KR20230164054A - L-글루포시네이트의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
L-글루포시네이트 (포스피노트리신 또는 (S)-2-아미노-4-(히드록시(메틸)포스포노일)부탄산으로도 알려져 있음) 암모늄 염의 제조 방법이 제공된다. 방법은 정제된 다단계 공정을 포함한다. 제 1 단계는 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화를 포함한다. 제 2 단계는 하나 이상의 아민 공여체로부터의 아민 기를 사용하는 PPO 의 L-글루포시네이트로의 특이적 아미노화를 포함한다. 제 3 단계는 또한 수득한 부산물의 원하는 최종 생성물로의 전환에 의한 수율로의 원하는 거울상이성질체의 농축을 포함한다. 제 3 정제 단계의 추가에 의해, L-글루포시네이트 및 D-글루포시네이트의 혼합물에 존재하는 D-글루포시네이트의 비율은 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염으로 실질적으로 전환될 수 있다.
Description
본 발명은 제초제 글루포시네이트의 L-이성질체를 제조하고 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 D,L-글루포시네이트의 라세미 혼합물로부터 L-이성질체를 제조하고 수득하는데 적합하다. 본 발명은 D,L-글루포시네이트의 라세미 혼합물로부터 수득된 L-이성질체의 수율을 최적화하는데 특히 적합하다.
또한, 본 발명은 산성 화합물의 알킬암모늄 염을 상응하는 암모늄 염으로 전환시키는 것을 목적으로 하는 방법에 또한 일반적으로 적용가능하다.
IUPAC-명칭: (2RS)-2-아미노-4-[히드록시(메틸)포스피노일]부티르산 또는 4-[히드록시(메틸)포스피노일]-DL-호모알라닌, CAS 등록 번호 51276-47-2 및 일반명 DL-4-[히드록실(메틸)포스피노일]-DL-호모알라니네이트를 갖는 제초제 글루포시네이트는 비선택적, 엽상-살포 제초제이며, 독성학적 또는 환경적 관점에서 가장 안전한 제초제 중 하나인 것으로 간주된다.
특히 글루포시네이트-암모늄 (IUPAC-명칭: 암모늄 (2RS)-2-아미노-4-(메틸포스피나토)부티르산, CAS 등록 번호 77182-82-2) 은 널리 공지된 이의 농경학적으로 허용가능한 염이다.
글루포시네이트 암모늄 및 그의 제초 활성은 또한 예를 들어 F. Schwerdtle et al. Z. Pflanzenkr. Pflanzenschutz, 1981, Sonderheft IX, pp. 431-440 에 의해 기재된 바 있다.
Hoerlein et al., in Rev. Environ. Contam. Toxicol. (Vol. 138, 1994) "Glufosinate (phosphinothricin), a natural amino acid with unexpected herbicidal properties" 는 글루타메이트 합성 억제제 글루포시네이트에 대해 토의하고 있다.
US 4,168,963 은 제초 활성을 갖는 인-함유 화합물을 기재하고 있으며, 그 중 특히, 포스피노트리신 (2-아미노-4-[히드록시(메틸)포스피노일]부탄산; 일반명: 글루포시네이트) 및 그의 염은 농화학 (농업 화학) 분야에서 상업적 중요성을 얻었다.
글루포시네이트는 라세미체이며 하기 구조 (1) 로 표시된다:
추가의 글루포시네이트는 2 개의 거울상이성질체의 라세미체이며, 이 중 하나만이 충분한 제초 활성을 나타낸다 (예를 들어, US 4265654 및 JP 92448/83 참조). L-글루포시네이트는 D-글루포시네이트보다 훨씬 더 강력하다 (Ruhland et al. (2002) Environ. Biosafety Res. 1:29-37).
글루포시네이트에 대한 현재의 상업적인 화학적 합성 방법은 L- 및 D-글루포시네이트의 라세미 혼합물을 산출한다 (Duke et al. 2010 Toxins 2:1943-1962).
라세미체 또는 이의 염으로서의 글루포시네이트는 상품명 BastaTM 및 LibertyTM 으로 상업적으로 입수가능하다.
IUPAC-명칭 (2S)-2-아미노-4-[히드록시(메틸)포스피노일]부티르산 (CAS 등록 번호 35597-44-5) 를 갖고 또한 글루포시네이트-P 로 지칭되는 L-글루포시네이트는 상업적으로 수득될 수 있거나, 예를 들어 US 10260078 B2, WO2006/104120, US5530142, EP0248357A2, EP0249188A2, EP0344683A2, EP0367145A2, EP0477902A2, EP0127429 및 J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, 1525-1529 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
그러나, 라세미체의 동적 동역학적 분해능 (WO18108794 에서와 같이) 또는 효소 촉매화된 라세미체 분해능 (예를 들어 EP0054897 에서 PG 아미다아제와 같이) 을 의미하는 통상적인 것을 기반으로 하거나, 비대칭 합성 예컨대 비대칭 수소화 (EP0238954 또는 EP1864989 에서와 같이) 를 기반으로 하는 거울상이성질체선택적 합성은, 출발 물질 또는 다른 보조제를 수득하기 어려운 것과 같은 추가적인 보조제를 필요로 하거나 합성을 더 복잡하게 하여 이에 따라 비용이 많이 드는 추가적인 합성 단계를 필요로 한다. 따라서, 이들 접근방식 중 어느 것도 라세미 물질의 합성과 비교하여 비용 경쟁력이 있는 것으로 아직 입증되지 않았다.
발명의 개요
따라서, 활성 거울상이성질체 L-글루포시네이트에 대한 필요성의 관점에서, 주로, 심지어 바람직하게는 단독으로, 활성 L-형태를 생성하는 방법이 여전히 필요하다.
또한, 간단하고 비용 효율적인 방식으로, 특히, 잘 확립되어 있고 이미 등록되어 있으며 농업적으로 신뢰할 수 있는 염인 글루포시네이트의 암모늄 염을 수득할 필요성도 있다.
L-글루포시네이트의 제조를 위한 새롭고 비용 효율적인 방법이 본원에 기재된다. 특히 이의 암모늄 염을 수득하기 위한 것이다.
상세한 설명
글루포시네이트를 라세미 혼합물로서 먼저 합성하였다. 시판되는 제초 생성물을 포함하는 대부분의 글루포시네이트는 L-글루포시네이트와 D-글루포시네이트의 50:50 혼합물을 포함하는 반면, 상기 언급된 바와 같이, 관찰된 제초 활성은 L-글루포시네이트에 의해 수행되면서, D-글루포시네이트는 활성이 아니고, 대신에 키랄 제초 불활성 화합물을 환경에 방출한다.
따라서, 단독으로 또는 적어도 주로, 글루포시네이트의 활성 L-이성질체를 제공하는 효율적이고, 간단하며 비용 효율적인 방법이 필요하다.
L-글루포시네이트를 수득하기 위한 종래 기술의 한 방법은 D,L 글루포시네이트의 탈라세미화를 통한 것이다.
예를 들어, WO 2017151573 은 2 단계 공정 (모식도 1) 으로의 식 DL-(1) 의 라세미 글루포시네이트-암모늄의 탈라세미화를 기재하고 있으며, 여기서 제 1 단계는 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화를 포함하고, 제 2 단계는 하나 이상의 아민 공여체로부터의 아민 기를 사용하는 PPO 의 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄으로의 특이적 아미노화를 포함한다.
모식도 1:
그러나, 이들 두 반응을 조합함으로써, L-글루포시네이트의 비율이 라세미 글루포시네이트 혼합물로부터 시작하여 실질적으로 증가할 수 있다고 하지만, 이는 실질적으로 L-글루포시네이트로 이루어지는 조성물이 수득됨을 의미하며, 주목되어야 할 공정에 대한 결함이 여전히 존재한다.
반응의 큰 그림은 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄이 화학량론적 속도로 수득되지 않지만, 부산물로서, L-글루포시네이트의 아민 공여체 암모늄 염도 또한 수득된다는 것을 나타낸다.
예를 들어, 아민 공여체가 모식도 1a 에서 나타낸 바와 같이 이소프로필아민인 경우, 이는 염의 혼합물, 즉 식 L-(1) 의 원하는 L-글루포시네이트-암모늄과 식 L-(2) 의 미등록 L-글루포시네이트-이소프로필암모늄을 초래한다.
모식도 1a:
따라서, 수득된 L-글루포시네이트 암모늄 염 L-(1) 이 이어서 정제되거나 실질적으로 정제되고 제초제로서 사용될 수 있지만, 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트-이소프로필암모늄 염은 또한 이로부터 이득을 얻고 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염을 또한 수득하기 위해 추가로 가공될 필요가 있다.
일반적으로, L-글루포시네이트 부산물의 추가 가공은 그의 성질에 따라 공정을 전체적으로 좋지 않게 할 정도로 지루하고 정교하며 시간이 많이 걸리게 할 가능성이 있다.
WO 2017151573 에서 언급된 바와 같이, 적절한 아민 공여체의 선택은 D-글루포시네이트의 L-글루포시네이트로의 경제적인 전환에 중요하다. 공여체의 이용가능성 및 비용, 공여체의 잠재적 회수 및 원하는 L-글루포시네이트로부터 부산물, 예를 들어 케토 부산물의 분리와 같은 다양한 문제가 열거된다.
