WO2002006506A1 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von seltenen monosacchariden, insbesondere von tagatose - Google Patents

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WO2002006506A1
WO2002006506A1 PCT/EP2001/008184 EP0108184W WO0206506A1 WO 2002006506 A1 WO2002006506 A1 WO 2002006506A1 EP 0108184 W EP0108184 W EP 0108184W WO 0206506 A1 WO0206506 A1 WO 0206506A1
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polyol
dehydrogenase
tagatose
red algae
extremophilic
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PCT/EP2001/008184
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Robert Stein
Wolfgang Gross
Bert KÜHL
Bernd Schlagheck
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Novabiotec Dr. Fechter Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Definitions

  • the invention relates to the purely enzymatic production of monosaccharides, which are rare in nature and can only be chemically produced by complex and expensive processes, such as, for example, tagatose, fuculose and xylulose. It has been found that these monosaccharides can be produced enzymatically in good purity by using a polyol corresponding to the monosaccharide to be produced or a plant, vegetable or fruit extract which contains a polyol corresponding to the monosaccharide to be prepared, with polyol dehydrogenase from extremophilic red algae and NAD is incubated and the resulting monosaccharide is isolated.
  • This enzymatic production is made possible by the use of polyol dehydrogenase from extremophilic red algae, especially from the thermo- and acidophilic red algae Galdieria sulphuraria.
  • D-Tagatose, Fuculose and Xylulose are rarely occurring sugars in nature, which are used in the food industry as fillers, as sweeteners without calories or also in dietary foods. Even at higher temperatures, such as at When baking occurs, these substances are stable and, like sugar, turn brown.
  • D-Tagatose is known to enhance the taste and to support the growth of health-promoting bacteria in the human intestinal tract (WO 99/43217, WO 99/34689, US 4,786,722.
  • No. 5,078,796 describes, for example, the preparation of D-tagatose by the isomerization of a mixture of D-galactose, metal hydroxide, for example Ca (OH) 2 and catalyst (inorganic salts such as CaCl 2 ) at low temperatures to give an intermediate metal hydroxide-D-Tagatose Connection and subsequent neutralization with acid.
  • the reaction mixture is deionized, alcohol is added and the tagatose is crystallized.
  • Whey, deproteinized whey or lactose are possible starting materials.
  • D-galactose is released from the lactose by acidic or enzymatic hydrolysis.
  • the chemical production methods are not only complex and cost-intensive, but they are also unsatisfactory for production on an industrial scale from the point of view of environmental protection.
  • D-Tagatose is known to be microbial. Some bacteria are able to produce D-tagatose if they find dulcitol as an external carbon source. An Arthrobacter globlformis culture, for example, produces appropriate Conditions D-Tagatose within approx. 15 days if dulcitol is added to the medium (P60 / 248196). The high costs, the long duration and the susceptibility to contamination of the fermentation make such a process for the industrial production of D-Tagatose unfavorable.
  • the object of the invention was to develop a production process for rare monosaccharides, in particular for D-tagatose, fuculose and xylulose, which is simple to carry out and is suitable for industrial production, ensures high product purity and does not require recycling of environmentally harmful substances.
  • the object of the invention is achieved by an enzymatic production process in which a polyol corresponding to the monosaccharide to be produced or a plant, vegetable or fruit extract which contains a polyol corresponding to the monosaccharide to be produced is incubated with polyol dehydrogenase from extremophilic red algae and NAD and the resulting monosaccharide is isolated.
  • fucitol is used as the starting material for the production of fuculose, for the production of xylulose arabitol or xylitol or fruit or vegetable extracts containing these, and for the production of tagatose dulcitol or a dulcitol-containing plant extract.
  • Dulcitol, fucitol, arabitol or xylitol itself can in turn be produced from extremophilic red algae and NADPH by reduction from galactose, fucose, arabinose or xylose using an aldose reductase. Since galactose is practically not found in nature in free form, from galactosides (galactose-containing oligosaccharides). The galactose contained in the galactosides can be released by using galactosidases (see Fig. 1).
  • Fig. 2 The production possibilities of the rare monosaccharides xylulose and fuculose are shown schematically in Fig. 2.
  • Xylulose is a pentose widely used in plants, but not in its free form, but mainly in the form of xylans.
  • the xylans can be hydrolysed from appropriate plant extracts, especially from Espertogras, deciduous and coniferous trees, straw, bran, plant gums, peanut and cotton seeds, and peel from apricot kernels to xylulose and other pentoses.
  • the xylanases can be purchased or purified from fungi using conventional methods.
  • Arabinose can be obtained from arabanes from appropriate plant extracts, in particular from beets, apples (especially from the retentate after the ultrafiltration of apple juice), plums and cherries, using arabinases.
  • the arabinases can be purchased or purified from fungi or bacteria using conventional methods.
  • the xylan or araban-containing extracts are used in one embodiment of the invention. As described, they are incubated with aldose reductase and polyol dehydrogenase from extremophilic red algae and instead of galctosidase with xylanase or arabinase. That way Xylulose is obtained from plant extracts containing xylan or araban.
  • commercially available xylose or arabinose can also be used as the starting product in the process according to the invention and then xylanase or arabinase can be dispensed with.
  • Fucose is a component of polysaccharides of marine brown algae (fucoidin) and can be obtained by hydrolysis from appropriate extracts, especially from fucus-containing extract from Fucus vesiculosus. Instead, of course, commercially acquired fucose can also be used as the starting product in the process according to the invention.
  • the conversion to fuculose takes place analogously to the production of tagatose or xylulose with aldose reductase and polyol dehydrogenase from extremophilic red algae.
