CN105349561B - 一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法。本发明提供了一种提高微生物发酵细胞密度的方法，通过在细胞周质空间表达血红蛋白和/或细胞表面展示(surfacedisplay)血红蛋白，和/或重塑细胞外膜的方法，促进血红蛋白与氧气的接触，从而提高氧气的利用效率，实现提高微生物发酵密度。实验证明，本发明构建的工程菌可以提高微生物发酵细胞密度以及胞内积累产物PHB的含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用血红蛋白提高发酵细胞密度的方法。
背景技术
高密度发酵技术一直是工业生产中要求的高效技术。对于很多需氧微生物，在发酵过程中限制细胞密度的最为重要的因素是氧气的利用。因此需要开发出了多种针对提高需氧微生物氧气利用率的技术。
目前已知的提高细胞密度的方法主要分为两类，其中一类是改变微生物的发酵条件来提高氧气的利用。例如在发酵过程中增大发酵罐中的通气量，增大发酵罐的压力，增大发酵罐搅拌桨转速，降低发酵罐中培养温度，提高输入空气中的氧气含量等方法。另外一类是利用微生物菌种改造，发明多种能够高效利用氧气的基因工程重组菌株。
现有的重组菌株大多是利用表达血红蛋白来吸收更多的氧气供给微生物本身使用。血红蛋白是一种氧结合蛋白，广泛存在于动植物和微生物中。血红蛋白的表达能够促进细菌的生长。然而目前的重组菌株大多利用血红蛋白的过表达，天然的低氧启动子启动等。由于血红蛋白在细胞质里面，细胞外膜、细胞壁和细胞膜把血红蛋白和氧气充分隔开，限制了血红蛋白与氧气的接触，氧气利用效率因此下降，不利于细胞的高密度生长。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提高微生物发酵细胞密度的方法。
本发明提供的方法，为通过如下1)-4)中至少一种方法构建重组微生物，促进重组微生物中的血红蛋白分子与氧气的接触，提高氧气的利用率，实现提高微生物发酵细胞密度：
1)在微生物细胞周质空间表达血红蛋白；使得氧气在周质空间内即可和血红蛋白发生结合，减少氧气进入细胞过程中的损失，提高利用率，从而提高细胞的生长数量和密度；
2)利用细胞表面展示将血红蛋白呈递微生物细胞外膜表面；使得血红蛋白在外膜直接与氧气发生结合，减少氧气在传入细胞内部过程的损失；
3)去除或重塑微生物细胞外膜；使表达在胞内或细胞周质空间的血红蛋白吸收更多的氧气，供给更多细胞生长繁殖，从而提高细胞的生长数量和密度；
4)在微生物细胞内过表达血红蛋白；血红蛋白可以吸收更多的细胞周围的氧气分子进入细胞内部，供给细胞生长繁殖所使用，从而提高细胞的生长数量和密度。
上述方法中，
所述提高微生物发酵细胞密度的方法为如下1)-4)中任一种：
1)在微生物细胞周质空间表达血红蛋白，
2)在微生物细胞周质空间表达血红蛋白，且利用细胞表面展示将血红蛋白呈递所述微生物细胞外膜表面；
3)在微生物细胞周质空间表达血红蛋白，且去除或重塑所述微生物细胞外膜；
4)在微生物细胞内过表达血红蛋白。
上述方法中，
所述在微生物细胞周质空间表达血红蛋白为利用双精氨酸转运系统将血红蛋白定位到微生物细胞周质空间表达；
所述细胞表面展示为膜蛋白展示技术，所述膜蛋白展示技术包括但不限于冰晶核蛋白、自体转运蛋白和S层蛋白，所述膜蛋白展示技术包括冰晶核蛋白、自体转运蛋白和S层蛋白中至少一种；
所述去除或重塑微生物细胞外膜为敲除或抑制细胞外膜的合成基因的表达，所述细胞外膜的合成基因包括LpxA、LpxC、LptD1、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、LpxL和LpxF中至少一种，所述细胞外膜的合成基因包括但不限于LpxA、LpxC、LptD1、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、LpxL和LpxF。
上述提高微生物发酵细胞密度的方法为如下A)或B)或C)或D)：
A)所示的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，使血红蛋白通过tat信号肽定位到所述重组微生物细胞周质空间表达，实现提高微生物发酵细胞密度；
B)所示的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因和转运蛋白编码基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，使血红蛋白通过转运蛋白和tat信号肽展示到所述重组微生物细胞膜外并在细胞周质空间表达，实现提高微生物发酵细胞密度；
C)所示的方法包括如下步骤：敲除出发微生物基因组中的LpxA和LptD基因，且将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子和血红蛋白编码基因导入所述出发微生物中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，促进所述重组微生物细胞内或细胞间质的血红蛋白吸收氧分子，实现提高微生物发酵细胞密度；
D)所示的方法包括如下步骤：将驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，使血红蛋白在所述重组微生物细胞内过表达，实现提高微生物发酵细胞密度。
上述方法中，
所述出发微生物为革兰氏阳性或阴性细菌，但不限于大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞菌或芽孢杆菌；
所述出发微生物包括大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞菌或芽孢杆菌；
所述提高微生物发酵细胞密度为所述重组微生物发酵后的细胞干重大于所述出发微生物发酵后的细胞干重。
上述方法中，
A)所示的方法中，所述tat信号肽编码基因、所述驱动血红蛋白表达的启动子和所述血红蛋白编码基因通过重组载体导入所述出发微生物；
B)所示的方法中，所述tat信号肽编码基因、所述驱动血红蛋白表达的启动子、所述血红蛋白编码基因和所述转运蛋白编码基因通过重组载体导入所述出发微生物；
C)所示的方法包括如下步骤：敲除出发微生物基因组中的LpxA和LptD基因，得到中间出发菌，再将所述tat信号肽编码基因、所述驱动血红蛋白表达的启动子和所述血红蛋白编码基因通过重组载体导入所述中间出发菌中，得到重组微生物；
所述敲除出发微生物基因组中的LpxA的方法为向所述出发微生物导入LpxA同源重组片段；所述LpxA同源重组片段由LpxA上游同源臂、标记基因和LpxA下游同源臂组成；
所述敲除微生物细胞基因组中的LptD为向所述出发微生物导入LptD同源重组片段；所述同源重组片段LptD由LptD上游同源臂、标记基因和LptD下游同源臂组成；
D)所示的方法中，
所述驱动血红蛋白表达的启动子和所述血红蛋白编码基因通过重组载体导入所述出发微生物。
上述方法中，
所述tat信号肽的氨基酸序列为序列表中序列18；
所述驱动血红蛋白表达的启动子为porin启动子；所述porin启动子的核苷酸序列为序列表中序列1第33-250位；
所述血红蛋白的氨基酸序列为序列表中序列19；
所述转运蛋白为Antigen43β；所述转运蛋白Antigen43β的氨基酸序列为序列表中序列20；
所述LpxA上游同源臂的核苷酸序列为序列8第1-40位核苷酸；
所述LpxA下游同源臂的核苷酸序列为序列8第1364-1403位核苷酸；
所述LpxA同源重组片段的核苷酸序列具体为序列8；
所述LptD上游同源臂的核苷酸序列为序列9第1-40位核苷酸；
所述LptD下游同源臂的核苷酸序列为序列9第1364-1403位核苷酸；
所述LptD同源重组片段的核苷酸序列具体为序列9；
A和C所示的方法中的所述重组载体的核苷酸序列为序列2；
B所示的方法中的所述重组载体的核苷酸序列为序列7；
D所示的方法中的所述重组载体的核苷酸序列为序列1；
所述tat信号肽编码基因的核苷酸序列为序列2的第277-384位核苷酸；
所述血红蛋白编码基因的核苷酸序列为序列1第277-717位；
所述转运蛋白Antigen43β编码基因的核苷酸序列为序列7第820-2799位。
上述方法在提高微生物细胞生产的化合物产量中的应用也是本发明保护的范围；
所述化合物为大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化合物具体为ALA，所述蛋白具体为phaP；所述大分子化合物具体为PHB；
或上述方法中的重组微生物也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种提高微生物细胞生产化合物产量的方法。
本发明提供的方法，利用上述方法构建重组微生物细胞的同时，向所述出发微生物导入合成化合物基因，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物细胞生产化合物产量。
上述方法中，所述化合物为大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化合物具体为ALA，所述蛋白具体为phaP；所述大分子化合物具体为PHB；
所述提高微生物细胞生产化合物产量为所述重组微生物发酵生产化合物产量大于所述表达合成化合物基因的微生物生产化合物产量；
所述表达合成化合物基因的微生物为将所述合成化合物基因导入所述出发微生物中得到的重组微生物。
上述方法为如下a)或b)或c)或d)：
a)所示的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因和合成化合物基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物细胞生产化合物产量；b)所示的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因、转运蛋白编码基因和合成化合物基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物发酵细胞密度；
c)所示的方法包括如下步骤：敲除出发微生物基因组中的LpxA和LptD基因，且将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因和合成化合物基因导入所述出发微生物中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物发酵细胞密度；
d)所示的方法包括如下步骤：将驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因和合成化合物基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物发酵细胞密度。
上述出发微生物细胞为革兰氏阳性或阴性细菌，但不限于大肠杆菌、嗜盐菌、假单胞菌或芽孢杆菌；大肠杆菌具体为E.coli Trans1T1；嗜盐菌具体为盐单胞菌TD 01。
以生产聚羟基丁酸酯PHB为例，上述合成化合物基因来源于pBHR68，通过质粒pBHR68导入出发微生物细胞E.coli Trans1T1。本发明的实验证明，本发明通过基于tat转运系统的膜间质血红蛋白蛋白表达提高细胞密度的方法，可以通过分子(基因)操作来实现，比如膜间质血红蛋白的基因操作，包括分别在细胞内或细胞周质空间过表达细胞血红蛋白基因等；本发明构建提高细胞密度的工程菌，已实例证明包括可以提高单位体积细胞积累量、单位体积PHB积累量等的产量，有的工程菌细胞干重提高了120％。且本发明的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。
附图说明
图1为质粒pSEVA331-vgb(左)和pSEVA331-tat-vgb(右)的结果示意图。
图2为质粒pSEVA331-gfp(左)和pSEVA331-tat-gfp(右)的结果示意图。
图3为质粒pSEVA331-vgb-meos(左)和pSEVA331-tat-vgb-meos(右)的结果示意图。
图4为共聚焦显微镜观察Tat转运系统转运GFP荧光蛋白定位示意图。
图5为超分辨显微镜观察VHb蛋白定位示意图。
图6为质粒pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43的结构示意图。
图7为质粒pRE112-6ISceI-LpxA(左)和pRE112-6ISceI-LptD右)的结构示意图。
图8为质粒pSEVA331-Pporin+ala的结构示意图。
