CN1057859A - Dna及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了含有芽孢杆菌属微生物之磷酸核
糖焦磷酸合成酶结构基因的DNA、含有核糖体结合
位点的DNA以及含有能够在芽孢杆菌属微生物中
表达之启动子序列的DNA在内的重组DNA,这些
DNA序列均已被修饰,从而增强了磷酸核糖焦磷酸
合成酶基因的表达。本发明还公开了被该修饰的
DNA整合的载体、一种新的芽孢杆菌属微生物以及
利用该微生物生产核酸相关物质的方法。
Description
本发明涉及一发酵生产核酸相关物质如肌苷和/或乌苷的方法、用于生产这类物质的新的微生物以及用于衍生该新微生物的新重组DNA。
利用微生物发酵方法生产核酸有关物质被认为是比较有利的,并且已提出和实施了多种方法。
迄今对核酸发酵进行的各种研究发现,核酸或其相关物质是活细胞所必需的初级代谢产物并且通常是由微生物生物合成的,但同时其产量受到微妙的调节,以防止其过量产生。根据这一知识,认为使用对终产物生物合成途径的调节已被解除的突变体来过量生产核酸或其相关物质比较有利。
例如,已知肌苷和/或鸟苷(嘌呤核苷酸相关物质)的生产受嘌呤核苷酸生物合成途径之终产物的负反馈调节。所说的终产物如腺嘌呤相关物质(如腺苷或其磷酸化化合物,如5′-腺苷酸)或鸟嘌呤相关物质(如鸟嘌呤或其磷酸化化合物,如5′-鸟苷酸)。
因此,在嘌呤核苷相关物质的发酵生产过程中通常将培养基中腺嘌呤或其相关物质的量限制在低浓度,以避免腺嘌呤或其相关物质对嘌呤核苷酸相关物质的生物合成进行负调节,并进而使用缺乏腺嘌呤琥珀酸合成酶的腺嘌呤依赖性突变株(Y.Nakao,Microbial Technology,Vol.1,p311-354,deited byH.J.Pepper and D.Perlman,Academic press,NewYork)。而且也已知道使用除具有腺嘌呤依赖性特征外还对核酸类似物等各种药物具有抗性的属于芽孢杆菌属(美国专利3,960,661,日本专利公开号41915/1982,美国专利4,701,413,美国专利3,912,587和美国专利4,283,346)和短杆菌属(美国专利3,736,228和日本专利公开号17592/1983)的细菌来大量生产肌苷和/或鸟苷。
另外,还有人提出了另一种生产核酸相关物质的方法,它包括将与核酸生物合成有关的酶的克隆化基因插入一载体上并将其引入宿主通过所谓的基因扩增作用而过量生产核酸(日本专利公开号28470/1984和156388/1985)。
但是,用常规方法获得的涉及嘌呤核苷生物合成或降解的许多突变株并不令人满意,需要进一步进行改进,因为核酸相关物质是食业和和制药工业重要的原料。因此,需要有更加有利的生产方法。
在此情况下,本发明人对提高与核酸相关物质的生产有关的各种因素进行了深入的研究。结果发现,增强磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶)的活性具有重要意义,该酶与作为生物合成核酸相关物质生物合成中间产物的磷酸核糖焦磷酸(PRPP)的形成有关。即本发明人已成功地构建了一种新的重组DNA,在其结构中,编码PRPP合成酶的Prs基因位于据信能够高度表达该合成酶之启动子的下游。而且,本发明人已利用该重组DNA转化适当选择的芽孢杆菌属接受体微生物而成功地衍生出一新的微生物,其中PRPP合成酶基因可得以高度而且稳定地表达。
另外还发现,使用这一技术从选自芽孢杆菌属微生物接受体获得的新微生物能够不断地积累大量核酸相关物质。
基于以上发现完成了本发明。
即,本发明的目的之一是提供一种可用于大量表达PRPP合成酶的新重组DNA。
本发明的目的之二是提供被该新重组DNA转化的新微生物。
本发明的目的之三是提供一种使用该新微生物生产核酸相关物质的方法。
通过以下的叙述并参照附图,本领域熟练技术人员能够很明显地看出本发明的上述目的和其它目的及优点。
图1显示了含有按下文实施例1(ⅱ)制得的编码PRPP合成酶之基因(prs)的重组质粒PPRSI的限制性酶切图谱。其中实线部分代表含有prs的DNA片段,空心部分代表PUC19。
图2显示了得自下面实施例1(ⅲ)的缺失质粒PPRS1505的限制性酶切图谱,其中实线部分代表含有Prs基因的DNA片段,空心部分代表载体PHSG398。另外还显示了连接部分之核苷序列的测定结果。
图3是得自下面实施例1(ⅳ)的PPSC32的限制性酶切图谱。其中实线部分代表含有prs基因的DNA片段,黑色部分代表SP启动子,划斜线部分代表氯霉素乙酰转移酶基因(cat),空心部分代表PBR322。
