CN115485557A - 用于检测CD16b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过确定CD16b的水平来确定样品中的中性粒细胞水平的方法,所述CD16b包含样品例如血液样品中的细胞内形式的CD16b。所述方法还可包括确定乳酸水平。还提供了相关的诊断和治疗方法。还提供了用于进行所述方法的套件和装置,特别是侧流套件和装置。
Description
技术领域
本发明涉及检测CD16b及其在确定中性粒细胞水平中的用途,特别是通过侧流测定。特别地,本发明提供了用于确定样品中的中性粒细胞水平的方法以及这样的方法用于诊断中性粒细胞减少和/或脓毒症的用途。本发明的多个其他方面提供了用于进行这样的方法的装置和套件。
背景技术
中性粒细胞是人和小鼠中最丰富的白细胞。其直径为12至1μm并且在外周血液循环中的半衰期为6至8小时。中性粒细胞占总白细胞计数的40至80%并且其正常范围为约1500至7500个细胞/μL。中性粒细胞代表了对入侵微生物响应的第一道线,其通过吞噬病原体和/或释放包含在特化颗粒中的抗菌因子。
化学治疗是减少白细胞(包括通过骨髓的中性粒细胞)产生的治疗的实例,其导致在循环中中性粒细胞数目下降。当中性粒细胞水平降至低于1500个细胞/μL血液时,对象患有中性粒细胞减少。由于中性粒细胞作为防御感染的第一道线而起作用,因此显著降低的水平使患者容易受到微生物攻击。认为低于1000个细胞/μL水平的中性粒细胞减少与降低患者抵抗感染的能力方面在临床上特别相关。因此,中性粒细胞减少使患者处于中性粒细胞减少性脓毒症的风险之中。
中性粒细胞减少性脓毒症(Neutropenic sepsis,NS)是例如癌症化学治疗和免疫抑制治疗的可能危及生命的并发症。其定义为脓毒症症状(包括温度高于38℃)以及中性粒细胞计数为0.5×109/L或更低(国家健康与护理卓越研究所(National Institute forHealth and Care Excellence,NICE)2012)。其是相对常见的病症,导致每500名被诊断出患有癌症的患者中约有1人死亡。
临床指南建议处于NS风险之中的患者(例如在化学治疗中的那些)即使有轻微的感染迹象(例如轻度发烧),也应立即去医院并基于紧急情况(例如在一小时内)来接受挽救生命的静脉内抗生素。这些患者进行血液测试(包括中性粒细胞水平),并在等待结果(最多2小时)的同时被自动给予抗生素以防其患有NS。
值得注意的是,约50%的患者具有正常的中性粒细胞水平并因此不一定需要去医院或接受抗生素。如果排除了NS的风险,这些患者中的许多患有轻度病毒感染,并且可由其全科医生进行检查。这些不必要的入院每年花费NHS约4000万英镑。
脓毒症是可能危及生命的病症,其由身体对感染的响应而引起。虽然NS与低的中性粒细胞计数有关,但在非中性粒细胞减少的对象(即大多数普通群体)中,脓毒症通常与超过7500个细胞/μL血液的中性粒细胞计数提高有关。脓毒症是英国死亡的主要原因,严重病例的死亡率为25至30%。
中性粒细胞计数可以使用例如流式细胞术来确定,其需要使用流式细胞仪。
发明内容
本发明人提供了用于确定作为中性粒细胞标志物的CD16b的方法。
CD16(存在于某些白细胞表面的分化分子簇)是IgG细胞表面受体。其是一种Ⅲ型Fcγ受体(片段,可结晶)。在人中,其以两种相对同源的形式-CD16a和CD16b(也分别称为FcγRⅢa和FcγRⅢb)存在。CD16a是跨膜蛋白,然而CD16b通过糖基-磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)接头锚定至质膜(Zhang et al.,2000)。
CD16蛋白在超过99%的群体中的中性粒细胞表面表达。CD16在吞噬作用、脱颗粒和氧化爆发中发挥作用。CD16b还特别地在从血管系统中去除可溶性免疫复合物中发挥作用。CD16a由中性粒细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞和树突细胞表达。它们最丰富地存在于中性粒细胞上(即只有20%的单核细胞表达CD16)。CD16b在中性粒细胞上表达,并且在嗜碱性粒细胞和活化的嗜酸性粒细胞上表达的程度要小得多,其仅占所有白细胞的1至5%。
通常估计每个中性粒细胞表达CD16b的100,000至200,000个拷贝。CD16b与FcγRIIa(CD32a)一起激活吞噬作用、中性粒细胞脱颗粒和氧化爆发,以应对病原体(Jianga etal 2016)。CD16b在激活和凋亡过程中通过蛋白酶作用从中性粒细胞脱落,导致血液中的可溶性部分。然而,其也通过细胞内储存迅速补充到细胞表面。CD16b脱落涉及由蛋白酶切割Cd16b的柄区,该蛋白酶被认为是ADAM17。该切割位点被认为在Ala195与Val196之间。
本发明人已确定CD16b的水平与中性粒细胞计数之间存在良好的正相关。特别地,如在实施例中所示,本发明人已从血液样品中分离出包含中性粒细胞的白细胞,并将所得细胞溶液分成两半。使用流式细胞术确定一半的中性粒细胞计数。另一半中存在的白细胞(包含中性粒细胞)被裂解并确定CD16b水平。确定了中性粒细胞计数与CD16b水平之间的良好正相关。
