CN103952429A - 一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用。本发明对恶臭假单胞菌XPSN进行基因改造，构建6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因失活的基因工程恶臭假单胞菌P-HSP。其构建方法包括步骤：引物设计、PCR扩增、构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB、将重组质粒转移入大肠杆菌S17-1、双亲杂交。本发明还将基因工程恶臭假单胞菌P-HSP作为生物催化剂应用于尼古丁转化反应生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶中。本发明中构建的基因工程菌株转化效率高，操作简便，菌株传代稳定，能够重复使用三次，降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因工程恶臭假单胞菌，尤其涉及一种生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的基因工程恶臭假单胞菌的构建与应用。
背景技术
尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是烟草中的主要生物碱，占烟草干重的2～8％。尼古丁属于N-杂环化合物，有很好的水溶性，能够非常容易的穿过生物膜和血脑屏障。1994年美国环保总局将尼古丁定义为“有毒的危险废弃物”。因此，从烟草废弃物中去除尼古丁或者将这些废弃物转化成有价值的化合物是十分必要的。微生物处理方法是建议的快速处理烟草废物的方法之一。很多微生物能够生长在烟叶及附近土壤中，并利用尼古丁作为唯一碳、氮源和能源。同时烟草加工会造成烟草废物的大量产生，这些废物含有以尼古丁为主的有毒物质，是一种“危险的有毒废物”，给我们的生存环境带来了极大威胁。此外，随着烟草使用被逐渐限制，开发烟草的其它用途也势在必行。
吡啶类化合物是一种自然环境中广泛存在的化合物，有很多吡啶类化合物具有重要的生物学活性，在医药等领域有重要的作用。但是多数吡啶类化合物是通过经典的有机化学合成进行生产。但是吡啶类化合物的有机合成途径往往伴随着副产物的生成，并且反应过程中使用到大量的有机溶剂，这些都会增加生产成本，并对环境造成污染。生物催化因为其具有反应温和，副产物少，不使用有机溶剂等特点，可以降低生产成本，减少有机溶剂的使用。因此可以取代或者取代部分的有机合成的步骤参与化合物的合成。
6-羟基-3-琥珀酰吡啶(6-hydroxy-3-succinoylpyridine,HSP)是尼古丁吡咯代谢途径中的一个重要的中间产物，也是一种潜在的重要的化工原料，例如可以作为生产重要药物地棘蛙素(epibatidine)的前体。6-羟基-3-琥珀酰吡啶可以作为前体生产2-位取代吡啶衍生物，2,5-二位取代吡啶衍生物或者N-氧化吡啶衍生物，这些化合物往往是具有重要生物学活性的药物或者农药。
已经报道的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产都是通过尼古丁降解微生物转化实现的。1997年Roduit等人利用争论贪噬菌DSM8244野生型菌株以流加的方式发酵生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶，但是该技术反应时间长，发酵条件复杂不利于控制反应。ZL200510025598.0公开了经过优化的利用以争论贪噬菌DSM8244野生型菌株为代表的几株野生型菌株制备成的休止细胞进行6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生 产。例如：利用争论贪噬菌DSM8244野生型菌株休止细胞进行尼古丁转化反应，反应体系为7.5L，尼古丁初始浓度为7g/L，最终得到22.3g6-羟基-3-琥珀酰吡啶粉末，尼古丁转化率为35.3％(mol/mol)。但是目前已经报道或者公开的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法使用的催化剂均为野生型菌株，这些野生型菌株中天然存在有能够催化6-羟基-3-琥珀酰吡啶转化成其它化合物的酶，例如已发现的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶(HspB)会在催化反应中进一步降解6-羟基-3-琥珀酰吡啶，从而不可避免地造成产物6-羟基-3-琥珀酰吡啶的损失。为了获得纯度高，浓度高的6-羟基-3-琥珀酰吡啶，必须严格控制反应条件，这增加了反应控制难度和生产成本。
发明内容
本发明的目的在于开发一种转化效率高，操作简便，传代稳定的菌株用于6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产，并克服其在反应中进一步降解的问题。本发明构建的基因工程恶臭假单胞菌菌株(命名为P-HSP)能使6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶功能失活，阻断代谢途径，实现了6-羟基-3-琥珀酰吡啶的积累，从而提高了转化率，转化实验易于控制，降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。