WO 2017151573 에서는 저가의 아민 공여체 예컨대 페닐에틸아민, L-아스파르테이트 또는 라세미 아스파르테이트, L-글루타메이트 또는 라세미 글루타메이트, L-알라닌 또는 라세미 알라닌, sec-부틸아민 및 이소프로필아민을 포함하는 여러 상이한 아민 공여체를 수용하는 트랜스아미나아제 효소를 사용할 수 있다는 것이 권장된다. L-글루포시네이트로부터 부산물 아세톤의 제거가 반응을 완료로 유도할 수 있으므로, 후자가 임의로는 유리한 것으로 언급된다. 그러나, 때로는 여러 가지의 후속 문제에 여전히 직면해 있다:
예를 들어, 아미노화의 부산물, 예를 들어, 공여체 분자로부터 생성된 케토 화합물이 반응 혼합물로부터 연속적으로 제거될 수 없는 경우, 첫째로 아민 공여체는 원하는 반응이 완료되도록 반응의 평형을 이동시키기 위해 매우 과량으로 적용되어야 하고, 둘째로 원하는 L-글루포시네이트로부터 아민 공여체 과량의 후속 제거는 추가적인 정제 단계를 필요로 한다.
그러나, 공여체 분자로부터 생성된 케토 화합물이 이소프로필아민으로부터 생성된 아세톤의 경우와 같이 반응 혼합물로부터 연속적으로 용이하게 제거될 수 있더라도, 다른 후속 문제에 직면할 것이다.
예를 들어, 알킬아민이 공여체로서 사용되는 경우, 이러한 알킬아민은 암모니아보다 더 강한 염기를 나타내고, 따라서, 바람직하지 않은 부반응으로서, 출발 암모늄 염으로부터의 암모니아의 대체가 관찰된다. 이것은 L-글루포시네이트의 알킬암모늄 염의 형성을 초래하며, 이는 - 규제 당국의 승인 누락으로 인해 - 농업 목적 및 상업적 조성물에 사용될 수 없다.
이의 관점에서, 종래 기술에서 선택된 바람직한 아미노 공여체는 글루타메이트였으며, 이는 아미노기전이 반응으로부터 초래되는 케토산 부산물, 즉 α-케토글루타레이트가 잘 확립되고 공지된 방법으로 분리 및/또는 정제될 수 있고, 약학 제제, 식품 첨가제 및 생체재료의 합성을 포함하여 다양한 적용에서 추가로 사용될 수 있기 때문이다. 또한, 임의로는 반응에서의 재사용을 위해 라세미 글루타메이트 또는 L-글루타메이트로 화학적으로 전환될 수 있고, 화학적 환원적 아미노화는 케토 기의 아민으로의 전환을 포함할 수 있다는 것이 언급된다.
그러나, 언급되었지만, 이소프로필아민은 바람직한 아민 공여체로 간주되지 않았다.
또한, 상기 나타낸 바와 같이, 바로 사용할 수 있는 야생형 트랜스아미나아제 효소를 쉽게 찾는 것은 분명하지 않다. 매우 종종, 원하는 아민 공여체를 정상적으로 수용하지 않고 원하는 기질을 최종적으로 수용하기 위해 진화될 필요가 있는 이러한 야생형 트랜스아미나아제는, 추가의 도전 과제를 제시할 수 있다.
상기 설명된 문제점을 고려하여, 해결하고자 하는 문제는 둘 모두: 먼저 L-글루포시네이트의 원치 않는 아민 공여체 염을 혼합물로부터 효과적으로 분리한 다음, 추가적으로 - 더 양호하게 - 이를 L-글루포시네이트 L-(1) 의 암모늄 염으로 직접 전환시켜, 이로써 원하는 암모늄 염의 수율을 증가시킨다.
본 발명에 따른 솔루션은 한편으로는 아민 공여체의 올바른 선택 및 아민 공여체의 경제적이고 친환경적인 제거 및 이로써 더 높은 화학량론적 수율의 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염의 수득 단계를 나타낸다.
놀랍게도, L-글루포시네이트, 및 특히 D,L 글루포시네이트 라세미체로부터 L-글루포시네이트의 유리하게 원하는 암모늄 염을 수득하기 위한 쉽고, 간단하며, 환경적이고 비용 효율적인 방식을 허용하는 새로운 방법이 이제 발견되었다.
따라서, 처음에 아민 공여체는 지방족 C1-C6-알킬아민으로부터 선택될 필요가 있음이 발견되었다. 이는 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염을 초래할 것이다.
이러한 지방족 C1-C6-알킬아민을 선택하는 이점은, 이들의 낮은 비점으로 인해, 이들이 간단한 증류에 의해 쉽게 제거될 수 있다는 것이다.
모식도 1.A:
따라서, 식 L-(2) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸로 이루어지는 군에서 선택될 것이다.
바람직하게는 지방족 C1-C6-알킬아민은 지방족 2차 C1-C6-알킬아민이다. 보다 바람직하게는 지방족 2차 C1-C6-알킬아민은 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민로 이루어지는 군에서 선택될 것이다.
아미노기전이 후 다음 도전 과제는 원치 않는 부산물, L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 를 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염 L-(1) 로부터 성공적으로 분리하고, 그로써 바람직하게는 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 를 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염 L-(1) 로 효과적으로 전환시키는 것이다.
이 문제는 L-글루포시네이트 알킬암모늄 염 L-(2) 를 칼슘 염 L-(3) 으로 전환시키는 제 1 중간 단계에서 Ca(OH)2 의 첨가에 의해 해결될 수 있고, 이로써 방출된 저비점 C1-C6-알킬아민이 증류에 의해 쉽게 제거될 수 있다.
모식도 2-1:
더 약한 염기인, L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 중 알킬아민은 더 강한 염기 Ca(OH)2 에 의해 그의 염으로부터 대체되고, 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트의 칼슘 염이 형성된다. 이어서, 저비점을 갖는 방출된 아민 공여체 C1-C6-알킬아민은 증류에 의해 제거될 수 있다.
제 2 중간 단계에서, 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트의 칼슘 염의 나머지 수용액에, 암모늄 술페이트가 첨가되고, 이는 수용액에서 해리되고, 술페이트 이온은 흔히 그의 수화 석고 또는 플라스터로 공지된 수불용성 칼슘 술페이트 (CaSO4) 를 형성하고, 이는 침전되는 한편, 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염 L-(1) 은 수용액에 용해된 상태로 유지된다.
모식도 2-2
석고는 무해하고, 무독성이며 본래부터 안전한 물질이고, 이는 여과에 의해 간단히 제거될 수 있다. 이제 식 L-(1) 의 원하는 L-글루포시네이트 암모늄 염을 함유하는 나머지 수용액으로부터, 용매를 제거함으로써 순수한 염을 수득할 수 있고, 암모늄 염 L-(1) 은 거의 정량적인 수율로 수득된다.
본 발명의
구현예
D-글루포시네이트를 L-글루포시네이트로 전환시키는 방법의 개별적이고 바람직한 구현예를 하기 본원에 제공한다.
구현예는 D- 및 L-글루포시네이트의 라세미 혼합물의 저비용 공급원료를 제초 생성물로 전환시키기 위한 유리하고 바람직한 수단을 포함하며, 여기서 제초적으로 활성인 L-거울상이성질체 L-글루포시네이트는 상당히 풍부하였다.
본 발명에 따른 방법은 전환을 위한 수단 및 방법 뿐만 아니라 원하는 L-거울상이성질체의 비율을 풍부하게 하고 그의 단리를 위한 수단을 포함한다.
방법은 하나의 단일 용기에서 연속적으로 (원-포트 공정) 또는 여러 개의 별개 용기에서 연속적으로 (멀티-포트 공정) 발생할 수 있는 여러 단계를 포함한다.
DAAO 효소
제 1 단계는 D-글루포시네이트 (D- 및 L-글루포시네이트의 라세미 혼합물에서 존재할 수 있음) 의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화이다.
모식도 1-1
이 단계는 바람직하게는 D-아미노산 옥시다아제 (DAAO) 효소에 의해 촉매화된다.
그러나, D-글루포시네이트의 PPO 로의 산화적 탈아미노화는 여러 부류의 효소에 의해 촉매화될 수 있지만, 또한 비효소적으로 발생할 수 있다. 가능한 효소는 DAAO, DAAD (D-아미노산 데히드로게나아제 (DAAD) 효소) 및 D-아미노산 데히드라타아제를 포함한다.
한 구현예에서, DAAO 효소는 D-글루포시네이트의 PPO 로의 전환을 촉매화하는데 사용된다. 이러한 반응은 하기 화학량론을 갖는다:
D-글루포시네이트 + O2 + H2O => H2O2 + NH3 + PPO.
수성 반응 완충제 중 산소의 용해도가 전형적으로 글루포시네이트의 용해도에 비해 낮기 때문에, 효율적인 공정을 위해, 산소는 DAAO 반응의 기간 전체에 걸쳐 도입되어야 한다.
초기에, D-글루포시네이트는 30 g/L 초과 내지 최대 140 g/L 만큼 많이 존재한다.
산소는 전형적으로 초기에 대략 8 mg/L 로 존재하지만, 반응을 계속하기에 충분한 산소를 허용하기 위해 반응 전체에 걸쳐 첨가된다. 물은 전형적으로, 500 g/L 초과로 존재하지만, 필수적인 것은 아니다.
몇몇 DAAO 효소는 당업계에 공지되어 있으며, 기질로서 D-글루포시네이트를 수용할 수 있고 반응을 유도하기에 충분한 활성을 제공할 수 있는 한, 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 방법에 사용될 수 있는 이러한 DAAO 효소는 활성이 증가되도록 변형된 로도스포리디움 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides), 트리고노프시스 바리아빌리스 (Trigonopsis variabilis), 푸사리움 종 (Fusarium sp), 칸디다 종 (Candida sp), 시조사카로마이세스 종 (Schizosasaccharomyces sp), 버티실리움 종 (Verticillium sp), 네오렌티누스 레피데우스 (Neolentinus lepideus), 트리코더마 레에세이 (Trichoderma reesei), 트리초스포론 올레아지노수스 (Trichosporon oleaginosus) 등으로부터의 것들을 포함한다.
특정 출발 효소는 WO2017/151573 에 기재되고 확인되었으며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함되고, 여기서 특히 7 페이지에서 시작된다.