具体地,本发明人已确定在细胞内的CD16b和膜锚定的CD16b(即细胞相关CD16b)的水平与中性粒细胞计数之间存在良好的正相关。重要的是,细胞内的CD16b和膜锚定的CD16b与中性粒细胞计数之间的相关性比可溶性CD16b与中性粒细胞计数之间的相关性要好得多。因此,本发明所有方面的优选实施方案是检测CD16b或确定CD16b的水平,其包括细胞内形式的CD16b,并且更优选地还包括膜锚定形式的CD16b,并且甚至更优选地排除存在于对象样品中的至少部分可溶性形式的CD16b。因此,本文对“CD16b的检测”或“检测到的CD16b”或对“CD16b水平的确定”或“CD16b水平”的任何提及应理解为包括以下作为优选实施方案:CD16b包含细胞内形式的CD16b并且更优选地还包括膜锚定形式的CD16b,并且甚至更优选地排除存在于对象样品中的至少部分可溶性形式的CD16b。
因此,一方面,本发明提供了CD16b作为样品中中性粒细胞标志物的用途。因此,除非另有指明,否则本文对“标志物”的任何讨论应理解为包括标志物是CD16b的实施方案。
本发明人已开发了用于检测CD16b的侧流测定。该测定可用于确定样品中CD16b的水平。
因此,提供了在样品中检测CD16b的方法,该方法包括使用侧流测定检测CD16b和/或确定CD16b的水平。优选地,本文提供的任何方法或用途均采用侧流测定来检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
还提供了在样品中检测中性粒细胞和/或确定中性粒细胞水平的方法,该方法包括检测CD16b和/或确定CD16b的水平。中性粒细胞的存在和/或水平可以基于检测到的CD16b的存在或水平来确定。优选地,(检测到的)CD16b包含细胞内形式的CD16b。仍更优选地,(检测到的)CD16b包含膜锚定形式的CD16b和细胞内形式的CD16b、基本上由其组成或由其组成。
循环中的血乳酸可用作脓毒症患者中全身组织低灌注和细胞功能障碍的标志物。因此,该方法还可包括在样品中检测乳酸的步骤。该方法还可包括检测指示样品中(中性粒细胞减少性或非中性粒细胞减少性)脓毒症的存在的一种或更多种不同的标志物。该方法还可包括在样品中检测乳酸和/或确定乳酸水平的步骤。检测乳酸和/或确定乳酸水平的步骤可(i)在确定CD16b的水平之前进行,(ii)在任何细胞裂解步骤之前进行,(iii)对包含样品的可溶性组分的溶液进行,和/或(iv)通过侧流测定进行。
在样品中检测中性粒细胞和/或确定中性粒细胞水平的方法可包括:
(a)对样品进行过滤以产生以下的步骤:
(i)包含白细胞的经过滤样品,其中白细胞包含中性粒细胞,其中经过滤样品优选地耗尽了样品的可溶性组分,特别是可溶性形式的CD16b;和
(ii)包含该样品的可溶性组分的溶液;其中所述溶液优选地不含白细胞或至少不含中性粒细胞,但可包含红细胞;
(b)来自(i)的经过滤样品的细胞裂解的步骤;
(c)确定来自(b)的样品中CD16b水平的步骤,任选地在第一侧流条上;以及任选地
(d)在(ii)的溶液中检测乳酸或确定乳酸水平的步骤,任选地在第二侧流条上,
其中步骤(d),如果存在的话,可以与步骤(b)或(c)同时或顺序进行。
优选地,使用乳酸脱氢酶和试剂检测乳酸和/或确定乳酸水平,优选地,其中该试剂是显色试剂,更优选地,其中该试剂在乳酸存在下在乳酸脱氢酶作用时改变颜色。
该方法可包括以下步骤:
i.将样品添加至第一测试条的第一样品施加区,以捕获包含在第一测试条内的过滤器上的任何中性粒细胞;
ii.将具有捕获的中性粒细胞的过滤器转移到第二测试条的第二样品施加区;
iii.向过滤器添加裂解试剂以裂解中性粒细胞;以及
iv.确定CD16b的水平。
优选地,确定CD16b水平的步骤包括:
i.使裂解的中性粒细胞与包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分的缀合区接触;
ii.使裂解的中性粒细胞和至少一个与CD16b结合的经标记检测部分的混合物与以下接触:
(i)针对至少CD16b的测试线,该测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b结合,从而将CD16b固定在测试线处以通过也与CD16b结合的经标记检测部分来产生信号;或者
(ii)针对至少CD16b的测试线,该测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤ii的CD16b结合的经标记检测部分结合,从而将其固定在测试线处,产生信号。
该裂解试剂可以是表面活性剂,其可以是离子的或非离子的,例如Triton X-100。该裂解试剂应该是膜溶解试剂。
与CD16b结合的经标记检测部分可以是与可检测标记,例如金颗粒缀合的抗CD16b抗体。另外的检测部分可以是抗CD16b抗体,优选多克隆抗体。将样品添加至第一施加区的步骤之后可以是细胞洗涤步骤。过滤器可以是适合捕获中性粒细胞的膜。在一个实施方案中,手动或自动地进行转移具有捕获的中性粒细胞的膜。该方法还可包括在样品中检测乳酸和/或确定乳酸水平。
还提供了适合或特别适于进行本文提供的一种或更多种方法的装置、系统、套件或测试物质组合物。本发明可以使用如本文所述的系统、装置、测试套件或测试物质组合物来进行。
