CN103333927B

CN103333927B - 用tdcD酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

Info

Publication number: CN103333927B
Application number: CN201310278996.8A
Authority: CN
Inventors: 马吉银; 魏爱英; 孟刚; 贾慧萍; 马风勇; 李小刚
Original assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103333927A

Abstract

本发明提供了发酵生产L‑色氨酸的方法，其包括改造细菌使其tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，乃至彻底消失；和，用改造的细菌发酵生产L‑色氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

Description

用tdcD酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产l-色氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

背景技术

通过产l-色氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产l-色氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因上（参见中国专利85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未见为了L-色氨酸生产而关注tdcD酶及其编码基因，事实上国际专利WO2012135389公开了生产芳香氨基酸的氧化产物，其中甚至需要额外表达异源的tdc酶。

TdcD酶由tdcD基因编码。在E. coli K12菌株及其衍生菌株（如，W3110菌株）等中，野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，通过Genbank提供的同源性比较工具，也能够找到其他野生型的tdcD基因。

本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现tdcD基因的改造能够有助于提高l-色氨酸的产量，而且与此前本发明人的发现不同，tdcD基因优选彻底地敲除，甚至在基因座位上不留存其他与tdcD基因无关的序列，由此开发了新的针对tdcD基因调控的方法，以此来提高l-色氨酸的产量，而且更重要的是，该方法与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-色氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产l-色氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产l-色氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产l-色氨酸的方法，其包括：

（1）改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产l-色氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Biovector公司商品化的pKD46质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，改造成能够使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低的新的tdcD基因。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。

本发明人经过长期研究发现，使得tdcD基因所编码的tdcD酶的表达量消失，或使得tdcD基因所编码的tdcD酶的酶活性消失，在一定培养基下，并不造成细菌本身生长困难，仍旧能够正常生长/繁殖，并发酵。更为令人意想不到的是，tdcD基因座位上的基因彻底消失，将进一步提高l-色氨酸的产量。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，优选使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低50%以上，更优选降低70%以上，如降低80%、90%或95%以上，最加优选降低100%（即，消失），也最优选是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失并且使得tdcD基因座位上的基因被敲除（即，彻底消失）。

改造的方式可以是在tdcD酶活性结构域，如该酶的氨基酸序列的第17-38位、第90-156位、183-205位和330-362位，进行突变，一般都能造成活性下降；也可以是在tdcD基因上引入终止密码子，使得无法表达有活性的tdcD酶；也可以通过同源重组，将tdcD基因替换成其他基因，如抗生素抗性基因，例如抗氯霉素抗性基因；或者完全敲除tdcD基因座位上的基因，使之彻底消失。在本发明的具体实施方式中，优选采用后两者。

相应地，本发明还提供了其他应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高l-色氨酸的发酵量的方法，其包括：

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵产生l-色氨酸。

l-色氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的l-色氨酸。尽管低产L-色氨酸的细菌不适合有经济效益地生产l-色氨酸，但是通过本发明的方法，仍旧能提高l-色氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-色氨酸的细菌。通过本发明的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本发明的方法或应用中，除了改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因以外，可以不再进行其他改造。例如，尤其对于高产L-色氨酸的细菌来说，仅仅改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因。

又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产l-色氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因而获得，而且使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低。

改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产l-色氨酸中，也可以和其他产L-色氨酸的细菌混合发酵生产l-色氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产l-色氨酸中。在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“细菌”是未改造或改造前的细菌，其染色体的tdcD基因座位上的基因是野生型的tdcD基因。

还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的细菌在提高l-色氨酸的发酵生产量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因而获得，而且使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低。

在本文中，细菌优选是埃希氏菌属细菌，更优选是大肠杆菌，如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在l-色氨酸生产/发酵中关注过细菌的tdcD基因，改造的染色体的基因大多集中于mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因位点上，因此现有技术中的细菌（尤其是埃希氏菌属细菌，如大肠杆菌）没有被报道不带有野生型的tdcD基因。在本发明的具体实施方式中，无论高产还是低产L-色氨酸的细菌，只要带有野生型的tdcD基因，通过本发明的方法进行改造，就能使得L-色氨酸的发酵量得到提高。

更本质地，在第五方面，本发明提供了改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低。

另外，优选在本发明的第一、二、三、四和/或五方面中，改造所述细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失，更优选改造所述细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。在本文中，“彻底消失”指的是不但无法检测出tdcD酶的表达和/或活性，而且使得tdcD基因座位上的基因被敲除。

本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生L-色氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。

埃希氏菌属细菌（如，大肠杆菌）中绝大多数的野生型的tdcD基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，而且本发明的具体实施方式也证实了在多种染色体上带有如SEQ IDNo：1所示的野生型的tdcD基因的细菌上实施本发明的改造，都能提高L-色氨酸的发酵量。所以优选在本文中，所述野生型的tdcD基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的引物等中间体物质。例如，在第七方面，本发明提供了引物，其多核苷酸选自，