本发明所提供的重组DNA包括:芽孢杆菌属微生物的磷酸核糖焦磷酸合成酶结构基团的DNA、含有核糖体结合位点的DNA以及含有能够在芽孢杆菌属微生物中表达之启动子序列的DNA,这些DNA序列均已被修饰,从而得以增强磷酸核糖焦磷酸合成酶的表达。将含有启动子序列的DNA插入到PRPP合成酶中使其紧位于含有核糖体结合位点的DNA的上游,与其相连的是PRPP合成酶基因的开放读码。
本发明还提供了含有重组DNA的载体,被该重组DNA或载体转化从而能够生产核酸相关物质的芽孢杆菌属新微生物,以及利用芽孢杆菌属微生物生产核酸相关物质的方法。
用于本发明的含有PRPP合成酶结构基因的DNA最好是包括编码酶的整个DNA及其5′-和/或3′-侧区。该DNA也可以是包括部分酶基因或包括部分酶基因及其5′或3′一侧区的DNA。通常可采用重组DNA技术从微生物的染色体DNA中分离出该DNA,用于这一目的的宿主载体系统的例子包括普遍采用的EK系统。即适用的宿主可以是得自大肠杆菌K-12的菌株,例如大肠杆菌C600(T.Mancatis等,“Molecular Cloning,A.Laboratory Manual”,Cold spring Harbor Laboratory,published by Cold spring Harbor Laboratory press,1982,page 504)、大肠杆菌JA221(IFO 14359,ATCC 33875)、大肠杆菌MM294(ATCC 33625〔proc.Natl.Acad.Sci.USA,73,4174(1976)〕或其衍生物。所用的载体可从PBR322、PACYC184、PACYC177、PUC18、PUC19、PHSG396、PHSG298等中适当选择。
另外,也可使用其它宿主-载体系统,例如大肠杆菌DF 50supF(Molecular Cloning,Page 504)、大肠杆菌NM538和NM539(J.Mol.Biol.,170,827)大肠杆菌LE392(J.Biol.Chem.,218,97)等宿主和Charon 4A(Molecular Cloning,Page31)、EMBL 3和EMBL 4(J.Mol.Biol.,170,827)等载体。当然,也可使用这样的宿主-载体系统,即其中芽孢杆菌属微生物例如枯草芽孢杆菌MI114(Gene,24,255)或其突变株被用作宿主,而能够在芽孢杆菌属微生物中自主复制的质粒如PUB110、PC194、PE194、PS194、PSA2100、PHy300PLK等被用作载体。
一般来说,对含有PRPP合成酶结构基因的DNA的供体来源并不专门局限于与下面所述的用作接受体的芽孢杆菌属微生物染色体上的PRPP合成酶结构基因在核苷酸序列上有高度同源性的供体,且任一微生物均可被用作供体。其中,当使用芽孢杆菌属微生物时可实现所谓的自身克隆,由于它易于操作,因此是优选的。而且,相信所产生的转化株是稳定的。该供体不一定能够产生核酸相关物质。
这类DNA供体的例子包括芽孢杆菌属微生物,例如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌。例如可使用以下微生物菌株:
枯草芽孢杆菌No.168(BGSC 1A1)
枯草芽孢杆菌No.115(IFO 14187,FERM BP-1327)
枯草芽孢杆菌MI114(Gene,24,255)
短小芽孢杆菌ATCC7061
地衣芽孢杆菌ATCC14580
其中BGSC是芽孢杆菌遗传原种中心,IFO是日本大坂发酵研究所,ATCC是美国典型培养物保藏中心。
可按常规方法从供体分离出染色体DNA,例如用苯酚提取染色体DNA(H.Saito和K.Miura,Biochim.Biophy.Acta.,72,619),用适当选择的限制酶切割所得的染色体DNA,并用DNA连接酶将其连接到一载体上,用该连接混合物转化PRPP合成酶缺陷型宿主,从中筛选出该缺陷已得到补偿的转化体,从而可得到含有PRPP合成酶结构基因的DNA。或者,可使用枯草芽孢杆菌PRPP合成酶结构基因的部分已知DNA序列〔D Nilsson等,Mol.Gen.Genet.,218,565(1989)作为探针并实施克隆杂交方法或噬菌斑杂交方法来克隆含有PRPP合成酶结构基因的DNA。可按常规方法转化宿主。例如,当宿主是大肠杆菌菌株时,可按S.N.Cohen等人(Pro.Natl.Sci.USA.,69,2110)所述的方法进行转化。当宿主是芽孢杆菌属微生物时可按已知方法例如S.Chang和S.N.Coh Cohen等所述的方法(Mol.Gen.Genet.,168,115进行转化。