除非另有说明,否则“CD16b”意指CD16b蛋白。该CD16b可包含膜锚定形式的CD16b(更特别是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定形式的CD16b)和/或细胞内形式的CD16b、基本上由其组成或由其组成。为了有助于检测细胞内形式的CD16b,该方法可包括细胞裂解的步骤,或者对经预先处理以实现细胞裂解的样品进行。细胞裂解步骤应裂解样品中存在的至少部分中性粒细胞。优选地,该细胞裂解步骤导致至少50、60、70、80、90、95、96、97、98或99%或基本上所有的中性粒细胞裂解。细胞裂解可以是完全的或部分的。优选地,该细胞裂解至少部分地,优选基本上溶解中性粒细胞的细胞膜。优选地,该细胞裂解至少部分地、优选基本上溶解中性粒细胞的细胞内膜。因此,本文使用术语“细胞裂解”表示细胞膜至少部分被破坏;不一定需要细胞的爆裂。该细胞裂解可释放细胞内形式的CD16b,或以其他方式使其可接近检测部分,例如抗CD16b抗体。例如,细胞裂解可通过使用合适的表面活性剂来实现,该表面活性剂可以是离子的或非离子的,例如Triton x100。
细胞裂解步骤可优选进行至少10、20、30、40或50秒和/或不超过30、20或10分钟;优选约1至5分钟或约3至5分钟。
细胞裂解的步骤可
(i)在去除至少部分可溶性CD16b的步骤之后进行;或
(ii)对先前已从中去除至少部分可溶性CD16b的样品进行。
该方法还包括在确定CD16b的水平之前从样品中去除至少部分、优选大部分或所有可溶性形式的CD16b的步骤。该方法对先前已从中去除至少部分,优选大部分或所有可溶性形式的CD16b的样品进行。去除至少部分可溶性形式的CD16b的步骤可以是过滤和/或洗涤步骤,其中过滤和/或洗涤步骤优选地产生:
(i)经过滤和/或经洗涤的样品,其包含白细胞,优选中性粒细胞,其中经过滤和/或经洗涤的样品优选地耗尽了样品的可溶性组分;和
(ii)包含样品的可溶性组分的溶液;其中该溶液优选不含白细胞,优选地不含中性粒细胞,但可包含红细胞。
从样品中除去至少部分可溶性形式的CD16b的步骤可在保持样品中存在的至少大部分并且优选地基本上全部的中性粒细胞完整且优选地存活(非凋亡)的条件下进行。
在本文中可与“膜锚定形式的CD16b”或“膜锚定的CD16b”互换使用的“GPI锚定形式的CD16b”意指锚定至完整中性粒细胞中的细胞膜的CD16b。该术语应理解为包括这样的CD16b:其在使中性粒细胞经受细胞裂解步骤之前锚定至完整中性粒细胞中的细胞膜。因此,作为细胞裂解的结果,GPI锚定形式的CD16b可以锚定至细胞膜部分,或从细胞膜释放,但仍应被视为“GPI锚定形式的CD16b”。
“细胞内形式的CD16b”意指存在于完整中性粒细胞中的细胞内部的CD16b。中性粒细胞通常包含CD16b的细胞内合并物,其可以易位到膜,例如以替代从膜上脱落的膜锚定的CD16b(即可溶性CD16b)。因此,术语“细胞内形式的CD16b”包括这样的CD16b合并物。
该术语应理解为包括在使中性粒细胞经受细胞裂解步骤之前的完整中性粒细胞中的细胞内的CD16b。因此,由于细胞裂解,细胞内形式的CD16b可从细胞中释放出来,但仍应被视为“细胞内形式的CD16b”。
趋化剂可刺激CD16b从细胞内合并物易位至中性粒细胞表面。因此,CD16b可从“细胞内CD16b”转变为“GPI锚定的CD16b”。
“GPI锚定形式的CD16b”和“细胞内形式的CD16b”二者均可以被认为是中性粒细胞不主动脱落的CD16b形式,或者在从对象中获取样品之前不主动脱落的CD16b形式。换言之,“GPI锚定形式的CD16b”和“细胞内形式的CD16b”二者通常均没有被蛋白酶,例如ADAM17切割,并且因此通常具有完整的柄区。它们也可以称为“完整的”或“非截短的”或“不可溶的”CD16b。
在本文提供的任何方面的一些优选实施方案中,CD16b包含“GPI锚定形式的CD16b”与“细胞内形式的CD16b”的组合、基本上由其组成或由其组成。因此,其优选地包含“完整的”CD16b、基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中,CD16b包含可溶性形式的CD16b。在另一些实施方案中,CD16b不包含可溶性形式的CD16b。因此,该方法可包括从样品中去除可溶性形式的CD16b的步骤,或者对经预处理以去除可溶性形式的CD16b的样品进行。
“可溶性形式的CD16b”意指已由中性粒细胞主动脱落的CD16b。如上所述,脱落涉及在柄区的切割,因此可溶性形式通常缺乏C端氨基酸,例如缺乏直至Val196或Ala195的C端区。因此,可溶性形式可称为“截短的”,特别是“C-端截短的”。
“去除”在该上下文中意指至少部分可溶性形式的CD16b被去除,例如至少20、30、40或50%,优选至少60、70、80、85、90、95或99%。
中性粒细胞可持续脱落至少一些CD16b,因此将理解的是,从样品中完全去除所有可溶性形式的CD16b可能是不可能的,因为任何含有中性粒细胞的样品通常都会含有一些新脱落的CD16b。样品处理条件,例如温度和pH值可影响脱落的程度,并且该方法可包括使用或调整这样的条件以使脱落最小化的步骤。
优选地,至少相当大部分的可溶性形式的CD16b被去除。另一种观点是,去除提高了中性粒细胞与可溶性形式的CD16b的比率,例如将其提高2、3、4或5或10倍。另一种观点是,去除确保了通过该测定检测到的任何可溶性形式的CD16b的水平不影响中性粒细胞水平的确定。例如,在去除后,任何可溶性形式的CD16b的水平可以是不显著的或由于任何新的脱落而显示出与中性粒细胞水平呈正相关。
例如,这样的去除可涉及形成细胞沉淀的步骤,例如通过离心,并去除至少一些流体,例如上清液。可采用一个或更多个洗涤步骤。
或者,这样的去除可涉及对样品进行过滤以将可溶性CD16b从中性粒细胞分离的步骤。将理解的是,这样的步骤将在进行用以检测CD16b的其余步骤之前进行,例如在任何细胞裂解步骤(如果使用的话)之前进行。