추가적인 DAAO 효소는 서열 유사성 및 기능적 스크린을 포함하는 다양한 방식으로 확인될 수 있다. 여기서, DAAO 효소가 돌연변이체 DAAO 효소인 경우, D-글루포시네이트를 기질로서 수용할 수 있어야 한다. 다른 DAAO 효소는 D-글루포시네이트를 수용하고 더 큰 활성을 갖도록 유사하게 변형될 수 있다. 동일한 방식으로, 공지된 DAAO 효소는 돌연변이유발에 의해 개선될 수 있고/있거나 신규한 DAAO 효소가 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 효소는 본원에 기재된 방법으로 만들어지고 시험될 수 있다. 돌연변이체 DAAO 효소 (예를 들어, 로도토룰라 그라실리스 (Rhodotorula gracilis) 로부터의) 는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이체 서열 내 위치에서 1 개의 돌연변이, 2 개의 돌연변이, 3 개의 돌연변이, 또는 3 개 초과의 돌연변이 (예를 들어, 4 개의 돌연변이, 5 개의 돌연변이, 6 개의 돌연변이, 7 개의 돌연변이, 8 개의 돌연변이, 9 개의 돌연변이, 또는 10 개의 돌연변이 또는 그 이상) 를 포함할 수 있다. 또한 여기서 WO2017/151573 에서의 개시물을 참조한다.
다른 적합한 D 아미노산 옥시다아제는 진균 공급원으로부터 수득될 수 있다.
나타낸 바와 같이, DAAO 효소는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 확인되고 시험될 수 있다. 효소가 기질로서 D-글루포시네이트를 수용할지를 결정하기 위해, 산소 전극 어세이 (Hawkes, 2011), 비색 어세이 (Berneman A, Alves-Ferreira M, Coatnoan N, Chamond N, Minoprio P (2010) Medium/High Throughput D-Amino Acid Oxidase Colorimetric Method for Determination of D-Amino Acids. Application for Amino Acid Racemases. J Microbial Biochem Technol 2: 139-146) 및/또는 생성물 형성의 직접 측정 (고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS) 등을 통함) 이 사용될 수 있다.
DAAO 효소에 의해 촉매화되는 반응은 산소를 필요로 한다. 일부 구현예에서, 산소, 산소 풍부 공기, 산소 풍부 기체 스트림 또는 공기는, 헤드 스페이스에서 또는 반응 용기를 통해 가스를 살포함으로써 반응에 도입되어 반응 속도를 향상시킨다.
DAAO 효소가 D-글루포시네이트의 PPO 로의 전환을 촉매화할 때, 히드로겐 퍼옥시드 (H2O2) 가 진전된다. 이는 효소 및 생체내 변화 (biotransformation) 의 다른 성분 (예를 들어, 생성물 및/또는 기질) 에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 카탈라아제와 같은 효소가 DAAO 효소에 추가로 사용되어 히드로겐 퍼옥시드의 제거를 촉매화할 수 있다. 카탈라아제는 하기 화학량론으로 히드로겐 퍼옥시드의 분해를 촉매화한다: 2H2O2 => 2H2O + O2.
일부 구현예에서, 히드로겐 퍼옥시드는 촉매화 및 비-촉매화 분해 반응을 사용하여 제거될 수 있다. 예를 들어, 히드로겐 퍼옥시드는 증가된 열 및/또는 pH 를 사용하는 비-촉매화 분해 반응에 의해 제거될 수 있다. 히드로겐 퍼옥시드는 또한, 예를 들어 전이 금속 및 다른 작용제, 예컨대 포타슘 요오디드를 사용하는 촉매화 분해 반응에 의해 제거될 수 있다. 히드로겐 퍼옥시드를 제거하는 것에 추가로, 카탈라아제를 사용하면 또한 산소 (O2) 가 생성된다. 카탈라아제에 의한 산소의 생성은, DAAO 가 기능하기 위해 산소를 필요로 하기 때문에, DAAO 효소를 사용하여 D-글루포시네이트의 PPO 로의 전환을 촉진하는데 도움이 될 수 있다.
다른 효소는 D-글루포시네이트의 PPO 로의 전환을 촉매화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, D-글루포시네이트를 기질로서 수용하는 DAAD 효소를 하기 화학량론으로 사용할 수 있다: D-글루포시네이트 + H2O + 수용체 => NH3 + 환원된 수용체 + PPO.
DAAD 가 사용되는 방법에서, DAAD 촉매화 반응은 산화환원 보조인자 재순환을 포함할 수 있는 것으로 인식된다. 이는 D-글루포시네이트로부터 더 많은 전자를 수용할 수 있도록 환원된 수용체를 산화시키는 것을 포함한다.
D-글루포시네이트의 PPO 로의 실질적으로 완전한 (80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과 또는 80 내지 100%, 85 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 95 내지 99%) 전환은 24 시간 이내, 18 시간 이내, 12 시간 이내, 또는 8 시간 이내에 발생할 수 있다.
TA 효소
제 2 단계는 하나 이상의 아민 공여체로부터의 아민 기를 사용하여, 트랜스아미나아제 (TA) 효소를 사용한 PPO 의, 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염 및 식 L-(2) 의 알킬암모늄 염으로의 특이적 아미노화이다.
모식도 1-2
이러한 제 2 단계는 예를 들어 트랜스아미나아제 (TA) 효소, L-아미노산 데히드로게나아제 (LAAD) 효소를 사용하는, 또는 화학적 전환에 의한 PPO 의 L-글루포시네이트로의 전환을 포함한다.
한 바람직한 구현예에서, 방법은 TA 에 의해 촉매화되는 반응이다.
트랜스아미나아제 (TA) 는 일반적으로 제약 및 정밀 화학 산업을 위한 키랄 아민의 제조에 중요한 효소이다. 이들 산업에서 사용하기 위한 신규한 TAm 은 활성-유도 방법 및 배양된 미생물로부터의 상동 서열 검색부터 주요 모티프를 사용한 검색 및 환경 DNA 라이브러리의 메타게놈 마이닝 (metagenomic mining) 까지를 포함하는 다양한 접근방식을 사용하여 발견되었다 (Kelly et al. (2020) Appl Microbiol Biotech 104:4781-4794).
반응이 아민 공여체 및/또는 트랜스아미나아제의 부재 하에 D-글루포시네이트가 PPO 로 실질적으로 전환되는 2 단계 공정으로서 수행되는 경우, 제 2 단계에서의 PPO 의 출발 양은 전형적으로 30 g/L 내지 140 g/L 범위이다. 반응이 단일 단계 공정으로 수행되는 경우, PPO 의 출발 양은 전형적으로 1 g/L 미만이고, 반응 동안 PPO 의 최고 수준은 전형적으로 25 g/L 미만이다. 아민 공여체는 초기에 라세미 글루포시네이트의 출발 양에 걸쳐 1 몰 과량과 6 몰 과량 사이로 존재한다.
본원에 기재된 방법에서 유용한 TA 는 대장균 (Escherichia coli) 으로부터의 gabT 트랜스아미나아제 (UniProt P22256) 를 포함하며, 이는 기질로서 PPO 와의 원하는 반응을 촉매화하는 것으로 나타났다 (Bartsch et al. (1990) Appl Environ Microbiol. 56(1):7-12). 또 다른 효소는 아민 공여체로서 이소프로필아민을 사용하여 더 높은 속도로 원하는 반응을 촉매화하도록 진전되었다 (Bhatia et al. (2004) Peptide Revolution: Genomics, Proteomics & Therapeutics, Proceedings of the Eighteenth American Peptide Symposium, Ed. Michael Chorev and Tomi K. Sawyer, July 19-23, 2003, pp. 47-48). 추가로, 수많은 미생물, 예컨대 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 등으로부터의 TA 효소가 본원에 기재된 방법의 실행에 사용될 수 있다.
원하는 경우, 효소는 이들의 활성을 증가시키기 위해 돌연변이유발에 의해서도 진전될 수 있다. 돌연변이체 TA 효소는 Schulz et al., Appl Environ Microbiol. (1990) Jan. 56(1):1-6 에 요약된 어세이에 의해, 및/또는 HPLC, LC-MS, 또는 유사한 생성물에 의한 생성물의 직접적 측정에 의해 원하는 활성에 대해 선택될 수 있다.
방법에서 사용하기 위한 추가적인 TA 효소는 원하는 활성을 위해 Prozomix Limited (Northumberland, United Kingdom), SyncoZymes (Shanghai, China), Evocatal (Monheim am Rhein, Germany), Codexis (Redwood City, CA) 또는 Abcam (Cambridge, United Kingdom) 에 의해 판매되는 것들과 같은 TA 의 컬렉션을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 서열 유사성은 신규한 TA 효소를 확인하는데 사용될 수 있다.
결국, TA 효소는 또한 원하는 반응을 촉매화할 수 있는 유기체로부터 확인될 수 있으며, 효소 공학에 의해 더 변형되고 최적화될 수 있어, 보다 양호한 선택성 및 더 높은 산출량을 갖는 경제적인 생산을 가능하게 한다.
후자는 예를 들어 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 WO 2020/025577 에서 수행되며, 이는 개선된 오메가-트랜스아미나아제 (ω-TA) 활성을 갖는 단백질, 개선된 ω-TA 활성을 갖는 각각의 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 키랄 아민 및 아미노산의 입체선택적 합성 또는 거울상이성질체 혼합물에서 키랄 아민 이성질체의 증가를 위한 방법을 기재한다. 특히 ω-트랜스아미나아제 (ω-TA) 변이체가 제공되며, 이는 각각의 야생형 ωTA 와 비교하여 개선된 반응 동역학, 개선된 기질 수용 및 개선된 비활성 (specific activity) 을 갖는 그의 아미노산 서열에서의 변형을 포함하며, 따라서 아민화 생성물에 대한 경제적으로 효율적인 생산 공정의 개발을 가능하게 한다. 이들 변이체는 글루포시네이트와 같은 포스포-아미노산의 거울상이성질체적으로 풍부한, 거의 순수한 또는 순수한 화합물을 생성할 수 있다.
