載の凍結菌体を用いて、表 21に示す反応液を 50ml容のネジロバィャ ル瓶に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°Cで反応した。各時間に反応
2
液 100 μ 1を採取し、 5Ν塩酸 Ζエタノール等量混合液 40 μ 1を加え反応を停止した。 反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を図 4に示す。
[0173] [表 21]
表 21
レゾルシン 0. 01 10 g
2 M炭酸水素カリウム 5 m l 脱イオン水 2 m l ァセトン 3 m l 凍結菌体 0. 15 g
[0174] [比較例 9]
表 22に示す反応液を用いて、実施例 33と同様に反応を行なった。結果を図 5に示 す。
[0175] [表 22]
表 22
レゾルシン 0. 01 1 g
2 M炭酸水素カリウム 5 m l 脱ィオン水 5 m 1 凍結菌体 0. 15 g 実施例 34
[0176] 実施例 9記載の凍結菌体を用いて、表 23に示す反応液を 50ml容のネジロバィャ ル瓶に移液し、気相部を 100%COで置換した後、 25°Cで反応した。各時間に反応
2
液 100 μ 1を採取し、 5Ν塩酸 Ζエタノール等量混合液 40 μ 1を加え反応を停止した。 反応停止後、実施例 9と同様に分析した。結果を図 4に示す。
[0177] [表 23] 表 23
2, 6—ジヒ ドロキシ安息香酸 0. 01 54 g
2 M炭酸水素カリウム 5 m l 脱イオン水 2 m l ァセトン 3 m l 凍結菌体 0. 15 g
[0178] 図 4より、アセトンを添カ卩した場合、反応液中のレゾルシンと 2, 6—ジヒドロキシ安息 香酸のモル比はレゾルシン： 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸 =6 :4に収束することがわか る。
[0179] [比較例 10]
表 24に示す反応液を用いて、実施例 34と同様に反応を行なった。結果を図 5に示 す。
[0180] 図 5より、アセトン無添カ卩の場合、反応液中のレゾルシンと 2, 6—ジヒドロキシ安息香 酸のモル比はレゾルシン： 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸 =3： 7に収束することがわかる。
[0181] [表 24]
表 24
2, 6—ジヒ ドロキシ安息香酸 0. 0154 g
2 M炭酸水素カリウム 5 m l 脱ィオン水 5 m 1 凍結菌体 0. 15 g

Claims

請求の範囲
[1] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微 生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び Z又は二酸ィヒ炭素を含む水性媒体中 で接触させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、有機溶媒を水性 媒体に添加することを特徴とする製造方法。
[2] 有機溶媒の添カ卩によって反応の平衡が 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する側へ 移動することを特徴とする請求項 1に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法
[3] 添加する有機溶媒の 1種類以上が水に対して相溶性を有することを特徴とする請 求項 1又は 2に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[4] 添加する有機溶媒の 1種類以上が非プロトン性溶媒であることを特徴とする請求項 1一 3何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[5] 添加する有機溶媒が炭素数 1から炭素数 4のカルボ-トリル、アルコール、エーテル 、ケトン及びスルフィエルより成る群力 選ばれた 1種以上の溶媒であることを特徴と する請求項 1又は 2に記載の 2, 6_ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[6] 請求項 1一 5の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であって 、反応系内のレゾルシンの酸ィ匕を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[7] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微 生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び Z又は二酸ィヒ炭素を含む水性媒体中 で接触させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、反応系内のレゾ ルシンの酸ィ匕を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安 息香酸の製造方法。
[8] レゾルシンの酸ィ匕を抑制する手法として、反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸 化炭素雰囲気とすることを特徴とする請求項 7に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸 の製造方法。
[9] レゾルシンの酸ィ匕を抑制する手法として、反応系内を減圧し脱気することを特徴とす る請求項 7に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[10] レゾルシンの酸ィ匕を抑制する手法として、水性媒体中へ酸化防止剤を添加すること を特徴とする請求項 7に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[11] 反応の進行に応じて水性媒体中へレゾルシンを 2回以上に分けて必要量を分割して 添加することを特徴とする、請求項 1一 10の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ 安息香酸の製造方法。
[12] レゾルシンから 2, 6—ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微 生物の処理物を 2回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とする請求 項 1一 11の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[13] 下記の（a)—（c)の全ての理化学的性質を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカル ボキシラーゼ。
(a)作用： 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒す る。
(b)温度安定性: pH7.0の緩衝液中での活性半減期が 50°Cにおいて約 120分、 60 °Cにおいて約 25分。
(c)至的温度: pH8で脱炭酸反応をさせる場合、温度 70°C付近において作用が至 的である。
[14] 下記の全ての理ィ匕学的性質をさらに有する、請求項 13に記載の 2, 6-ジヒドロキシ 安息香酸デカルボキシラーゼ。
(d)炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でレゾルシンに作用させ て 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。
[15] 配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカ ノレボキシラーゼ。
[16] 配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して 得られるアミノ酸配列を有する 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[17] 配列表の配列番号： 2記載の塩基配列で表される 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカル ボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[18] 配列表の配列番号： 2記載の塩基配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得 られる塩基配列で表される 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブュ ニットをコードする遺伝子。
[19] 配列表の配列番号： 2記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズす る 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子
[20] 請求項 13— 16のいずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラ ーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド。
[21] 請求項 20に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換微生物。
[22] 請求項 13— 16いずれか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼを産生する微生物または請求項 21に記載の形質転換微生物を培養し、該微生物 またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該 2, 6-ジヒドロキシ安息 香酸デカルボキシラーゼの製造方法。
[23] 請求項 22に記載の方法により製造した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼを、炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシン〖こ 作用させて 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した 2, 6-ジヒドロ キシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 6-ジヒドロキシ安息香 酸の製造方法。
[24] 請求項 22に記載の方法により製造した 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラー ゼを、炭酸イオン及び Zまたは二酸ィ匕炭素を含む水性媒体中でカテコールに作用さ せて 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した 2, 3-ジヒドロキシ安 息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする 2, 3-ジヒドロキシ安息香酸の 製造方法。
[25] 微生物が請求 13— 16の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボ キシラーゼを産生する微生物であることを特徴とする請求項 1一 12の何れか一項に 記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[26] 微生物が請求項 17— 19の何れか一項に記載の遺伝子を保持し、該遺伝子情報 に基づく 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生物であること を特徴とする請求項 1一 12の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製 造方法。 微生物が請求項 22に記載の形質転換微生物であることを特徴とする請求項 1 の何れか一項に記載の 2, 6-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
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