CN117625571A - 一种改进的酮还原酶及其在依折麦布制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明改进的酮还原酶，属于生物催化合成技术领域。本发明所述酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第253位V突变为F，或第304位R突变为I或同时突变。本发明提供了一种酮还原酶及其应用，提高了酶在有机溶剂中的耐受性，有效降低(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基]‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮和依折麦布工业化生产成本，提高产品质量。
Description
技术领域
本发明属于生物催化合成技术领域，具体而言，涉及一种改进的酮还原酶及其在制备依折麦布手性中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的方法及应用。
背景技术
依折麦布（Ezetimibe），化学名为：（3R,4S）-1-（4-氟苯基）-3-[(3S)-3-(4-氟苯基)-3-羟丙基]-4-(4-羟苯基)-2-氮杂环丁酮，是由先灵葆雅公司和默克共同开发并于2002年上市的第一个胆固醇选择性吸收抑制剂药物，商品名为ezetrol（益适纯）。本品作为饮食控制以外的辅助治疗，可单独或与HMG-CoA还原酶抑制（他汀类）联合应用于治疗原发性（杂合子家族性或非家族性）高胆固醇血症，可降低总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和载脂蛋白B(Apo B)。
化合物2（(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷（又称恶唑烷）-2-酮，CAS: 189028-95-3）是依折麦布原料药合成中的关键手性中间体。使用化学法（图1）合成化合物2在酮还原成手性羟基步骤涉及不对称还原，所用催化剂、配体价格较贵，成本较高。目前已报道的制备工艺中最具优势的是利用酮还原酶（KRED）（图2）催化化合物1（(4S)-3-[5-(4-氟苯基)-1,5-二氧代戊基]-4-苯基-2-恶唑烷酮，CAS:189028-93-1）制备，可以达到较高的光学纯度和转化率，化合物2的成本可大幅度降低。
Amit Singh等发现了菌株Burkholderia cenocepacia能催化化合物1生成化合物2，通过对条件进行优化，底物投料浓度为0.71g/L时，产物生成率为54%，e.e.>99％。柳志强等(CN 104630243 B)发现了一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126羰基还原酶，将此酶基因在大肠杆菌中异源表达，获得重组菌株。重组细胞作为生物催化剂，以化合物1为底物制备化合物2，7.1g/L底物投料浓度下，产物de>99％，12小时底物转化率为26 .4％。柳志强等(CN 105039361 A)还发现了一种来源于圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides) ZJB14212 的羰基还原酶，将此酶基因在大肠杆菌中异源表达，获得重组菌株。同样使用重组细胞作为生物催化剂，以化合物1为底物制备化合物2，底物浓度为35g/L时，底物转化率为91%，e.e.>99%。Codexis 公司(CN 102186972 B)利用蛋白质工程技术将Lactobacillus kefir中的羰基还原酶进行了多轮改造，将每轮的有益突变结合起来最终得到一个比较理想的羰基还原酶突变体，其活性和选择性与野生型相比均得到了大幅度的提高，成功地将该反应体系放大，在底物浓度为100g/L 时，产率接近99％，d.e.>99％。与已报道的其它催化该底物的野生型羰基还原酶相比，底物浓度得到了提高，并保持较高的非对映选择性。
Amit Singh，柳志强等通过对天然羰基还原酶或菌株的挖掘，获得了具有催化化合物1合成化合物2的酶或菌株，虽然转化率和产物纯度较高，但底物投料量较低，不利于放大生产。国外酶制剂Codexis公司利用蛋白质工程技术将L.kefir中的羰基还原酶进行了多轮改造，最终得到活性和选择性与野生型相比均大幅度提高的突变体，但仍存在起始物料转化不完全，影响产品质量的问题。
化合物1和化合物2较差的水溶性限制了底物与生物酶的有效接触，这一问题成为限制催化反应效率的关键瓶颈。目前为止，添加有机溶剂是化合物2生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的添加，尤其是高剂量的有机溶剂会对酶产生毒害作用，进而影响生物催化效率，有机溶剂的用量受到严格控制，这一方面限制了转化体系中底物的投料量，影响产率；另一方面由于产物的大量析出，把残余底物包结，使底物不完全转化，影响产品质量。为了突破这一瓶颈，迫切的需要获得高有机溶剂耐受性的酮还原酶，实现依折麦布关键中间体（化合物2）工业化生产。因此继续筛选不同生物来源的酮还原酶或使用体外人工进化技术和高通量筛选技术定向进化获得更加高效的酮还原酶是实现依折麦布关键中间体工业化生产的努力方向。
本发明是基于本公司申请号为201810751489.4，名为一种改进的酮还原酶及其应用的专利发明的发明。原专利采用异丙醇和甲酸铵-甲酸脱氢酶系统给辅酶NAD+提供H-，进一步提高原料浓度，即使增加酶催化反应时间或增加酶量，仍会有较多原料剩余。甲苯相较于异丙醇对原料有更高的溶解性，开发更加耐受甲苯的酮还原酶突变体将会进一步提高原料浓度，从而提高了生产效率。
发明内容
发明目的：本发明针对现有技术中酶法制备依折麦布手性中间体的不足，提供了一种催化活性高、对映选择性高、有机溶剂及底物耐受性高的酮还原酶突变体，以及在制备依折麦布手性中间体中的应用。
本发明一方面提供了一种改进的酮还原酶，即酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体的有机溶剂及底物耐受性均高于目前报道的酮还原酶。
本发明的技术方案是，一种酮还原酶突变体，其特征是，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第253位V突变为F，第304位R突变为I。
