JPH02265493A - プロモーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規なプロモーター配列に関する。

［従来の技術］ 今日、多種の微生物を利用し、産業上有用な物質を効率
良くまた多量に生産することが可能となってきた。とり
わけ、大腸菌を用いた系は、強力なプロモーター系、正
確な制御系、さらには多くの種類の宿主系が確立され、
微生物由来の遺伝子をはじめとし、植物、動物に至る遺
伝子まで発現制御することが可能となってきている。し
かしながら、大腸菌は、細胞内膜の外側に細胞壁、さら
にその外側に莢膜と呼ばれる膜を有し、それら３重の構
造を有するため、分泌されるタンパク質も莢膜と内股の
間にあるペリプラズム層に蓄積される。そのため、蓄積
される量も物理的に制限を受ける。また、ペリプラズム
層に蓄積されたタンパク質を取り出す場合、菌体を物理
的又は生物的方法で破砕し、抽出するという非常に複雑
な工程を必要とする。この場合、タンパク質が機械的障
害又は酵素的障害を受は活性を失うおそれがあリ、必ず
しも高い回収率は達成できない。

また、動物由来のタンパク質（例えばインターフェロン
、ヒト成長ホルモン等）を大腸菌で機能するプロモータ
ーの下流に連結し、発現を行なわせた場合、多くの場合
そのタンパク質は細胞質中に不溶性顆粒として形成され
、活性を持たない不溶物として形成される。この場合も
先の場合と同様に物理的又は生物的方法により国体を破
砕し不溶画分として、目的タンパク質を集めなければな
らない、また、大腸菌以外のタンパク質の発現であるた
め動物中では可溶性クンバク質にも関わらず大腸菌内で
は不溶性かつ不活性型として取り出される。そのため、
活性を持つ正しい三次構造のタンパク質に変性剤を用い
て再構築しなければならない、それら一連の方法は非常
に煩雑であり、実用上は不向きである。また、他の微生
物（例えば枯草菌、酵母、カビ等）を用い生産物を菌体
外に分泌させ、活性型として取り出す方法等が研究され
ているが、発現量が低いとか、宿主菌によるタンパク質
分解酵素により分解され失活するといった問題点を有し
ている。また、動物細胞による分泌発現の系も多（研究
されているが微生物に比べ増殖能が非常に低く、大量に
タンパク質を必要とする場合不向きである。

しかも、現在の技術では、宿主の種類等により、適当な
プロモーター配列を選択して使用しなければならないと
いう問題点を有している。このことは即ち、目的物の生
産を種々の宿主で実現する場合には、それら宿主内で働
く種々のプロモーター配列を準備し、プラスミドを構築
しなければならないことを意味している。

上記従来技術における問題点に鑑み、もし、所望のタン
パク質を種々の宿主に効率的に生産させることができる
プロモーター配列が存在すれば、そのような所望のタン
パク質の生産に大いに貢献することは明らかである。

［発明が解決しようとする課題Ｊ 従って、この発明の目的は、所望のタンパク質の遺伝子
工学的な分泌生産に用いることができる、高効率なプロ
モーター配列を提供することである。

（課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、高い分泌能を持つバチルス属細菌に着
目し、とりわけ高頻度で分泌されるタンパク質を選び出
して鋭意研究した結果、少なくともバチルス属細菌内及
び大腸菌内で働くプロモーター配列を見出し、かつ、こ
れを含むプラスミドを構築し、これを用いて所望のタン
パク質を生産させることに成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、少なくともバチルス属細菌内及び
大腸菌内で働くプロモーター配列を提供する。