图9为质粒pSEVA331-Pporin+vgb+ala(左)和pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala(右)的结构示意图。
图10为质粒pSEVA331-Pporin+phaP的结构示意图。
图11为质粒pSEVA331-Pporin+vgb+phaP(左)和pSEVA331-Pporin+tat-vgb+phaP(右)的结构示意图。
图12为ALA标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为大肠杆菌重组菌构建示意图。
所用酶试剂均购自ThermoScientific Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
LB培养基含：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
MM培养基配置方法：2g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，其余为水。溶解后高压灭菌。冷却后每50ml加入1ml组分I(10g(NH4)2SO4和2gMgSO4加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)和组分II(96.5g Na2HPO4.12H2O和15g KH2PO4，加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)。(NH4)2SO4，MgSO4，Na2HPO4.12H2O，KH2PO4购自国药集团化学试剂有限公司，目录号分别为10002992，10034998，10020392，1017628。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL氯霉素。
pBHR68载体记载在如下文献中：Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbüchel A(1999)A sensitive，viable-colony staining methodusing Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage com-pounds.Arch Microbiol 171：73-80，该质粒中含有来源于罗氏真养杆菌Ralstonia eutropha的PHB合成基因phaC基因、β-酮基硫解酶PhaA和NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶phaB。
实施例1、通过细胞内表达VHb血红蛋白基因提高发酵单位细胞密度
一、工程菌的构建
1、表达载体pSEVA331-Pporin+vgb的构建
1)、目的启动子Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01，现保存于中科院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号CGMCC4353；专利的公开号CN102816729A)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
PCR反应条件：
先95℃预变性5分钟；再95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。
PCR扩增目的片断(50μL体系)：
PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第33-250位。
2)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-1TF和G-vgb-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-1TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3’
G-vgb-2TR：5’gggttttcccagtcacgacttattcaaccgcttgagcg 3’
得到441bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第277-717位。
3)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3’
G-V-2TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第717-(3565)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带685b大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+vgb，其核苷酸序列为序列表中的序列1，质粒的结构示意图见图1的左图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)和盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)的构建
将上述1制备的表达载体pSEVA331-Pporin+vgb用电击转化法转入到E.coliTrans1T1(北京全式金生物科技有限公司CD501-01)中，获得重组菌A E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)(提取质粒，测序验证正确)；
将pSEVA331标准质粒(The Standard European Vector Architecture惠赠，http://seva.cnb.csic.es)用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得对照菌BE.coli Trans1T1(pSEVA331)；
将上述1制备的表达载体pSEVA331-Pporin+vgb和pBHR68用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌C E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)(提取质粒，测序验证正确)；
将pSEVA331标准质粒和pBHR68用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得对照菌D E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)；
将上述1获得的pSEVA331-Pporin+vgb接合转化入盐单胞菌TD01(Fu,X.-Z.etal.Development of Halomonas TD01as a host for open production ofchemicals.Metabolic engineering 23,78-91(2014).公众可从清华大学获得)，得到重组菌株TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)(提取质粒，测序验证正确)。
将pSEVA331标准质粒接合转化入盐单胞菌TD01，得到对照菌株TD01(pSEVA331)。
二、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)、TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)和TD01(pSEVA331)提高细胞密度
A、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)提高细胞密度
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)的细胞干重比对照菌E.coliTrans1T1(pSEVA331)有明显提高，得到1.86g/L，结果也如表1所示。
表1为LB培养基条件下摇瓶培养细胞干重检测
由表1的测定结果可以看出，在大肠杆菌E.coli Trans1T1过表达vgb基因，细胞干重有明显提高，能够提高发酵细菌细胞密度。
B、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)提高细胞密度
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。运用气相色谱仪(GC，Hewlett-Packard model 6890)验证细胞中均聚物的积累。运用液相色谱仪(HPLC，SpectroSYSTEM，Thermo Separation Products，USA)检测葡萄糖的消耗。
液相检测色谱柱为Bio-rad公司有机酸柱，Aninex HPX-87X Ion ExclusionColumn(300×7.8mm)。流动相为5mM H2SO4，流速为0.5ml/min。进样量为10μl。检测器使用美国SPECTRA SYSTEM公司的RI-150示差检测器。
样品检测：取1.5ml菌液，10000rpm离心后取上清液，用0.45mm滤膜过滤后作为色谱的样品。
标准曲线测定：葡萄糖水溶液。将葡萄糖的标准样品稀释不同倍数，以0.5ml/min的流速，通过HPLC检测，并绘制标准曲线。
葡萄糖标样的出峰时间为第11.051min。
结果为各组葡萄糖几乎全部用完，根据标样定量检测出各组培养基中葡萄糖的浓度，用于监测培养基中碳源的变化从而适当的补加碳源。
气相检测3-羟基丁酸均聚物的方法：
设定炉温为80℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：80℃停留1.5分钟，以30℃/min的速度升温至140℃，接着以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5分钟。样品的进样量为1μl，使用安捷伦公司生产的微量进样器。
气相样品准备：取40-60mg待测样品的干细胞(菌液10000rpm，10分钟条件下离心，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中)，加2ml氯仿，2ml酯化液(纯甲醇中含3％(v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标)于酯化管中，加盖密封后于100下加热4小时。冷却后加入1ml蒸馏水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层后，取下层氯仿相1μl注入气相色谱仪(HP公司Hewlett Packard 6890)中进行色谱分析。依照HP公司Hewlett Packard 6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。
标准样品准备：取10-20mg的3－羟基丁酸3HB(sigma-aldrich，产品货号：363502-10G)水溶液于酯化管中，加2ml氯仿，2ml酯化液，加盖密封后在100℃进行酯化。在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2.2分钟有明显出峰，表征酯化样品中的3-羟基丁酸。
以标准样品为对照，如果待测细胞的酯化样品(待测样品)在2.2分钟也有明显的出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的酯化样品有且仅有3HB单体。因为在干细胞中3HB只能以聚合物的形式存在，这样的结果即证明了均聚物的产生。
结果为E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)的干细胞在2.2分钟也有明显的出峰，并且没有其它特异出峰，说明能够生产均聚物。
通过分析气相检测到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有均聚物的比重(质量百分比％)，及每L培养体系中能够生产的均聚物或共聚物的浓度(g/L)，具体结果见表2所示。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)的细胞干重和PHB百分含量比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)有明显提高，得到5.27g/L，结果如表2所示。
表2为LB培养基条件下摇瓶培养检测结果