本发明所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3和EQID NO: 4所示的氨基酸序列。
根据本发明的一方面，提供了一种基因，该基因编码上述任一种酮还原酶突变体，基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO: 8。
根据本发明的另一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒上含有上述任一种基因的核苷酸序列，进一步地，质粒为pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET-28c(+)、pET-5b(+)、pET-15b、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-25b(+)、pET-27b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30 Xa/LIC、pET-30 EK/LIC、pET-31b(+)、pET-32b(+)、pET-32c(+)、pET-32 EK/LIC、pET-32 Xa/LIC、pET-33b(+)、pET-37b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)、pET-43.1a(+)、pET-43.1b(+)、pET-43.1c(+)、pET-43.1 EK/LIC、pET-44a(+)、pET-44b(+)、pET-44c(+)、pET-44 EK/LIC、pET-45b(+)、pET-46 EK/LIC、pET-47b(+)、pET-48b(+)、pET-49b(+)、pET-51b(+)、pET-52b(+)、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pBV220、pBV221、pCold-GST、pCold IV、pCold-GST或pTrcHis C。
根据本发明的再一方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞内含有上述任一种重组质粒，且所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞，原核细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
根据本发明的又一方面，提供了一种生产(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的方法，包括酮还原酶对5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮进行催化加氢以形成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的反应步骤，酮还原酶为上述任一种酮还原酶突变体。
有益效果：应用本发明的技术方案，通过在SEQ ID NO: 1所示的酮还原酶的基础上，采用随机突变及定点饱和突变的分子生物学方法对酮还原酶的基因进行突变，从而改变酶的氨基酸序列，实现酶结构和功能的改变，再通过高通量定向筛选的方法，得到具有上述位点中的至少之一发生突变的酮还原酶。使用该酮还原酶突变体催化前体酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，在150 g/L5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮，1g/L酮还原酶（酶粉），50%（V/V）甲苯体系反应24小时，底物转化率≥99.9%，产物e.e.值100.0%。本发明提供了一种有机溶剂耐受性、底物投料量更高的技术方案，可进一步降低(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮和依折麦布的工业生产成本及提高产品质量，具有良好的工业应用价值。
附图说明
图1化学法催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮的还原反应
图2酮还原酶催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1, 5-二酮的还原反应。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：获得201810751489.4专利中T. brockii菌株I140S突变的酮还原酶重组质粒
通过201810751489.4专利中SEQ ID NO: 9的酮还原酶编码基因序列，经密码子和酶切位点优化并委托服务商人工合成全长基因和两端的酶切位点，与pET28a(+)表达质粒分别进行酶切、切胶回收、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜。挑选数个单菌落至LB培养基（含50 mg/L 硫酸卡那霉素），37℃培养过夜后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，进行PCR和测序验证，获得重组质粒pET28a-I140S。
实施例2：对重组质粒pET28a-I140S酮还原酶基因进行随机突变与克隆
根据实施例1所述内容，以重组质粒pET28a-I140S为模板，并根据酮还原酶I140S编码基因用Primer 5.0设计并合成两端引物（表1），使用易错PCR技术（物料及浓度见表2，反应条件见表3）获得含有大量碱基突变的线性基因片段，将这些PCR产物和pET28a(+)表达质粒分别进行酶切、切胶回收、连接和转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50mg/L 硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜。
挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR 鉴定和双酶切鉴定后，将重组质粒命名为pET28a(+)-A-Z，并将含有重组质粒的大肠杆菌进行后续的诱导表达。
实施例3：酮还原酶突变体的诱导表达与酶活初筛