［発明の効果］ 本発明により、少なくともバチルス属細菌及び大腸菌に
所望のタンパク質を生産させることができるプロモータ
ー配列が提供された。この発明のプロモーターは、高活
性であり、従って、これを利用してタンパク質を生産す
ると、高効率に所望のタンパク質を生産させることがで
きる。さらに、本発明のプロモーターは、後述の実施例
で明らかになるように、所望のタンパク質を菌体外分泌
生産させるために用いることも可能であり、この場合に
は該タンパク質が菌体外に分泌されるので、菌体を破砕
する必要がなくなり、その結果、タンパク質が障害を受
けることがなくなる。また、生産された所望のタンパク
質の精製も容易である。

［発明の詳細な説明Ｊ 本発明のプロモーター配列は少なくともバチルス属細菌
内及び大腸菌内の両方において機能するものであり、こ
のようなプロモーター配列は初めて見出された。このよ
うなプロモーター配列は、バチルス属細菌の耐熱性中性
プロテアーゼのプロモーター配列に見出すことができ、
下記実施例においてはバチルス・ステアロサーモフィル
スの耐熱性中性プロテアーゼ旺１（同一出願人による特
願昭６２−２５３７４９号に記載）のプロモーター配列
を採用しているがこれに限定されるものではない、好ま
しいプロモーターは、その−３５領域がＴＴＴＴＣＣｌ
−１０領域がＴＡＴＴＧＴである。ここで、「−３５領
域Ｊ及びｒ−１０領域」とは、転写開始点の上流３５塩
基目及びｌＯ塩基目の塩基配列を示すが、枯草菌では大
腸菌の場合と異なり、丁度−３５及び−１０の位置では
なく、２．３塩基のずれがある。なお、プロモーター配
列は大腸菌で十分研究された結果、−３５領域と一１０
領域に特徴があることがわかっている。下記実施例にお
いて得られたプロモーター配列の全塩基配列並びに−３
５領域及び−１０領域の位置が図１に示されている。ま
た、−３５領域と−１０領域との間の塩基数は、特に限
定されないが１図１に示すように１８塩基であることが
好。

ましい。

本発明のプロモーターは、常法により化学合成すること
によっても調製することができるし、本発明のプロモー
ターを含む天然の染色体ＤＮＡから切り出してくること
もできる。後述の実施例においては、本発明のプロモー
ターは、バチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２株（徹工研菌寄第９６４５号）の染色体ＤＮＡから得
られたものである。

本発明のプロモーターは、従来と同様の態様により、所
望のポリペプチドを高効率に生産するために用いること
ができる。すなわち、本発明のプロモーター配列及びそ
の下流に位置する所望のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、さらにはプロモーター配列の下流であって前記
構造遺伝子の上流に位置するＳＤ配列、前記構造遺伝子
の下流に位置するターミネータ−１宿主細胞内で複製す
るための複製開始点及び好ましくは形質転換株を選択す
るための、薬剤耐性や栄養要求性のような選択マーカー
を有するプラスミドを構築し、このプラスミドで枯草菌
のようなバチルス属細菌や大腸菌を常法により形質転換
し、形質転換株を培養し、培養物又は菌体から所望のポ
リペプチドを回収することにより、所望のポリペプチド
を生産することができる。このようなプラスミドは、例
えばｐＵＢｌｌｏ及びｐＴＢ５３のような市販の発現ベ
クターに本発明のプロモーター配列及び所望のポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を常法により組み込むこと
により得ることができ、このような方法は例えばＴ、　
Ｍａｎｉａｔｉｓら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、　　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
”（１９８２１，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ
ｒや、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　　６８巻、１９７９に詳しく記載されている。

本発明のプロモーターは、所望のポリペプチドの菌体内
生産のために利用することもできるが、生産されたポリ
ペプチドを菌体外に分泌させる機能を有するシグナルペ
プチドをコードする配列（以下シグナル配列と言う）及
び特に所望のポリペプチドがタンパク質分解酵素である
場合等のような必要な場合にはその下流にいわゆるプロ
構造をコードする配列を存在させることにより所望のポ
リペプチドを菌体外に分泌させることができる。下記実
施例では、バチルス・ステアロサーモフィルス關に一２
３２株由来のシグナル配列及びプロ構造コード配列を利
用して、枯草菌及び大腸菌において分泌生産を行なって
いる。