本发明的技术方案如下：
1、基因工程恶臭假单胞菌P-HSP的构建方法，由以下步骤组成：
(1)利用PCR技术，以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XPSN(CCTCCNo.M205038)基因组为模板，扩增得到命名为hspB(基因序列见序列表)的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因的部分基因片段；
(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的基因片段和pK18mob质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为EcoRI和BamHI。pK18mob质粒从大肠杆菌Trans1-T1中提取获得，该质粒可以在大肠杆菌中复制，但在恶臭假单胞菌中不能复制，为恶臭假单胞菌的自杀质粒；
(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pK18mob质粒用连接酶进行连接，构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB；优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
(4)将步骤(3)中得到的敲除用重组质粒pK18mob-hspB转化入大肠杆菌S17-1中，作为双亲杂交的供体菌株；
(5)选用恶臭假单胞菌XPSN作为受体菌株培养，将其与步骤(4)中得到的供体菌株进行双亲杂交，经过筛选和验证后获得基因工程恶臭假单胞菌，命名为P-HSP。
进一步，步骤(1)中的扩增使用上游引物PH-F：5′-ccggaattcggggacaaatgtggtggtg-3′，下游引物PH-R5′-cgcggaatcccaagaactacccgaacaga-3′。
进一步，步骤(5)所述验证为PCR扩增验证，使用的引物为：上游引物mob-F：5′-cggctcgtataatgtgtgga-3′，下游引物hspB-R5′-ctacagaaaggtttccatagt-3′。
2、提供一种基因工程恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P-HSP，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014135，保藏日期为：2014年4月20日，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，分类命名：恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。
3、提供一种利用基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，以尼古丁为底物，以基因工程恶臭假单胞菌P-HSP为生物催化剂。
进一步，由以下步骤组成：
(1)斜面培养：将基因工程恶臭假单胞菌P-HSP接种到固体培养基斜面上，28-32℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，接种到含有卡那霉素的液体培养基中，28-32℃过夜培养，制得种子；优选地，卡那霉素的浓度为50μg/mL；
(3)制备休止细胞：将步骤(2)中得到的种子接种到同时含有卡那霉素和尼古丁的液体培养基中，28-32℃培养9-11小时，然后离心，收集菌体，并用0.9％NaCl洗涤一次，再用蒸馏水重悬菌体沉淀，即为恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞，4℃储存备用；优选地，卡那霉素的浓度为50μg/mL，尼古丁的浓度为1g/L，离心转速为5000转/分钟，离心时间为10分钟，用蒸馏水重悬菌体沉淀至3.4g/L细胞干重(dry cell weight，DCW)；
(4)转化反应：在恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞中加入尼古丁，调节pH至9.0，在28-32℃、110-130转/分钟的条件下振荡反应，然后终止转化反应，恶臭假单胞菌菌株P-HSP休止细胞可以分批反应，或补料分批连续转化反应。
(5)生物催化剂的分离：将步骤(4)终止反应后的混合物离心，分离沉淀，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的上清液；优选地，离心转速为5000转/分钟，离心时间为15分钟；
(6)样品浓缩：将步骤(5)中分离的上清液进行蒸馏，制得浓缩液。优选地，所述蒸馏在真空度0.08Mpa、70℃的条件下进行，浓缩也的体积是上清液体积的1/20；
(7)6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取：将步骤(6)中制得的浓缩液用盐酸调节pH至2.5以下，室温静置1.5-2.5小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀，然后去除上清，再用盐酸溶液洗涤沉淀，最后干燥所述沉淀，得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。优选地，采用抽滤的方法去除上清，用2mol/L的盐酸溶液洗涤沉淀，并在60℃干燥箱中干燥该沉淀8小时。