根据实施例2所述内容，挑取上述LB琼脂培养基上的单克隆菌落接种于96孔板（预装0.5mL含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基），于37℃、220 rpm震荡过夜培养。取以上培养液25μL，转接至48深孔板（预装2mL含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基），于37℃、220 rpm培养4小时，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.05mM），28℃，220 rpm诱导培养14小时，5000rpm离心20 min收集菌细胞，倒掉离心上清液获得含有酮还原酶的全细胞。
向全细胞深孔板内分别加入100μL含有1mg/mL NAD的三乙醇胺溶液、100μL 5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮溶液（10 mg/mL溶于异丙醇），将深孔板放于28℃，220 rpm中进行酶反应26小时。添加900μL乙酸乙酯,28℃，220 rpm震荡30min，使之充分接触混匀。3000rpm,离心30min。移取200μL有机相于96深孔板中，加入200μL2,4-二硝基苯肼溶液混匀后，置于55℃恒温水槽中反应15min，反应结束后取出深孔板置于冰水浴中冷却从而终止反应。检测OD495处吸光值。
将实施例3中酶活高于母本的突变体菌株以5%接种量接种于2 mL含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基，于37℃，220 rpm振荡培养4小时，取以上培养液100μL，转接至3mL含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃，220 rpm振荡培养2小时后，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.05 mM），28℃，220 rpm诱导培养14 小时，5000 rpm离心20 min收集菌细胞。全细胞内加入50μL含有1mg/mL NAD的三乙醇胺溶液、350μL 5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮溶液（10 mg/mL溶于异丙醇），将深孔板放于28℃，220 rpm中进行酶反应26小时。添加3mL乙酸乙酯，28℃，220 rpm震荡30min，使之充分接触混匀。3000rpm离心30min，取有机相进行HPLC分析。
选取催化活性优于I140S的突变体进行测序，分析突变位点，复测催化活性确定突变体V253F（SEQ ID NO: 2）、R304I（SEQ ID NO: 3）的催化活性及立体选择性均比本方案初始的I140S显著提高，复筛反应结果如表4所示。从表4可见，两种酮还原酶突变体对5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮的催化效率分别为I140S的1.29及1.23 倍，且产物有更高的e.e.值。
表4酮还原酶母本与突变体酶法制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮活性比较
注：表4中的*指转化1 g底物所需各酮还原酶突变体重组细胞的湿重。0.5 wt 指转化1.0 g底物需要0.5 g酮还原酶突变体重组湿细胞。
实施例5：双突变位点突变体酶的制备
目标质粒扩增：根据实施例4所述内容，以含I140S+R304I突变的酮还原酶编码基因（SEQ ID NO.7）的重组质粒为模板，并根据SEQ ID NO.7基因序列设计并合成突变位点处GTT换为TTT引物（表5），使用定点突变技术（物料及浓度见表6，反应条件见表7）获得含有TTT突变的线性基因片段。
扩增产物DpnI消化：根据表8所示对扩增产物进行DpnI消化，将反应体系置于37℃恒温1-2小时，胶回收纯化目标扩增产物。
重组反应：按照表9所示添加完物料后，置于37℃反应30min，待反应完成后，反应产物直接转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50 mg/L硫酸卡那霉素的LB琼脂平皿中，37℃培养过夜。
对突变体酶诱导表达并对转化效果进行验证，方法如实施例4所示。从表10可见，酮还原酶双位点突变体对5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1, 5-二酮的催化效率为酮还原酶母本的1.39倍，且产物有更高的e.e.值。
表10酮还原酶母本与突变体酶法制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮活性比较
注：表10中的*指转化1 g底物所需各酮还原酶突变体重组细胞的湿重。0.5 wt 指转化1 g主原料需要0.5 g酮还原酶突变体重组湿细胞。
实施例6：酮还原酶突变体酶粉制备
将V253F、R304I、V253F-R304I菌株分别以0.01%接种量接种于（500 mL/瓶*10瓶/突变体）含有50 mg/L 硫酸卡那霉素的LB培养基，于37℃，220 rpm振荡培养5~6 小时，加入一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度为0.05 mM），25℃，220 rpm诱导培养16 小时，7000 ×g离心收集菌体。所得25~30 g菌细胞使用100 mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）重悬菌细胞后用高压均质机破碎细胞，10℃，10000 ×g离心20 min获得上清液，使用真空冷冻干燥机-25℃将其冻干制成3~5 g酶粉，即酮还原酶突变体酶粉。
以含V253F-R304I突变体为例，向100 mL反应瓶中依次加入5.0 g原料5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮、10~40mL甲苯，搅拌至原料完全溶解，加入40~10 mL磷酸盐缓冲液（100mM，pH 7.0，含2 mM 硫酸镁），加入5 mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），4.0 g葡萄糖，10 mg葡萄糖脱氢酶和实例6中的100 mg酮还原酶突变体酶粉，体系pH使用饱和碳酸钠维持5.5~7.0，并于30±2℃保温24小时；加入30 mL乙酸乙酯和2 g硅藻土，体系抽滤，10 mL乙酸乙酯淋洗滤饼，合并滤液，静置分液，有机相经浓缩得到(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮粗品。反应转化率和产物e.e.值检测结果见表11。