  • galactosides a plant extract containing galactoside, milk or whey with galactosidase, aldose reductase and polyol dehydrogenase from extremophilic red algae, NADPH and NAD can also be incubated and the tagatose isolated and crystallized.
  • Galactosides are widespread in nature and are preferred, for example, in legumes in soybeans, but also in cabbage, sugar beet, ulmaceae or tuberous.
  • Stachyose a galactoside consisting of 2 galactose, a glucose and a fructose unit, and raffinose (D-galactose, D-glucose and D-fructose) are found in Ulmaceae as the most important form of transport besides sucrose. Soy or legume samer generally also contain a lot of stachyose and raffinose in addition to sucrose and verbascose. Ripe soybeans contain little starch, but 4.1% stachyose and an additional 1.4% raffinose. Cabbage also has a high content of oligosaccharides such as stachyose and raffinose, as well as sugar beet.
  • the molasses that is produced from sugar beet in sugar production has a raffinose content of approx. 3%.
  • the front runner is Stachys Sieboldii Mig. (Tuberous, Lamiaceae), which contains 14-18% stachyosis. Floridiside or isofloridoside from red algae can also be used as the starting material for galactose.
  • either the plant extracts mentioned, which are obtained by customary methods, or the xylans, arabanes, fucoidin or galactosides (e.g. raffinose, stachyose or melibiose) themselves can be used as starting materials in the process for the preparation of the rare monosaccharides.
  • the plants can be digested with water using conventional methods. Milk or whey, which contain considerable amounts of galactosides, can also be used for the enzymatic production of tagatose according to the invention.
  • the galactose contained in the galactosides is released by galactosidase.
  • galactosidase According to the invention, commercially available galactosidase can be used. It is also possible to purify galactosidase from different organisms. Melon (Citrullus battich and Cucumls melo), Aspergillus nlger, Bifidobacterium adolescentis, Mortierella vinacea, Phanerochaete chrysosporium, Thermotoga neapolitana, Pyrococcus furiosus, Penicillium spec, coffee beans, Phaseolus vulgaris, Aspergillillusididearans speculas, Bacillus nidulans.
  • Aspergillus ficuum Aspergillus tamarii, Saccharum officinarum are possible sources of galactosidase. According to the invention, particular preference is given to using galactosidase from thermophilic and acidophilic single-cell red algae.
  • the galactose released by galactosidase in a first step in the process according to the invention for producing tagatose is converted by the aldose reductases according to the invention from extremophilic red algae to dulcitol, which is used by the polyol dehydrogenase according to the invention from extremophilic red algae to tagatose.
  • fuculose or xylulose are produced by incubating fucitol or arabitol or xylitol or plant, vegetable or fruit extracts containing them with polyol dehydrogenase from extremophilic red algae and NAD and subsequently cleaning the sugars.
  • Arabitol and xylitol are naturally found in many fruits and vegetables, such as xylitol in strawberries, plums or pears, arabitol in wine or avocado, for example.
  • Fucitol can be produced by conventional methods from the fucose of the alga Fucus vesiculosis.
  • Tagatose 1 to 40 g of lyophilized plant extract are dissolved in 50 ml of buffer according to the invention. Incubate 1 to 1000 U for each galactosidase, aldose reductase and polyol dehydrogenase in the presence of 0.1 to 10 mM NADPH and NAD and a pH of 5 to 9. Incubation can take place at temperatures from 10 to 50 ° C for 1 to 24 h.
  • L-iditol or L-fucitol dehydrogenase is very particularly preferably isolated and used as polyol DH.
  • the genes or the corresponding cDNAs of the enzymes according to the invention can also be found in other microorganisms are cloned and these are then used as a whole, living unit or homogenate for the production of tagatose, fuculose or xylulose, as is possible, for example, with yeasts.
  • the incubation with the three enzymes takes place at 10-50 ° C, preferably at about 20 ° C for 1 to 24 hours, preferably for 5-13 Hours, particularly preferably for 9 hours.
  • a good yield of tagatose is achieved according to the invention if e.g. 1 part by weight of lyophilized galactoside-containing plant extract, each with 1-100 U, preferably 5-20 U, particularly preferably about 10 U galactosidase, aldose reductase and polyol dehydrogenase.
  • galactose or dulcitol see FIG. 1
  • the latter specifically from red algae or the celstraceae, there again preferably from Euonymus europaea.
  • Dulcitol as a direct starting material for synthesis occurs only to a significant extent in a few plants, such as the Pfaffenhütchen and some red algae. Dulcitol can be extracted using conventional methods.
  • the incubation is also preferably carried out with aldose reductase and polyol dehydrogenase at 10-50 ° C., preferably at approx. 20 ° C., for 1 to 24 hours for 5-13 hours, particularly preferably for 9 hours.
  • aldose reductase and polyol dehydrogenase at 10-50 ° C., preferably at approx. 20 ° C., for 1 to 24 hours for 5-13 hours, particularly preferably for 9 hours.
  • the polysaccharide is incubated together with arabanases or xylanases as in the case of the use of xylans or arabanes; or the incubation is preceded by conventional acid hydrolysis, such as when using fucoidin or fucoidin-containing plant extract.
  • a good yield of fuculose or xylulose is achieved according to the invention if e.g. 1 part by weight of lyophilized polysaccharide-containing plant extract, each with 1-100 U, preferably with 5-20 U, particularly preferably with about 10 U aldose reductase and polyol dehydrogenase or hemicelluloses.
  • fucitol or xylitol or arabitol or the corresponding aldoses of fucose, xylose or arabinose can be purchased commercially or extracted from suitable plants using conventional methods.