WO2020025577 에서 바람직한 ω-TA 변이체는 거울상이성질체 과량의 (S)-아민을 포함하는 조성물의 생성을 가능하게 하고, 따라서 특히 거울상이성질체 과량의 (S)-글루포시네이트를 수득하기에 적합하며, 여기서 글루포시네이트에 대한 (S)-거울상이성질체성의 용어는 동일한 원하는 L-글루포시네이트를 나타낸다. 편리하게는, 각각의 ω-TA 변이체는 동시에 조성물 중 (R)-거울상이성질체의 양을 감소시켜, 따라서 글루포시네이트의 불활성 D-거울상이성질체가 덜 수득된다.
PPO 의 L-글루포시네이트로의 실질적으로 완전한 전환은 24 시간 이내, 18 시간 이내, 12 시간 이내, 또는 8 시간 이내에 발생할 수 있다. 이러한 맥락에서, 실질적으로 완전하다는 것은 PPO 의 L-글루포시네이트로의 전환이 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과 (또는 약 80 내지 약 100%, 약 85 내지 약 100%, 약 90 내지 약 100%, 또는 약 95 내지 약 99%) 임을 의미한다.
아민 공여체
아민 공여체 분자는, 아민 수용체 분자에 아민 기를 공여하여 그에 따라 아민 공여체 분자의 아민 기가 카르보닐 기가 되는 분자를 포함하는 아민 기이다.
본 발명에서 선택되는 아민 공여체 분자는 C1-C6-알킬-아민이다.
상기 추가로 언급된 바와 같이, 아민 공여체는 간단한 증류에 의해 쉽게 제거될 수 있으므로, 저비점으로 인해 지방족 C1-C6-알킬아민에서 선택될 것이다.
바람직하게는, 아민 공여체는 2차 지방족 C1-C6-알킬아민에서 선택될 것이다.
따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 지방족 2차 C1-C6-알킬아민은 바람직하게는 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에서, 지방족 2차 C1-C6-알킬아민은 이소프로필아민 또는 sec-부틸아민이다.
특히 바람직한 지방족 2차 C1-C6-알킬아민은 이소프로필아민이고, 이는 식 L-(2a) 의 L-글루포시네이트의 이소프로필암모늄 염을 초래할 것이다.
모식도 1a:
Kelly et al. (2017, Chem. Rev. 2018, 118, 1, 349-367) 은 알라닌이 예를 들어 효소에 의한 그의 광범위한 수용 및 피루베이트 부산물을 제거하기 위한 다양한 옵션에 관해 TA-촉매화된 반응에 대한 아민 공여체로서 인기가 있는 것으로 입증되었음을 기재하고 있다. 그러나, 알라닌을 사용하면 바람직하지 않은 반응 평형이 초래된다고 지적되는데, 이는 출발 물질과는 먼 것이다. Later Kelly et al. ((2020) Appl Microbiol Biotech 104:4781-4794) 은 공지된 S-선택적 TA 의 것들을 통해 잘 분포된 서열을 갖는 TA 에서의 진화 다양성을 기재하고 있다. 이들 중 하나 (소위 "pQR2189") 는 아미노 공여체 이소프로필아민 ("IPAm") 을 수용하는 능력을 나타냈다.
이소프로필아민의 이점은 그의 허용가능한 화학물질 가격 및 부산물이 제거될 수 있는 용이성 뿐만 아니라 전환율 개선에 있어서의 상당한 진전이다.
본 발명에 따른 방법에서 아미노 공여체 분자로서 사용되는 경우, 이소프로필아민은 ω-TA 의 작용에 의해 아세톤으로 전환된다. 아세톤은 상대적으로 낮은 온도에서 증발한다는 이점으로 이어지는 휘발성 화합물이다. 이는 반응이 일어나는 동안 반응 혼합물로부터 ω-TA 에 의해 생성된 아세톤을 제거할 수 있게 하여, 반응의 평형이 본 발명에 따른 아민 제조 방법에 의해 생성된 원하는 아민으로 이동하는 유리한 효과를 초래한다. 이는 ω-TA 에 의해 촉매화되는 역반응이 하나의 반응 파트너의 결여로 인해 감소됨에 따라 원하는 아민을 많은 양으로 수득할 수 있게 한다.
이전에 언급된 WO2020025577 는 또한 2-부틸아민 및 이소프로필아민과 같은 아미노 공여체 분자로서 사용되는 알킬아민을 지칭한다.
TA 에 대한 아민 공여체로서의 그의 역할에 있어서 이소프로필아민은 또한 Park et al. (2013, Organic & Biomolecular Chemistry 11, 6929-6933) 과 같은 다른 문헌에서 발견될 수 있으며, 이는 이소프로필아민 및 다양한 다른 화합물을 아민 공여체로서 사용함으로써 케토산으로부터 비천연 아미노산의 거울상이성질체선택적 합성에서 상이한 트랜스아미나아제의 거동을 개시한다.
바람직하게는, 아민 생성을 위한 아민 공여체 분자는 10 g/l (리터 당 그램) 과 250 g/l 사이, 보다 바람직하게는 15 g/l 과 200 g/l 사이, 보다 더 바람직하게는 17 g/l 과 180 g/l 사이의 양으로 제공된다.
예시적인 구현예
하기에, 예시적이지만 비제한적인 구현예가 본 발명을 추가로 정의하는 것으로 기재된다.
식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염을 수득하는 방법으로서,
식 중에서, 식 L-(2) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되고;
하기 단계를 특징으로 하는 방법:
단계 1: Ca(OH)2 를 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 의 수용액에 첨가함으로써 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 를 L-글루포시네이트 칼슘 염 L-(3) 에 반응시키고, 이로써 방출된 저비등 C1-C6-알킬아민을 증류에 의해 제거하는 단계.
단계 2: (NH4)2SO4 를 L-글루포시네이트의 칼슘 염 L-(3) 의 잔여 수용액에 첨가함으로써 L-글루포시네이트 L-(3) 칼슘의 칼슘 이온을 암모늄 술페이트의 암모늄 이온에 의해 대체하고, 침전된 칼슘 술페이트 (석고) 를 여과에 의해 제거하는 단계.
단계 3: 맑은 여과물로부터 물을 제거하여 원하는 암모늄 염 L-(1) 을 단리하는 단계.
단계 1 에서 증류가 70 초과 내지 130℃, 바람직하게는 75 내지 120℃, 특히 80 내지 110℃ 의 온도에서 수행되는 것인, 상기 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 증류는 바람직하게는 대기압 (정상압으로도 지칭) 하에 수행된다. 증류는 또한 감압 하에서, 바람직하게는 100 mbar 내지 대기압 미만, 보다 바람직하게는 100 mbar 내지 1000 mbar 미만, 특히 100 mbar 내지 900 mbar 에서 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 증류는 20 내지 110℃, 또는 30 내지 120℃ 의 온도에서 수행될 수 있다.
단계 2 가 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 알코올, 및 특히 메탄올의 첨가를 추가로 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 알코올은 바람직하게는 25 내지 75℃, 보다 바람직하게는 30 내지 70℃, 보다 더 바람직하게는 35 내지 65℃, 특히 40 내지 60℃ 의 온도에서 첨가된다.
단계 2 가 여과 단계 없이 단계 1 에 후속하여 수행되는 것인, 상기 기재된 바와 같은 방법.
식 L-(2) 의 L-글루포시네이트-알킬암모늄 염이 2 단계 공정으로 식 DL-(1) 의 글루포시네이트-암모늄의 탈라세미화에 의해 수득되며,
제 1 단계에서 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화가 D-아미노산 옥시다아제 (DAAO) 효소로 실행되고,
제 2 단계에서 PPO 가 하나 이상의 아민 공여체로부터 아민 기를 사용하여 트랜스아미나아제 (TA) 효소에 의해 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로 아미노화되는 것인,
상기 기재된 바와 같은 방법.
식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염이 아민 공여체의 존재 하에 트랜스아미나아제 (TA) 효소와의 반응에 의해 제 2 단계에서 수득되며, 아민 공여체가 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방족 2차 C1-C6-알킬아민인, 상기 기재된 바와 같은 방법. 바람직하게는, 아민 공여체는 이소프로필아민 또는 sec-부틸아민, 보다 바람직하게는 이소프로필아민에서 선택되는 2차 지방족 C1-C6-알킬아민이다.
식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염에서 C1-C6-알킬암모늄 이온이 상기 본원에 기재된 바와 같은 지방족 C1-C6-알킬아민의 암모늄 염인, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법. 바람직하게는, 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염에서 C1-C6-알킬암모늄 이온은 이소프로필아민 암모늄 또는 sec-부틸아민 암모늄, 보다 바람직하게는 이소프로필아민 암모늄이다.
DAAO 효소가 로도스포리디움 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides) (UniProt P80324), 트리고노프시스 바리아빌리스 (Trigonopsis variabilis) (UniProt Q99042), 네오렌티누스 레피데우스 (Neolentinus lepideus) (KZT28066.1), 트리코더마 레에세이 (Trichoderma reesei) (XP_006968548.1) 또는 트리초스포론 올레아지노수스 (Trichosporon oleaginosus) (KLT40252.1) 로부터의 효소에서 선택되는 것인, 상기 기재된 바와 같은 방법.
바람직하게는, DAAO 효소는 돌연변이체 DAAO 이고, 보다 바람직하게는 돌연변이체 DAAO 는 로도스포리디움 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides) 로부터의 서열을 기반으로 하는 돌연변이체 DAAO 이다.
TA 효소가 ω-트랜스아미나아제인, 상기 기재된 바와 같은 방법.