可按照上面“Molbcular Cloning”(P86-93)中所述的方法从所获得的转化株大规模地分离含有结构基因的DNA。
为了从如此获得的含有PRPP合成酶基因的DNA构建和分离本发明的新重组DNA,可使用常规重组DNA技术,例如可适当使用大肠杆菌的宿主-载体系统。一般来说,可按以下步骤进行构建和分离。
在下述的于大肠杆菌中构建本发明重组DNA的步骤中,在许多情况下宜于将DNA片段亚克隆至一新载体或利用多聚连接子连接之。为此,最好利用例如PUC118或PUC119(为大肠杆菌载体)的多聚连接子部分进行亚克隆,因为新重组DNA的构建和核苷酸序列的测定均可易于进行。
可使用合适的限制性酶从含有PRPP合成酶基因的质粒获得本发明的新重组DNA。根据需要,还可使用具有核酸外切酶活性的酶,该酶从其末端消化双链DNA,例如可用BAL31切割和缺失基因之开放读码起始密码子的5′-上游区。然后按开放译读码起始密码子之5′-上游相同的方向在其上连接一核糖体结合位点(其为与接受体16S核糖体RNA结合相关的序列)。再向其上连接一个具有启动子活性的启动子序列,从而使之能够在芽孢杆菌属微生物中从核糖体结合位点的5′-上游进行高表达。
作为本发明的核糖体结合位点,可使用与3′OHUCUUUCCUCC5′互补的DNA。序列3′OHUCUUUCCUCC5′为芽孢杆菌属微生物16S核糖体的信使RNA。
该序列可由芽孢杆菌属微生物染色体DNA克隆获得,或者通过人工合成获得。也可利用存在于上述克隆PRPP合成酶基因开放读码上游区的序列,而不经任何修饰。
为了得到其中仅保留了PRPP合成酶基因之开放读码的DNA或得到其中保留了开放读码以及位于其5′-上游之核糖体结合位点的DNA,可适当改变限制酶的种类、具有核酸外切酶活性的酶的量以及反应时间,以得到具有不同切割部分和不同大小的DNA片段,然后通过下文所述的适当方法(例如测定该片段的核苷酸序列)来筛选所需的DNA片段。可按已知方法测定核苷酸序列,例如,可将DNA片段再克隆到用于测定核酸序列的载体(如M13、PUC118或PUC119)上,然后按照已知方法,例如F.Sangar等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463)进行序列测定。
用于本发明的启动子序列并不限于某一特定的启动子,只要它具有能够在下面的步骤中所用的接受体中表达的DNA序列即可使用,而不管它是来自原核、真核生物体或者是合成DNA。
其例子包括得自芽孢杆菌属微生物染色体的启动子、得自芽孢杆菌微生物噬菌体的启动子或能够在芽孢杆菌属微生物的细胞中自主复制之质粒的启动子。
这类启动子的具体例子有:
AAAAGGTATTGACTTTCCCTACAGGGTGTGTAATAATTTATATACA
SPO1-15[Lee,G and Pero,J,J.Mol.Biol.,152
247(1981)]
AAAAGTTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTGGCATAATAATCTTAAC
SPO1-26[Lee et al.,Mol.Gen.Genet.,180,57
(1980)]
GAAAAGTGTTGAAAATTGT CGAACAGGGTGATATAATAAAGAGTA
φ29G3b[Marray,C.L.and Robinowtiz,J.C.,
J.biol.Chem.,257,1053(1982)]
GAAAAGGGTAGACAAACTATCCTTTAACATGTTATACTATAATAGAA
φ29G2[Yoshikawa,H.et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,78,1336(1981)]
ATTAATGTTTGACAACTAT TACAGAGTATGCTATAATGGTAGTATC
φ29Al[Yoshikawa,H.et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,78,1336(1981)]
TAATATCGTTGACATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAA
pur操纵子
这类启动子可用合适的限制酶从含有它的DNA(质粒)上切割下来,通过例如琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级分离,然后回收之。也可按照磷酰胺酯方法,使用市售的DNA合成仪(如Applied Biosystems Inc.,U.S.A生产的装置)人工合成具有上述启动子核苷酸序列的DNA。