  • the production process according to the invention for rare monosaccharides, in particular for tagatose has the advantage over the chemical processes of the prior art that enzymes as biocatalysts emerge unchanged from the reactions they promote and do not have to be disposed of or costly to recycle. In addition, their specificity ensures high product purity, which is> 98% for Tagatose.
  • the Tagatose obtained according to the invention is particularly suitable as a glaze for baking and luxury items such as chocolates, petit four or even cakes. The invention is explained in more detail below using exemplary embodiments:
  • the plants can be digested with water using conventional methods (e.g. ball mill or press).
  • the samples are deproteinized, the water-soluble galactosides optionally enriched with Rezex RSO oligosaccharide by HPLC, lyophilized and taken up in reaction buffer for the enzymatic conversion.
  • the respective enzyme is isolated from the culture (see below).
  • the enzyme in question can be extracted from the cells using conventional methods.
  • Cell homogenates can be separated by two or more techniques such as ammonium sulfate precipitation, hydrophobic, interaction Chromatography, ion exchange chromatography and gel filtration are cleaned in order to obtain enzyme preparations which only have an electrophoretically detectable band or which contain the enzyme in the necessary degree of purity.
  • Preparations of the enzymes can be immobilized using conventional methods such as adsorptive, ionic, covalent bonding or matrix encapsulation. These products can then be used repeatedly in a batch process or continuously after filling into columns or membrane reactors.
  • the activity of the polyol dehydrogenase is determined as follows: 800 ul 50 M Tris / HCl, 50 ul 4 mM NAD, 50 ul 1 M polyol and 100 ul of an appropriate enzyme extract solution are mixed and the formation of NADH at 340 nm with a Photometer tracked.
  • the aldose reductase activity is determined as follows: In a reaction mixture, designed for a volume of 1 ml, consisting of 50 mM potassium phosphate, pH 7.0, 0.3 mM NADPH, 50 mM galactose and a suitable amount of enzyme extract, is using a Photometers tracked the formation of NADP.
  • the galactosidase activity is determined as follows: In 1 ml of test solution consisting of 40 mM Hepes-KOH, pH 6.5, a suitable amount of substrate p-nitrophenol ⁇ -d-galactoside and a suitable amount of enzyme extract at 30 ° C followed the formation of p-nitrophenol using a photometer at 360 nm. Cleaning of aldose reductase
  • the unbound proteins were loaded onto a hydroxyapatite column (16 x 1.5 cm) equilibrated with 10 mM Tris-HCl, pH 8.3. After rinsing with 30 ml column buffer, the proteins were eluted with a linear gradient of 200 ml from 0.1-0.8 M potassium phosphate, pH 7.5. The two activity peaks were dialyzed separately against 2 1 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5 and 0.5 mM DTT overnight. The samples were each loaded onto a cation exchange column (Econo-Pak High S, Biorad), equilibrated with 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5. The column was washed with 10 ml column buffer and proteins eluted with a linear gradient from 0-1.5 M NaCl in column buffer.
  • Proteins from the supernatant were precipitated by increasing the ammonium sulfate saturation to 40% and pelleted by centrifugation again.
  • the resulting precipitate was taken up in 20 mM Tris-HCl pH 8.5 and desalted against this buffer by dialysis for 2 h.
  • the dialysate was loaded onto a DEAE Fractogel column (2.5 x 20 cm) equilibrated with 20 mM Tris-HCl, pH 8.5.
  • the column was washed with 3 times the column bed volume of column buffer and proteins were eluted with a linear gradient of 0-150 mM KC1 in column buffer.
  • the dialysate was brought to 40% saturation with ammonium sulfate and to 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 and 40% ammonium sulfate equilibrated decyl agarose column (1.5 x 16 cm).
  • the column was washed with 3 times the column bed volume of buffer (see above) before proteins were eluted with a descending ammonium sulfate gradient (40-0% saturation) in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  • the reaction mixture was deproteinized and sugar was separated by means of HPLC on a REZEX RCM monosaccharide column which was eluted isocratically with distilled water at 80 ° C.
  • the Tagatose peak was identified on the basis of comparisons with sugar standards.
  • the fractions were concentrated and the Tagatose crystallized using conventional methods. Purification of the Tagatose
  • the reaction mixtures also contain undesirable substances such as further oligosaccharides, monosaccharides, sugar alcohols, etc.
  • these can be removed by a combination of fewer purification techniques, e.g. Proteins by filter techniques, insoluble components by centrifugation, salts with ion exchangers in the H or OH form.
  • remaining sugars can be separated by HPLC or selectively precipitated with alcohol or other solvents. Chromatography with silica gels also produces high-purity saccharides.
  • the purified Tagatose can then be crystallized using conventional methods.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die rein enzymatische Herstellung von in der Natur selten vorkommenden und chemisch nur durch aufwendige und kostenintensive Verfahren herstellbare Monosaccharide wie beispielsweise Tagatose, Fuculose und Xylulose. Es wurde gefunden, dass diese Monosaccharide enzymatisch in guter Reinheit hergestellt werden können, indem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entspre-chendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rot-algen und NAD inkubiert wird und das entstehende Mono-saccharid isoliert wird. Möglich wird diese enzymatische Herstellung durch die Verwendung von Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, speziell aus der thermo- und acidophilen Rotalge <i>Galdieria sulphuraria</i>.

Description

Verfahren zur enzymati sehen Herstellung von seltenen Monosacchariden, insbesondere von Tagatose
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die rein enzymatische Herstellung von in der Natur selten vorkommenden und chemisch nur durch aufwendige und kostenintensive Verfahren herstellbare Monosaccharide wie beispielsweise Tagatose, Fuculose und Xylulose. Es wurde gefunden, dass diese Monosaccharide enzymatisch in guter Reinheit hergestellt werden können, indem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen- , Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol- Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird. Möglich wird diese enzymatische Herstellung durch die Verwendung von Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, speziell aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria.