以下、この発明を実施例に基づきより具体的に説明する
。なお、下記実施例においては、各配列の具体的な塩基
配列やアミノ酸配列が示されているが、一般に、プロモ
ーター配列やＳＤ配列のような特定の機能を有する塩基
配列は、その塩基配列を構成する塩基のうち少数の塩基
がＮ換され、欠失し又は少数の塩基が付加された場合で
あっても実質的に同一の機能を果たす場合があることは
当業者において広く認識されているところである。従っ
て、下記実施例において具体的に示される塩基配列やと
は少数の塩基が置換され、欠失し又は付加されている点
において異なるが実質的に同一の機能を果たすものは下
記実施例において具体的に開示された塩基配列と実質的
に同一のものであると解釈すべきである。

１立１」 （１１Ｍに一２３２株染色体ＤＮＡの調製耐熱性中性プ
ロテアーゼｎ５１Ｍ　（同一出願人による特願昭６２−
２５３７４９号に記載）を含むバチルス・ステアロサー
モフィルスＩＪＫ−２３２株（ＭｏｔｏｋｉＫｕｂｏ、
にｅｉｉｃｈｉ　Ｍｕｒａｙａｓ＋ａ、にｏｊｉ　５ｅ
ｔｏ及びＴａｄａｙｕｋｉ　Ｉｍａｎａｋａ、　Ｊ、　
Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　６６巻、１号
、ｌａｐ、　１３−１７　、１９８８、”Ｈｉｇｈｌｙ
Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　　Ｎｅｕｔｒａｌ　　Ｐｒ
ｏｔｅａｓｅ　　ｆｒｏｍ　　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒ＋ｍｏｐｈＨｕｓ、　８’ｌ工研菌寄第
９６４５号）を１００　ｍｌのし培地を含む５００　＋
ｍｌ容量フラスコ中で一夜５５℃で培養した。遠心集菌
後、２Ｏｎ＋ｌのＴＥ緩衝液（１０１１Ｍトリス、ｌ　
ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５）で洗浄し、次いで６Ｉ
ｌｌの１５％シヨ糖−５０＋ａＭ　）リス（ｐＨ８，５
１−５０■Ｍ　ＥＤＴＡ−Ｉ　１１８７ｍｌリゾチーム
に懸濁し、水中で３０分間静置した。これに６＋＋＋１
の２％ザルコシルー５０ｍ１）リス（９Ｈ８，５１−５
０＠Ｍ　ＥＤＴＡを添加し、室温で約１５分間放置して
完全に溶菌させた０次いで５０ｍ１容量フラスコにＣｓ
Ｃ１１１ｇを入れ、さらに前記溶菌液１２ｍ１を加えた
。その後１０　鳳ｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド液０
．６　ｍｌを加えた。この液を２本の遠心管に分注し、
　ＰＲ６５Ｔローター（日立製作新製）で超遠心場で分
離した。超遠心終了後、ＤＮＡ画分を注射針で抜き取り
、ｎ−ブタノールで３回抽出を繰り返してエチジウムブ
ロマイドを除去した。このＤＮＡ試料を１（１＋＋Ｍ）
リス（ｐＨ７，５１−０，１膳Ｍ　Ｅ［ｌＴＡ中で透析
し、４℃で保存した。

（２）制限酵素処理・リガーゼ処理 枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラスミド
ｐＴＢ５３　　（文献：命中ら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１４６巻、　１０９１頁、１
９８１年；命中ら、Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３０巻、１３９９
頁、１９８４年）を常法により調製した。このｐＴＢ５
３及び上記のようにして調製したバチルス・ステアロサ
ーモフィルスＭＫ−２３２株染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐ
ｓｔＩでそれぞれ完全分解した１反応条件は次のとおり
であった。