例如,可以将包含白细胞(例如中性粒细胞)的样品沉积在过滤器,例如用作过滤器的合适的膜上,其中来自样品的白细胞(例如中性粒细胞)被捕获在过滤器中或过滤器上。
该过滤器应该适用于,例如配置成(i)捕获包括中性粒细胞的细胞;或(ii)专门捕获中性粒细胞。因此,过滤器可“捕获”中性粒细胞。“捕获”中性粒细胞意指中性粒细胞保留在过滤器的表面和/或内部,然而样品的其他组分,特别是例如可溶性CD16b的组分以及还优选地红细胞不被过滤器捕获。将理解的是,过滤器可能不会捕获样品中存在的100%的中性粒细胞,但其应捕获大多数或显著比例的中性粒细胞,优选存在于样品中的至少或约70、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99%的中性粒细胞。
在一些实施方案中,样品中存在的其他细胞类型也可被过滤器捕获,但在另一些实施方案中,其他细胞类型不被捕获。优选地,红细胞不被过滤器捕获。因此,优选地,过滤器被配置成选择性地捕获白细胞,特别是中性粒细胞。
因此,可使用允许从可溶性CD16b中分离中性粒细胞的合适过滤器对样品进行过滤,例如通过尺寸排阻和/或吸附。过滤器可包含合适的基质,例如LeukosorbTM,例如作为White Blood Cell Syringe Filter的部分,两者均可购自Pall LifeSciences,600South Wagner Road Ann Arbor,MI 48103-9019,USA。过滤器可优选地为膜或包含膜,例如微孔膜。血液分离膜是已知的。适合用于本发明的套件、装置和方法的过滤器包括适合用于捕获中性粒细胞的任何过滤器,例如FR1或FR2血液分离垫(可购自MdiMembrane Technologies,20-21 Industrial Area,Ambala Cantt 133 006 INDIA)),例如FR1 R2990/998/1)。该过滤器可以是检测装置的组成部分;是检测装置的模块化部分;或与检测装置分开。例如,该过滤器和检测装置可作为套件的一部分提供。如本文中其他地方所提及,检测装置优选地为侧流装置。例如,过滤器可以用作样品施加垫和/或在样品施加区中。
在一些实施方案中,该样品可包含足够的流体以允许中性粒细胞被过滤器捕获,同时允许其他样品组分,特别是可溶性CD16b并且还优选地红细胞通过过滤器。然而,在一些优选实施方案中,在将样品施加至过滤器之后,将合适的流体施加至过滤器以去除除白细胞之外的样品组分,特别是可溶性CD16b并且还优选红细胞。例如,非白细胞组分可从过滤器中冲洗掉。例如,溶液可以是缓冲液。这样的去除除白细胞之外的样品组分的步骤可称为‘洗涤’步骤。因此,该过滤步骤可优选地包括洗涤步骤,并且除非另有说明,否则任何对“过滤”的提及应理解为涵盖过滤的优选实施方案,包括洗涤步骤。
流体优选地为缓冲液并且应该选择以确保中性粒细胞保持完整并且优选地有生存力(非凋亡)。
优选地,在过滤步骤期间用溶液去除样品中至少50%、60%、70%、80%、90%或100%的非白细胞(例如非中性粒细胞)组分。优选地,样品的所有非白细胞(例如非中性粒细胞)组分均从过滤器中去除。
过滤步骤可产生包含样品的可溶性组分的溶液;其中该溶液优选地不含白细胞或至少不含中性粒细胞,但可包含红细胞。可对该溶液进行测定,例如以确定乳酸的水平。
在过滤步骤之后,该方法可包括使过滤器与侧流装置的容器或样品垫或样品施加区流体连通的步骤。例如,这可包括将具有捕获的白细胞(例如中性粒细胞)的过滤器从第一样品施加区转移到第二样品施加区。该转移可以手动或自动地进行。这可涉及接触过滤器和容器或样品垫或样品施加区;或使用流体将白细胞(例如中性粒细胞)从过滤器冲入容器或冲入样品垫或样品施加区。其可涉及旋转过滤器,例如通过围绕原点旋转约90度或约180度;或翻转过滤器(使得朝上的表面被置于朝下);或者在其他情况下以适当的方式放置和倾斜过滤器。手动或自动地转移可使用镊子或通过将过滤器从第一位置(例如初始的第一测定区域或隔室(compartment))翻转到第二位置(例如CD16b检测的区域或隔室)进行。
例如,在过滤步骤期间,可将包含中性粒细胞的样品添加至过滤器,例如第一测试条的第一样品施加区域中的膜。可将具有捕获的中性粒细胞的过滤器转移到第二测试条的第二样品施加区。优选地,该过滤器捕获中性粒细胞并在转移到第二样品施加区之前被洗涤。
例如,可对样品进行过滤以捕获白细胞。任选地,可单独收集滤液。随后在与过滤器接触的同时可裂解白细胞(例如中性粒细胞),例如使用裂解缓冲液(例如其包含表面活性剂)。或者,可将细胞从过滤器中洗脱,例如进入容器或到达装置或测试条上。
过滤步骤(如果使用的话)应在保持中性粒细胞完整且优选地非凋亡(即保持中性粒细胞存活)的条件下进行。因此,应该在使白细胞(例如中性粒细胞)凋亡和溶解最小化的方式和条件下,将白细胞(例如中性粒细胞)捕获在过滤器中或过滤器上。优选地,在过滤步骤期间,少于50%、40%、30%、20%、10%或5%的白细胞(例如中性粒细胞)被裂解或经历凋亡。优选地,超过50%、60%、70、80、90%、95%的白细胞(例如中性粒细胞)在过滤步骤期间没有被裂解或经历凋亡。如果使用过滤步骤,则白细胞(例如中性粒细胞)裂解应该(基本上)仅在过滤步骤之后进行。
在这样的过滤步骤(如果使用的话)之后,在白细胞与测试装置或测试条接触之前、同时或之后可使白细胞(例如中性粒细胞)与细胞裂解试剂(例如表面活性剂)接触。因此,测试装置可包含细胞裂解试剂。