由表2的测定结果可以看出，在大肠杆菌E.coli Trans1T1过表达vgb基因，细胞干重有明显提高，并且PHB百分含量也有明显的提高。
C、工程菌盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)的密度提高
表达工程菌盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)和TD01(pSEVA331)分别用LB60(60g/L NaCl)在37℃培养48小时，48小时后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果如表3所示。每个菌种设置三组平行。
表3过表达vgb的重组菌生产PHB的摇瓶实验结果
由表3的测定结果可以看出，在盐单胞菌TD01中过表达vgb基因，细胞干重有明显提高，并且PHb百分含量也有一定的提高。
实施例2、通过细胞周质空间表达VHb血红蛋白基因提高发酵单位细胞密度
一、工程菌的构建
1、表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用Pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-1TF和G-tat-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-1TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-2TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第277-384位。
3)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-1TF和G-vgb-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-3TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTATGttagaccagcaaacc 3’
G-vgb-4TR：5’gggttttcccagtcacgacttattcaaccgcttgagcg 3’
得到441bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第385-825位。
4)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-3TF和G-V-4TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-3TF：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3’
G-V-4TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第825-(3673)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带793b大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，其核苷酸序列为序列表中的序列2，质粒的结构示意图见图1的右图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)和盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的构建
将上述制备的表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb用电击转化法转入到E.coliTrans1T1中，获得重组菌E E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)(提取质粒，测序验证正确)；
将上述制备的表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb和pBHR68用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌F E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)(提取质粒，测序验证正确)；
将上述获得的pSEVA331-Pporin+Tat-vgb接合转化入盐单胞菌TD01，得到重组菌株TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)(提取质粒，测序验证正确)。
二、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coliTrans1T1(pSEVA331，pBHR68)和TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)提高细胞密度
A、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)提高细胞密度
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的细胞干重比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)有明显提高，得到2.39g/L，结果也如表4所示。
表4为LB培养基条件下摇瓶培养细胞干重检测
由表4的测定结果可以看出，在大肠杆菌E.coli Trans1T1的细胞周质空间过表达vgb基因，细胞干重有明显提高。
B、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)提高细胞密度，LB培养基条件下摇瓶培养细胞干重检测。
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。运用气相色谱仪(GC，Hewlett-Packard model 6890)验证细胞中均聚物的积累。运用液相色谱仪(HPLC，SpectroSYSTEM，Thermo SeparationProducts，USA)检测葡萄糖的消耗。
结果为E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli Trans1T1(pSEVA331，pBHR68)的干细胞在2.2分钟也有明显的出峰，并且没有其它特异出峰，说明能够生产均聚物。
通过分析气相检测到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有均聚物PHB的比重(质量百分含量％)，及每L培养体系中能够生产的均聚物或共聚物的浓度(g/L)，结果见表5所示。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb，pBHR68)的细胞干重和PHB质量百分含量比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coliTrans1T1(pSEVA331，pBHR68)有明显提高，得到7.91g/L，结果也如表5所示。
表5为LB培养基条件下摇瓶培养检测结果
由表5的测定结果可以看出，在大肠杆菌E.coli Trans1T1细胞周质空间中过表达vgb基因，细胞干重相对于细胞内过表达vgb基因更加有明显提高，并且PHB积累量也有的提高。
C、工程菌盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的密度提高
表达工程菌盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)和TD01(pSEVA331)分别用LB60(60g/L NaCl)在37℃培养48h，48小时后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果如表6所示。每个菌种设置三组平行。
表6过表达vgb的重组菌生产PHB的摇瓶实验结果
由表6的测定结果可以看出，在盐单胞菌TD01细胞周质空间中过表达vgb基因，细胞干重相对于细胞内过表达vgb基因更加有明显提高，并且PHB积累量提高了50％。
三、工程菌盐单胞菌TD01(pSEVA331)、盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)和盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)发酵罐细胞密度监测
1、菌种活化
取出甘油管保存的盐单胞菌TD01(pSEVA331)、盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)和盐单胞菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)三菌株，使用灭菌牙签蘸取甘油管保藏菌种，划线于LB Cm培养基平板上(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，60g/L琼脂糖，其余为水，pH 7.0-7.2)。将划线好的平板倒置于37℃温箱中培养24h，等待菌落生长。
2、种子培养及放大
在已经生长好的平板上分别挑取对应的单克隆于20mL LB60液体培养基，于37℃、200rpm条件下培养12小时，作为种子液。种子液(培养基为LB60)经过两级放大培养接种于发酵罐。
3、发酵罐发酵培养
采用1.5L发酵罐(infors)培养，初始发酵培养基体积为0.7L，种子液(培养基为LB60)经过两级放大培养，接种量5％(v/v)，发酵培养基为LB60培养基。发酵条件如下：温度37℃，pH控制在8.5，溶氧(Dissolved oxygen,DO)设置为20％，空气流速0.7L/min，搅拌速度与溶氧偶联，最低100rpm、最高800rpm，通过H3PO4(10％(v/v))和NaOH(5M)的自动流加来调节pH。当发酵液中的葡萄糖浓度降低至低于2g/L时，采用连续补料的方式加入葡萄糖(配制成500g/L溶液)。
经过96小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果如表7所示。
表7重组菌生产发酵实验结果
由表7的测定结果可以看出，在盐单胞菌TD01细胞周质空间中过表达vgb基因，细胞干重相对于细胞内过表达vgb基因以及不表达vgb基因有非常显著提高，并且PHB积累量也有一定的提高。
四、重组菌tat转运系统的定位监测
1、表达载体pSEVA331-Pporin+sfGFP的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第33-250位。
2)、目的基因gfp的获得
以iGEM编号BBa_I746916的基因为模板，以G-gfp-1TF和G-gfp-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-gfp-1TF：5’gagaaagaggagaaatactagATGCGTAAAGGCGAAGAGc 3’
G-gfp-2TR：5’ggttttcccagtcacgacTCATTATTTGTACAGTTCATCC 3’
得到720bp的PCR产物，为目的基因gfp，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第277-996位。
3)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-5TF：5’GGATGAACTGTACAAATAATGAgtcgtgactgggaaaacc 3’
G-V-6TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第996-(3844)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带964b大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+sfGFP，其核苷酸序列为序列表中的序列3，质粒的结构示意图见图2的左图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、表达载体pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-3TF和G-tat-4TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-3TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-4TR：5’gaacagCTCTTCGCCTTTACGACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第277-384位。