进一步，步骤(4)中分批反应时加入尼古丁的终浓度为6g/L，反应时间为5小时。
进一步，生物催化剂重复使用：将步骤(5)中的沉淀用蒸馏水重悬后，重新制得恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞后，并重复步骤(4)至(5)。
进一步，上述重复为一次或两次，第一次重复时，加入的尼古丁的终浓度为4g/L，反应时间为5小时，第二次重复时，加入的尼古丁终浓度为4g/L，反应时间为6小时。
进一步，可采取补料分批连续转化反应的方式进行生产：将步骤(4)制备的休止细胞中加入终浓度为6g/L的尼古丁，分别在转化开始后5小时、10小时和17小时补充4g/L尼古丁，23小时后终止转化反应。补料分批生产的催化剂不再进行重复使用。
样品检测：将步骤(7)制得的6-羟基-3-琥珀酰吡啶粉末，用HPLC、LC-ESI-MS、 13C NMR和1H NMR检测样品的纯度和结构。
本发明对于转化率和生产速率的定义如下：
6-羟基-3-琥珀酰吡啶转化率定义为(mol/mol)
6-羟基-3-琥珀酰吡啶生产速率定义为(g/L/h)为：
本发明中构建的基因工程菌株转化效率高，操作简便，菌株传代稳定，能够重复使用三次。以尼古丁为底物，利用补料分批连续转化的方法，6-羟基-3-琥珀酰吡啶的最高产量为16.3g/L，对应的反应周期仅为23小时，生产速率为0.71g/L/h，转化率为75％(mol/mol)。
附图说明
图1是本发明实施例1中检测尼古丁转化结果的HPLC图谱，其中实线和虚线分别代表反应进行0小时(尼古丁峰)和5小时(6-羟基-3-琥珀酰吡啶峰)的样品。
图2是本发明实施例2补料分批连续反应中尼古丁和6-羟基-3-琥珀酰吡啶的浓度随时间的变化图。
图3是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的LC-ESI-MS检测图谱。
图4是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的1H NMR图谱。
图5是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的13C NMR图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所 使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
构建hspB基因敲除质粒pK18mob-hspB：
本实施例中所用的菌株为恶臭假单胞菌XPSN(CCTCC No.M205038)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
(1)扩增6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因(hspB)片段：
利用恶臭假单胞菌XPSN基因组为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。
PCR扩增引物：上游引物PH-F：5′-ccgGAATTCggggacaaatgtggtggtg-3′，下游引物PH-R5′-cgcGGATCCcaagaactacccgaacaga-3′。其中下划线所标示的碱基序列分别是EcoRI和BamHI的酶切位点。
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
将得到的PCR产物用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，参照说明书中描述的方法对DNA片段进行切胶回收。
(2)提取pK18mob质粒：将含有pK18mob质粒的大肠杆菌Trans1-T1按照1％(体积比)接种量，接种至5mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中培养10h。将培养后的菌体利用普通质粒小提试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司)，参照说明书中描述的方法提取pK18mob质粒。
(3)将步骤(1)中得到的hspB基因片段和步骤(2)中得到的pK18mob质粒分别利用NEB的限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切。
双酶切反应体系：
酶切反应体系于37℃水浴锅孵育10小时。将酶切后的hspB基因片段和pK18mob质粒分别用Axygen公司的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit参照说明书中描述的方法进行回收，即获得具有粘性末端的线性基因片段和线性质粒片段。
(4)将步骤(3)中得到的双酶切后的hspB基因片段和pK18mob质粒用T4DNA连接酶(购买自New England Biolabs公司)进行连接，连接过程参照说明书中的方法，连接在16℃水浴锅中进行，反应时间为10h。获得连接后的重组质粒pK18mob-hspB。