如果细胞,优选白细胞(例如中性粒细胞)从过滤器中洗脱(完整),则该细胞悬液的体积可以例如与裂解缓冲液接触,并且随后可以将裂解的样品施加至测试装置或测试条。或者,(完整的)细胞,优选白细胞(例如中性粒细胞)可以直接施加至包含细胞裂解试剂的测试装置。例如,可用细胞裂解试剂浸渍侧流装置的样品垫。
在一些实施方案中,可溶性形式的CD16b的去除可涉及使用结合试剂,例如对可溶性形式的CD16b具有高度选择性的抗体,例如其特异性识别在脱落过程中通过蛋白酶切割产生的可溶性形式的CD16b的C端区的抗体。
在一些实施方案中,作为去除可溶性形式的CD16b的替代或补充,使用参考来校正可溶性形式的CD16b的存在,从而允许确定膜锚定形式的CD16b(更特别地,糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的CD16b)和/或细胞内形式的CD16b的水平。
本发明人已确定CD16b的水平指示样品中的中性粒细胞水平。进而,低于某个阈值(本文中其他地方讨论的)的中性粒细胞水平指示中性粒细胞减少。患有中性粒细胞减少的对象患中性粒细胞减少性脓毒症的风险提高。因此,CD16b水平指示中性粒细胞减少并可用于确定中性粒细胞减少性脓毒症的风险或诊断中性粒细胞减少性脓毒症,特别是如果对象具有一种或更多种感染症状,例如温度高于38℃。
在本文提供的任何方法或装置中,在确定CD16b以及任选地一种或更多种另外的标志物(例如乳酸)的水平之前不超过24小时可优选地从对象中获取样品,优选地在确定CD16b以及任选一种或更多种另外的标志物(例如乳酸)的水平之前不超过4、3、2或1小时或者30、25、20、15、10或5分钟从对象中获取样品。
本发明的方法非常快,可在少于60、45、30或15分钟内确定CD16b(和任选地其他标志物,例如乳酸)的水平和相应的中性粒细胞水平。优选地,可在少于15分钟内确定CD16b(和任选地其他标志物,例如乳酸)的水平。
本发明的方法优选地在进行本文公开的方法步骤之前不需要孵育样品(例如用外源添加的任何细胞信号传导分子)的步骤。
高于某个阈值(本文中其他地方讨论的)的中性粒细胞水平指示脓毒症。为了区分这样的脓毒症与中性粒细胞减少性脓毒症,可以使用术语“非中性粒细胞减少性”脓毒症。
还提供了用于在对象中预测、诊断、排除和/或监测中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法,该方法包括在样品中检测CD16b和/或确定CD16b的水平。优选地,CD16b包含细胞内形式的CD16b,并且优选地还包含GPI锚定形式的CD16b,并且优选地排除至少部分可溶性形式的CD16b。
在本文提供的任何方法中,样品中中性粒细胞水平的确定可基于确定的CD16b水平(如本文中其他地方所讨论的,其优选地包含细胞内形式的CD16b并且优选地还包含GPI锚定形式的CD16b并且优选地排除至少部分可溶性形式的CD16b)来进行。虽然可以以这样的方式进行中性粒细胞水平的确定,但作为替换地,CD16b水平可方便地用作中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的间接标志物。
CD16b水平和/或中性粒细胞水平的确定可以是例如半定量或定量的。人血液样品中中性粒细胞的正常范围为约1500至7500个细胞/μL。具有已知中性粒细胞计数的样品的连续稀释可用于确定如何将确定的CD16b水平转变为中性粒细胞计数。
CD16b水平和/或中性粒细胞水平可被确定为高于或低于预定阈值。阈值水平可从群体研究中限定或可特定于个体。在特定于个体的情况下,该水平可反映在一个或更多个较早时间点获取的那些。下面讨论合适阈值的详细描述。应当自然地理解,这些段落中的“标志物”可以是CD16b,但讨论也适用于任何其他合适的标志物。
在一些实施方案中,标志物(例如CD16b)的阈值水平通过确定在一个或更多个较早时间点获取自对象的血液样品中的标志物水平来设置。在其最简单的形式中,本发明可以依赖于受试样品与先前获取的样品(即单个较早时间点)中的标志物水平之间的简单比较。然而,通常,较早时间点可以包含至少两个,并且可能至少3、4、5、6、7、8、9或10个较早的测量值,其在确定当前样品中的标志物水平之前。那些较早的测量值可以在数天或数周,例如1、2、3、4、5或6周或更长时间内获取。在健康(非中性粒细胞减少性的和非脓毒症性)状态期间可以设置基线以确定测量未来水平变化所针对的初始阈值。健康(非中性粒细胞减少性和非脓毒症性)状态可最初通过常规方法,例如通过流式细胞术的中性粒细胞计数来确定。
在多个时间点测量标志物水平的情况下,可计算这些水平的平均值以提供受试样品的阈值。在一些实施方案中,阈值可以参考滑动窗口来设置,已在该滑动窗口内测量了标志物的水平,以提供基线。因此,阈值水平是由系统“学习”出来的。
阈值水平可参考包含与中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症状态相关限定的样品的训练数据集来设置。阈值水平可根据所采用的测量技术而有所不同。本文阐述了示例性的群体阈值。
半定量确定可涉及确定中性粒细胞水平是否为“正常的”。“正常的”中性粒细胞水平,其也可称为“健康的”、“非中性粒细胞减少的”和/或“非感染的”中性粒细胞水平,其可限定为约1500至7500个中性粒细胞/μL血液。“正常的”CD16b,也可称为“健康的”、“非中性粒细胞减少的”和/或“非感染的”CD16b水平,其可限定为存在于样品中的通常为约1500至7500个中性粒细胞/μL血液的水平。例如,这可等同于约5至25ng/ml CD16b,其可例如对应于25至80CU的立方单位读数。
