CN103436479A

CN103436479A - 一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN103436479A
Application number: CN2013104082557A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 丁凤英; 陈勇; 柳东; 郭亭; 谢婧婧
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103436479B

Abstract

本发明公开了一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。本发明还公开了上述基因工程菌的构建方法及应用。通过本发明的方法，丙酮丁醇梭菌平均乙偶姻产量达到5g/L左右。

Description

一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丁酮，又名乙偶姻（acetoin）、乙酰甲基甲醇，通常为淡黄色液体或晶体，天然存在于玉米、葡萄、草莓、干酪、肉类等食品中，是一种应用广泛的香料，我国国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食用香料，美国食品和萃取协会（FEMA）安全号为2008。此外，3-羟基丁酮还可以作为化学合成中的重要原料，比如可用于合成手性近晶材料和向列材料。

3-羟基丁酮的传统化工制备主要是采用化学法或者酶法转化，其原料主要是双乙酰（丁二酮）和2,3-丁二醇。但是这些方法的原料昂贵，而且往往条件苛刻，设备要求高。另外，还可以采用微生物发酵法生产3-羟基丁酮。在微生物中，两分子丙酮酸在乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase,ALS）作用下合成一分子乙酰乳酸，乙酰乳酸经乙酰乳酸脱羧酶(acetolactate decarboxylase,ALDC)作用即可生成3-羟基丁酮。在一些微生物中，3-羟基丁酮还可以被进一步还原生成2,3-丁二醇。目前人们已经发现很多可以产生3-羟基丁酮的菌种，例如：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等奶制品或者酿酒发酵菌株，可以产生少量的3-羟基丁酮（通常低于1g/L）。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、产气节杆菌（Enterobacter aerogenes）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等主要用来生产2,3-丁二醇的菌种也能够产生3-羟基丁酮。

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是目前生产丁醇的主要菌种。其发酵产物除丁醇外，还有丙酮和乙醇，因此在生产中又被称为ABE（Acetone-Butanol-Ethanol）发酵。通常，60g/L的葡萄糖经丙酮丁醇梭菌发酵可产生12g/L的丁醇，6g/L的丙酮以及2g/L的乙醇，丁醇:丙酮:乙醇的比值为6:3:1（w/w）。除ABE外，丙酮丁醇梭菌还会产生少量的3-羟基丁酮。在丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC824中，3-羟基丁酮的产量通常情况下不足1g/L（Collas,F.,Kuit,W.,Clément,B.,Marchal,R.,López-Contreras,A.M.,Monot,F.,2012.Simultaneous production of isopropanol,butanol,ethanol and2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC824engineered strains.AMB Express2,45；Roos,J.W.,McLaughlin,J.K.,Papoutsakis,E.T.,1985.The effect of pH on nitrogensupply,cell lysis,and solvent production in fermentations of Clostridium acetobutylicum.Biotechnol.Bioeng.27,681-694）。在控制搅拌速度和压力的条件下，3-羟基丁酮最高产量达到2.2g/L（Doremus,M.G.,Linden,J.C.,Moreira,A.R.,1984.Agitation and pressureeffects on acetone-butanol fermentation.Biotechnol.Bioeng.27,852-860）。Kanouni等人将丙酮丁醇梭菌ATCC824经3-氟丙酮酸诱变后，筛选得到最高3-羟基丁酮产量达3.5g/L的突变株（A.EI Kanouni,A.M.Junelles,R.Janati-Idrissi,H.Petitdemange,R.Gay,1989.Clostridium acetobutylicum Mutants Isolated for Resistance to the Pyruvate Halogen Analogs.CURRENT MICROBIOLOGY18,139-144），据我们所知，这是丙酮丁醇梭菌中目前文献报道的最高乙偶姻产量。

提高丙酮丁醇梭菌的3-羟基丁酮产量有以下几方面的意义:

(1)提高传统ABE发酵的经济效益。目前丁醇价格约1.1万元/吨，丙酮0.8万元/吨，乙醇0.55万元/吨。按照3吨糖产1吨溶剂来算，ABE发酵的产品价值只是略高于原料（约3200元/吨糖），使得生物法生产ABE经济效益很差。然而3-羟基丁酮价格较高，化学法制备的3-羟基丁酮价格约10万元/吨，生物法生产的3-羟基丁酮约25万元/吨。因此提高ABE发酵中的3-羟基丁酮产量将显著提高ABE发酵的经济效益。