바람직하게는 TA 효소는 아르트로박터 종 (Arthrobacter sp.), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 크렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) JS2F (S), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) JS64 (S), V. 플루비알리스 (V. fluvialis) JS17 (S), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) KNK425 (S), 알칼리제네스 데니트리피칸스 (Alcaligenes denitrificans) Y2k-2 (S), 메소리조비움 종 (Mesorhizobium sp.) LUK (S), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) SC6394 (S), 모락셀라 라쿠나타 (Moraxella lacunata) WZ34 (S), 자니박터 테라에 (Janibacter terrae) DSM13953 (S), 슈도모나스 시코리이 (Pseudomonas cichorii) DSM 50259 (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) ATCC49838 (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) KNK08-18 (S) , 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) ACC (S), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) NBRC14164 (S), 바실러스 할로톨레란스 (Bacillus halotolerans) (S), 바실러스 서브틸리스 아종 스테르코리스 (Bacillus subtilis subsp. stercoris) (S), 바실러스 서브틸리스 아종 이나쿠오소룸 (Bacillus subtilis subsp. inaquosorum) (S), 바실러스 엔도피티쿠스 (Bacillus endophyticus) (S), 리조비움 라디오박터 (Rhizobium radiobacter) (S), 크로모박테리움 비오라세움 (Chromobacterium violaceum) DSM30191 (S), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) (S) Ingram et al. (2007), 아르트로박터 시트레우스 (Arthrobacter citreus) (S), 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crescentus) (S), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) (S), 파라코쿠스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans) (S), 폴라로모나스 종 (Polaromonas sp.) JS666 (S), 오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi) (S), 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumannii) (S), 아세토박터 파스튜리아누스 (Acetobacter pasteurianus) (S), 버크홀데리아 비에트나멘시스 (Burkholderia vietnamensis) (S), 할로모나스 엘론가타 (Halomonas elongata) (S), 버크홀데리아 그라미니스 (Burkholderia graminis) (S), 테르모마이크로비움 로세움 (Thermomicrobium roseum) (S), 스파에로박터 테르모필루스 (Sphaerobacter thermophilus) (S), 지오바실러스 테르모데니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) (S), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) (S), 바실러스 미오코이데스 (Bacillus mycoides) (S), 할로모나스 종 (Halomonas sp.) CSM-2 (S), 로도스피릴라세아에 박테리움 (Rhodospirillaceae bacterium) (S), 라브렌지아 종 (Labrenzia sp.) LAB (S), 아피피아 종 (Afipia sp.) P52-10 (S), 오세아니바쿨룸 인디쿰 (Oceanibaculum indicum) (S), 일루마토박터 코키네우스 (Ilumatobacter coccineus) (S), 바리오보락스 종 (Variovorax sp.) KK3 (S), 파라버크홀데리아 카리벤시스 (Paraburkholderia caribensis) (S), 히드로게노파가 팔레로니이 (Hydrogenophaga palleronii) (S), 솔리루브로박터 솔리 (Solirubrobacter soli) (S), 키네오스포리아 종 (Kineosporia sp.) R_H_3 (S), 로세오모나스 데저티 (Roseomonas deserti) (S), 시노리조비움 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti) (S), 보세아 루피네 (Bosea lupine) (S), 보세아 바빌로비아에 (Bosea vaviloviae) (S), 슈드아시도보락스 인터메디우스 (Pseudacidovorax intermedius) (S), 버크홀데리아 종 (Burkholderia sp.) UYPR1.413 (S), 대장균 (Escherichia coli) K12 (S), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) (S), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis) (S), 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi) (S), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) KD131 (S), 루에게리아 종 (Ruegeria sp.) TM1040 (S), 메조리조비움 로티 (Mesorhizobium loti) MAFF30399 (S) 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) (S) 에서 선택되는 S-선택적 ω-트랜스아미나아제 효소이다.
보다 바람직하게는 TA 효소는 돌연변이체 ω-트랜스아미나아제이다.
가장 바람직하게는 TA 는 아르트로박터 종 (Arthrobacter sp.) 또는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터의 서열을 기반으로 하는 돌연변이체 ω-트랜스아미나아제이다.
특히, 바람직한 선택된 ω-트랜스아미나아제 돌연변이체는 WO 2020/025577 에 기재되어 있다.
식 DL-(1) 의 글루포시네이트-암모늄의 탈라세미화에 의해 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염을 수득하는 방법으로서, 출발 단계에서 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 으로의 산화적 탈아미노화가 D-아미노산 옥시다아제 (DAAO) 효소로 실행되고, 후속 단계에서 PPO 가 에틸아민, N-프로필아민, 이소프로필아민, N-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 아민 공여체로부터의 아민 기를 사용하여 트랜스아미나아제 (TA) 효소에 의해 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로 아미노화되고,
(식 L-(2) 에서 R1 및 R2 가 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택됨),
추가 후속 단계에서 Ca(OH)2 를 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염의 수용액에 첨가함으로써 이를 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트 칼슘 염으로 반응시키고, 방출된 저비등 C1-C6-알킬아민이 증류에 의해 제거되고:
추가 후속 단계에서 (NH4)2SO4 를 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트의 칼슘 염의 잔여 수용액에 첨가함으로써 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트 칼슘 염의 칼슘 이온이 암모늄 술페이트의 암모늄 이온에 의해 대체되고, 침전된 칼슘 술페이트 (석고) 가 여과에 의해 제거되고:
최종 단계에서 맑은 여과물로부터 물을 제거하여 원하는 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염이 수득되는, 방법.
모든 방법 단계가 단일 용기 내에서 원-포트-공정으로서 연속적으로 수행되는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법.
개별 방법 단계가 별개의 용기에서 멀티-포트-공정으로서 연속적으로 수행되는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법.
증류 단계가 70 초과 내지 130℃, 바람직하게는 75 내지 120℃, 특히 80 내지 110℃ 의 온도에서 수행되는 것인, 상기 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 증류는 바람직하게는 대기압 (정상압으로도 지칭) 하에 수행된다. 증류는 또한 감압 하에서, 바람직하게는 100 mbar 내지 대기압 미만, 보다 바람직하게는 100 mbar 내지 1000 mbar 미만, 특히 100 mbar 내지 900 mbar 에서 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 증류는 20 내지 110℃, 또는 30 내지 120℃ 의 온도에서 수행될 수 있다.
(NH4)2SO4 가 첨가되는 경우, 단계가 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 알코올, 및 특히 메탄올의 첨가를 추가로 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 알코올은 바람직하게는 25 내지 75℃, 보다 바람직하게는 30 내지 70℃, 보다 더 바람직하게는 35 내지 65℃, 특히 40 내지 60℃ 의 온도에서 첨가된다.
(NH4)2SO4 첨가가 여과 단계 없이 증류 단계 후에 수행되는 것인, 상기 기재된 바와 같은 방법.
유기 모이어티 R 이 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지방족, (헤테로)시클릭 또는 개방형 직쇄/분지쇄, 포화 또는 불포화 모이어티이고, 임의로는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는, 식 (6) 의 유기 카르복실산 RCOONH4 의 암모늄 염을 수득하는 방법으로서,
하기를 특징으로 하는 방법:
(A)
제 1 단계에서, Ca(OH)2 를 첨가하고, 이후 대체된 C1-C6-알킬아민을 증류에 의해 제거함으로써 식 (5) 의 카르복실산의 중간체 칼슘 염이 식 (4) 의 카르복실산의 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 생성되고, 식 (4) 에서 R1 및 R2 가 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되고;
(B)
제 2 단계에서, 식 (6) 의 카르복실산 RCOONH4 의 암모늄 염이, 암모늄 술페이트를 첨가하여 식 (5) 의 카르복실산 칼슘 염의 칼슘 이온을 대체한 후 침전된 석고 CaSO4 를 여과에 의해 제거함으로써 수득된다:
식 (5) 의 카르복실산의 중간체 칼슘 염이 식 (4) 의 카르복실산의 2차 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 생성되며, 식 (4) 에서 R1 및 R2 가 서로 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되는 것인, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법.
단계 (A) 에서 증류가 70 초과 내지 130℃, 바람직하게는 75 내지 120℃, 특히 80 내지 110℃ 의 온도에서 수행되는 것인, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 증류는 바람직하게는 대기압 (정상압으로도 지칭) 하에 수행된다. 증류는 또한 감압 하에서, 바람직하게는 100 mbar 내지 대기압 미만, 보다 바람직하게는 100 mbar 내지 1000 mbar 미만, 특히 100 mbar 내지 900 mbar 에서 수행될 수 있다. 이와 관련하여, 증류는 20 내지 110℃, 또는 30 내지 120℃ 의 온도에서 수행될 수 있다.
단계 (B) 가 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 알코올, 및 특히 메탄올의 첨가를 추가로 포함하는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법. 이와 관련하여, 알코올은 바람직하게는 25 내지 75℃, 보다 바람직하게는 30 내지 70℃, 보다 더 바람직하게는 35 내지 65℃, 특히 40 내지 60℃ 의 온도에서 첨가된다.
단계 (B) 가 여과 단계 없이 단계 (A) 에 후속하여 수행되는 것인, 상기 본원에 기재된 바와 같은 방법.
제조 방법
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 L-글루포시네이트의 제조 방법은 여러 단계 공정을 포함하며, 공정은 제 1 단계에서 L-글루포시네이트 염 중의 더 약한 (C1-C6)-알킬암모늄 이온을 칼슘에 의해 대체하기 위해 Ca(OH)2 와 같은 강염기를 포함하는 칼슘을 사용하고, 이후 저비점을 갖는 방출된 (C1-C6)-알킬아민을 증류에 의해 제거하는 것을 특징으로 한다. 그런 다음, 제 2 단계에서, 이소-프로필아민이 제거된 L-글루포시네이트의 칼슘 염 L-(3) 의 잔여 수용액에 암모늄 술페이트를 첨가한다.