表11不同甲苯浓度对酮还原酶突变体的影响
实施例8：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的酮还原酶突变体在(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮制备中的应用
向500mL反应瓶中加入30 g原料5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮，100 mL甲苯，搅拌至原料完全溶解，加入100 mL磷酸盐缓冲液（100mM，pH 7.0，含2 mM 硫酸镁）；加入20 mg氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），20g葡萄糖，0.1g葡萄糖脱氢酶和实例6中的0.2 g酮还原酶突变体酶粉，体系pH使用饱和碳酸钠维持5.5~7.0，并于30±2℃保温24小时；加入120mL乙酸乙酯和9g硅藻土，体系抽滤，60mL乙酸乙酯淋洗滤饼，合并滤液，静置分液，有机相经浓缩得到(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮粗品。反应转化率和产物e.e.值检测结果见表5。
表12酮还原酶突变体酶法制备(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮
表12结果表明，突变体（V253F-R304I突变体（SEQ ID NO: 4））在酶催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1, 3-氧氮杂环戊烷-2-酮中，即150 g/L底物，50%甲苯和1 g/L酶粉存在的反应体系中，反应24小时，转化率即可达到99.9%以上，产物e.e.值达到100.0%，筛选出的酮还原酶突变体在酶法制备 (4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1, 3-氧氮杂环戊烷-2-酮中均表现出了极高的立体选择性、有机溶剂耐受性及高效性。
Claims (10)
1.一种改进的酮还原酶突变体，其特征在于，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQID NO: 1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第253位V突变为F，第304位R突变为I中的一个或两个。
2.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4，突变体的编码基因为SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8。
3.一种含有权利要求1或2任一所述的酮还原酶突变体编码基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET-28c(+)、pET-5b(+)、pET-15b、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-25b(+)、pET-27b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30 Xa/LIC、pET-30 EK/LIC、pET-31b(+)、pET-32b(+)、pET-32c(+)、pET-32 EK/LIC、pET-32Xa/LIC、pET-33b(+)、pET-37b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)、pET-43.1a(+)、pET-43.1b(+)、pET-43.1c(+)、pET-43.1 EK/LIC、pET-44a(+)、pET-44b(+)、pET-44c(+)、pET-44 EK/LIC、pET-45b(+)、pET-46 EK/LIC、pET-47b(+)、pET-48b(+)、pET-49b(+)、pET-51b(+)、pET-52b(+)、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pBV220、pBV221、pCold-GST、pCold IV、pCold-GST或pTrcHis C。
5.一种含有权利要求4所述的重组质粒的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞，所述原核细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
7.一种将酮还原酶突变体在底物5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1, 3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基) 戊烷-1, 5-二酮还原为(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1, 3-氧氮杂环戊烷-2-酮中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于还原过程中加入底物，甲苯，磷酸盐缓冲液、辅酶，氢供体，和酮还原酶突变体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于辅酶为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、氢供体为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
10.根据权利要求7或8任一所述的应用，其特征在于还原反应体系pH维持5.5~7.0，甲苯体积占还原体系不超过50%。
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