(2)有利于开发以3-羟基丁酮为代谢前体的其他重要化学品。ABE发酵中，丁醇是一个疏水性很强的化合物，对细胞有很大的毒性，限制了丁醇的发酵效率。相比丁醇，2,3-丁二醇或者2-丁醇对细胞的毒性较小。尤其是2-丁醇具有与1-丁醇相似的性质，因此可以替代1-丁醇用于第二代生物燃料。通过在丙酮丁醇梭菌中导入乙偶姻还原酶即可将3-羟基丁酮还原生成2,3-丁二醇，2,3-丁二醇同时也是2-丁醇的前体。然而研究表明丙酮丁醇梭菌中3-羟基丁酮的合成是这些途径中的限制步骤（Wardwell,S.A.,Yang,Y.T.,Chang,H.Y.,San,K.Y.,Rudolph,F.B.,Bennett,G.N.,2001.Expression of the Klebsiellapneumoniae CG21acetoin reductase gene in Clostridium acetobutylicum ATCC824.J IndMicrobiol Biotechnol.27,220-227;Siemerink,M.A,,Kuit,W.,López Contreras,A.M.,Eggink,G.,van der Oost,J.,Kengen,S.W.,2011.d-2,3-Butanediol Production Due toHeterologous Expression of an Acetoin Reductase in Clostridium acetobutylicum.Appl.Environ.Microbiol.77,2582-2588）。因此，强化丙酮丁醇梭菌3-羟基丁酮的合成，提高其产量对2,3-丁二醇以及2-丁醇等的开发都有重要意义。

(3)在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），霍乱弧菌（Vibrio Cholerae）等中，转录调控因子alsR通过感应乙酸的积累和pH的降低并以乙酸为共调节物促进ALS和ALDC基因的表达，进而促进3-羟基丁酮的生成。因此3-羟基丁酮的生成避免了微生物生存环境的酸化，具有“解毒”的作用。然而，在野生丙酮丁醇梭菌中，这种解毒作用主要是通过丙酮等溶剂的生成来完成，这或许是3-羟基丁酮产量低的原因。事实上，在丙酮丁醇梭菌中3-羟基丁酮和丙酮的生成也确实具有此消彼长的相反关系。因此，通过强化3-羟基丁酮的合成，丙酮产量就会降低。碳源由生成三碳化合物丙酮转向生成四碳化合物3-羟基丁酮，产品得率会进一步提升，并且3-羟基丁酮较丙酮不易挥发，对产品回收也有帮助。

为了提高丙酮丁醇梭菌3-羟基丁酮的产量，研究通常强化乙酰乳酸合成反应，而非强化乙酰乳酸脱羧反应。因为通常认为，乙酰乳酸合成反应对3-羟基丁酮的生成贡献更大，而即使在缺乏ALDC的情况下乙酰乳酸仍可以自发脱羧生成3-羟基丁酮。然而，无论是在丙酮丁醇梭菌中表达其自身的ALS还是枯草芽孢杆菌的ALS，3-羟基丁酮产量均没有提高（Wardwell,S.A.Metabolism of acetoin in C.acetobutylicum ATCC824.RiceUniversity.1999）。这表明丙酮丁醇梭菌中通过表达ALS来强化乙酰乳酸的合成反应对3-羟基丁酮产量的影响甚小。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，通过强化乙酰乳酸脱羧反应提高梭菌的3-羟基丁酮产量。

本发明还要解决的技术问题是提供上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。

其中，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因来自于梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属。具体为如下1）至4）中任一所述的基因：

1）其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

2）其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

3）严格条件下可与序列表中SEQ ID No：1或SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子；

4）与SEQ ID No：1或SEQ ID No：2的序列具有90%以上的同源性且编码乙酰乳酸脱羧反应酶的DNA分子。

其中，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、产芽孢梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。优选为C.acetobutylicum ATCC824和C.acetobutylicum CGMCC5234。

其中，丙酮丁醇梭菌Clostridium.acetobutylicum CGMCC5234，菌株号为B3，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.5234，保藏日期2011年9月9日，该菌株的信息记载在中国专利201210075094.X，申请日2012年3月20日。

上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，从梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属菌株中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入梭菌中进行表达。

上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，优选的是，从丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC824中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum CGMCC5234中进行表达。

上述高产3-羟基丁酮的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。

本发明的通过强化乙酰乳酸脱羧反应来提高3-羟基丁酮产量的方法，可以显著提高梭菌的乙偶姻产量，使原料由生成丙酮转向生成更多的乙偶姻，而丁醇产量不受影响，即提高了梭菌发酵的产品得率也提高了梭菌发酵的产品价值。