(5)取步骤(4)中获得的重组质粒pK18mob-hspB10μL利用热激的方法(参照《分子克隆实验指南(第三版)》)转化到E.coli Trans1-T1(购买自北京全式金公司)感受态细胞中。将热激后的菌液涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培养12小时。在平板上挑取单菌落，提取质粒进行测序(委托上海博尚生物技术有限公司)，测序结果表明成功获得了hspB基因的敲除质粒pK18mob-hspB。
实施例2：
对菌株恶臭假单胞菌XPSN中hspB基因进行敲除，构建基因工程菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P-HSP。
利用双亲杂交的方法将敲除质粒pK18mob-hspB导入恶臭假单胞菌XPSN中，使敲除质粒上的hspB基因片段与恶臭假单胞菌XPSN中的hspB基因进行同源重组，使敲除质粒插入到hspB基因中，从而使hspB基因失活。
本实施例中所用的双亲杂交受体菌株为恶臭假单胞菌XPSN(CCTCC No.M205038)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
M9柠檬酸盐液体培养基：A液：将5g柠檬酸三钠溶解于适量蒸馏水中并定容至800mL。B液：将17g Na2HPO4·12H2O，3g KH2PO4，0.5g NaCl和1g NH4Cl溶解于适量蒸馏水中并定容至200mL。将A液，B液分别进行高温高压蒸汽灭菌(121℃，20min)。使用前将A、B液按照4:1的比例混合使用。
M9柠檬酸盐固体培养基：M9液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
(1)双亲杂交供体菌株的获得：取10μL重组质粒pK18mob-hspB通过热激的方法转化入大肠杆菌S17-1感受态细胞中。将热激后的菌液涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养12小时。在平板上挑取单菌落至5mL LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)中，能够生长的菌株即为转化成功的菌株命名为大肠杆菌S17-hspB，将其作为双亲杂交的供体菌株。
(2)双亲杂交供体菌株和受体菌株的培养：
种子培养：将步骤(1)中获得的双亲杂交供体菌株大肠杆菌S17-hspB接种到5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床中振荡培养过夜，摇床转速为200转/分钟。同时将双亲杂交受体菌株恶臭假单胞菌XPSN接种于5mL LB液体培养基中，30℃摇床中振荡培养过夜，摇床转速为200转/分钟。
转接培养：将过夜培养的供体菌株以5％(体积比)接种量接种于新鲜的5mlLB液体培养基中(加入50μg/mL卡那霉素)，37℃200转/分钟振荡培养；将过夜培养的受体菌株以5％(体积比)接种量接种于新鲜的5mL LB液体培养基中，30℃200转/分钟振荡培养；用分光光度计在600nm下检测细胞浊度，当600nm下吸光度到达0.6时，将两个菌株取出进行下一步的双亲杂交实验。
(3)双亲杂交过程：分别取5mL供体菌株大肠杆菌S17-hspB和1mL受体菌株恶臭假单胞菌XPSN加入离心管中，5000转/分钟离心3min；丢弃上清，用灭过菌的生理盐水(0.9％NaCl)将沉淀悬浮，5000转/分钟离心3min，弃上清。并重复该步骤一次；在用生理盐水洗涤两次之后，丢弃上清，将菌体沉淀用500μL无菌生理盐水悬起，将菌液涂布到LB固体培养基平板上，将平板放入37℃恒温培养箱中培养6h后，将平板转移到30℃恒温培养箱中，过夜培养。
第二天，用灭过菌的生理盐水清洗LB固体培养基平板上的菌苔，将菌液按照10倍梯度稀释后涂到含有50μg/mL卡那霉素的M9柠檬酸盐固体培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养过夜。
(4)双亲杂交结果筛选：将步骤(3)中M9柠檬酸盐固体培养基平板上生长的单菌落挑出，接种到5mL LB液体培养基中(加入50μg/mL卡那霉素)，30℃摇床中培养，摇床转速为200转/分钟；将培养后的菌液进行PCR扩增验证，获得hspB基因插入失活后的基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP。
PCR扩增引物：
上游引物mob-F：5′-cggctcgtataatgtgtgga-3′，下游引物hspB-R5′-ctacagaaaggtttccatagt-3′。
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