3)、目的基因gfp的获得
以iGEM编号BBa_I746916的基因为模板，以G-gfp-3TF和G-gfp-4TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-gfp-3TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTCGTAAAGGCGAAGAGctgttc 3’
G-gfp-4TR：5’ggttttcccagtcacgacTCATTATTTGTACAGTTCATCC 3’
得到717bp的PCR产物，为目的基因gfp，其核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第385-1101位。
4)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3’
G-V-2TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1101-3949-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带1069bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP，其核苷酸序列为序列表中的序列4，质粒的结构示意图见图2的右图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
3、表达载体pSEVA331-Pporin+vgb+meos的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第33-250位。
2)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-5TF和G-vgb-6TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-5TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3’
G-vgb-6TR：5’GTCTGGCTTAATCGCACTCATttcaaccgcttgagcgtac 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第277-714位。
3)、目的基因meos的获得
以北京大学生物影像中心惠赠的Meos3.2基因为模板，以G-meos-1TF和G-meos-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-meos-1TF：5’gtacgctcaagcggttgaaATGAGTGCGATTAAGCCAGAC 3’
G-meos-2TR：5’cagggttttcccagtcacgacttaTCGTCTGGCATTGTCAG 3’
得到681bp的PCR产物，为目的基因meos，其核苷酸序列为序列表中序列5自5’末端第715-1395位。
4)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3’
G-V-2TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1396-(4243)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带1363bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+vgb+meos，其核苷酸序列为序列表中的序列5，质粒的结构示意图见图3的左图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
4、表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-1TF和G-tat-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-1TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-2TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第277-384位。
3)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-7TF和G-vgb-8TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-7TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTATGttagaccagcaaaccattaac 3’
G-vgb-8TR：5’GTCTGGCTTAATCGCACTCATttcaaccgcttgagcgtac 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第385-822位。
4)、目的基因meos的获得
以北京大学生物影像中心惠赠的Meos3.2基因为模板，以G-meos-1TF和G-meos-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-meos-1TF：5’gtacgctcaagcggttgaaATGAGTGCGATTAAGCCAGAC 3’
G-meos-2TR：5’cagggttttcccagtcacgacttaTCGTCTGGCATTGTCAG 3’
得到681bp的PCR产物，为目的基因meos，其核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第823-1503位。
5)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3’
G-V-2TR：5’gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列6自5’末端第1503-4351-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带1471bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos，其核苷酸序列为序列表中的序列6，质粒的结构示意图见图3的右图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
5、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+sfGFP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+meos)和E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos)的构建
将上述4制备的表达载体pSEVA331-Pporin+sfGFP、pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP、pSEVA331-Pporin+vgb+meos和pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos用电击转化法转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+sfGFP)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+meos)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos)。
将pSEVA331标准质粒用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得对照菌BE.coli Trans1T1(pSEVA331)。
6、共聚焦显微镜观察Tat转运系统转运GFP荧光蛋白定位监测
共聚焦显微镜样品准备：将E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+sfGFP)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP)发酵48h后收集收集100ul菌体，使用无菌过滤的PBS洗三遍，使用4％多聚甲醛500ul固定15分钟；再使用PBS洗两遍，使用FM4-64FX染料冰上染10分钟之后装片。
使用共聚焦显微镜观察，同一放大倍数的结果如图4(左图为E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+sfGFP)，右图为E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP))所示，可以看出E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+sfGFP)细胞中绿色荧光是均匀充满与整个细胞内部，E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-sfGFP)细菌内部绿色荧光蛋白GFP是呈现聚集于细胞膜中。说明tat转运系统将GFP荧光蛋白转运与细胞周质空间中。
7、超分辨显微镜观察VHb蛋白定位监测
共聚焦显微镜样品准备：将E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+meos)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos)发酵48h后收集收集200ul菌体，使用无菌过滤的PBS洗三遍，使用4％多聚甲醛500ul固定15分钟；再使用PBS洗两遍之后装片。
使用超分辨显微镜观察，同一放大倍数的结果如图5所示(请指明左图为E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+meos)，右图为E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos))，可以看出E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+meos)细胞中Vhb-Meos融合蛋白荧光点是均匀充满与整个细胞内部，E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb+meos)细菌内部VHb-Meos融合蛋白荧光点是呈现聚集于细胞周围两端。说明tat转运系统将VHb-Meos荧光蛋白转运与细胞周质空间中。
上述结果证明tat信号肽可以将目的蛋白血红蛋白VHb转运至细胞周质空间中表达。
实施例3、通过细胞表面展示血红蛋白提高发酵单位细胞密度
一、工程菌的构建
1、表达载体pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列7自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-1TF和G-tat-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-1TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-2TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列7自5’末端第277-384位。
3)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-7TF和G-vgb-9TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-7TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTATGttagaccagcaaaccattaac 3’
G-vgb-9TR：5’gtacaccgccatttcccatttcaaccgcttgagcgtac 3’
得到435bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列7自5’末端第389-819位。
4)、目的基因Antigen43 β的获得
以E.coli K-12MG1655基因组为模板，以G-A-1TF和G-A-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-A-1TF：5’gtacgctcaagcggttgaaatgggaaatggcggtgtac 3’
G-A-2TR：5’gggttttcccagtcacgactcagaaggtcacattcagtg 3’
得到1980bp的PCR产物，为Antigen43β片段，其核苷酸序列为序列表中序列7自5’末端第820-2799位。
5)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-1TF：5’cactgaatgtgaccttctgagtcgtgactgggaaaaccc 3’
G-V-2TR：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccg 3’
得到1987bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列7自5’末端第2799-5647-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带2767bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43，其核苷酸序列为序列表中的序列7，质粒的结构示意图见图6。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43)的构建
将上述1制备的表达载体pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43用电击转化法转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌A E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43)(提取质粒，测序验证正确)。
二、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)提高细胞密度
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
结果如表8，发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin Tat-vgb-Ag43)的细胞干重比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达150％。
表8重组菌生产发酵实验结果
实施例4、通过去除或者重塑微生物外膜提高发酵单位细胞密度
LpxA和LptD基因为合成细胞外膜相关基因，下面的实验通过敲除LpxA和LptD基因实现去除或者重塑微生物外膜。
一、工程菌的构建
1、敲除出发菌LpxA基因构建Escherichia coli Trans1T1△LpxA
以LpxA-Km TF和LpxA–Km TR为引物，以pKD13质粒(记载在如下文献中：DatsenkoK&Wanner B(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 97(12):6640-6645.公众可从清华大学获得)为模板，用pfu酶进行PCR反应扩增卡那霉素抗性基因和FRT位点，并在两段设计引入LpxA同源臂。
引物为：
LpxA-Km TF:
5’-3’ATGAAATTCAAAACAAACAAACTCAGCCTTAATCTTGTGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
LpxA-Km TR:
5’-3’TTAATTACCCTTCTTCTGTGCCGGGGTCTGGCCTTTGTTGTCTGTCAAACATGAGAATTAA
得到1403bp的PCR产物，为含有LpxA上游同源臂、Km、FRT、LpxA下游同源臂的DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列8，其中，LpxA上游同源臂为序列8自5’末端第1-40位核苷酸，Km为序列8自5’末端第121-915位核苷酸，FRT为序列8自5’末端第61-94和1283-1316位核苷酸，LpxA下游同源臂为序列8自5’末端第1364-1403位核苷酸。
将带有重组酶的质粒pKD46recA(Datsenko,K.&Wanner,B.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 97,6640-6645(2000).公众可从清华大学获得)转化到出发菌Escherichiacoli Trans1T1中，得到转化子。
取500μl转化子菌液接种到20ml新鲜LB培养基中，30℃培养至OD6000.6-0.8时加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖诱导，诱导后2h，放冰上预冷30分钟，收集3ml菌体，5000rpm离心2分钟，预冷的去离子水洗两次，预冷的10％甘油洗一次，保留100ul甘油，加入10ul含有LpxA上游同源臂、Km、LpxA下游同源臂FRT的DNA片段，混匀后转移到预冷的电击杯中，电击1.8KV，5ms。加入1ml无抗MMG培养基，37℃培养90分钟，涂MMG卡纳抗性平板，得到转化子。
将PCP20质粒(Datsenko,K.&Wanner,B.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 97,6640-6645(2000).公众可从清华大学获得.)转入阳性克隆中，通过FRT重组去除基因组上的抗性基因，得到重组菌。
对重组菌基因组上LpxA位置进行测序，结果为基因组上删除1674LpxA基因的为阳性重组菌，即为LpxA基因敲除的菌株，命名为Escherichia coli Trans1T1△LpxA，为将序列表中序列8通过同源重组的方式替换Trans1T1基因组上LpxA基因，实现敲除LpxA基因得到的重组菌。
2、敲除出发菌LptD基因构建Escherichia coli Trans1T1△LpxA△LptD
以LptD-Km TF和LptD–Km TR为引物，以pKD13质粒(记载在如下文献中：DatsenkoK&Wanner B(2000)One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 97(12):6640-6645.公众可从清华大学获得)为模板，用pfu酶进行PCR反应扩增卡那霉素抗性基因和FRT位点，并在两段设计引入LptD同源臂。
引物为：
LptD-Km TF:
ATGAAAAAACGTATCCCCACTCTCCTGGCCACCATGATTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
LptD-Km TR:
TCACAAAGTGTTTTGATACGGCAGAATGTTCGAACGCAGCCTGTCAAACATGAGAATTAA
得到1403bp的PCR产物，为含有LptD上游同源臂、Km、FRT、LptD下游同源臂的DNA片段，其核苷酸序列为序列表中序列9，其中，LptD上游同源臂为序列9自5’末端第1-40位核苷酸，Km为序列9自5’末端第121-915位核苷酸，FRT为序列9自5’末端第61-94和1283-1316位核苷酸，LptD下游同源臂为序列9自5’末端第1364-1403位核苷酸。
将带有重组酶的质粒pKD46recA(Datsenko,K.&Wanner,B.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 97,6640-6645(2000).公众可从清华大学获得)转化到出发菌Escherichiacoli Trans1T1△LpxA中，得到转化子。
取500μl转化子菌液接种到20ml新鲜LB培养基中，30℃培养至OD6000.6-0.8时加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖诱导，诱导后2h，放冰上预冷30分钟，收集3ml菌体，5000rpm离心2分钟，预冷的去离子水洗两次，预冷的10％甘油洗一次，保留100ul甘油，加入10ul含有LptD上游同源臂、Km、LptD下游同源臂FRT的DNA片段，混匀后转移到预冷的电击杯中，电击1.8KV，5ms。加入1ml无抗MMG培养基，37℃培养90分钟，涂MMG卡纳抗性平板，得到转化子。
将PCP20质粒(Datsenko,K.&Wanner,B.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 97,6640-6645(2000).公众可从清华大学获得.)转入阳性克隆中，通过FRT重组去除基因组上的抗性基因，得到重组菌。
对重组菌基因组上LptD位置进行测序，结果为基因组上删除2355bp LptD基因的为阳性重组菌，即为LptD基因敲除的菌株，命名为Escherichia coli Trans1T1△LpxA△LptD，为将序列表中序列9通过同源重组的方式替换Trans1T1△LpxA基因组上LptD基因，实现敲除LptD基因得到的重组菌。
3、敲除出发菌LpxA基因构建盐单胞菌TD01△LpxA
以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物LpxAH1-F和LpxAH1-R通过PCR扩增出LpxA在基因组上的上游500bp的DNA片段作为同源臂H1；用引物LpxAH2-F和LpxAH2-R通过PCR扩增出下游500bp的DNA片段作为同源臂H2。
其次，以引物LpxAH1-F和LpxAH2-R，同源臂H1和H2的DNA片段，通过OE PCR将H1和H2连接在一起，得到LpxA的同源DNA片段H1+H2。
再次，利用XbaI和SphI双酶切片段H1+H2，连入同样用XbaI和SphI双酶切后的pRE112-6ISceI自杀质粒骨架，转化至E.coli S17-1感受态细胞，构成6234bp质粒pRE112-6ISceI-LpxA。验证方法为利用引物pRE112-F和pRE112-R进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb，阴性片段约150bp。
表9构建自杀质粒及验证用到的引物
pRE112-6ISceI-LpxA的重组质粒，其核苷酸序列为序列表中序列10，其中，LpxA上下游同源臂(LpxA的同源DNA片段H1+H2)为序列10自5’末端第5205-6204位核苷酸，Cm为序列8自5’末端第4459-5118位核苷酸。质粒的结构示意图见图7左图。
盐单胞菌TD01作为受体菌，E.coli S17-1(pRE112-6ISceI-LpxA)作为供体菌进行接合转化，在有Cm抗性的60LB平板上筛选单克隆。得到单克隆，验证方法为：引物LpxAH1-F和pRE112-F为一组，LpxAH2-R和pRE112-R为一组(组合方式取决于同源臂片段连入自杀质粒时的方向)，分别对单克隆进行PCR验证。若两个PCR产物一个为长片段(其大小为上下游同源臂和LpxA基因长度之和，约2.8kb)，另一个为短片段(大小为上下游同源臂之和，约1000bp)，则证明该单克隆为自杀质粒通过第一次同源重组整合到基因组上的嵌入体。单克隆均为阳性嵌入体。
选取其中一个嵌入体作为受体菌，以E.coli S17-1(pBBR1MCS1-I-SceI)(Fu etal.,2014)作为供体菌进行接合转化(Fu et al.,2014)，将帮助质粒pBBR1MCS1-I-SceI转入嵌入体菌株当中。该帮助质粒上表达了归位内切酶I-SceI，会切割嵌入到基因组上的自杀质粒上的I-SceI酶切位点，形成基因组的双链断裂，从而刺激第二次同源重组的发生来修复基因组断裂。在含有壮观霉素(Spe)的60LB平板上筛选单克隆，理论上会得到随机回复为野生型的克隆和敲除型的克隆，需要对它们进行菌落PCR来验证和筛选。