有益效果：本发明的高产3-羟基丁酮的基因工程菌的基因转录分析表明，乙酰乳酸脱羧反应对3-羟基丁酮产量有更大的影响。通过在丙酮丁醇梭菌中强化乙酰乳酸脱羧反应，将3-羟基丁酮产量由初始1.8g/L左右大幅提高到5g/L左右；而丙酮由4.5g/L左右降低至2g/L，总溶剂（ABE和3-羟基丁酮）得率也由0.35g/g提高到0.39g/g。显著提高了丙酮丁醇梭菌发酵的经济效益。

附图说明

图1是丙酮丁醇梭菌代谢网络示意图。

图2重组丙酮丁醇梭菌B3（pIMP1-ALDC)发酵液气相色谱图谱，按出峰先后顺序依次为：3.711min，丙酮；4.126min，乙醇；5.409min，丁醇；6.734min，3-羟基丁酮；7.767min，乙酸；9.299min，丁酸。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下述实施例中如无特殊说明，所用方法均为常规方法，如《分子克隆：实验室手册》（New York:Cold Spring Habor Laboratary Press,1989）中所述的方法。所用试剂均可从商业途径获得。

下述实施例以丙酮丁醇梭菌为例阐明本发明的提高梭菌3-羟基丁酮产量的方法。

酵母粉购自英国OXIOD公司，目录号1023098；蛋白胨购自英国OXIOD公司，目录号594566。

LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，固体培养基另加15g/L琼脂粉。用于大肠杆菌的常规培养。

2xYTG培养基配方为：16g/l蛋白胨，10g/l酵母粉，4g/l NaCl,5g/l葡萄糖。用于培养制备电转化感受态的丙酮丁醇梭杆菌。

P2平板培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨3g/L，七水合硫酸镁3g/L，乙酸铵2g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，琼脂粉15g/L。

实施例1：构建含有乙酰乳酸脱羧酶基因CAC2967表达质粒的丙酮丁醇梭菌。

采用细菌基因组试剂盒提取对数生长中后期的丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC824基因组DNA，用以下引物进行PCR扩增其乙酰乳酸脱羧酶基因CAC2967：

ALDC-s CATATGATTGAAGAAGTGATCCCTAATCAT（划线部分为NdeI识别位点）；

ALDC-as GAAATAAGTAAAGTTGAGAAATAACATATG（划线部分为NdeI识别位点）。

采用TAKARA公司的高效保真酶Primerstart进行PCR扩增，扩增程序为：95℃3min；98℃10s、55℃15s、72℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物经测序后确定其序列如SEQ ID No：1所示。

将所得PCR产物纯化回收后，与经Nde I酶切后的pIMPI-ptb载体(Mermelstein,L.D.,Welker,N.E.,Bennett,G.N.,Papoutsakis,E.T.,1992.Expression of cloned homologousfermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC824.Biotechnology10,190–195)在T4DNA连接酶作用下连接，构建得到载体pIMP1-ALDC。

将质粒pIMP1-ALDC转化到E.coli TOP10(pAN2)中，E.coli Top10购自北京天根生化科技有限公司（目录号CB104）。pAN2为甲基化质粒（Heap,J.T.,Pennington,O.J.,Cartman,S.T.,Carter,G.P.,Minton,N.P.,2007.The ClosTron:a universal gene knock-outsystem for the genus Clostridium.J Microbiol Methods70,452-464）。并将转化后细胞涂布于含有氨苄青霉素和四环素素的LB平板上，挑取单菌落富集培养后提取质粒，pIMP1-ALDC质粒即是甲基化后的pIMP1-ALDC质粒。

厌氧条件下，取2xYTG培养基培养的生长至对数中期的C.acetobutylicum B3（保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.5234;地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）培养液60ml，4℃、4000rpm离心10min弃去上清，加入足量预冷的电转缓冲液EPB（270mM蔗糖，5mM NaH₂PO₄，pH7.4），洗涤两次，并用2.3ml EPB重悬。然后取570ul加入0.4cm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20ul甲基化的pIMP1-ALDC质粒，冰浴放置2min。2.0kV电压，25uF电容进行电转化。随后将电转液加入到1ml37℃的2xYTG培养基中复苏培养4h，离心收集细胞100ul并将细胞涂布于含有2.5ug/ml红霉素的P2平板中。厌氧培养24-36h后，获得含有pIMP1-ALDC质粒的重组丙酮丁醇梭菌，命名为C.acetobutylicum B3(pIMP1-ALDC)。