Ｐｓｔｌ緩衝液（１０ｍＭ）リス（ｐ）！　７．４１−
１０　＋ｓＭＩＪｇｃ１．−５０　ｓＭ　ＮａＣ１−１
＋ｓＭジチオスレイトール）の１０倍濃縮液を使用する
（１０　ｘ　ＰｓｔＩ緩衝液）。

ｉｌ　　１４に−２３２ＤＮＡ　　　　　　　　　　　
３０　　μ１１０　ｘ　Ｐｓｔｌ緩衝液　　　　　　　
　１０ｊ、ｔｌウシ血清アルブミンｆ５　ｍｇ／ａｌｌ
　　　　２　　μｌ蒸留水　　　　　　　　　　　　５
６　１Ｉｌｌ　　　　　　　　　　　　　　　２　　ｕ
ｌｌｉ） ｐＴＢ５３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２０　　　μ１１０　ｘ　Ｐｓ−緩衝液　　　　　
　　　１０ｕｌウシ血清アルブミン（５＋ｍｇ／■１１
　　　２　　μｍ蒸留水　　　　　　　　　　　　　６
６　１Ｉｌｌ　　　　　　　　　　　　　　　２　　ｕ
１１反応３７℃で９０分間行なった。

２種のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そ
の後エタノールを０．４５　ｍｌ加えて１０−１５分、
２０℃放置後、遠心して上清を捨てた。沈殿をエタノー
ルで洗って脱水、脱塩し。

デシケータ−で乾燥した。乾燥物に１０　ｘ　　リガー
ゼ緩衝液（６６０ｍＭ）リス（ｐＨ７，６）　　６６　
ｍ１４ＭｇＣ１＊）　　５μｍ　、　１００　＋＊Ｍジ
チオスレイトール５μｍ　、　１０　ｗＭ　ＡＴＰ　５
μｌ、蒸留水３４μｌを加えて混合した後、ＤＮＡリガ
ーゼｌｕｌを加え、４℃、１６時間保った。これを次の
形質転換に用いた。

（３）コンピテントセルの調製 バチルス・サチルスＭＴ−２株（文献：藤井ら、Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４　＠、８３１頁、１９８
３年）をＬ培地で３７℃、−後培養した培養液を、ＴＦ
−１（Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｇ　５ａｌｔ　ｘ　１０　（
ＮＨ４１ＳＯ４２％、にＪＰＯ４１４％、　ＫＨＩＰ０
４６％、クエン酸ナトリウム１％）２＋＊１．２％カザ
ミノ酸Ｑ、２　ｍｌ、　１　ｍｇ／ｍｌアミノ酸液１　
ａｌｌ、蒸留水１４．８　＋ｗｌ　、　５％グルコース
＋０．２％Ｍｇ５Ｏ，２繻ｌ）に植え、３時間４５分振
盪培養し、ＴＦ−２（１０ｘ　Ｓｐｉｚｉｇｅｎ’ｓ　
５ａｌｔ　３．６　ｍｌ　、　２％カザミノ酸０，１８
■１．蒸留水２８．４４　ｍｌ、　５％グル：ｆ　　Ｘ
　＋　０．２％　ＭｇＳＯ４３，６ａｌｌに植え、１時
間３０分振盪培養し、コンピテントセルな得た。

（４）耐熱性中性プロテアーゼのクローニング前記（２
）のＤＮＡ溶液４０ｕｌと１ｍｌのコンピテントセルを
混合し、３７℃、３０分激しく撹拌した。これを遠心後
、３＋ｍｌのＬ培地を加え。