수용액 중 해리된 암모늄 술페이트, 및 술페이트 이온은 침전되는, 흔히 석고로 알려진 수불용성 칼슘 술페이트 (CaSO4) 를 형성하고, 원하는 암모늄 염 L-(1) 은 거의 정량적인 수율로 수득된다:
모식도 2:
침전된 석고 (또는 플라스터) 는 여과에 의해 용액으로부터 용이하게 제거될 수 있고, 암모늄 염 L-(1) 을 함유하는 잔여 수용액으로부터, 용매를 제거함으로써 순수한 염을 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 모식도 2a 에서 예시된 바와 같이, 바람직한 아민 공여체는 이소프로필아민이고, 이는 31.4℃ 의 비점을 가지며 따라서 수용액으로부터 용이하게 제거될 수 있다.
모식도 2a:
이러한 새롭고 창의적인 공정 단계는 D,L 글루포시네이트의 탈라세미화 공정에 포함되며, 이는 D-글루포시네이트의 PPO 로의 상기 언급된 산화적 탈아미노화로 시작된다. 후속 아미노기전이 반응 단계 후 L-글루포시네이트가 PPO 로부터 직접 수득될 수 있지만, 상당한 양의 부산물, 즉 식 L-(2a) 의 L-글루포시네이트 이소프로필암모늄이 또한 수득되며, 이는 이어서 본원에 상기 요약된 바와 같이 본 발명에 따라 추가로 가공될 것이다.
상기 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법이 L-글루포시네이트의 제조에 사용되고 적용되지만, 전환은 보편적으로 적용가능하고, 구체적으로 글루포시네이트 또는 인 화합물에 제한되지 않지만, - 하기 모식도 X 에 나타낸 바와 같이 - 또한 식 (6) 의 카르복실산의 임의의 암모늄 염을 수득하는데 용이하게 적용될 수 있으며, 여기서 R 은 유기 (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지방족, (헤테로)시클릭 또는 개방형 직쇄/분지쇄, 임의로는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 임의의 포화 또는 불포화 모이어티이다. 여기서, 마찬가지로, Ca(OH)2 를 첨가한 후 증류에 의해 대체된 C1-C6-알킬아민을 제거함으로써 중간체 Ca 염 (5) 가 식 (4) 의 카르복실산의 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 제조되며, 여기서 식 (4) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되고; 제 2 단계에서, 카르복실산의 원하는 (미치환된) 암모늄 염 (6) 은 또한 먼저 암모늄 술페이트를 첨가한 후, 여과에 의해 침전된 석고를 제거하여 수득될 수 있다:
모식도 X:
모식도 X 에서 R 은 임의의 유기 모이어티일 수 있고, 식 (4) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택된다.
개별적인 예시 및 표시 목적을 위해, 하기 본원의 제조예는 모식도 Xa 에서 제공되고, 여기서 염은 2-페닐프로판산의 이소프로필암모늄 염 (7) 인데, 이것은 음이온이 비-인 카르복실레이트임을 의미하며, 이는 Ca(OH)2 의 첨가 및 이소프로필아민의 제거 후 중간체 Ca 염 (8) 을 형성하고, 암모늄 술페이트의 첨가 및 석고의 침전 후 2-페닐프로피온산의 암모늄 염 (9) 으로 전환된다.
모식도 Xa:
공정은 "원-포트" 또는 다수의 용기, 즉 별개의 변환으로 수행될 수 있다.
반응이 단일 용기 또는 통에서 일어나는 경우, TA 효소는 DAAO 효소와 함께 첨가되거나, 나중에, 예를 들어 DAAO 효소가 산화적 탈아미노화의 일부 또는 실질적으로 전부를 촉매화하도록 허용된 후에 첨가될 수 있다.
효소는 다수의 방법에 의해 반응에 첨가될 수 있다.
하나의 접근방식은 대장균 (E. coli), S. 세레비지에 (S. cerevisiae), P. 파스토리스 (P. pastoris) 등과 같은 미생물(들) 에서 효소(들) 를 발현시키고, 전체 세포를 전체 세포 생촉매로서 반응에 첨가하는 것이다. 다른 접근방식은 효소(들) 를 발현시키고, 미생물을 용해시키며, 세포 용해물을 첨가하는 것이다. 또 다른 접근방식은 용해물로부터 효소(들) 를 정제하거나 부분적으로 정제하고, 반응에 순수한 또는 부분적으로 순수한 효소(들) 를 첨가하는 것이다. 상기 접근방식과 조합될 수 있는 추가의 접근방식은 효소(들) 를 지지체에 고정시키는 것이다 (예시적인 전략은 Datta et al. (2013) 3 Biotech. Feb; 3(1): 1-9 에 요약되어 있음). 반응에 여러 효소가 필요한 경우, 효소는 단일 미생물 내의 모든 효소를 발현하는 것을 포함하여 하나 또는 여러 미생물에서 발현될 수 있다.
반응에 여러 효소가 필요한 경우, 효소는 단일 미생물 내의 모든 효소를 발현하는 것을 포함하여 하나 또는 여러 미생물에서 발현될 수 있다.
상기 접근방식과 조합될 수 있는 추가의 접근방식은 효소(들) 를 지지체에 고정시키는 것이다 (예시적인 전략은 Datta et al. (2013) 3 Biotech. Feb; 3(1): 1-9 에 요약되어 있음). Datta et al., 에서 요약된 바와 같이, 그리고 제한하려는 의도 없이, 단독으로 또는 조합으로, 효소는 예를 들어, 효소(들) 자체의 응집체를 포함하는 천연 또는 합성 중합체 또는 무기 지지체에 흡착되거나, 이에 공유적으로 또는 비공유적으로 부착되거나, 그 내에 포획될 수 있다. 일단 고정화되면, 효소(들) 및 지지체는 벌크 용액에 분산되거나 층 (bed), 컬럼, 또는 효소와 반응 용액을 상호작용시키기 위한 임의의 수의 유사한 접근방식에 패킹될 수 있다. 폭기 (aeration) 는 여기서 구상된 DAAO 반응에 중요하므로, 버블 컬럼 (bubble column) 또는 이와 유사한 것이 효소 고정화에 사용될 수 있다. 예로서, 반응 혼합물은 고정된 효소의 컬럼을 통해 흐르고 (유동 반응), 고정층 또는 고정된 효소의 컬럼에 첨가되고, 반응하도록 허용되고, 반응 용기의 바닥 또는 상부로부터 제거되거나 (플러그 유동), 분산된 고정된 효소에 첨가되고 반응하도록 허용된 후 고정된 효소가 여과, 원심분리 또는 유사한 것에 의해 제거 (배치) 될 수 있다. 따라서, 효소의 고정화를 위한 임의의 방법이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
DAAO, TA 및/또는 다른 반응이 완충제에서 발생할 수 있다.
생체내 변화 반응에서 흔히 사용되는 예시적인 완충제는 트리스, 포스페이트, 또는 임의의 Good 완충제, 예컨대 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 (MES); N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산 (ADA); 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES); N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES); β-히드록시-4-모르폴린프로판술폰산 (MOPSO); 콜라민 클로라이드; 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS); N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES); 2-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산 (TES); 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES); 3-(비스(2-히드록시에틸)아미노)-2-히드록시프로판-1-술폰산 (DIPSO); 아세트아미도글리신, 3-(N-트리스(히드록시메틸)메틸아미노(-2-히드록시프로판술폰산 (TAPSO); 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO); 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-(2-히드록시프로판술폰산) (HEPPSO); 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 (HEPPS); 트리신; 글리신아미드; 비신 (bicine); 또는 3-[[1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일]아미노]프로판-1-술폰산 (TAPS) 을 포함한다. 추가적인 예시적 완충제 레시피는 Whittall, J. and Sutton, P. W. (eds) (2012) Front Matter, in Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations 2, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK 에서 발견될 수 있다. 암모늄은 또한 완충제로서 작용할 수 있다.
DAAO, TA 및/또는 다른 반응은 (라세미 글루포시네이트 암모늄의 첨가로 인해 존재하는 암모늄 제외) 완충제가 첨가되지 않거나 낮은 수준 (1 mM 미만) 의 완충제가 첨가되어 발생할 수 있다. 특히, 고정화된 DAAO 및 TA 는 라세미 글루포시네이트 암모늄의 첨가로 인해 존재하는 암모늄을 제외하고는 다른 첨가제 없이, 그리고 1 mM 미만의 포스페이트 완충제의 존재 하에 안정하고 활성일 수 있다.
일부 구현예에서, 반응은 정의된 pH 범위 내에서 일어나며, 이는 pH 4 와 pH 10 사이 (예를 들어, pH 6 과 pH 9 사이, 예컨대 대략 pH 7.5 내지 pH 8) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 반응은 정의된 온도에서 발생한다. 온도는 실온과 용매의 비점 사이의 지점, 가장 전형적으로 실온과 50℃ 사이에서 유지될 수 있다.