这样就构建出本发明的DNA。然后用其转化接受体。在此情况下,若预先将一个能够在芽孢杆菌属微生物中表达的标记基因如药物抗性基因连接到本发明DNA上,则在某些情况下可易于进行如下文所述的从接受体中筛选转化株的工作。
另外,在此情况下,若将PRPP合成酶基因的5′-侧区预先连接到已被连接之启动子的5′-上游,则更加有利,因为在按下面所述进行接受体染色体上的重组后将引起双股交换型重组。
为了大量获得本发明的新重组DNA,用上述连接混合物转化宿主微生物,然后收集生长于选择性培养基上的转化株,例如当利用药物抗性作为选择标记时,培养基中应含有相应的药物。按照已知方法(例如“Mobculer Cloning”第86-93页中所述的方法),可从该转化株大量地制备重组DNA。
下面叙述一种通过用如此得到的新重组DNA转化接受体而获得新微生物的方法。
用于该转化过程的接受体可以是具有转化能力的任何微生物,即可使用能够将细胞外提供的DNA结合进来并且能在其染色体上与该DNA的核苷酸序列高度同源的部分引起重组,从而改变其遗传特性的微生物。与供体DNA所含有的PRPP合成酶基因高度同源的接受体染色体DNA上的PRPP合成酶基因,在核苷酸序列上并不一定要与供体完全相同。由于已知芽孢杆菌属微生物,尤其是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和地衣形芽孢杆菌能够积累嘌呤核苷酸相关物质,例如肌苷,鸟苷等以及嘧啶核苷相关物质(如尿嘧啶、胞嘧啶等)、具有转化能力、无致病性并且已被安全地用于发酵工业,因此它们适于作为衍生具有生产核酸相关物质能力之转化株的微生物。
另外,在许多情况下,给作为接受体的上述微生物提供一个或多个有利于积累核酸相关物质的已知特性,例如8-氮鸟嘌呤抗性等核酸类似物抗性、核苷酸磷酸化酶缺陷、5′-鸟苷酸还原酶缺陷、叶酸拮抗物抗性等,将使核酸相关物质的生产得到更大改善。
芽孢杆菌属接受体的例子包括:
枯草芽孢杆菌BM1032(IFO14558,FERM BP-1242)
枯草芽孢杆菌IA3(BGSC No,1A3)
枯草芽孢杆菌NA-6011(IFO 14189,FERM BP-291)
枯草芽孢杆菌NA-6012(IFO 14190,FERM BP-292)
枯草芽孢杆菌NA-6128(IFO14373,FERM BP-617)
枯草芽孢杆菌NA-7821(IFO 14368,FERM BP-618)
枯草芽孢杆菌ATCC 19221
枯草芽孢杆菌ATCC 14662
短小芽孢杆菌(FERM P-2116)
短小芽孢杆菌(FERM P-4832)
短小芽孢杆菌(FERM P-4829)
地衣形芽孢杆菌IFO 12485
本发明的新重组DNA被用于转化芽孢杆菌属微生物。在此情况下,可以按整合于质粒的形式或通过切割质粒或切下的本发明之DNA而获得的线性DNA的形式来使用该DNA。可按已知方法用该DNA片段转化芽孢杆菌属微生物〔C.Anagnostopoulos and J.Spizizen,J.Bacterial.,81,741(1961);etc.〕。
当利用药物抗性基因作为选择标记时,可通过在含有相应药物的琼脂平板上进行培养而很容易地筛选出转化株。
通过测定PRPP合成酶的活性能够很容易地确定如此所获的转化株是否为具有所需特征的新微生物。即,与其亲本株相比,被本发明的重组DNA所转化而使PRPP合成酶活性得到提高的新微生物具有较高的PRPP合成酶活性。
转化株的一个典型例子就是按下文实施例中所述方法获得的枯草芽孢杆菌BM 3032(IFO 15058,FERM BP-2987)。
当然,按照本文所述的方法选择启动子和受体,可以很容易地得到各种转化株。
为了利用本发明所获得的转化株来生产核酸相关物质,可使用生产核酸相关物质的常规发酵方法。
核酸相关物质的例子包括嘌呤核苷相关物质(如肌苷、鸟苷)、嘧啶核苷相关物质(如尿嘧啶、胞嘧啶)等。具体地说,优选嘌呤核苷相关物质(如肌苷、鸟苷等)。
为了发酵,可使用含有碳源、氮源、金属离子并根据需要还含有氨基酸、核酸、维生素等其它培养物质的营养基。碳源的例子包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、糖化淀粉以及糖蜜等。氮源的例子包括有机含氮物质如胨、玉米浸出液、大豆粉、干酵母、尿素等和无机含氮物质如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和碳酸铵等。这些物质可以单独使用,也可以联合使用。可适当选用微生物生长所必需的其它营养物、各种无机盐、氨基酸、维生素等,而且它们可以单独使用或联合使用。