D-Tagatose, Fuculose und Xylulose sind in der Natur selten vorkommende Zucker, die in der Lebensmittelindustrie als Füllstoff, als Süßstoff ohne Kalorien oder auch in diätischen Lebensmitteln eingesetzt werden. Auch bei höheren Temperaturen, wie sie z.B. beim Backen auftreten, sind diese Substanzen stabil und bekommen wie Zucker eine braune Färbung.
Daneben ist von D-Tagatose bekannt, dass sie den Geschmack verstärken und das Wachstum von gesundheitsfördernden Bakterien im menschlichen Darmtrakt unterstützen soll (WO 99/43217, WO 99/34689, US 4,786,722.
Bisher werden diese seltenen Monosaccharide durch aufwendige, kostenintensive chemische
Herstellungsverfahren erzeugt. So sind u. a. große Wasser- und Säuremengen nötig. US 5,078,796 beschreibt beispielsweise die Herstellung der D-Tagatose durch die Isomerisierung einer Mischung aus D-Galactose, Metallhydroxid, z.B. Ca(OH)2 und Katalysator (anorganische Salze wie z.B. CaCl2) bei niedrigen Temperaturen zu einer intermediären Metallhydroxid-D-Tagatose- Verbindung und anschließende Neutralisierung mit Säure. Das Reaktionsgemisch wird deionisiert, mit Alkohol versetzt und die Tagatose kristallisiert. Molke, deproteinisierte Molke oder Lactose sind mögliche Ausgangsstoffe. D-Galactose wird durch saure oder enzymatische Hydrolyse aus der Lactose freigesetzt. Die chemischen Produktionsmethoden sind nicht nur aufwendig und kostenintensiv, sondern sie sind für die Produktion im industriellen Maßstab auch unter dem Gesichtspunkt des Umweltschutzes nicht zufriedenstellend.
Von D-Tagatose ist bekannt, dass sie auch mikrobiell hergestellt werden kann. Einige Bakterien sind in der Lage, D-Tagatose zu bilden, wenn sie Dulcitol als externe Kohlenstoffquelle vorfinden. So produziert eine Arthro- bacter globlformis Kultur unter entsprechenden Anzuchts- bedingungen D-Tagatose innerhalb von ca. 15 Tagen, wenn dem Medium Dulcitol zugesetzt wird ( P60/248196) . Die hohen Kosten, die lange Dauer und die Kontaminationsanfälligkeit der Fermentation machen ein solches Verfahren zur industriellen Herstellung von D- Tagatose ungünstig.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Herstellungsverfahren für seltene Monosaccharide, insbesondere für D-Tagatose, Fuculose und Xylulose, zu entwickeln, das einfach durchführbar und zur industriellen Herstellung geeignet ist, eine hohe Produktreinheit gewährleistet und kein Recyclen von umweitschädlichen Stoffen erfordert.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein enzymatisches Herstellungsverfahren gelöst, bei dem ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird. Je nach gewünschtem Monosaccharid werden so zur Herstellung von Fuculose Fucitol als Ausgangsstoff eingesetzt, zur Herstellung von Xylulose Arabitol oder Xylitol oder Früchte- oder Gemüseextrakte, die diese enthalten, und zur Herstellung von Tagatose Dulcitol oder ein Dulcitol-haltiger Pflanzenextrakt .
Dulcitol, Fucitol, Arabitol oder Xylitol selbst können wiederum mittels einer Aldose-Reductase aus extremophilen Rotalgen und NADPH durch Reduktion aus Galactose, Fucose, Arabinose oder Xylose erzeugt werden. Galactose muß, da sie praktisch nicht in freier Form in der Natur vorkommt, aus Galactosiden (Galactose-haltige Oligosaccharide) gewonnen werden. Die in den Galactosiden enthaltene Galactose kann durch den Einsatz von Galactosidasen freigesetzt werden (vgl. Abb. 1).
Die Herstellungsmöglichkeiten der seltenen Monosaccharide Xylulose und Fuculose sind schematisch in Abb. 2 dargestellt .
Xylulose ist eine in Pflanzen weit verbreitete Pentose, allerdings nicht in freier Form, sondern vor allem in Form von Xylanen. Mittels Xylanasen können die Xylane aus entsprechenden Pflanzen-Extrakten, vor allem aus Espertogras, Laub- und Nadelbäumen, Stroh, Kleie, Pflanzengummen, Erdnuß- und Baumwollsamen sowie Schalen von Aprikosenkernen, zu Xylulose und anderen Pentosen hydrolysiert werden. Die Xylanasen können käuflich erworben werden oder aus Pilzen mittels konventioneller Methoden aufgereinigt werden.
Arabinose kann mittels Arabinasen aus Arabanen aus entsprechenden Pflanzen-Extrakten, vor allem aus Rüben, Äpfeln (speziell aus dem Retentat nach der Ultrafiltration von Apfelsaft) , Pflaumen und Kirschen, gewonnen werden. Die Arabinasen können käuflich erworben werden oder aus Pilzen bzw. Bakterien mittels konventioneller Methoden aufgereinigt werden.
Analog den Galactosid-haltigen Pflanzenextrakten werden in einer Ausführungsform der Erfindung die Xylan- bzw. Araban-haltigen Extrakte eingesetzt. Sie werden wie beschrieben mit Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und statt mit Galctosidase mit Xylanase bzw. Arabinase inkubiert. Auf diese Weise lässt sich Xylulose aus Xylan- oder Araban-haltigen Pflanzenextrakten gewinnen. Natürlich kann auch kommerziell erworbene Xylose bzw. Arabinose als Ausgangsprodukt im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden und dann auf Xylanase oder Arabinase verzichtet werden.