나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 실질적으로 순수한 L-글루포시네이트 (L-글루포시네이트와 D-글루포시네이트의 라세미 혼합물보다는) 의 조성물을 제공한다. 실질적으로 순수한 L-글루포시네이트는, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과의 D-글루포시네이트가 L-글루포시네이트로 전환되어, 조성물에 존재하는 D-글루포시네이트 및 L-글루포시네이트의 합과 비교하여 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 초과, 또는 약 99% 초과 L-글루포시네이트를 갖는 조성물을 초래한다는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 용어 "초과" 는 최대 100% 의 범위를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
임의로는, L-글루포시네이트는 생체내 변화 반응 혼합물로부터 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있다. 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 대안적 절차를 사용할 수 있다: a) -20℃ 과 용액의 비점 사이에서 가변적인 온도에서 에테르 또는 물과 같은 적합한 용매를 사용하는 생체내 변화 혼합물로부터의 결정화, b) 생체내 변화 혼합물의 진공 하 농축, 이후 이에 따라 제조된 농축물의, -20℃ 과 용액의 비점 사이에서 가변적인 온도에서 에테르 또는 물과 같은 적합한 용매를 사용하는 결정화, 또는 c) 생체내 변화 혼합물의 진공 하 농축, 이후 DCM, 메탄올 (MeOH), EtOAc, 암모니아 (NH3) 또는 이의 혼합물, 예컨대 DCM/MeOH 또는 EtOAC/MeOH/NH3 과 같은 용매 중 이동상으로서 이에 따라 제조된 농축물의 실리카 겔 또는 옥타데실 실란 리간드와 같은 고정상에 대한 분별 정제. 대안적으로, 생체내 변화 혼합물은 잡초의 예방 또는 방제를 위해 직접 (및/또는 다양한 아쥬반트의 첨가와 함께) 사용될 수 있다. 효소는, 지지되는 경우 단순 여과에 의해, 또는 용액 중 유리되는 경우 한외여과의 사용, 셀라이트 또는 탄소와 같은 흡수제의 사용에 의해, 또는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 통한 변성에 의해 제거될 수 있다. L-글루포시네이트는 아미노산을 보유하는데 효과적인 것으로 알려진 이온-교환 크로마토그래피 또는 다른 고체상에 의해, 또는 글루포시네이트의 수불용성 염을 형성하는 것으로 알려진 적합한 유기 또는 무기 상대이온 (counter-ion) 을 첨가함으로써 양이온성 또는 음이온성 염으로서 결정화에 의해 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 이러한 염은 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 제형에 적합한 글루포시네이트의 형태로 변형될 수 있다. 대안적으로, L-글루포시네이트는 저급 알코올, 케톤, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴과 같은 수혼화성 용매의 첨가에 의해 결정화를 통해 쯔비터 이온, 양이온성 또는 음이온성 염으로서 단리될 수 있다. 대안적으로, 글루포시네이트는 물의 제거 및 메탄올과 같은 유기 용매 중 용해, 탈염, 이어서 쯔비터이온으로서의 결정화 또는 전환 및 HCl 염 또는 암모늄 염과 같은 허용가능한 염 형태로서의 후속 결정화에 의해 단리될 수 있다. 대안적으로, L-글루포시네이트 외의 성분의 일부 또는 전부를 생체내 변화 혼합물로부터 제거하고, 혼합물을 임의로 농축한 다음, 혼합물을 잡초의 예방 또는 방제를 위해 직접 (및/또는 다양한 아쥬반트의 첨가와 함께) 사용할 수 있다. 대안적으로, 생체내 변화 혼합물은 잡초의 예방 또는 방제를 위해 직접 (및/또는 다양한 아쥬반트의 첨가와 함께) 사용될 수 있다. 임의로는, 미반응된 채로 남아 있는 아민 공여체와 같은 성분은 부분적으로 또는 완전히 단리되고 후속 반응에 사용될 수 있다. 임의로는, 미반응 PPO 는 부분적으로 또는 완전히 단리되고, 라세미 글루포시네이트로 화학적으로 전환되고, 후속 반응에 사용될 수 있다.
한 구현예에서, L-글루포시네이트는 생체내 변화 혼합물로부터 단리되지 않고, D-글루포시네이트, PPO 및 L-글루포시네이트를 포함하는 조성물이 수득된다. 이러한 조성물은 제초 조성물로서 직접 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이며, 용어는 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 의도되는 것으로 이해된다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되고 예시된 개별 구현예 각각은 본 발명의 범주 또는 취지를 벗어나지 않고 임의의 다른 여러 구현예의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 그와 조합될 수 있는 개별 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 열거된 방법은 열거된 이벤트의 순서로, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실행될 수 있다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 물질이 이제 기재된다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로 제공된다.
실시예
도면
카르복실산의 원하는 거울상이성질체의 암모늄 염을 수득하기 위한 본 발명에 따른 제조 공정의 유효성은 본원에 나타낸 바와 같은 하기 도면에서 입증된다:
도 1: L-이소프로필-암모늄 글루포시네이트 L-(2) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 2: L-암모늄 글루포시네이트 L-(1) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 3: 이소프로필-암모늄 2-페닐프로피오네이트 (7) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 4: 암모늄-2-페닐프로피오네이트 (9) 의 1H-NMR 스펙트럼:
카르복실산의 원하는 거울상이성질체의 암모늄 염을 수득하기 위한 본 발명에 따른 제조 공정의 유효성은 본원에 나타낸 바와 같은 하기 도면에서 입증된다:
도 1: L-이소프로필-암모늄 글루포시네이트 L-(2) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 2: L-암모늄 글루포시네이트 L-(1) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 3: 이소프로필-암모늄 2-페닐프로피오네이트 (7) 의 1H-NMR 스펙트럼:
도 4: 암모늄-2-페닐프로피오네이트 (9) 의 1H-NMR 스펙트럼:
실시예 1
L-이소프로필암모늄 글루포시네이트 L-(2) 의 L-암모늄 글루포시네이트 L-(1) 로의 전환:
5.5 g (30 mmol) L-포스포노트리신 L-(10) (Zeiss, H.-J.; J. Org. Chem. 1991, 56, 1783) 을 실온에서 80 ml 의 물 및 1.9 g (33 mmol) 이소프로필아민 중에 용해하였다. 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 맑은 용액의 0.5 ml 샘플을 진공 하 농축하고, H-NMR 분석을 수행하였다. 수득한 고체 잔류물의 1H-NMR 스펙트럼 분석으로, 이소프로필암모늄 염 L-(2) 이 수득되었음을 확인하였다 (도 1 참조).
남은 용액에 75 ml 의 물 및 1.48 g (20 mmol) 의 칼슘 히드록시드를 첨가하였다. 칼슘 염 L-(3) 의 약간 탁한 용액을 수득하였다. 정상압 하에, 증류에 의해 용액으로부터 100 ml 물을 제거하였다. 시작시, 비점은 88-95℃ 였고, 이후, 증류가 끝날 때까지 100℃ 에서였다. 1 N- H2SO4 로 증류물의 적정에 의해 1.85 g (98% 에 상응함) 의 초기 수득한 이소프로필아민이 제거되었음이 나타날 수 있다.
Ca 염 L-(3) 의 잔여 용액을 50℃ 로 냉각시키고, 50 ml 의 메탄올로 추가 희석하였다. 2.64 g (20 mmol) (NH4)2SO4 를 용액에 첨가하여, 이를 밤새 실온에서 교반하고, 다음날, 침전된 백색 고체 석고를 여과에 의해 제거하였다. 수득한 맑은 여과물을 농축하여 건조시키고, 백색 고체 잔류물 (1H-NMR, 도 2 참조) 이 녹는점 m.p.: 205℃ (분해) 인 6.2 g (96%) 암모늄 염 L-(1) (모노히드레이트) 로 산출되었다. 좌선성 화합물로서 그의 거울상이성질체 순도는 그의 광학 회전 ((-) 방향) 뿐만 아니라 HPLC 분석을 통해 입증되었다.
실시예 2
L-이소프로필암모늄 2-페닐프로피오네이트 (7) 의 암모늄 2-페닐프로피오네이트 (9) 로의 전환:
4.5 g (30 mmol) 2-페닐프로피온산 및 1.9 g (33 mmol) 이소프로필아민을 실온에서 80 ml 의 물 중에 용해하고, 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 수득한 맑은 용액의 0.5 ml 샘플을 취하고, 진공 하 농축하고, H-NMR 분석을 수행하였다. 고체 잔류물의 1H-NMR 스펙트럼 분석으로, 이소프로필암모늄 염 (7) 이 수득되었음을 확인하였다 (도 3 참조).
용액을 75 mL 의 물로 희석하고, 1.20 g (16 mmol) 의 칼슘 히드록시드를 첨가하였다. 칼슘 염 (8) 의 이러한 현탁액으로부터, 정상압에서 증류에 의해 60 ml 의 물을 제거하였다. 시작시, 비점은 88-95℃ 였고, 그런 다음, 증류가 끝날 때까지 100℃ 에서였다. 1 N H2SO4 로 증류물의 적정으로, 1.80 g (96%) 이소프로필아민이 물로 제거되었음이 나타났다.
Ca 염 (8) 의 잔여 현탁액을 50℃ 로 냉각시키고, 50 ml 메탄올로 희석하였다. 2.10 g (16 mmol) (NH4)2SO4 를 현탁액에 첨가한 다음, 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날 침전된 백색 고체 석고를 여과에 의해 제거하였다. 수득한 맑은 여과물을 50 ml 의 메틸-t-부틸 에테르로 세척하고, 수성상을 추가로 농축하였다. 수득한 무색 결정질 잔류물은 4.2 g (84%) 의 예상된 암모늄 염 (9) 인 것으로 나타났으며, 이는 1H-NMR 에 의해 확인되었다 (도 4 참조).
Claims (15)
- 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염을 수득하는 방법으로서,
(식 L-(2) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택됨);
하기 단계를 특징으로 하는 방법:
단계 1: Ca(OH)2 를 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 L-(2) 의 수용액에 첨가함으로써 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염 (L-2) 를 L-글루포시네이트 칼슘 염 L-(3) 에 반응시키고, 이로써 방출된 저비등 C1-C6-알킬아민을 증류에 의해 제거하는 단계;
단계 2: (NH4)2SO4 를 L-글루포시네이트의 칼슘 염 L-(3) 의 잔여 수용액에 첨가함으로써 L-글루포시네이트 L-(3) 칼슘의 칼슘 이온을 암모늄 술페이트의 암모늄 이온에 의해 대체하고, 침전된 칼슘 술페이트 (석고) 를 여과에 의해 제거하는 단계.