如果需要的话,还可向培养基中加入消泡剂、表面活性剂等,如硅油、聚二醇醚等。
通常在振荡培养或通气浸没培养等通气条件下进行培养。培养基的PH值范围最好在4-9之间。如果培养过程中PH发生变化,可加入硫酸、碳酸钙、氢氧化钠、氨气、氨水等物质将PH调整至上述优选范围内。培养温度通常在20-45℃范围内,以利于所用微生物的生长和所需核酸相关物质的积累。培养一直进行到所积累的核酸相关物质的量基本上达到最大值为止。通常在培养24-144小时后即可达到预期的结果。
为了从培养物中分离出核酸相关物质可以采用常规的分离和纯化方法,例如沉淀法和使用离子交换树脂或活性炭等的层析法。
如上文所述,可按照本发明以高产率工业化生产,作为生产重要的调味物质5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸之原料的肌苷和/或鸟苷。
即利用能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物作为接受体并用本发明的DNA转化该接受体,即可获得PRPP合成酶(与生产核酸相关物质的重要中间产物PRPP的合成有关的酶)活性得到改善的新微生物。
该新微生物能够不断地大量生产核酸物质。
以下实施例进一步详细说明本发明,但并不构成对本发明范围的限定。除非另有说明,实施例中的操作均按下述方法(1)至(8)进行。
(1)用限制酶消化DNA
所用限制酶(由Takara Shuzo Co.,Ltd.,Japan生产)的缓冲液由制造者具体指定。于37℃按每毫克DNA使用10单位酶进行消化。然后用TE缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA〕饱和的苯酚提取反应混合物。向提取物中加入1/10体积的3M乙酸钠(pH6),再加入2.5体积的乙醇,离心该混合物以沉淀DNA。
(2)大量质粒的提取
按“Molcular Cloning”第86页至93页所述的方法进行提取。即将含有质粒DNA的大肠杆菌接种于LB培养基(250ml;10g/l细菌用胰化胨,5g/l酵母抽提物及5g/l氯化钠)中并培养过夜。然后收集微生物细胞并用TE缓冲液洗涤。向洗过的细胞中加入溶菌酶,接着加入含1%月桂酰硫酸钠的0.2N氢氧化钠溶液,以引起细胞裂解。加入5M乙酸钾后,离心得到含有质粒的上清液。向上清液中加入0.6份(V)的异丙醇以沉淀质粒DNA,再经乙醇洗后将其溶于TE缓冲液中。向该溶液中加入氯化铯使比重达到1.60,再加入溴乙锭至终浓度为600μg/mlo使用超速离心机(Rotor V65Ti)以50,000rpm的转速将该混合物于20℃离心12小时,并取出紫外光下检测出的质粒带。用正丁醇萃取而除去溴乙锭后,进行乙醇沉淀。
(3)转化大肠杆菌
按“Molecular Cloning”第250页中所述的方法进行转化。
将大肠杆菌接种于3ml LE培养肉汤中并培养过夜。然后将其一部分培养基(1ml)接种于100ml LB培养基,并于37℃下振荡培养直至微生物细胞数达到约5×107细胞/ml。然后收集细胞,并加入含有50mM氯化钙和10mM Tris-HCl缓冲液(PH8)的冰冷无菌水(50ml)将其悬浮并冰冷15分钟。离心收集细胞,并将其再次悬浮于上述水溶液(6.7ml)中。向0.2ml该溶液中加入DNA,将混合物冰冷30分钟。向其中加入0.8ml LB培养基,将该混合物于37℃保温1小时。然后将培养物涂布到含有药物的LB琼脂平板上,于37℃培养过夜。
(4)BAL31核酸外切酶消化处理
进行BAL31核酸酶消化处理以从两末端消化DNA的双条链即将用限制性酶处理过的DNA(10μg)溶于BAL31缓冲溶液〔100μl;12mM氯化钙,12mM氯化镁,200mM氯化钠,20mM Tris-HCl(PH8)以及2mM EDTA〕,并向该混合物中加入BAL 31核酸外切酶(1单位,由日本Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)。于30℃保温该混合物。消化后进行苯酚提取和乙醇沉淀。为了将消化后的DNA粘性末端转变为平整末端,将上述DNA悬浮于T4DNA聚合酶的缓冲溶液〔20μl;含有33mM Tris-乙酸(pH7.9),10mM乙酸镁,0.5mM二硫苏糖醇,66mM乙酸钾,0.01% BSA,及0.1mM dATP、dGTP、dCTP和dTTP〕中,并向混合物中加入T4DNA聚合酶(5单位由日本Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)。将该混合物于37℃保温30分钟,然后进行苯酚抽提和乙醇沉淀。