为了验证该敲除型单克隆的稳定性，将该单克隆在无抗的60LB平板上划线传代。此过程也同时是为了丢失帮助质粒。随机挑选划线后长出的单克隆，对其再次进行PCR验证，用引物LpxAH1-F和LpxAH2-R扩增的条带大小全部为1.0kb，与阳性对照质粒pRE112-6ISceI-LpxA扩增出的长度相同，而阴性对照野生型TD01扩增条带大小为2.8kb，证明LpxA敲除成功，得到突变株TD01△LpxA。
4、敲除出发菌LptD基因构建盐单胞菌TD01△LpxA△LptD
以盐单胞菌TD01的基因组为模板，用引物LptDH1-F和LptDH1-R通过PCR扩增出LptD在基因组上的上游500bp的DNA片段作为同源臂H1；用引物LptDH2-F和LptDH2-R通过PCR扩增出下游500bp的DNA片段作为同源臂H2。
其次，以引物LptDH1-F和LptDH2-R，同源臂H1和H2的DNA片段，通过OE PCR将H1和H2连接在一起，得到LptD的同源DNA片段H1+H2。
再次，利用XbaI和SphI双酶切片段H1+H2，连入同样用XbaI和SphI双酶切后的pRE112-6ISceI自杀质粒骨架，转化至E.coli S17-1感受态细胞，构成质粒pRE112-6ISceI-LptD。验证方法为利用引物pRE112-F和pRE112-R进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb，阴性片段约150bp。
表9构建自杀质粒及验证用到的引物
得到6234bp pRE112-6ISceI-LptD的重组质粒，其核苷酸序列为序列表中序列11，其中，LptD上下游同源臂(LptD的同源DNA片段H1+H2)为序列11自5’末端第5205-6204位核苷酸，Cm为序列8自5’末端第4459-5118位核苷酸。质粒的结构示意图见图7右图。
将重组质粒pRE112-6ISceI-LptD导入E.coli S17-1(Fu et al.,2014)中，得到E.coli S17-1(pRE112-6ISceI-LptD)。盐单胞菌TD01△LpxA作为受体菌，E.coli S17-1(pRE112-6ISceI-LptD)作为供体菌进行接合转化，在有Cm抗性的60LB平板上筛选单克隆。得到单克隆，验证方法为：引物LptDH1-F和pRE112-F为一组，LptDH2-R和pRE112-R为一组(组合方式取决于同源臂片段连入自杀质粒时的方向)，分别对单克隆进行PCR验证。若两个PCR产物一个为长片段(其大小为上下游同源臂和LptD基因长度之和，约2.8kb)，另一个为短片段(大小为上下游同源臂之和，约1000bp)，则证明该单克隆为自杀质粒通过第一次同源重组整合到基因组上的嵌入体。单克隆均为阳性嵌入体。
选取其中一个嵌入体作为受体菌，以E.coli S17-1(pBBR1MCS1-I-SceI)(Fu etal.,2014)作为供体菌进行接合转化，将帮助质粒pBBR1MCS1-I-SceI转入嵌入体菌株当中。该帮助质粒上表达了归位内切酶I-SceI，会切割嵌入到基因组上的自杀质粒上的I-SceI酶切位点，形成基因组的双链断裂，从而刺激第二次同源重组的发生来修复基因组断裂。在含有壮观霉素(Spe)的60LB平板上筛选单克隆，理论上会得到随机回复为野生型的克隆和敲除型的克隆，需要对它们进行菌落PCR来验证和筛选。
为了验证该敲除型单克隆的稳定性，将该单克隆在无抗的60LB平板上划线传代。此过程也同时是为了丢失帮助质粒。随机挑选划线后长出的单克隆，对其再次进行PCR验证，用引物LptDH1-F和LptDH2-R扩增的条带大小全部为1.0kb，与阳性对照质粒pRE112-6ISceI-LptD扩增出的长度相同，而阴性对照野生型TD01扩增条带大小为2.8kb(图3.5)，证明LptD敲除成功，得到突变株TD01△LpxA△LptD。
5、工程菌工程菌Escherichia coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)的构建
将表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb、pSEVA331-Pporin+vgb、pSEVA331用电击转化法分别转入到E.coli Trans1T1△LpxA△LptD中，获得重组菌Escherichia coliTrans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)；将表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb、pSEVA331-Pporin+vgb、pSEVA331用结合转化法分别转入转入到TD01△LpxA△LptD中，获得重组菌TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)(提取质粒，测序验证正确)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)(提取质粒，测序验证正确)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)(提取质粒，测序验证正确)。
二、工程菌E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coliTrans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)、TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01(pSEVA331)提高细胞密度
表达工程菌工程菌E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)、TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01(pSEVA331)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
结果如表10，发现E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)的细胞干重比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、E.coliTrans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达40％。实验组E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的细胞干重比E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、E.coli Trans1T1△LpxA△LptD(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达100％。TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)的细胞干重比对照菌TD01(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、TD01(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达50％。实验组TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的细胞干重比TD01△LpxA△LptD(pSEVA331-Pporin+vgb)、TD01△LpxA△LptD(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达100％。
表10为重组菌生产发酵实验结果
实施例5、革兰氏阴性菌提高发酵单位细胞密度
一、工程菌枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+vgb)和枯草芽孢杆菌168(pSEVA331)的构建
以枯草芽孢杆菌168(Anagnostopoulos and J.Spizizen.1961.Requirement fortransformation in Bacillus subtilis.J.Bacteriol.81:741-746，公众可从清华大学获得)为出发菌，将表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb、pSEVA331-Pporin+vgb、pSEVA331分别转化进入出发菌中，获得重组菌枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)(提取质粒，测序验证正确)、枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+vgb)(提取质粒，测序验证正确)和枯草芽孢杆菌168(pSEVA331)(提取质粒，测序验证正确)。
二、工程菌枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+vgb)和枯草芽孢杆菌168(pSEVA331)提高细胞密度
表达工程菌枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)、枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+vgb)和枯草芽孢杆菌168(pSEVA331)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH 7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
结果如表11，发现枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb)的细胞干重比对照菌枯草芽孢杆菌168(pSEVA331-Pporin+vgb)和枯草芽孢杆菌168(pSEVA331)有明显提高，提高比例高达80％。
表11为重组菌生产发酵实验结果
实施例6、通过提高发酵单位细胞密度增加目的产物的产量
一、工程菌产5-氨基乙酰丙酸(ALA)的构建
1、表达载体pSEVA331-Pporin+ala的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列12自5’末端第33-250位。
2)、目的基因ALA的获得
以酵母菌为模板，以G-ALA-1TF和G-ALA-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-ALA-1TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgcaacgctccatttttg 3’
G-ALA-2TR：5’cagggttttcccagtcacgacttactgcttgataccactag 3’
得到1644bp的PCR产物，为目的基因ALA，其核苷酸序列为序列表中序列12自5’末端第277-1923位。
3)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-1TF：5’gtttctagtggtatcaagcagtaagtcgtgactgggaaaaccctg 3’
G-V-2TR：5’ctggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列12自5’末端第1923-(4771)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带1891bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+ala，其核苷酸序列为序列表中的序列12，质粒的结构示意图见图8。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、表达载体pSEVA331-Pporin+vgb+ala的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列13自5’末端第33-250位。
2)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-5TF和G-vgb-10TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-5TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3’