“正常的”乳酸水平,其也可称为“健康的”、“非中性粒细胞减少的”和/或“非感染的”乳酸水平,可限定为存在于样品中的通常为约1500至7500个中性粒细胞/μL血液的水平。
半定量确定可涉及确定中性粒细胞水平是否为“中性粒细胞减少的”。“中性粒细胞减少的”中性粒细胞水平可限定为少于1500个中性粒细胞/μL血液,优选少于1400、1300、1200、1100或1000个细胞/μL血液。“中性粒细胞减少的”CD16b水平可限定为存在于样品中的通常为少于1500个中性粒细胞/μL血液,优选少于1400、1300、1200、1100或1000个中性粒细胞/μL血液的水平。
例如,这可以等同于约<5ng/mL CD16b,其可例如对应于<25CU的立方单位读数。
“中性粒细胞减少的”乳酸水平可限定为存在于样品中的通常为少于1500个中性粒细胞/μL血液,优选少于1400、1300、1200、1100或1000个中性粒细胞/μL血液的水平。
半定量确定可涉及确定中性粒细胞水平是否为“严重中性粒细胞减少的”。作为“中性粒细胞减少的”水平的子集的“严重中性粒细胞减少的”中性粒细胞水平可限定为小于1000个细胞/μL血液,优选少于900、800、700、600、500、400或300个细胞/μL血液。“严重中性粒细胞减少的”CD16b水平可限定为存在于样品中的通常为少于1000个中性粒细胞/μL血液,优选少于900、800、700、600、500、400或300个中性粒细胞/μL血液的水平。“严重中性粒细胞减少的”乳酸水平可限定为存在于样品中的通常为少于1000个中性粒细胞/μL血液,优选少于900、800、700、600、500、400或300个中性粒细胞/μL血液的水平。
半定量确定可涉及确定中性粒细胞水平是否为“异常高的”。“异常高的”中性粒细胞水平可限定为超过7500个中性粒细胞/μL血液,优选超过7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500或9000个细胞/μL血液。“异常高的”CD16b水平可限定为存在于样品中的通常为超过7500个中性粒细胞/μL血液的水平,优选超过7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500或9000个细胞/μL血液的水平。“异常高的”乳酸水平可以限定为存在于样品中的通常为超过7500个中性粒细胞/μL血液的水平,优选超过7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500或9000个细胞/μL血液的水平。
在健康对象中,乳酸水平通常为约1.0至1.5mmol/L血液。乳酸水平的半定量确定可涉及确定乳酸水平是否为“正常的”、“升高的”或“异常高的”,其中“正常的”乳酸水平可限定为约1.0至1.5mmol/L,“升高的”乳酸水平可以限定为约1.5至2.0mmol/L,并且“异常高”的乳酸水平可以限定为大于约2.0mmol/L,例如大于2.5、2.7、3、3.5、3.7或4.0mmol/L。
因此,低于预定阈值的CD16b水平或中性粒细胞水平,例如“中性粒细胞减少的”或“严重中性粒细胞减少的”水平可指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著。高于预定阈值的CD16b水平或中性粒细胞水平,例如“中性粒细胞减少的”水平可指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著。
高于预定阈值的CD16b水平或中性粒细胞水平,例如“异常高”的中性粒细胞水平可指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症和/或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著。
可以使用一个或更多个适当阈值,优选地至少或恰好2或3个。
CD16b水平或中性粒细胞水平可用于预测、诊断或排除对象患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或非中性粒细胞减少性脓毒症,或者发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或非中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著。
在一些实施方案中,该方法可包括确定CD16b的水平处于或低于中性粒细胞减少的或严重中性粒细胞减少的阈值,并且作为该确定的结果,确定对象应接受针对中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的适当的治疗。该方法还可包括施用或调整合适的治疗的步骤。合适的治疗在本文中其他地方进行了讨论,但在一些情况下,适当的治疗可以是或包括减少或中断(其可以是暂时的)引起中性粒细胞减少的治疗,例如化学治疗。
在一些实施方案中,该方法可包括确定CD16b的水平处于或接近正常水平,即高于“中性粒细胞减少的”阈值但低于“异常高的”阈值,并且作为该确定的结果,确定对象不需要任何针对中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的治疗。