(5)DNA的连接
使用DNA连接试剂盒(由日本Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)连接2至3个DNA片段。连接条件遵照生产者的说明。
(6)转化枯草芽孢杆菌
按照Dubnou等人所述的方法进行转化。即将微生物接种于LB培养基(5ml)中并于37℃过夜培养。然后将其中的0.5ml转移至SPT培养基(20ml;含有1.4%磷酸氢二钾,0.6%磷酸二氢钾,0.2%硫酸铵,0.1%柠檬酸钠,0.02%硫酸镁,0.5%蔗糖,0.02%酪蛋白氨基酸,0.1%酵母抽提物,50μg/ml色氨酸及50μg/ml亮氨酸)中并于37℃保温4小时。然后将其中的10ml培养液转移至SPII培养基(100ml;含有1.4%磷酸氢二钾,0.2%硫酸铵,0.1%柠檬酸钠,0.02%硫酸镁,0.5%蔗糖,75μg/ml氯化钙及508μg/ml氯化镁)中并于37℃保温90分钟。向1ml该培养液中加入1μg DNA,并于37℃振荡30分钟后将其涂布于含有药物的LB琼脂平板上,于37℃保温过夜。
(7)菌落杂交
将转化的菌落分别接种在置于含50μg/ml氨苄青霉素之LB琼脂平皿和含氨苄青霉素之LB琼脂主平皿上的尼龙滤膜(Colony/plaque screen NFF-978X,由美国E.I.du pont de Nemours & Co.,Ltd生产)上,并于37℃保温过夜。
然后从平板中取出该尼龙滤膜,在0.5N氢氧化钠溶液中浸泡10分钟,再在1M Tris-HCl(pH7.5)中浸泡10分钟。然后在室温下干燥之。
另外,制备一探针。按照制造商指定的方案,使用MEGALABEL(由日本Takara Shuzo Co.,Ltd.生产)进行制备。
按制造商指定的方法进行杂交。
(8)测定核苷酸序列
使用SEQUENASE(由日本Toyo Boseki Kab Kabushiki Kaisha生产),按照制造商所指定的方法测定核苷酸序列。
本文所说的IFO号是指大坂发酵研究所的登记号,FERM BP号是布达佩斯条约下的工业科技厅发酵研究所(FRI)的登记号。
实施例1
(ⅰ)制备染色体DNA
将枯草芽孢杆菌No.115〔IFO 14187,BP-1327)(1987年3月28日保藏)〕接种于LB培养基(40ml)上并于37℃保温过夜。将所获得的微生物细胞按染色体DNA提取方法用苯酚进行提取,以得到染色体DNA(5mg)
(ⅱ)克隆PRPP合成酶基因(Prs)
用BclI消化按上文(ⅰ)中所述方法制备的染色体DNA(10μg),用琼脂糖凝胶电泳法进行分级分离,然后用单向电洗脱装置(由Iaternational Biotech nologies Inc生产)回收约3.6至4.5Kb的DNA。
另外,用BamHI消化0.5μg pUC19,与上述DNA片段混合并连接之。然后用以转化大肠杆菌JM109(由日本Takara Shuzo Co.,Ltd生产),并从中筛选出氨苄青霉素抗性菌株。选择约200个菌株的菌落,并利用合成的寡聚核苷酸(5′-CCAGACCATGGCGGTGTGACACGTGCCCGC-3′)作为探针进行菌落杂交。从与探针杂交的菌株中的一个菌株〔大肠杆菌JM109(PPRSI)〕中获得质粒PPRSI。其限制性酶切图谱示于图1中。
(ⅲ)制备缺失质粒PPRS1505
用KpnI消化得自上述步骤(ⅱ)的10μg PPRSI之后,用BAL31消化10分钟。然后用xbaI完全消化,并用琼脂糖凝胶电泳法进行分级分离以回收约3.0kb的DNA。将该DNA连接于已用SmaI和xbaI双重消化的0.5μg pHSG398(由Takara Shuzo Co.,Ltd.,生产)上。然后用其转化大肠杆菌JM109以选择氯霉素(30μg/ml)抗性菌株。结果得到如图2所示的质粒pPRSI505。
(ⅳ)制备pPSC32
用KpnI消化上述步骤(ⅲ)中制备的pPRS1505(1μg),并用HindⅢ进行部分消化,然后进行琼脂糖凝胶电泳以回收约3.0kb的DNA部分。与此类似,用EcoRI和kpn I对pSP19(0.5μg,EP-A 412688)进行双重消化,并用琼脂糖凝胶电泳法进行分级分离以回收约0.1kb的DNA级分。用HindⅢ和BamHI对pCAT15(0.5μg,日本专利公开号82096/1987)进行双重消化,并用琼脂糖凝胶电泳法分级分离以回收约1.0kb的DNA级分。用EcokI和BamHI对pBR322(0.5μg)进行双重消化,并用琼脂糖凝胶电泳法分级分离以回收约3.9kb的DNA片段。