(5)基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP的保存：将步骤(4)获得的基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP在无菌操作下接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于30℃摇床中振荡培养过夜，摇床转速为200转/分钟；在无菌操作下，取过夜培养物1mL加入到灭菌的1.5mL离心管中，5000转/分钟离心3min。丢弃上清，用灭菌的15％甘油溶液将菌体沉淀重悬，制备成为甘油保藏管，将甘油保藏管迅速放到-20℃冰箱中可保存半年至一年。每隔半年，取出甘油保藏管中保存的菌株恶臭假单胞菌P-HSP进行活化，并重新保存甘油保藏管。
实施例3：
利用恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞催化的方法生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶
本实施例中所用的菌株为基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP(保藏编号为CCTCC M2014135)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
本实施例使用休止细胞催化法生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的步骤如下：
(1)斜面培养：将恶臭假单胞菌P-HSP接种于LB固体斜面培养基上，30℃培养12小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌操作下，用接种环接种至50mL LB液体培养基(加入50μg/mL卡那霉素)中进行菌株活化。接种后培养物在于30℃以转速160转/分钟，振荡培养10小时，制得种子。
(3)扩大培养：按照5％(体积比)接种量，将种子接种于1L的LB液体培养基(加入50μg/mL卡那霉素，同时加入1g/L尼古丁)中，于30℃以转速160转/分钟，振荡培养10小时。
(4)休止细胞制备：将步骤(3)培养得到的菌液，5,000转/分钟离心10min，收集菌体。丢弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀，5,000转/分钟离心10min收集菌体。用生理盐水重复洗涤一次。用蒸馏水重悬菌体沉淀至3.4g/L细胞干重(dry cell weight，DCW)，此细胞即为生物催化剂(恶臭假单胞菌P-HSP的休止细胞)，用作催化生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
(5)生物转化尼古丁生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶：
向步骤(4)制备的休止细胞中加入终浓度为6g/L的尼古丁，反应总体系为4L，用盐酸将反应液的pH调节至9.0，在30℃摇床中，转速为120转/分钟条件下，进行催化反应，5小时后终止转化反应；
(6)生物催化剂的去除：将步骤(5)中终止转化反应后的反应液在5,000转/分钟条件下离心15min。将上清转移至新的容器中，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的样品。
(7)催化剂的重复使用：将步骤(6)中离心后的菌体用蒸馏水重悬菌体沉淀至3.4g/L DCW，重复步骤(5)，所不同的是加入的尼古丁的终浓度为4g/L，反应时间为5小时。重复步骤(6)将菌体与含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶样品的上清液分离。
(8)将步骤(7)中离心后的菌体重复步骤(7)的操作，所不同的是转化反应的时间是6小时。
(9)样品浓缩：将步骤(6)(7)(8)中分离的上清液，利用真空旋转蒸发仪，在真空度0.08MPa，70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20。
(10)6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取：向步骤(9)中制得的浓缩液中加入浓盐酸(12mol/L)，调节pH小于2.5，此时样品中出现沉淀，将样品充分混合后在室温放置2小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀。将含有沉淀的样品用抽滤的方法过滤到中速分析滤纸上，用2mol/L盐酸洗涤沉淀；将洗涤后的沉淀在60℃干燥箱中干燥8小时。最后(6)(7)(8)步骤样品分别得到27.24g，19.32g，11.92g6-羟基-3-琥珀酰吡啶。6-羟基-3-琥珀酰吡啶的转化效率分别为98％、100％和92％(mol/mol)。
样品检测：将步骤(10)制备的6-羟基-3-琥珀酰吡啶样品用HPLC检测，纯度达到98％，图1为HPLC检测尼古丁转化结果的图谱，其中实线和虚线分别代表反应进行0小时(尼古丁峰)和5小时(6-羟基-3-琥珀酰吡啶峰)的样品。用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鉴定结构，鉴定结果如图3、图4和图5所示，确定所得样品为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为KR100-5C18柱(250×4.6mm，颗粒5μm，瑞典Kromasil公司)，流动相为1mM硫酸:甲醇＝88:12，流速为0.5mL/min，紫外检测器波长为210nm，259nm和276nm，柱温为30℃。，