Fucose ist Bestandteil von Polysacchariden mariner Braunalgen (Fucoidin) und lässt sich durch Säurehydrolyse aus entsprechenden Extrakten gewinnen, vor allem aus Fucan-haltigern Extrakt aus Fucus vesiculosus . Stattdessen kann natürlich auch kommerziell erworbene Fucose als Ausgangsprodukt im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Die Umsetzung zu Fuculose erfolgt analog zur Herstellung von Tagatose oder Xylulose mit Aldose- Reduktase und Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen.
Neu an dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber bisher bekannten Vorgehensweisen ist, daß die Herstellung der seltenen Monosaccharide nicht wie bisher mittels chemischer Verfahren erfolgt, sondern allein auf Umsetzungsreaktionen von Enzymen basiert. Möglich wird dies durch die Verwendung neuartiger Enzyme aus extremophilen Algen, speziell aus Galdieria sulphuraria aus der Gruppe der Rhodophyceen.
Zur Herstellung der Tagatose können erfindungsgemäß auch Galactoside, ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt, Milch oder Molke mit Galactosidase, Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert und die Tagatose isoliert und kristallisiert werden. Galactoside sind in der Natur weit verbreitet und kommen z.B. in Leguminosen, vorzugsweise in Soja, aber auch in Kohl, Zuckerrüben, Ulmaceen oder Knollenziest vor. Stachyose, ein Galactosid aus 2 Galactose-, einer Glucose und einer Fructose-Einheit, und Raffinose (D-Galactose, D-Glucose und D-Fructose) kommen z.B. in Ulmaceen als wichtigste Transportform neben Saccharose vor. Soja oder generell Leguminosensameri enthalten ebenfalls neben Saccharose und Verbascose vor allem viel Stachyose und Raffinose. So enthalten reife Sojabohnen wenig Stärke, dagegen aber 4.1% Stachyose und zusätzlich 1.4 % Raffinose. Auch Kohl weist einen hohen Gehalt an Oligosacchariden wie Stachyose und Raffinose auf, ebenso Zuckerrüben. Die bei der Zuckergewinnung aus Zuckerrüben entstehende Melasse hat einen Raffinose- Gehalt von ca. 3%. Spitzenreiter ist Stachys sieboldii Mig. (Knollenziest, Lamiaceae) , der 14-18% Stachyose enthält. Als Ausgangsstoff für Galactose kann ebenso Floridisid bzw. Isofloridosid aus Rotalgen eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß können im Verfahren zur Herstellung der seltenen Monosaccharide als Ausgangsstoffe entweder die genannten Pflanzenextrakte, die nach üblichen Methoden gewonnen werden, oder die Xylane, Arabane, Fucoidin oder Galactoside (z.B. Raffinose, Stachyose oder Melibiose) selbst eingesetzt werden. Um z.B. die Galactoside zu extrahieren, können die Pflanzen mit Wasser nach konventionellen Methoden aufgeschlossen werden. Zur erfindungsgemäßen enzymatischen Herstellung der Tagatose kann auch Milch oder Molke, die erhebliche Mengen an Galactosiden enthalten, dienen.
Die in den Galactosiden enthaltene Galactose wird durch Galactosidase freigesetzt. Erfindungsgemäß kann kommerziell erhältliche Galactosidase eingesetzt werden. Es ist auch möglich, Galactosidase aus unterschiedlichen Organismen aufzureinigen. Melone { Citrullus battich und Cucumls melo) , Aspergillus nlger, Bifidobacterium adolescentis, Mortierella vinacea, Phanerochaete chrysosporium, Thermotoga neapolitana, Pyrococcus furiosus, Penicillium spec , Kaffeebohnen, Phaseolus vulgaris, Aspergillus nidulans, Bacillus stearothermus , Klebsiella spec. , Aspergillus ficuum, Aspergillus tamarii , Saccharum officinarum sind mögliche Quellen für Galactosidase . Erfindungsgemäß besonders bevorzugt wird Galactosidase aus thermo- und acidophilen einzelligen Rotalgen eingesetzt .
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Tagatose in einem ersten Schritt durch Galactosidase freigesetzte Galactose wird von den erfindungsgemäßen Aldose-Reduktasen aus extremophilen Rotalgen zu Dulcitol umgesetzt, das von den erfindungsgemäßen Polyol-Dehydro- genäsen aus extremophilen Rotalgen zu Tagatose verwertet wird.
Andere Monosaccharide wie Fuculose oder Xylulose werden hergestellt, indem Fucitol oder Arabitol bzw. Xylitol oder Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakte, die diese enthalten, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen und NAD inkubiert und die Zucker nachfolgend gereinigt werden. Arabitol und Xylitol kommen natürlich in vielen Früchten und Gemüsen vor, so Xylitol z.B. in Erdbeeren, Pflaumen oder Birnen, Arabitol z.B. in Wein oder Avocado vor. Fucitol kann nach konventionellen Methoden aus der Fucose der Alge Fucus vesiculosis hergestellt werden. Im Fall der Tagatose werden erfindungsgemäß 1 bis 40 g lyophilisierter Pflanzenextrakt in 50 ml Puffer gelöst. Je Galactosidase, Aldosereductase und Polyol- Dehydrogenase sind 1 bis 1.000 U bei Anwesenheit von 0,1 bis 10 mM NADPH und NAD und einem pH-Wert von 5 bis 9 zu inkubieren. Die Inkubation kann bei Temperaturen von 10 bis 50°C über 1 bis 24 h erfolgen.
Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Prozesse mit diesen Enzymen, nämlich der Aldose-Reduktase und der Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria besonders vorteilhaft laufen und reine Monosaccharide entstehen. Ganz besonders bevorzugt werden die Enzyme aus dem Stamm MSh von Galdieria sulphuraria, hinterlegt am 12. Juli 2000 unter der Hinterlegungsnummer 1372/1 bei der CCAP in Großbritannien, eingesetzt. Die Hinterlegung bei dieser Hinterlegungsstelle genügt den Anforderungen des Budapester Vertrages .
Die Isolierung, Reinigung und Aktivitätsbestimmung der Enzyme kann nach konventionellen Methoden erfolgen und ist in den Beispielen näher beschrieben. Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemäß L-Idit- oder L-Fucit- Dehydrogenase als Polyol-DH isoliert und eingesetzt.
Im Sinne der Erfindung können selbstverständlich auch die erfindungsgemäßen Enzyme eingesetzt werden, die aus den Rotalgen kloniert und in anderen Wirtsorganismen, z.B. E. coli oder Pseudomonas spec , exprimiert und aus diesen in üblicher Weise gewonnen werden.
Gemäß der Erfindung können auch die Gene bzw. die korrespondierenden cDNAs der erfindungsgemäßen Enzyme in andere Mirkoorganismen kloniert werden und diese dann als ganze, lebende Einheit oder Homogenat zur Herstellung von Tagatose, Fuculose oder Xylulose eingesetzt werden, wie es zum Beispiel mit Hefen möglich ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Tagatose aus Galactosiden oder Galactosid-haltigem Pflanzenextrakt, Molke oder Milch erfolgt die Inkubation mit den drei Enzymen bei 10-50°C, bevorzugt bei ca. 20°C für 1 bis 24 Stunden, bevorzugt für 5-13 Stunden, besonders bevorzugt für 9 Stunden.
Eine gute Ausbeute an Tagatose wird erfindungsgemäß erzielt, wenn z.B. 1 Gew. Teil lyophilisierter Galactosid- haltiger Pflanzenextrakt mit je 1-100 U, bevorzugt mit 5- 20 U, besonders bevorzugt mit ca. 10 U Galactosidase, Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase versetzt wird.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, mit Galactose oder Dulcitol zu starten (vgl. Abb. 1), letzteres speziell aus Rotalgen oder den Celstraceen, dort wiederum bevorzugt aus Euonymus europaea . Dulcitol als direkter Ausgangsstoff für die Synthese kommt nur in wenigen Pflanzen in nennenswertem Umfang vor, wie dem Pfaffenhütchen und einigen Rotalgen. Die Extraktion von Dulcitol kann mit konventionellen Methoden vorgenommen werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Xylulose und Fuculose aus Polysacchariden oder Polysaccharid-haltigem Pflanzenextrakt erfolgt die Inkubation ebenfalls mit Aldose-Reduktase und Polyol- Dehydrogenase bei 10-50°C, bevorzugt bei ca. 20°C, für 1 bis 24 Stunden, bevorzugt für 5-13 Stunden, besonders bevorzugt für 9 Stunden. Je nach verwendetem Polysaccharid erfolgt die Inkubation zusammen mit Arabanasen bzw. Xylanasen wie im Fall des Einsatzes von Xylanen bzw. Arabanen; oder der Inkubation geht eine konventionelle Säurehydrolyse voraus, wie beim Einsatz von Fucoidin oder Fucoidin-haltigem Pflanzenextrakt.
Eine gute Ausbeute an Fuculose bzw. Xylulose wird erfindungsgemäß erzielt, wenn z.B. 1 Gew. Teil lyophilisierter Polysaccharid-haltiger Pflanzenextrakt mit je 1-100 U, bevorzugt mit 5-20 U, besonders bevorzugt mit ca. 10 U Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase bzw. Hemicellulosen versetzt wird.
Es ist er indungsgemäß auch möglich, das Verfahren mit Fucitol bzw. Xylitol oder Arabitol oder den korrespondierenden Aldosen Fucose, Xylose oder Arabinose zu beginnen (vgl. Abb. 2). Diese können kommerziell erworben werden oder mit konventionellen Methoden aus geeigneten Pflanzen extrahiert werden.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren für seltene Monosaccharide, insbesondere für Tagatose, hat gegenüber den chemischen Verfahren des Standes der Technik den Vorteil, dass Enzyme als Biokatalysatoren aus den von ihnen geförderten Reaktionen wieder unverändert hervorgehen und weder entsorgt, noch aufwendig recycelt werden müssen. Darüberhinaus gewährleisten sie durch ihre Spezifität eine hohe Produktreinheit, die bei Tagatose >98% beträgt. Die erfindungsgemäß erhaltene Tagatose eignet sich in besonderem Maße als Glasur für Back- und Genussmittel wie Pralinen, Petit Four oder auch Kuchen. Nachfolgend wird die Erfindung an Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert :
Ausführungsbeispiele;
Beispiel 1: Herstellung von Tagatose
Um Dulcitol oder Galactoside zu extrahieren, können die Pflanzen mit Wasser nach konventionellen Methoden aufgeschlossen werden (z.B. Kugelmühle oder Presse). Die Proben werden deproteinisiert, die wasserlöslichen Galactoside wahlweise durch HPLC an Rezex RSO- Oligosaccharid angereichert, lyophilisiert und in Reaktionspuffer für die enzymatische Umsetzung aufgenommen.
Anzucht von Galdieria sulphuraria
Stamm MSh von Galdieria sulphuraria wurde autotroph in mit auf 5% C02 angereicherter Luft belüfteten Kulturröhren bei 20°C in mineralischem Medium im Dauerlicht (80 μE m"2 s"1; L40W/30-1 Osram) steril angezogen.