G-vgb-10TR：5’gaacctcgcaaaaatggagcgttgttcaaccgcttgagcgtac 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列13自5’末端第277-714位。
3)、目的基因ALA的获得
以酵母菌为模板，以G-ALA-3TF和G-ALA-4TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-ALA-3TF：5’gtacgctcaagcggttgaacaacgctccatttttgcgaggttc 3’
G-ALA-4TR：5’cagggttttcccagtcacgacttactgcttgataccactag 3’
得到1644bp的PCR产物，为目的基因ALA，其核苷酸序列为序列表中序列13自5’末端第715-2358位。
4)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-1TF：5’gtttctagtggtatcaagcagtaagtcgtgactgggaaaaccctg 3’
G-V-2TR：5’ctggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列13自5’末端第2358-(5206)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带2326bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+vgb+ala，其核苷酸序列为序列表中的序列13，质粒的结构示意图见图9的左图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
3、表达载体pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列14自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-1TF和G-tat-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-1TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-2TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列14自5’末端第277-384位。
3)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-7TF和G-vgb-11TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-7TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTATGttagaccagcaaaccattaac 3’
G-vgb-11TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATGAC 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列14自5’末端第385-822位。
4)、目的基因ALA的获得
以酵母菌为模板，以G-ALA-5TF和G-ALA-6TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-ALA-5TF：5’gatttgtacgctcaagcggttgaacaacgctccatttttgcgag 3’
G-ALA-6TR：5’cagggttttcccagtcacgacttactgcttgataccactag 3’
得到1644bp的PCR产物，为目的基因ALA，其核苷酸序列为序列表中序列14自5’末端第823-2466位。
5)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’gtttctagtggtatcaagcagtaagtcgtgactgggaaaaccctg 3’
G-V-2TR：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列14自5’末端第2466-5314-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带2434bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala，其核苷酸序列为序列表中的序列14，质粒的结构示意图见图9的右图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
3、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+ala)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+ala)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala)的构建
将上述1,2制备的表达载体pSEVA331-Pporin+ala、pSEVA331-Pporin+vgb+ala和pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala用电击转化法转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+ala)(提取质粒，测序验证正确)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+ala)(提取质粒，测序验证正确)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala)(提取质粒，测序验证正确)。
将pSEVA331标准质粒用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得对照菌BE.coli Trans1T1(pSEVA331)。
二、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+ala)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+ala)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala)提高ALA产量
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+ala)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+ala)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，2g/L葡萄糖，其余为水，pH7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
比色分析法确定操作步骤如下：
1、配制标准样品或取发酵液进行预处理。
发酵液预处理：12000rpm离心发酵液2min，用尼龙滤膜再次过滤去除菌体。将上清转入新的离心管中，4℃保存。
2、配制乙酸钠缓冲液(pH＝4.6)
量取57mL的冰乙酸、称取82g无水乙酸钠，加入量筒中，加水定容至1L。
3、乙酰丙酮反应体系配制
按一定比例对发酵液进行稀释，10倍，50倍，100倍，200倍等。取稀释液800微升，分别加入400微升的乙酸钠缓冲液和200微升的乙酰丙酮中。
4、将体系置于酯化管中，水浴煮沸反应15min。
5、配制Modified Ehrlich’s reagent
分别取30mL冰乙酸，1g对-二甲基苯甲醛，8mL70％的高氯酸，加入50mL的量筒中，通过滴加冰乙酸定容50mL。避光，低温保存，现用现配。
6、Modified Ehrlich’s reagent显色反应
冷却至室温，加入800微升Modified Ehrlich’s reagent反应，显色为枚红色
7、检测OD554值
用1cm的比色皿在波长554nm下利用分光光度计检测，若未观察到明显变化在5min,10min，15min时分别测量，取最大值(显色反应最完全)。
8、根据ALA/OD554的标准曲线计算出ALA的浓度。
9、标准曲线的制作，将0.128g的ALA盐酸盐溶于无菌水，定容到1L，配制成0.100g/L的ALA。经过稀释，得到0mg/L(无菌水)，1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L,5mg/L,6mg/L和这7个梯度的标准品溶液，用显色法检测，绘制标准曲线。
如图12所示，ALA的测定浓度X通过x＝(y-0.075)/0.120计算得出，y值为OD554测量值。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+tat-vgb+ala)的细胞ALA产量比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+ala)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb+ala)提高了60％。
三、工程菌产PhaP蛋白的构建
1、表达载体pSEVA331-Pporin-phaP的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列15自5’末端第33-250位。
2)、目的基因phaP的获得
以酵母菌为模板，以G-phaP-1TF和G-phaP-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-ALA-1TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgaatatggacgtgatcaag 3’
G-ALA-2TR：5’ggttttcccagtcacgactcaggccttgcccgtgctcttc 3’
得到351bp的PCR产物，为目的基因phaP，其核苷酸序列为序列表中序列15自5’末端第277-627位。
3)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-1TF：5’gaagagcacgggcaaggcctgagtcgtgactgggaaaacc 3’
G-V-2TR：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列15自5’末端第1923-(3475)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带1891bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+phaP，其核苷酸序列为序列表中的序列15，质粒的结构示意图见图10。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
2、表达载体pSEVA331-Pporin+vgb-phaP的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列16自5’末端第33-250位。
2)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-5TF和G-vgb-12TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-5TF：5’gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3’
G-vgb-12TR：5’gctcttgatcacgtccatattttcaaccgcttgagcgtac 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列16自5’末端第277-714位。
3)、目的基因phaP的获得