实施例4：
使用恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞利用补料分批连续反应的方法生产6-羟基 -3-琥珀酰吡啶
本实施例中所用的菌株为基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP(保藏编号为CCTCC M2014135)。
本实施例中所用的培养基的组成如下：
LB液体培养基：酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121℃，20min。
用本发明利用补料分批连续反应法生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的步骤如下：
微生物菌种：基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP
(1)斜面培养：将恶臭假单胞菌P-HSP接种于LB固体培养基斜面上，30℃恒温培养箱中培养12小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，在无菌操作下，用接种环接种至50mL LB液体培养基(加入50μg/mL卡那霉素)中进行菌株活化。接种后培养物在30℃恒温振荡摇床中以转速160转/分钟，培养10小时，制得种子。
(3)休止细胞制备：按照5％(体积比)接种量，将种子接种到1L的LB液体培养基(加入50μg/mL卡那霉素，同时加入1g/L尼古丁)中。接种后培养物在30℃恒温振荡摇床中以转速160转/分钟，培养10小时。
(4)将步骤(3)培养得到的菌液，5,000转/分钟离心10min，收集菌体。丢弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀，5,000转/分钟离心10min收集菌体。用生理盐水重复洗涤一次。用蒸馏水重悬菌体沉淀至3.4g/L细胞干重(dry cell weight，DCW)，此细胞即为生物催化剂(恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞)，用作催化生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
(5)补料分批连续转化尼古丁生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶：
向步骤(4)制备的休止细胞中(总体积为4L)中加入终浓度为6g/L的尼古丁，用盐酸将反应液的pH调节至9.0，在30℃以120转/分钟的转速下进行催化反应。分别在转化开始后5小时，10小时，17小时向反应体系中加入终浓度为4g/L的尼古丁。反应在开始后23小时终止。
(6)生物催化剂的去除：将步骤(5)中终止转化反应后的反应液在5,000转/分钟下离心15min。将上清转移至新的容器中，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的样品。
(7)样品浓缩：将步骤(6)中分离的上清液，利用真空旋转蒸发仪，在真空度0.08MPa，70℃的条件下蒸馏浓缩至原体积的1/20。
(8)6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取：向步骤(7)中制得的浓缩液中加入浓盐酸(12mol/L)，调节pH小于2.5，此时样品中出现沉淀，将样品充分混合后在室温 放置2小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀。将含有沉淀的样品用抽滤的方法过滤到中速分析滤纸上，用2mol/L盐酸洗涤沉淀；将洗涤后的沉淀在60℃干燥箱中干燥8小时。最后步骤(6)中样品得到65.2g6-羟基-3-琥珀酰吡啶。6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产速率为0.71g/L/h，转化率为75％(mol/mol)。
(9)样品检测：将步骤(8)制备的6-羟基-3-琥珀酰吡啶样品用HPLC检测，纯度达到98％，图2为补料分批连续反应中尼古丁和6-羟基-3-琥珀酰吡啶的浓度随时间的变化图。用ESI-MS、13C NMR和1H NMR鉴定结构确定为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
HPLC方法使用Agilent1200液相色谱仪，色谱柱为KR100-5C18柱(250×4.6mm，颗粒5μm，瑞典Kromasil公司)，流动相为1mM硫酸:甲醇＝88:12，流速为0.5mL/min，紫外检测器波长为210nm，259nm和276nm，柱温为30℃。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用PCR技术，以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)XPSN(保藏编号为CCTCC No.M205038)基因组为模板，扩增得到命名为hspB的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因的部分基因片段；