然后,将这四个DNA片段混合和连接之,用它们转化大肠杆菌JM109。通过选择氨苄青霉素抗性而获得大肠杆菌JM109(pPSC32)。其质粒pPSC32的限制性酶切图谱示于图3。
实施例2
(ⅰ)用pPSC32转化肌苷和/或鸟苷生产菌枯草芽孢杆菌BM1032菌株
用实例1(ⅳ)制备的1μg pPSC32转化枯草芽孢杆菌BM1032(IFO 14459,FERM BP-1242)以获得氯霉素(10μg/ml)抗性菌株。其中的一株被命名为枯草芽孢杆菌BM3032。该菌株已于1990年6月20日保藏于IFO(保藏登记号为IFO15058),并于1990年6月25日保藏于布达佩斯条约下的FRI(保藏登记号为FERM BP-2987)。
(ⅱ)枯草芽孢杆菌BM3032的肌苷和/或鸟苷生产率
将生长于5ml LB培养基中的菌环枯草芽孢杆菌BM 3032接种于20ml表1所示的培养基中,并于27℃培养53小时。经高效液相层析测得发酵后培养液中所积累的肌苷和鸟苷的量分别为14mg/ml和2.5mg/ml。另外,于上述同样条件下培养枯草芽孢杆菌BM1032,结果培养液中仅积聚了8.0mg/ml肌苷和1.1mg/ml鸟苷。
表1
培养基成分 浓度(g/l)
Glufinal 120
(接上表)
谷氨酸-钠 12
硝酸铵 20
DL-α-丙氨酸 0.3
酪蛋白氨基酸 10
色氨酸 0.2
亮氨酸 0.2
核糖核酸(RNA) 2
生物素 0.0002
磷酸二氢钾 2
氯化钾 1
硫酸镁 1
硫酸亚铁 0.005
硫酸锰 0.01
碳酸钙 15
pH 7.5
(ⅲ)测定PRPP合成酶活性
在含有腺嘌呤的SPI培养基中过夜培养枯草芽孢杆菌BM 3032后,收集细胞并洗涤,然后破细胞,按照K.F.Jensen等所述的方法〔K.F.Jensen等,AnalyticalBiochemistry,98,254-263(1979)〕测定上清液的pRPP合成酶活性。
结果是,本发明转化株枯草芽孢杆菌BM3032的pRPP合成酶活性比作为对照株的枯草孢杆菌BM1032高2.8倍。
Claims (44)
1、一种重组DNA,它包括含有芽孢杆菌属微生物之磷酸核糖焦磷酸合成酶结构基因的DNA、含有核糖体结合位点的DNA以及含有能够在芽孢杆菌属微生物中表达之启动子序列的DNA,这些DNA序列已被修饰,从而增强了磷酸核糖焦磷酸合成酶基因的表达。
2、如权利要求1所述的重组DNA,其中含有启动子序列的DNA紧位于含有核糖体结合位点的DNA并在其上游。
3、如权利要求1所述的重组DNA,其中DNA序列在核糖体结合位点被修饰。
4、如权利要求1所述的重组DNA,其中DNA序列在启动子序列处被修饰。
5、如权利要求4所述的重组DNA,其中启动子序列与能够表达的另一个启动子序列相交换。
6、如权利要求5所述的重组DNA,其中另一个启动子序列得自芽孢杆菌属微生物的染色体DNA或芽孢杆菌属微生物的噬菌体。
7、如权利要求1所述的重组DNA,其中结构基因的供体是枯草芽孢杆菌属微生物。
8、如权利要求7所述的重组DNA,其中结构基因的供体是枯草芽孢杆菌115(FERM BP-1327)。
9、如权利要求1所述的重组DNA,其中结构基因的供体是短小芽孢杆菌。
10、如权利要求1所述的重组DNA,其中结构基因的供体是地衣芽孢杆菌。
11、含有权利要求1所述之重组DNA的载体。
12、含有权利要求2所述之重组DNA的载体。
13、含有权利要求3所述的重组DNA的载体。
14、含有权利要求4所述之重组DNA的载体。
15、含有权利要求5所述之重组DNA的载体。
16、含有权利要求6所述的重组DNA的载体。
17、一种已被权利要求1所述的重组DNA转化能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
18、一种已被权利要求2所述的重组DNA转化能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
19、一种已被权利要求3所述的重组DNA转化能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
20、一种已被权利要求4所述的重组DNA转化能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
21、一种已被权利要求5所述的重组DNA转化能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
22、一种已被权利要求6所述的重组DNA转化的够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
23、一种已被权利要求11所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
24、一种已被权利要求12所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
25、一种已被权利要求13所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
26、一种已被权利要求14所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
27、一种已被权利要求15所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
28、一种已被权利要求16所述的载体转化的能够产生核酸相关物质的芽孢杆菌属微生物。
29、如权利要求17所述为枯草芽孢杆菌的微生物。
30、如权利要求29所述的微生物,它为枯草芽孢杆菌BM3032(FERM BP-2987)。
31、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求17所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核核酸相关物质。
32、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求18所述的芽孢菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
33、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求19所述的芽孢杆菌属微生物以生产和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
34、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求20所述的芽孢杆菌属微生物以生产和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
35、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求21所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
36、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求22所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
37、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求23所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
38、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求24所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
39、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求25所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
40、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求26所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
41、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求27所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
42、一种生产核酸相关物质的方法,该方法包括培养权利要求28所述的芽孢杆菌属微生物以生成和积聚核酸相关物质,并收集核酸相关物质。
43、如权利要求31所述的方法,其中微生物是枯草芽孢杆菌。
44、如权利要求43所述的方法,其中微生物是枯草芽孢杆菌BM3032(FERM BP-2987)。
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