实施例2：构建含有乙酰乳酸脱羧酶基因BSU36000表达质粒的丙酮丁醇梭菌。

采用细菌基因组试剂盒提取对数生长中后期的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）CGMCC No.3720（记载于中国专利201010171377.5中）。用以下引物进行PCR扩增其乙酰乳酸脱羧酶基因BSU36000：

BSU36000-s CATATGATGAAACGAGAAAGCAACATTC（划线部分为NdeI识别位点）；

BSU36000-as TGAAGGAAGCCCTGAATAACATATG（划线部分为NdeI识别位点）。扩增产物经测序后确定其序列如SEQ ID No：2所示。将扩增产物按照实施例1的方法导入丙酮丁醇梭菌获得含有pIMP1-BSU36000质粒的重组丙酮丁醇梭菌，命名为C.acetobutylicum B3(pIMP1-BSU36000)。

实施例3：利用基因工程菌发酵生产ABE和3-羟基丁酮。

丙酮丁醇梭杆菌（C.acetobutylicum）B3(pIMP1-ALDC)和B3(pIMP1-BSU36000)在P2种子培养基（不加琼脂，其他组分同P2平板培养基）中37℃静止培养12h。分别以10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中。发酵培养基的配方如下：K₂HPO₄0.5g/L;KH₂PO₄0.5g/L;CH₃COONH₄2.2g/L；MgSO₄·7H₂O0.2g/L;MnSO₄·H₂O0.01g/L;NaCl0.01g/L;FeSO₄·7H₂O0.01g/L；对氨基苯酸1mg/L;硫胺1mg/L;生物素0.01mg/L。37℃厌氧发酵60h。发酵液组分用气相色谱检测，气相色谱检测条件如下：火焰离子检测器（FID），Agilent HP-INNOWAX19091N-236毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25um)，N2为载气，流速2mL/min，分流比90：1，H2流速30ml/min，空气流速300ml/min，进样口温度180℃，检测器220℃，柱温（程序升温）：70℃保留0.5min，然后以20℃/min的速率升温到190℃，保留4min。气相色谱出峰先后顺序见图2。发酵结果见表1，其中丙酮丁醇梭杆菌B3（pIMP1-ALDC)和B3(pIMP1-BSU36000)所对应的数据为任意挑选的10株重组菌的平均数据。

表1重组丙酮丁醇梭菌pIMP1-ALDC及对照菌株发酵结果

由表1可见，表达乙酰乳酸脱羧蛋白的重组菌株3-羟基丁酮产量明显提高，实现了底物由生成丙酮向生成3-羟基丁酮的转变。其中，丙酮丁醇梭杆菌B3（pIMP1-ALDC)的3-羟基丁酮产量与野生菌B3以及对照菌株B3(pIMP1)相比，分别提高了162%和120%，同时丁醇产量不受影响。与表达前相比，总溶剂（ABE和3-羟基丁酮）得率也提高了11.4%。

虽然以上实施例仅以C.acetobutylicum ATCC824和C.acetobutylicum B3（CGMCC5234）为例进行了说明，但本领域的技术人员通过本发明的公开，很容易看出本发明的方法同样适用于其他产梭菌，这些菌株包括但不限于：C.acetobutylicum,C.beijerinckii,C.saccharobutylicum,C.saccharoperbutylacetonicum,C.butyricum,C.sporogenes,C.thermosaccharotyticum,C.pasteurianum,C.tyrobutyricum,C.perfringens,C.botulinum。因此这些内容同样应当属于本发明的范围。

Claims

1.一种高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，它是导入了乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因的梭菌。

2.根据权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因来自于梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属。

3.根据权利要求1或2所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸脱羧反应酶的编码基因具体为如下1）至4）中任一所述的基因：

1）其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

2）其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

4.根据权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、糖丁醇梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、产芽孢梭(C.sporogenes)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)或肉毒梭菌(C.botulinum)。

5.根据权利要求4所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌，其特征在于，所述梭菌为C.acetobutylicum ATCC824和C.acetobutylicum CGMCC5234。

6.权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于，从梭菌属、芽孢杆菌属或克雷伯氏菌属菌株中克隆乙酰乳酸脱羧反应酶的基因，并通过电转化的方法将其导入梭菌中进行表达。

7.权利要求1所述的高产3-羟基丁酮的基因工程菌在生产3-羟基丁酮中的应用。