(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的基因片段和pK18mob质粒进行双酶切；
(3)将步骤(2)中双酶切后的所述基因片段和所述pK18mob质粒用连接酶进行连接，构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB；
(4)将步骤(3)中得到的所述敲除用重组质粒pK18mob-hspB转化入大肠杆菌S17-1中，作为双亲杂交的供体菌株；
(5)选用恶臭假单胞菌XPSN作为受体菌株培养，将其与步骤(4)中得到的供体菌株进行双亲杂交，经过筛选和验证后获得基因工程恶臭假单胞菌，命名为P-HSP。
2.根据权利要求1所述的基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增使用上游引物PH-F：5′-ccggaattcggggacaaatgtggtggtg-3′，下游引物PH-R5′-cgcggaatcccaagaactacccgaacaga-3′。
3.根据权利要求1所述的基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中的验证为PCR扩增验证，使用的引物为：上游引物为mob-F：5′-cggctcgtataatgtgtgga-3′，下游引物为hspB-R5′-ctacagaaaggtttccatagt-3′。
4.一种根据权利要求1所述的构建方法构建的基因工程恶臭假单胞菌P-HSP，保藏编号为CCTCC M2014135，保藏于中国典型培养物保藏中心。
5.一种利用基因工程恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于以尼古丁为底物，以基因工程恶臭假单胞菌P-HSP为生物催化剂。
6.根据权利要求5所述的利用基因工程恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)斜面培养：将所述基因工程恶臭假单胞菌P-HSP接种到固体培养基斜面上，28-32℃培养11-13小时；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株，接种到含有卡那霉素的液体培养基中，28-32℃过夜培养，制得种子；
(3)制备休止细胞：将步骤(2)中得到的所述种子接种到同时含有卡那霉素和尼古丁的液体培养基中，28-32℃培养9-11小时，然后离心，收集菌体，并用0.9％NaCl洗涤一次，再用蒸馏水重悬菌体沉淀，即为恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞，4℃储存备用；
(4)转化反应：在所述恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞中加入尼古丁，调节pH至9.0，在28-32℃、110-130转/分钟的条件下振荡反应，然后终止转化反应，所述恶臭假单胞菌菌株P-HSP休止细胞可以分批反应，或补料分批连续转化反应；
(5)生物催化剂的分离：将步骤(4)终止转化反应后的混合液离心，分离沉淀，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的上清液；
(6)样品浓缩：将步骤(5)中分离得到所述上清液进行蒸馏，制得浓缩液；
(7)6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取：将步骤(6)中制得的所述浓缩液用盐酸调节pH至2.5以下，室温静置1.5-2.5小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀，然后去除上清，再用盐酸溶液洗涤得到的沉淀，最后干燥所述沉淀，得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
7.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步骤(4)中分批反应时加入尼古丁的初始浓度为6g/L，反应时间为5小时。
8.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步骤(4)中补料分批连续转化反应中先加入尼古丁的初始浓度为6g/L，然后分别在转化开始后5小时、10小时和17小时补充终浓度为4g/L的尼古丁，23小时后终止转化反应。
9.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述生物催化剂重复使用，将所述步骤(5)中的所述沉淀用蒸馏水重悬，重新制得基因工程恶臭假单胞菌P-HSP的休止细胞，并重复步骤(4)至(5)。
10.根据权利要求9所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述重复为一次或两次，第一次重复时，加入的尼古丁的终浓度为4g/L，反应时间为5小时，第二次重复时，加入的尼古丁终浓度为4g/L，反应时间为6小时。
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