5'GTGGGAGAGATCTCACTAAAAACTGGGGATAACGCCTTAAATGGCGAAGAAACGGTTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG3'，和

5'CATCCTGAACATCGTATACAAACTGTTTTAATCCGTAACTCAGGATGAGAAAAGAGTAACGGCTGACATGGGAATTAGC 3'。

又如，在第八方面，本发明提供了引物对，其包含下述多核苷酸：

本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-色氨酸的发酵量的方式，对于高产和低产L-色氨酸的细菌都适用，而且与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-色氨酸，便于推广应用。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

构建实施例使tdcD基因表达失活及彻底敲除

以pKD3质粒（可购自Biovector，Inc）为模板，以引物P1和P2（委托上海英俊公司合成）进行PCR扩增，获得长度为1100 bp的DNA片段。其中，PCR按如下方式进行：94℃变性30秒，52℃退火30秒，以及72℃延伸30秒（30个循环）。其中，引物序列如下：

P1:5'GTGGGAGAGATCTCACTAAAAACTGGGGATAACGCCTTAAATGGCGAAGAAACGGTTTGAGCGATTGTGTAGGCTGGAG 3'

P2:5'CATCCTGAACATCGTATACAAACTGTTTTAATCCGTAACTCAGGATGAGAAAAGAGTAACGGCTGACATGGGAATTAGC 3'

将上述ＤＮＡ片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，送测序公司进行测序鉴定，表明其不再含有tdcD酶的ORF了，保存备用。然后，将该DNA片段分别随pKD46质粒分别转化入几乎不产L-色氨酸的E. coli K12 W3110菌株（可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITE Biological Resource Center,NBRC)）和高产L-色氨酸的E. coli 1-1703菌株（可购自中科院微生物研究所，其为经E. coli K12 W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了野生型的tdcD基因）中。具体过程如下

将pKD46质粒（可购自Biovector，Inc，其包含编码Red重组酶）分别电转化入E. coli K12 W3110菌株和E. coli 1-1703菌株后，置于含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中且在30℃过夜培养，将0.5ml培养好的培养物加入到盛有50ml LB培养基的500ml锥形瓶中，并于30℃培养至0D600=0.3，加入L-阿拉伯糖至终浓度为100mmol/L，继续培养至细菌浓度OD600=0.7时离心菌体，将得到的菌体细胞10⁸个重悬于0.5mL生理盐水并加入1ug上述获得的ＤＮＡ片段，于冰中放置5min后，于1800V电击后迅速加入2mL 复苏培养基 (配方为：20g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，0.5 g/L NaCl，2.5 mM KCl，10 mM MgCl₂，20 mM葡萄糖)，于30℃复苏90 min，然后涂布于含34ng/µL氯霉素的LB抗性平板上37℃培养24 h，挑选具有氯霉素抗性的菌落，分别在含氨苄青霉素的LB平板上划线检测，保留不具有氨苄青霉素抗性的转化子。对菌体破裂后，进行PCR鉴定，扩增片段大小为1100 bp，表明宿主菌的tdcD基因已经被敲除，得到两种具有氯霉素抗性的阳性菌株，分别记为YPT-W-001（来自E. coli K12W3110菌株）和YPT-W-011（来自E. coli 1-1703）。

为了将引入的氯霉素抗性基因也敲除（使得tdcD基因座位上的基因被彻底敲除），将pCP20质粒（可购自Biovector，Inc）电转化入YPT-W-001和YPT-W-011，然后迅速加入复苏培养基 (配方同上)，于30℃复苏120 min，然后涂布于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养24 h，将这两种抗性的阳性克隆转入含有氨苄青霉素和氯霉素抗性LB液体培养基中，并在30℃条件下培养8h后，将温度调为42℃继续培养4-5h。然后，将菌液涂布于不带任何抗生素的LB平板上，挑取单克隆，分别在含氨苄青霉素的LB平板和含氯霉素的平板上划线检测，保留不具有氨苄青霉素和氯霉素抗性的菌株，表明抗生素抗性基因也被敲除，分别记为YPT-W-002（来自YPT-W-001）和YPT-W-012（来自YPT-W-011）。

效果实施例色氨酸发酵实验

将E. coli K12 W3110菌株和E. coli 1-1703以及实施例1制备的4种菌株分别接种在25mL表1所述的种子培养基中，于37℃、220rpm培养8 h。然后取1 mL种子培养基的培养物接种在25 mL表1所述的发酵培养基中，于37℃、220rpm培养培养36 h。当培养完成时，通过HPLC测定l-色氨酸的产生。