３７℃、２時間穏やかに撹拌した。その０．１■ｌを１
％カゼインと共にテトラサイクリン（２０μｌ／ｍｌ）
又はカナマイシン（５μｌ／ｍｌ）を含むＬＡプレート
にまいた。このプレートを１６時間、３７℃に保ち、ハ
ローを形成するコロニーな取得した。このようにして得
られた形質転換株をバチルス・サチルスＭＴ−２／ｐＴ
Ｚ２３２と命名した。バチルス・サチルスＭＴ・２／ｐ
ＴＺ２３２は昭和６１年９月３０日付で微工研に微工研
菌寄第８９８２号として寄託されている。バチルス・サ
チルスＭＴ−２／ｐＴ２２３２を培養して常法によりプ
ラスミドＤ　Ｎ　Ａ　、　ｐＴＺ２３２を得た。このプ
ラスミドの制限酵素開裂部位を図２に示す。

（５）耐熱性プロテアーゼ構造遺伝子及びその近傍の全
塩基配列の決定 プラスミドｐＴＺ２３２からＨｉｎｄＩＩＩ　−Ｐｓｔ
Ｉ断片を切り出し、ジデオキシ法によりその全塩基配列
を決定した。結果を図１に示す。

（６）プロモーター配列の同定 プラスミドｐＴＺ２３２の転写開始点を８１マツピング
法により同定した。すなわち、プラスミドｐｒｚｚ３ｚ
から旧ｎｄｌＩＩ　−Ｂａ＋ｓ旧断片を公知の方法で分
離し、Ｂａ＋＊旧５°末端をＴ４−ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用い％　［γ−”ＰＩＡＴＰでラベルした。こ
の断片と、公知の方法で分離した旺す遺伝子のｍＲＮＡ
を含むＲＮＡ画分をパイプリダイズした。

これを８１ヌクレアーゼ処理し、ＧｉｌｍａｎとＣｈａ
ｍｂｅｒｌｉｎ　（Ｃｅｌｌ　３５巻％ｐｐ、　２８５
−２９３．１９８３１記載の方法に従い、転写開始点を
決定した。その結果、図１に示すＴ（−１０領域から１
１塩基対下流）から転写されることが明らかとなった。

従って、この転写開始点より上流がプロモーター配列で
あり、検索を行なったところ、旺１（Ｊ　。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３巻、ｐｐ、　８２４−８
３１．１９８５１と非常によ（似たプロモニター配列を
見出すことができた０図１に示されるように、このプロ
モーターの一３５領域はＴＴＴＴＣＣｌ−ｉｏ領領域Ｔ
ＡＴＴＧＴであり、その間の塩基数は１８塩基であった
。

（７１ＳＤ配列の同定 （６）で決定した転写開始点の下流で、がっＡＴＧ（Ｍ
ｅｔｌ以下のオーブンリーディングフレームの上流で、
ＳＤ配列の検索を行なったところ、ＧＡＡＡＡＧＧから
成るＳＤ配列が見出された。なお、ＳＤ配列の検索は、
常法に基づき、コンセンサス配列及び従来報告されてい
るＳＤ配列の比較により行なった。

（８）シグナルペプチドコード配列の同定図１に示す塩
基配列を基にアミノ酸配列を推定したところ、唯一のオ
ーブンリーディングフレームが見出された。その結果、
図１に示すように、ＡＴＧ（Ｍｅｔｌから１９アミノ酸
から成るシグナル配列が見出された。なお、シグナルペ
プチドのアミノ酸配列は種によって大きく異なるが、船
釣に、 ↓ Ｍｅｔ−塩基性アミノ酸−疎水性アミノ酸−Ａｌａ　−
Ａｌａ（又はＡｌａ　−Ｘ−Ａｌａ）　（ｌは切断点を
示す）で表わされる約２０アミノ酸から成ることがわか
っている。