Enzyme
Nach Anzucht der Organismen gemäß konventionellen Methoden wird das jeweilige Enzym aus der Kultur isoliert (s.u.). Das betreffende Enzym kann mit konventionellen Methoden aus den Zellen extrahiert werden. So können Zell-Homogenate durch 2 oder mehrere Techniken wie Ammoniumsulfat-Fällung, hydrophobe , Interaktions- Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration gereinigt werden, um Enzym-Präparationen zu erhalten, die nur noch eine elektrophoretisch detektierbare Bande aufweisen oder das Enzym in dem nötigen Reinheitsgrad enthalten. Präparationen der Enzyme können durch Anwendung konventioneller Methoden wie z.B. adsorptive, ionische, kovalente Bindung oder Matrixeinhüllung immobilisiert werden. Diese Produkte können dann wiederholt im Batch-Verfahren oder kontinuierlich nach Einfüllen in Säulen bzw. Membranreaktoren benutzt werden.
Enzymnachweise
Die Aktivität der Polyol-Dehydrogenase wird bestimmt wie folgt: 800 μl 50 M Tris/HCl, 50 μl 4 mM NAD, 50 μl 1 M Polyol und 100 μl einer angemessenen Enzymextrakt-Lösung werden gemischt und die Bildung von NADH bei 340 nm mit einem Photometer verfolgt . Die Aldose-Reduktase-Aktivität wird wie folgt bestimmt : In einem Reaktionsansatz, ausgelegt auf ein Volumen von 1 ml, bestehend aus 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.0, 0.3 mM NADPH, 50 mM Galactose und einer geeigneten Menge Enzym- Extrakt, wird mittels eines Photometers die Bildung von NADP verfolgt.
Die Galactosidase-Aktivität wird bestimmt wie folgt: In 1 ml Test-Lösung, bestehend aus 40 mM Hepes-KOH, pH 6.5, einer geeigneten Substrat-Menge p-Nitrophenol α-d- Galactosid und einer geeigneten Menge Enzym-Extrakt wird bei 30°C die Bildung von p-Nitrophenol mittels eines Photometers bei 360 nm verfolgt. Reinigung der Aldose-Reduktase
Alle Reinigungsschritte wurden bei 0-4°C ausgeführt. In einem Beadbeater (Biospec Products, Bartlesville, OK) wurden 10-20 g Algen mit 50 ml Aufschlußpuffer, bestehend aus 20 mM Kaliumphosphat, pH 8.0 und 2 mM DTT und 0.5 mM EDTA aufgeschlossen. Der Extrakt wurde 60 min bei 37000 x g zentrifugiert, der Überstand auf eine DEAE-Fractogel- Säule (22 x 2,5 cm), equilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH 8.3 und 0.5 mM DTT gegeben. Die Aldose-Reduktase bindet nicht an die Matrix und kann mit 50 ml Puffer eluiert werden. Die ungebundenen Proteine wurden auf eine Hydroxyapatit-Säule (16 x 1,5 cm), equilibriert mit 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, geladen. Nach Spülen mit 30 ml Säulenpuffer wurden die Proteine mit einem linearen Gradienten von 200 ml von 0.1 - 0.8 M Kaliumphosphat, pH 7.5 eluiert. Die zwei Aktivitäts-Peaks wurden separat über Nacht gegen 2 1 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5 und 0.5 mM DTT dialysiert. Die Proben wurden jeweils auf eine Kationenaustauscher-Säule (Econo-Pak High S, Biorad) , equilibriert mit 20 mM Hepes-KOH, pH 6.5, geladen. Die Säule wurde mit 10 ml Säulenpuffer gewaschen und Proteine mit einem linearem Gradienten von 0 - 1.5 M NaCl in Säulenpuffer eluiert .
Fraktionen mit Aldose-Reduktase wurden vereinigt und 1 ml-Aliquots auf eine Gelfiltrations-Säule (Superdex 200 HiLoad, 1,6 x 60 cm, Pharmacia), equilibriert mit 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.0 und 0.25 M NaCl geladen. Proteine wurden isokratisch mit Säulenpuffer eluiert, Fraktionen mit Aldose-Reduktase vereinigt . Die gelelektrophoretische' Analyse dieser Proben zeigte nur eine Protein-Bande. Reinigung der L-Idit-Dehydrogenase
Alle Reinigungsschritte wurden bei 0-4°C ausgeführt. In einem Beadbeater (Biospec Products, Bartlesville, OK) wurden 10-20 g Algen mit 50 ml Aufschlußpuffer, bestehend aus 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 und 1.4 mM ß-Mercaptoethanol und 1 g Polyvinylpolypyrrolidon/100 ml aufgeschlossen. Der Extrakt wurde 15 min bei 4000 x g zentrifugiert . Der Überstand wurde für weitere 60 min bei 40000 x g zentri- fugiert . Der Rohextrakt wurde auf 10% Ammoniumsulfat- Sättigung eingestellt und der Ansatz 15 min bei 32000 x g zentrifugiert . Proteine aus dem Überstand wurden durch Erhöhen der Ammoniumsulfat-Sättigung auf 40% gefällt und durch erneutes Zentrifugieren pelletiert . Der resultierende Niederschlag wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8.5 aufgenommen und durch 2 h Dialyse gegen diesen Puffer entsalzt. Das Dialysat wurde auf eine DEAE-Fractogel- Säule (2,5 x 20 cm), equilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH 8.5, geladen. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen Säulenpuffer gewaschen und Proteine mit einem linearen Gradienten von 0-150 mM KC1 in Säulenpuffer eluiert. Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase wurden vereinigt und 2 h gegen 10 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 dialysiert . Das Dialysat wurde auf eine Hydroxyapatit-Säule (1,5 x 16 cm), equilibriert mit 10 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 geladen. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen mit dem gleichen Puffer gewaschen und Proteine mit einem aufsteigendem Gradienten von 10 - 200 mM Kaliumphosphat, pH 6.8 eluiert. Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase-Aktivität wurden vereinigt und 2 h gegen 1 1 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 dialysiert . Das Dialysat wurde mit Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 40% gebracht und auf eine mit 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 und 40% Ammoniumsulfat equilibrierte Decylagarose-Säule (1,5 x 16 cm) gegeben. Die Säule wurde mit dem 3-fachen Säulenbettvolumen Puffer (s.o.) gewaschen, bevor Proteine mit einem absteigenden Ammoniumsulfat-Gradienten (40 - 0% Sättigung) in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, eluiert wurden. Fraktionen mit Polyol- Dehydrogenase-Aktivität wurden vereinigt und 1 l- Aliquots auf eine mit 20 mM Tris HCl, pH 7.5 equilibrierte Gelfiltrations-Säule (Superdex 200 HiLoad, 1,6 x 60 cm, Pharmacia) geladen. Proteine wurden isokratisch mit dem gleichen Puffer eluiert und Fraktionen mit Polyol-Dehydrogenase-Aktivität vereinigt.