在一些实施方案中,该方法可包括确定CD16b的水平处于或低于中性粒细胞减少的阈值但高于严重中性粒细胞减少的阈值,并且作为该确定的结果,确定应监测或继续监测对象的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的发生。
在一些实施方案中,该方法可以包括确定CD16b的水平处于或高于异常高的中性粒细胞阈值,并且作为该确定的结果,确定对象应该接受针对(非中性粒细胞减少性)脓毒症的适当的治疗。该方法还可包括施用或调整合适的治疗的步骤。合适的治疗在本文中其他地方进行了讨论。
本发明的方法、系统、装置、测试套件或测试物质组合物可以与监测中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的其他标志物或指标(例如症状)联合使用。
对象是哺乳动物对象,通常是人。对象可以例如患中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;或者是怀疑患有中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的对象;或者是尚未被诊断为患有和/或不知道患有中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的对象。
在一些实施方案中,对象可患有癌症。在一些实施方案中,对象可以选自以下对象:(i)已暴露于辐射;(ii)已接受或正在接受能够引起中性粒细胞减少的药物,例如抗精神病药物或甲状腺药物;(iii)患有HIV、肝炎和/或自身免疫性病症,例如类风湿性关节炎;(iv)已接受或正在接受化学治疗和/或放射治疗;(v)正表现出或正在经历感染症状;和/或(vi)最近接受过手术。
任何这样的暴露、病症或治疗优选地持续进行或发生在最后1、2、3、4、5或6周或者1、2、3、4、5或6个月内。
因此,在一些实施方案中,对象患有癌症并且已接受或正在接受化学治疗和/或放射治疗,并且进行该方法以检测、诊断或监测中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症。
应当注意,本发明是基于分离的样品在体外进行的,所述样品可以已或可以未经过预处理。因此,本发明的方法通常不(尽管其可以)包括获得用于测试的样品的步骤,而是对提供的样品进行。样品可以有利地从手指针刺获得或提供。从合规性的角度来看,这是特别有利的,并且为本文所述的多种测试装置,特别是侧流形式提供了足够的体积。类似地,在一些实施方案中,系统和测试套件包括用于接收样品的合适容器。该容器可以是有色的以保护任何光敏分析物。
血液样品可以是毛细血管或静脉内血液样品,优选毛细血管,例如通过手指针刺获得的血液样品(即,在手指上小刺一下以抽取一滴或数滴血)。优选地,样品是新鲜的,例如可在获取样品的1、2、3、4、5、10、20、30、40、40或60分钟内,最优选在20分钟或更少、10分钟或更少、5分钟或更少或者1分钟或更少的时间内对样品进行分析。
在一些实施方案中,提供了使用手指针刺测试和侧流测定对与中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或非中性粒细胞减少性脓毒症有关的对象的状态的即时(point-of-care,POC)测量。CD16b的确定方便地避免了对于进行具有技术挑战性并且不适合即时诊断测试的中性粒细胞计数的需要。该对象可以是住院或未住院的。
因此,任何所提供的方法优选地在用于待由例如患者、护士、临床医生或其他护理提供者使用的即时护理设置的系统、装置、物质组合物或测试套件中实施。
标志物(例如CD16b)的存在或水平的确定可依赖于检测部分,其可以例如是与目的标志物(例如CD16b)特异性结合的结合试剂。优选地,CD16b的水平使用一种或更多种CD16b检测部分,优选地经标记的结合试剂,优选地一种或更多种CD16b结合抗体来确定。结合试剂可以例如是抗体或适配体。抗体可以是单克隆或多克隆来源的。优选地,抗体是多克隆抗体。也可使用片段和衍生抗体,包括但不限于Fab片段、scFv、单结构域抗体、纳米抗体、重链抗体、适配体等,其保留特异性结合功能并且这些都包含在“抗体”的定义中。这样的抗体可用于本发明的方法、系统和测试套件中。
CD16b特异性抗体是可商购获得的,例如来自Abcam Plc of Discovery Drive,Cambridge Biomedical Campus,Cambridge,CB2 0AX,UK的抗CD16b抗体[MM0272-5L11](ab89207)。最优选地,抗体是来自R&D Systems的抗CD16人FcγRⅢA/B(CD16b)抗体(多克隆山羊IgG)(产品代码:AF1597)或来自Stratech Scientific Ltd的抗人CD16b兔抗体(产品代码:11046-RP02)。该抗体可以是抗人CD16兔抗体。
用于产生特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的。抗体可以是人或非人来源的(例如啮齿动物,例如大鼠或小鼠),并且可以根据已知技术进行人源化和/或另外地修饰(Jones et al.,Nature(1986)May 29-Jun.4;321(6069):522-5;Roguska et al.,ProteinEngineering,1996,9(10):895-904;和Studnicka et al.,Humanizing Mouse AntibodyFrameworks While Preserving 3-D Structure.Protein Engineering,1994,Vol.7,pg805)。