（９）プロ構造配列の同定 バチルス・ステアロサーモフィルスの菌体外に分泌され
る耐熱性プロテアーゼ旺すを、　ＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３０
００ＳＷ及びＴＳＫ　ｇｅｔ−Ｇ２０００ＳＷ　　（東
ソー株式会社製ゲルろ適用担体）によるクロマトグラフ
ィーにより精製した。その精製したタンパク質をエドマ
ン分解し、全自動シークエンサーによりそのＮ末端部分
のアミノ酸配列を同定した。その結果、ｌｌ５−Ｔｈｒ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒが同定され、　Ｉｌｅ以降が
成熟タンパク領域であり、それ以前がシグナル配列まで
プロ構造であることが同定された。

夫胤上ユ 耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドの小型
化 上記（４）で得られたプラスミドｐＴＺ２３２を２０ユ
ニツトの制限酵素Ｂｇｌ■で切断後１％アガロース電気
泳動にかけ分子量の大きいバンドのゲルを切’）　取ツ
タｅ　コノケＡｙ中（１）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲＧＥＮＥ　
ＣＬＥＡＮ（フナコシ）を用いて回収するとＢｇｌ　Ｕ
断片が得られた。

得られたＢｇｌ　ＩＩ断片を上記（２）の方法によりＤ
ＮＡリガーゼを用いライゲーションを行ない、プラスミ
ドｐＴＺ２３２を小型化した（図３）、得られたプラス
ミドをプラスミドｐＴＺ２３２Ｂｇと命名した。

ｐＴＺ２３２の制限酵素地図を図４に示す。

上記（３）で示したコンピテントセル調製に従い、プラ
スミドｐＴ２２３２８ｇを用いてバチルス・サチルスＭ
ｔ−２を形質転換した。このプラスミドを持つＭｔ−２
株は小型化前のプラスミドと同様、耐熱性中性プロテア
ーゼの生産を効率良（行なった。

支丘■ユ バチルス属細菌中で働（プロモーターの強さの測定 実施例１のプラスミドに含まれるプロモーター（−３５
領域：　ＴＴＴＴＣＣ，−１０領域：　ＴＡＴＴＧＴ）
と旺亘のプロモーター配列（−３５領域：　ＴＴＴＴＣ
Ｃ，−１０領域ＴＡＴＴ　Ｔ　Ｔ　）　　（Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３巻、８２４−８３１゜１９８
５１の強さを比較するため、同一コピー数プラスミドベ
クター及び同一宿主菌を用い、酵素活性を比較すること
によりプロモーターの強さを比べた。

すなわち、工ＴをコードするｐＮＰ２２　ｔＪ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１６３巻、ｐｐ、　８２４−
８３１．　１９８５１をＢｇｌ　ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ
で切断したもの（ｐＴＢ５３１と、公知の発現ベクター
ｐＴＢ５３をＢｇｌ　１１　％Ｈｉｎｄｉｒｌで切断し
たものとをＴ４リガーゼにより連結し、ｐＴＮＴ５３を
得た（図５）、実施例２で作製したｐＴＺ２３２Ｂｇ及
びこのｐＴＮＴ５３の両プラスミドで、それぞれバチル
ス・サチルスＭＴ−２株を形質転換した。得られた形質
転換株をＬ培地を用いて培養し、プロテアーゼ活性と生
育を調べた。結果を図６に示す６図６中、丸はプロテア
ーゼ活性（カゼイン消化法により測定）、四角は菌の生
育状態（培養液の６６０ｎ−での吸光度）を示す。

図６より明らかなように、両者共生育は同程度であるの
に、ｐＴＺ２３２８ｇを有する形質転換体は約４０００
　Ｕ／ｍｌ　（７）酵素活性を示したが、ｐＴＮＴ５３
を有するものは約２００　Ｌｌ／ｓｏ１であった。これ
らの結果から、実施例１で得られたベクター中に含まれ
る本発明のプロモーターは、工Ｔ遺伝子のプロモーター
に比べ約２０倍高いプロモーター活性を示した。