단계 3: 맑은 여과물로부터 물을 제거하여 원하는 암모늄 염 L-(1) 을 단리하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트-알킬암모늄 염이 2-단계 공정으로 식 DL-(1) 의 글루포시네이트-암모늄의 탈라세미화에 의해 수득되는 방법으로서,
제 1 단계에서 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화가 D-아미노산 옥시다아제 (DAAO) 효소로 실행되고,
제 2 단계에서 PPO 가 하나 이상의 아민 공여체로부터 아민 기를 사용하여 트랜스아미나아제 (TA) 효소에 의해 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로 아미노화되는 것인 방법. - 제 2 항에 있어서, 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염이 아민 공여체의 존재 하에 트랜스아미나아제 (TA) 효소와의 반응에 의해 제 2 단계에서 수득되며, 아민 공여체가 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 지방족 2차 C1-C6-알킬아민인 방법.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 아민 공여체가 이소프로필아민 또는 sec-부틸아민에서 선택되는 2차 지방족 C1-C6-알킬아민이고, 바람직하게는 이소프로필아민인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염에서 C1-C6-알킬암모늄 이온이 제 3 항에서 정의된 바와 같은 지방족 C1-C6-알킬아민의 암모늄 염이고, 바람직하게는 이소프로필아민 암모늄 또는 sec-부틸아민 암모늄이고, 특히 이소프로필아민 암모늄인 방법.
- 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DAAO 효소가 로도스포리디움 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides) (UniProt P80324), 트리고노프시스 바리아빌리스 (Trigonopsis variabilis) (UniProt Q99042), 네오렌티누스 레피데우스 (Neolentinus lepideus) (KZT28066.1), 트리코더마 레에세이 (Trichoderma reesei) (XP_006968548.1) 또는 트리초스포론 올레아지노수스 (Trichosporon oleaginosus) (KLT40252.1) 로부터의 효소에서 선택되는 것인 방법.
- 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, DAAO 효소가 돌연변이체 DAAO 인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 돌연변이체 DAAO 가 로도스포리디움 토룰로이데스 (Rhodosporidium toruloides) 로부터의 서열을 기반으로 하는 돌연변이체 DAAO 인 방법.
- 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TA 효소가 ω-트랜스아미나아제이고, 바람직하게는 아르트로박터 종 (Arthrobacter sp.), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 크렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) JS2F (S), 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) JS64 (S), V. 플루비알리스 (V. fluvialis) JS17 (S), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) KNK425 (S), 알칼리제네스 데니트리피칸스 (Alcaligenes denitrificans) Y2k-2 (S), 메소리조비움 종 (Mesorhizobium sp.) LUK (S), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) SC6394 (S), 모락셀라 라쿠나타 (Moraxella lacunata) WZ34 (S), 자니박터 테라에 (Janibacter terrae) DSM13953 (S), 슈도모나스 시코리이 (Pseudomonas cichorii) DSM 50259 (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) ATCC49838 (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) KNK08-18 (S), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) ACC (S), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) NBRC14164 (S), 바실러스 할로톨레란스 (Bacillus halotolerans) (S), 바실러스 서브틸리스 아종 스테르코리스 (Bacillus subtilis subsp. stercoris) (S), 바실러스 서브틸리스 아종 이나쿠오소룸 (Bacillus subtilis subsp. inaquosorum) (S), 바실러스 엔도피티쿠스 (Bacillus endophyticus) (S), 리조비움 라디오박터 (Rhizobium radiobacter) (S), 크로모박테리움 비오라세움 (Chromobacterium violaceum) DSM30191 (S), 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) (S) Ingram et al. (2007), 아르트로박터 시트레우스 (Arthrobacter citreus) (S), 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crescentus) (S), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) (S), 파라코쿠스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans) (S), 폴라로모나스 종 (Polaromonas sp.) JS666 (S), 오크로박트룸 안트로피 (Ochrobactrum anthropi) (S), 아시네토박터 바우마니이 (Acinetobacter baumannii) (S), 아세토박터 파스튜리아누스 (Acetobacter pasteurianus) (S), 버크홀데리아 비에트나멘시스 (Burkholderia vietnamensis) (S), 할로모나스 엘론가타 (Halomonas elongata) (S), 버크홀데리아 그라미니스 (Burkholderia graminis) (S), 테르모마이크로비움 로세움 (Thermomicrobium roseum) (S), 스파에로박터 테르모필루스 (Sphaerobacter thermophilus) (S), 지오바실러스 테르모데니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) (S), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) (S), 바실러스 미오코이데스 (Bacillus mycoides) (S), 할로모나스 종 (Halomonas sp.) CSM-2 (S), 로도스피릴라세아에 박테리움 (Rhodospirillaceae bacterium) (S), 라브렌지아 종 (Labrenzia sp.) LAB (S), 아피피아 종 (Afipia sp.) P52-10 (S), 오세아니바쿨룸 인디쿰 (Oceanibaculum indicum) (S), 일루마토박터 코키네우스 (Ilumatobacter coccineus) (S), 바리오보락스 종 (Variovorax sp.) KK3 (S), 파라버크홀데리아 카리벤시스 (Paraburkholderia caribensis) (S), 히드로게노파가 팔레로니이 (Hydrogenophaga palleronii) (S), 솔리루브로박터 솔리 (Solirubrobacter soli) (S), 키네오스포리아 종 (Kineosporia sp.) R_H_3 (S), 로세오모나스 데저티 (Roseomonas deserti) (S), 시노리조비움 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti) (S), 보세아 루피네 (Bosea lupine) (S), 보세아 바빌로비아에 (Bosea vaviloviae) (S), 슈드아시도보락스 인터메디우스 (Pseudacidovorax intermedius) (S), 버크홀데리아 종 (Burkholderia sp.) UYPR1.413 (S), 대장균 (Escherichia coli) K12 (S), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) (S), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) (S), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis) (S), 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi) (S), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) KD131 (S), 루에게리아 종 (Ruegeria sp.) TM1040 (S), 메조리조비움 로티 (Mesorhizobium loti) MAFF30399 (S) 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) (S) 에서 선택되는 S-선택적 ω-트랜스아미나아제 효소인 방법.
- 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, TA 효소가 돌연변이체 ω-트랜스아미나아제이고, 바람직하게는 TA 가 아르트로박터 종 (Arthrobacter sp.) 또는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터의 서열을 기반으로 하는 돌연변이체 ω-트랜스아미나아제인 방법.
- 식 DL-(1) 의 글루포시네이트-암모늄의 탈라세미화에 의해 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염을 수득하는 방법으로서,
출발 단계에서 D-글루포시네이트의 PPO (2-옥소-4-(히드록시(메틸)포스피노일)부티르산) 로의 산화적 탈아미노화가 D-아미노산 옥시다아제 (DAAO) 효소로 실행되고,
후속 단계에서 PPO 가 에틸아민, n-프로필아민, 이소프로필아민, n-부틸아민, sec-부틸아민, 아밀아민, sec-펜틸아민, n-헥실아민 및 sec-헥실아민으로 이루어지는 군에서 선택되는 아민 공여체로부터의 아민 기를 사용하여 트랜스아미나아제 (TA) 효소에 의해 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염으로 아미노화되고,
(식 L-(2) 에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택됨),
추가 후속 단계에서 Ca(OH)2 를 식 L-(2) 의 L-글루포시네이트 C1-C6-알킬암모늄 염의 수용액에 첨가함으로써 이를 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트 칼슘 염으로 반응시키고, 방출된 저비등 C1-C6-알킬아민이 증류에 의해 제거되고:
추가 후속 단계에서 (NH4)2SO4 를 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트의 칼슘 염의 잔여 수용액에 첨가함으로써 식 L-(3) 의 L-글루포시네이트 칼슘 염의 칼슘 이온이 암모늄 술페이트의 암모늄 이온에 의해 대체되고, 침전된 칼슘 술페이트 (석고) 가 여과에 의해 제거되고:
최종 단계에서 맑은 여과물로부터 물을 제거하여 원하는 식 L-(1) 의 L-글루포시네이트 암모늄 염이 수득되는 것인 방법. - 제 11 항에 있어서, 모든 방법 단계가 단일 용기에서 원-포트-공정 (one-pot-process) 으로서 연속적으로 수행되는 것인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 개별 방법 단계가 별개의 용기에서 멀티-포트-공정 (multi-pot-process) 으로서 연속적으로 수행되는 것인 방법.
- (헤테로)방향족 또는 (헤테로)지방족, (헤테로)시클릭 또는 개방형 직쇄/분지쇄, 포화 또는 불포화 모이어티인 유기 모이어티 R 을 갖고, 임의로는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는, 식 (6) 의 유기 카르복실산 RCOONH4 의 암모늄 염을 수득하는 방법으로서,
하기를 특징으로 하는 방법:
(A) 제 1 단계에서, Ca(OH)2 를 첨가하고, 이후 대체된 C1-C6-알킬아민을 증류에 의해 제거함으로써 식 (5) 의 카르복실산의 중간체 칼슘 염이 식 (4) 의 카르복실산의 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 생성되고, 식 (4) 에서 R1 및 R2 가 서로 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되고;
(B) 제 2 단계에서, 식 (6) 의 카르복실산 RCOONH4 의 암모늄 염이, 암모늄 술페이트를 첨가하여 식 (5) 의 카르복실산 칼슘 염의 칼슘 이온을 대체한 후 침전된 석고 CaSO4 를 여과에 의해 제거함으로써 수득됨:
- 제 14 항에 있어서, 식 (5) 의 카르복실산의 중간체 칼슘 염이 식 (4) 의 카르복실산의 2차 C1-C6-알킬암모늄 염으로부터 생성되며, 식 (4) 에서 R1 및 R2 가 서로 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 또는 펜틸에서 선택되는 것인 방법.
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