Verfahrensdurchführung
50 ml Galactosid-haltiges Ausgangsmaterial (5 g lyophili- sierter Pflanzenextrakt (s.o.) gelöst in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7.5) wurden mit je 10 U kommerziell erhältlicher Galactosidase aus Apergillus niger oder grünen Kaffeebohnen, aus G. sulphuraria gereinigter Aldose- Reductase (s.o.) und aus G. sulphuraria gereinigter Polyol-Dehydrogenase, 4 mM NADPH und 4 mM NAD versetzt und 9 h bei 20°C inkubiert. Der Reaktions-Ansatz wurde deproteinisiert und Zucker mittels HPLC an einer REZEX RCM-Monosaccharid-Säule, die bei 80°C isokratisch mit destilliertem Wasser eluiert wurde, getrennt. Anhand von Vergleichen mit Zucker-Standards wurde der Tagatose-Peak identifiziert. Die Fraktionen wurden konzentriert und die Tagatose nach konventionellen Methoden kristallisiert. Reinigung der Tagatose
Die Reaktionsgemische enthalten neben dem gewünschten Produkt auch unerwünschte Substanzen wie weitere Oligosaccharide, Monosaccharide, Zuckeralkohole, etc. Im Allgemeinen können diese durch eine Kombination weniger Aufreinigungstechniken entfernt werden, so z.B. Proteine durch Filtertechniken, unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation, Salze mit Ionenaustauschern in der H- oder OH-Form. Als letzter Schritt können verbleibende Zucker mittels HPLC getrennt werden oder selektiv mit Alkohol oder anderen Lösungsmitteln ausgefällt werden. Chromatographie mit Silica-Gelen produziert ebenfalls hochreine Saccharide . Die gereinigte Tagatose kann dann mit konventionellen Methoden kristallisiert werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von seltenen Monosacchariden, dadurch gekennzeichnet , daß ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes
Polyol oder ein Pflanzen-, Gemüse- oder Früchteextrakt, der ein dem herzustellenden Monosaccharid entsprechendes Polyol enthält, mit Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen oder Mikroorganismen, die diese Polyol-Dehydrogenase exprimieren, und NAD inkubiert wird und das entstehende Monosaccharid isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
Polyol-Dehydrogenase aus dem Stamm MSh, Hinterlegungsnummer CCAP 3172/1 eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß L-Idit- oder L-Fucit-Dehydrogenase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Fuculose Fucitol oder ein Fucitol-haltiger Pflanzenextrakt eingesetzt wird.
6. Verfahren nach nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Xylulose Arabitol oder Xylitol oder ein Früchte- oder Gemüseextrakt, der diese enthält, eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von Tagatose Dulcitol oder ein
Dulcitol-haltiger Pflanzenextrakt eingesetzt wird.
8. Verfahren zur enzymatischen Herstellung seltener Monosaccharide, dadurch gekennzeichnet, daß
Galactosid-haltige, Fucan-haltige, Xylan- oder Araban- haltige Extrakte hydrolisiert, mit Aldose-Reduktase und Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen oder mit Mikroorganismen, die diese Reduktase oder Dehydrogenase exprimieren, NADPH und NAD inkubiert werden und das entstandene Monosaccharid isoliert wird.
9. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Tagatose nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
Galactoside oder ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt, Milch oder Molke mit Galactosidase, Aldose- Reduktase aus extremophilen Rotalgen, Polyol-
Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert werden und die Tagatose isoliert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß
Polyol-Dehydrogenase aus der thermo- und acidophilen Rotalge Galdieria sulphuraria eingesetzt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß
Polyol-Dehydrogenase aus dem Stamm MSh, Hinterlegungsnummer CCAP 3172/1 eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß L-Idit- oder L-Fucit-Dehydrogenase eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Galactoside Floridosid, Iso loridosid, Raffinose, Stachyose oder Melibiose eingesetzt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Galactosid-haltiger Pflanzenextrakt aus Legu i- nosen, vorzugsweise aus Soja, oder aus Kohl,
Zuckerrüben, Ulmaceen oder Knollenziest eingesetzt wird.
15. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Tagatose, dadurch gekennzeichnet, daß
Galactose oder ein Galactose-haltiger Pflanzenextrakt mit Aldose-Reduktase aus extremophilen Rotalgen, Polyol-Dehydrogenase aus extremophilen Rotalgen, NADPH und NAD inkubiert wird und die entstehende
Tagatose isoliert wird.
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