！１０九豆 大腸菌における発現 図２に示した、プロモーター配列を含む５ａｌｌ−Ｐｓ
ｔＩ断片の大きい方を実施例２で示した方法により回収
した。大腸菌中で複製可能なプラスミドｐＵｃ１９を５
ａｌＩ及びｐｓＴＩで切断後、上記虱■−Ｐｓｔｌ断片
を実施例１（２）で示した方法により連結した。該組換
えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝
酒造（株））に常法により形質転換した。得られた形質
転換株をＬ培地で３７℃。

１６時間培養した。菌体な集菌後、培地中のプロテアー
ゼ活性を測定したところ、５００　Ｕ　／ｍｌのプロテ
アーゼ活性が培地中に分泌されていた。このように本発
明のプロモーター配列は枯草菌のみならず大腸国中でも
効率良く異種タンパク質な分泌生産した。

Ｋ五五玉 ヒトウロキナーゼの分泌生産 図２に示す、シグナル配列を含む断片であるＢａ＋ｍＨ
Ｉ−Ｈｉｎｄｍ断片及びＡａｔＩ−Ｐｓｔｌ断片を抽出
した。ウロキナーゼ構造遺伝子はＬＬＬ　ＩＩ　−Ａａ
ｔＩ（Ａｇｒｉｃ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｗ、、　５２
巻、３２９−３３６．　１９８８１として抽出した。こ
れらの断片とベクターとしてｐＴＢ５３のＰｓｔＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで切断したものとを実施例１（２）に示し
た方法により連結した（図７）、このようにして得られ
た組換えプラスミドを実施例１（３）で示した方法によ
り形質転換した。得られた組換え菌をＬ培地で３７℃、
２４時間培養した。菌体を集菌後、培地中のウロキナー
ゼ活性を測定した。その結果、培地１ｍｌ当たり３００
０　Ｕ／■ｌの酵素活性を示した（ウロキナーゼの活性
測定はＳ−２４４４合成基質活性測定法（Ｈａｙａｓｈ
ｉ、　Ｓら、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　２２巻、５７
３−５７８．１９８１に従い測定した。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のプロモーター配列並びにＳＤ配列、シグ
ナルペプチドコード配列、プロ構造コード配列及び耐熱
性中性プロテアーゼ構造遺伝子を含む領域の塩基配列並
びにそれによってコードされるアミノ酸配列を示す図、 図２は本発明のプロモーター配列の１実施例を含むプラ
スミドであるｐＴＺ２３２の制限酵素地図、 図３はｐＴ２２３２を小型化しテｐＴ２２３２８ｇを作
製する工程を示す図。 図４はｐＴ２２３２８ｇ＋７）制限ｕ　素地図、図５は
比較実験に用いた。耐熱性中性プロモ−ターＴを有する
プラスミドｐＴＮＴ５３を作製する工程を示す図、 図６は本発明の１実施例のプロモーター配列を含むプラ
スミドｐＴＺ２３２８ｇ及び比較のためのプラスミドＩ
ＩＴＮ丁５３で形質転換された形質転換株の生育状態及
びプロテアーゼ活性を示す図。 図７は、ヒトウロキナーゼをコードする１本発明の１実
施例のプロモーター配列を含むプラスミドｐＭＫ４の制
限酵素地図である。 図４　（その２） 図１（そのｌ） 図１（その３）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともバチルス属細菌内及び大腸菌内で働く
   プロモーター配列。
2. （２）バチルス属細菌の耐熱性中性プロテアーゼ遺伝子
   由来のものである請求項１記載のプロモーター配列。
3. （３）バチルス・ステアロサーモフィルスの耐熱性中性
   プロテアーゼ遺伝子由来のものである請求項２記載のプ
   ロモーター配列。
4. （４）−３５領域がＴＴＴＴＣＣ、−１０領域がＴＡＴ
   ＴＧＴである請求項１記載のプロモーター配列。
5. （５）−３５領域と−１０領域との間の塩基数が１８塩
   基である請求項４記載のプロモーター配列。