以酵母菌为模板，以G-phaP-3TF和G-phaP-4TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-phaP-3TF：5’gtacgctcaagcggttgaaaatatggacgtgatcaagagc 3’
G-phaP-4TR：5’ggttttcccagtcacgactcaggccttgcccgtgctcttc 3’
得到348bp的PCR产物，为目的基因phaP，其核苷酸序列为序列表中序列16自5’末端第715-1062位。
4)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-1TF：5’gtttctagtggtatcaagcagtaagtcgtgactgggaaaaccctg 3’
G-V-2TR：5’ctggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列16自5’末端第2358-(3910)-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带2326bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+vgb+phaP，其核苷酸序列为序列表中的序列16，质粒的结构示意图见图11的左图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
3、表达载体pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP的构建
1)、目的基因Pporin的获得
提取盐单胞菌TD01(Halomonas TD01)的基因组为模板，以G-Pporin-1TF和G-Pporin-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-Pporin-1TF：5’gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3’
G-Pporin-2TR：5’ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3’
得到218bp的PCR产物，为目的基因Pporin，其核苷酸序列为序列表中序列17自5’末端第33-250位。
2)、目的基因tat的获得
提取大肠杆菌K-12系JM109SG的基因组为模板，以G-tat-1TF和G-tat-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-tat-1TF：5’gaaagaggagaaatactagATGAACAATAACGATCTC 3’
G-tat-2TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATG 3’
得到108bp的PCR产物，为目的基因tat信号序列，其核苷酸序列为序列表中序列17自5’末端第277-384位。
3)、目的基因vgb的获得
提取透明颤菌(Vitreoscilla)的基因组为模板，以G-vgb-7TF和G-vgb-11TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-vgb-7TF：5’CATTGTTAACGCCGCGACGTATGttagaccagcaaaccattaac 3’
G-vgb-11TR：5’ggtttgctggtctaaCATACGTCGCGGCGTTAACAATGAC 3’
得到438bp的PCR产物，为目的基因vgb，其核苷酸序列为序列表中序列17自5’末端第385-822位。
4)、目的基因phaP的获得
以酵母菌为模板，以G-phaP-5TF和G-phaP-6TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-phaP-5TF：5’gtacgctcaagcggttgaaaatatggacgtgatcaagagc 3’
G-phaP-6TR：5’gggttttcccagtcacgactcaggccttgcccgtgctcttc 3’
得到348bp的PCR产物，为目的基因phaP，其核苷酸序列为序列表中序列17自5’末端第823-1170位。
5)、载体骨架的扩增
以pSEVA331标准质粒为模板，以G-V-1TF和G-V-2TR为引物，用pfu酶进行PCR扩增。
引物为：
G-V-2TF：5’gtttctagtggtatcaagcagtaagtcgtgactgggaaaaccctg 3’
G-V-2TR：5’ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatccgc 3’
得到2880bp的PCR产物，为载体骨架片段，其核苷酸序列为序列表中序列17自5’末端第1170-4018-33位。
将上述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)的DNA片段通过Gibson assembly同源重组方法连接，得到连接产物，转化到大肠杆菌Trans1T1中，得到转化子。
使用验证引物F24、R24验证引物用pfu酶进行PCR扩增得到跑胶条带，挑选条带2434bp大小的阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述(1)、(2)、(3)个片段，该质粒记作pSEVA331-Pporin+tat-vgb+phaP，其核苷酸序列为序列表中的序列17，质粒的结构示意图见图11的右图。
验证引物为：
F24：5’agcggataacaatttcacacagga 3’
R24：5’cgccagggttttcccagtcacgac 3’
3、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-phaP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-vgb-phaP)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP)的构建
将上述1,2制备的表达载体pSEVA331-Pporin+phaP、pSEVA331-Pporin+vgb+phaP和pSEVA331-Pporin+tat-vgb+phaP用电击转化法转入到E.coli Trans1T1中，获得重组菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-phaP)(提取质粒，测序验证正确)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb-phaP)(提取质粒，测序验证正确)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP)(提取质粒，测序验证正确)。
将pSEVA331标准质粒用电击转化法同时转入到E.coli Trans1T1中，获得对照菌BE.coli Trans1T1(pSEVA331)。
四、工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-phaP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb-phaP)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP)提高PhaP蛋白产量。
表达工程菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-phaP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb-phaP)和E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP)分别用LB培养基，在37℃，200rpm过夜培养；然后按5％接种量(v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基(含：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，其余为水，pH7.0-7.2)，37℃，200rpm，摇瓶培养48小时，得到菌液，经离心、水洗、冰干后得到样品的细胞干重，每个菌种设置三组平行。
对发酵细胞液破壁之后进行SDS-PAGE凝胶蛋白电泳实验，根据蛋白条带的大小判断蛋白量的表达并且将目的蛋白所在的凝胶电泳条带进行蛋白质谱学定量分析实验。
结果发现E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+Tat-vgb-phaP)的细胞phaP蛋白产量比对照菌E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin-phaP)、E.coli Trans1T1(pSEVA331-Pporin+vgb-phaP)提高了40％。
Claims (11)
1.一种提高微生物发酵细胞密度的方法，为通过构建重组微生物，在微生物细胞周质空间表达血红蛋白，促进重组微生物中的血红蛋白分子与氧气的接触，提高氧气的利用率，实现提高微生物发酵细胞密度；
所述微生物为大肠杆菌或盐单胞菌；
所述在微生物细胞周质空间表达血红蛋白为利用双精氨酸转运系统将血红蛋白定位到微生物细胞周质空间表达；
所述双精氨酸转运系统包括：氨基酸序列为序列表中序列18所示的tat信号肽；驱动血红蛋白表达的porin启动子；
所述porin启动子的核苷酸序列为序列表中序列1第33-250位；
所述血红蛋白的氨基酸序列为序列表中序列19；
所述tat信号肽编码基因的核苷酸序列为序列2的第277-384位核苷酸；
所述血红蛋白编码基因的核苷酸序列为序列1第277-717位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述提高微生物发酵细胞密度的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，使血红蛋白通过tat信号肽定位到所述重组微生物细胞周质空间表达，实现提高微生物发酵细胞密度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述提高微生物发酵细胞密度为所述重组微生物发酵后的细胞干重大于所述出发微生物发酵后的细胞干重。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述重组载体的核苷酸序列为序列2。
5.权利要求1-4中任一所述方法在提高微生物细胞生产的化合物产量中的应用；
所述化合物为大分子化合物或小分子化合物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述小分子化合物为ALA，所述大分子化合物为PHB或phaP蛋白。
7.权利要求1-4中任一所述方法中的重组微生物，在提高微生物细胞生产的化合物产量中的应用；所述化合物为大分子化合物或小分子化合物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述小分子化合物为ALA；所述大分子化合物为PHB或phaP蛋白。
9.一种提高微生物细胞生产化合物产量的方法，利用权利要求1-4中任一所述方法构建重组微生物细胞的同时，向所述出发微生物导入合成化合物基因，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物细胞生产化合物产量；所述微生物为大肠杆菌或盐单胞菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述化合物为大分子化合物或小分子化合物；
所述提高微生物细胞生产化合物产量为所述重组微生物发酵生产化合物产量大于所述表达合成化合物基因的微生物生产化合物产量；
所述表达合成化合物基因的微生物为将所述合成化合物基因导入所述出发微生物中得到的重组微生物；
所示的方法包括如下步骤：将tat信号肽编码基因、驱动血红蛋白表达的启动子、血红蛋白编码基因和合成化合物基因导入出发微生物细胞中，得到重组微生物，发酵所述重组微生物，实现提高微生物细胞生产化合物产量。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述小分子化合物为ALA，所述大分子化合物为PHB或phaP蛋白。
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