表1 培养基配方

结果如表2所示，通过本发明的构建，几乎不产色氨酸的菌株，提高L-色氨酸的产量的倍数非常可观，尽管绝对提高量比不过高产菌株，但是相对提高量却远远高于高产菌株，我们预计这是由于一些依赖于tdcD的代谢途径代偿到产色氨酸相关的途径上，从而有助于l-色氨酸产量的提高；彻底去除tdcD基因座位上的DNA片段，将比在其上保留不相干的基因要更能提高一定的色氨酸的产量，这表明调控tdcD基因表达的调控序列也会对色氨酸的生产有一定影响（另文详细公开）。

表2 色氨酸发酵量

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> 用tdcD酶表达弱化和/或酶活性降低的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

<130> CN

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1296

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 1

atgaatgaat ttccggttgt tttggttatt aactgtggtt cgtcttcgat taagttttcc 60

gtgctcgatg ccagcgactg tgaagtatta atgtcaggta ttgccgacgg tattaactcg 120

gaaaatgcat tcttatccgt aaatggggga gagccagcac cgctggctca ccacagctac 180

gaaggtgcat tgaaggcaat tgcatttgaa ctggaaaaac ggaatttaaa tgacagtgtg 240

gccttaattg gccaccgcat cgctcacggc ggcagtattt ttaccgagtc cgccattatt 300

accgatgaag tcattgataa tatccgtcgc gtttctccac tggcacccct gcataattac 360

gccaatttaa gtggtattga atcggcgcag caattatttc cgggcgtaac tcaggtggcg 420

gtatttgata ccagtttcca ccagacgatg gctccggaag cttatttata cggcctgccg 480

tggaaatatt atgaagagtt aggtgtacgc cgttatggtt tccacggcac gtcgcaccgc 540

tatgtttccc agcgcgcaca ttcgctgctg aatctggcgg aagatgactc cggcctggtt 600

gtggcgcatc ttggcaatgg cgcgtcaatc tgcgcggttc gcaacggtca gagtgttgat 660

acctcaatgg gaatgacgcc gctggaaggc ttgatgatgg gtacccgcag tggcgatgtc 720

gactttggtg cgatgtcctg ggtcgccagc caaaccaacc agagcctggg tgacctggaa 780

cgcgtagtga ataaagagtc gggattatta ggtatttccg gtctttcttc ggatttacgt 840

gttctggaaa aagcctggca tgaaggtcac gaacgcgcgc aactggcaat taaaaccttt 900

gttcaccgaa ttgcccgtca tattgccgga cacgcagctt cattacgtcg cctggatgga 960

attatattca ccggcggaat aggagagaat tcaagcttaa ttcgtcgtct ggtcatggaa 1020

catttggctg tattaggctt agagattgat acagaaatga ataatcgctc taactcctgt 1080

ggtgagcgaa ttgtttccag tgaaaatgcg cgtgtcattt gtgccgttat tccgactaac 1140

gaagaaaaaa tgattgcttt ggatgccatt catttaggca aagttaagga aggtgcgaat 1200

aagcggggaa attcttctcg gctgactcag tcatttcatt tcttcatgtt tgagccgatt 1260

ttttctcccg taaatgcctt gaatcagcct atttag 1296

Claims

1.发酵生产L-色氨酸的方法，其由如下步骤组成：

（1）改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，其中野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，而且其中所述细菌是大肠杆菌；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-色氨酸。

2.权利要求1所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失。

3.权利要求1所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。

4.权利要求1所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成抗生素抗性基因。

5.权利要求1所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成氯霉素抗性基因。

6.提高L-色氨酸的发酵量的方法，其由如下步骤组成：

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵产生L-色氨酸。

7.权利要求6所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失。

8.权利要求6所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。

9.权利要求6所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成抗生素抗性基因。

10.权利要求6所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成氯霉素抗性基因。

11.改造获得的细菌在发酵生产L-色氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因而获得，而且使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，其中野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，而且其中所述细菌是大肠杆菌。

12.权利要求11所述的应用，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失。

13.权利要求11所述的应用，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。

14.权利要求11所述的应用，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成抗生素抗性基因。

15.权利要求11所述的应用，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成氯霉素抗性基因。

16.改造获得的细菌在提高L-色氨酸的发酵量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因而获得，而且使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，其中野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，而且其中所述细菌是大肠杆菌。

17.权利要求16所述的应用，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失。

18.权利要求16所述的应用，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。

19.权利要求16所述的应用，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成抗生素抗性基因。

20.权利要求16所述的应用，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成氯霉素抗性基因。

21.改造细菌的方法，其由如下步骤组成：

改造所述细菌染色体上的野生型的tdcD基因，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性降低，其中野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，而且其中所述细菌是大肠杆菌。

22.权利要求21所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性消失。

23.权利要求21所述的方法，其中，使改造获得的细菌的tdcD酶的表达量和/或酶活性彻底消失。

24.权利要求21所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成抗生素抗性基因。

25.权利要求21所述的方法，其中，所述改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因是改造成氯霉素抗性基因。

26.权利要求21-25之一所述的方法改造而得到的细菌，其中所述细菌是大肠杆菌。