在某些实施方案中,标志物例如CD16b的水平使用与标记缀合的抗体或适配体来确定。标记意指允许直接或间接检测的组分。例如,标记可以是酶、任选地过氧化物酶或荧光团。可以使用有色颗粒,例如金标记,例如以胶体金的形式。
作为替代或补充,聚链霉亲和素-生物素系统可用于检测CD16b。在这些实施方案中,抗CD16b的结合抗体可以与生物素缀合。生物素化抗体可与固定CD16b(如果存在的话)的测试装置中的聚链霉亲和素测试线结合。这些抗体任选地还可或作为替代地包含可检测标记,例如金标记。在该实施方案中,可检测(例如金)标记有助于在测试条上检测CD16b。在一个具体实施方案中,该检测方法采用两种不同的抗CD16b抗体。在该实施方案中,一种抗CD16b抗体与生物素缀合,而另一种抗CD16b抗体与可检测标记,例如金标记缀合。
作为替代地,生物素和链霉亲和素可颠倒,使得抗CD16b试剂与链霉亲和素缀合并且测试线包含生物素。
有色颗粒,例如金标记可以光学检测并且通常不需要使用检测试剂。然而,标记的检测可需要使用检测试剂。在抗体与作为标记的酶缀合的情况下,检测试剂可包含化学组合物,使得酶催化化学反应以产生可检测的产物。由合适的酶催化的反应产物可以是但不限于荧光的、发光的或放射性的,或者其可吸收或反射可见光或紫外光。适用于检测这样的可检测标记的检测器的实例包括但不限于X射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计、光探测器和密度计。在某些实施方案中,检测试剂可包含二抗。然后使用与靶蛋白例如CD16b结合的未标记的一抗和与标记缀合的二抗来确定标志物水平,其中二抗与一抗结合。
用于确定蛋白质水平的表达水平和/或标志物的量和/或浓度的另外的技术包括,例如,Western印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、质谱、ELISA和其他。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度,通常使用单克隆抗体,因为其具有特异性表位识别能力。多克隆抗体也已成功用于多种免疫测定,因为其与单克隆抗体相比,对靶标的亲和力增加。在一些优选实施方案中,可使用侧流测定来检测蛋白质水平。
在其中或从其中检测CD16b的“样品”可以是血液或含有中性粒细胞的血液衍生物,例如血浆或血沉棕黄层,优选血液。样品可以是经过预处理的,例如通过添加稳定剂和/或抗凝剂,但在一些实施方案中,样品是未经预处理的。该方法可包括去除一种或更多种非靶细胞类型的步骤,或者其可对已从中去除一种或更多种非靶细胞类型的样品进行。示例性的非靶细胞是红细胞。非靶细胞可通过物理方法(例如histopaqueTM梯度),或通过其他方法(例如使用与在非靶细胞表面上表达(并且优选地在中性粒细胞表面上未表达或未以显著量表达)的靶分子特异性结合的结合试剂)来去除。如上所述,该方法可包括去除可溶性形式的CD16b的步骤,或者其可对已从中去除可溶性形式的CD16b的样品进行。该方法可包括裂解中性粒细胞的步骤,或者其可对其中中性粒细胞已被裂解的样品进行。
在某些实施方案中,本发明可在侧流或垂直流装置中进行。因此,通常,本发明(或一种或更多种检测装置)可依赖于一些固体支持物形式。该固体支持物可限定样品的液体流动路径。在一些具体实施方案中,该固体支持物包含色谱介质或毛细管流动装置。在一些实施方案中,本发明可以以测试条形式提供。
图8中示意性地示出了合适的侧流配置。其包含样品垫(1),样品可添加至该样品垫;缀合垫(2),其可包含检测部分(3)例如经标记的结合试剂;合适的膜,例如硝酸纤维素,其包含测试捕获线(5a)和任选地对照捕获线(5b);以及任选地吸收垫(6)。这些组件可以在背衬材料,例如塑料粘合背衬卡上组装。优选地,样品包含经过滤和/或经洗涤的细胞(例如中性粒细胞)。
合适的侧流装置可包含:
a.第一测试条,其包含第一样品施加区,来自对象的样品添加至该第一样品施加区,其中第一样品施加区包含捕获白细胞(例如中性粒细胞)并且优选地不捕获可溶性形式的CD16b和红细胞的过滤器;
b.第二测试条,其包含:
i.第二样品施加区,具有捕获的细胞的过滤器添加至该样品施加区,或者在其他情况下使过滤器与该样品施加区接触;
ii.缀合区,其包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分;
iii.固体支持物,其限定样品的液体流动路径并且包含:(i)针对至少CD16b的测试线,该测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b结合,从而将CD16b固定在测试线处以通过也与CD16b结合的经标记检测部分来产生信号;或(ii)针对至少CD16b的测试线,该测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤ii的CD16b结合的经标记检测部分结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号;并且任选地还包含:
iv.至少一种经标记的对照结合试剂,其与固定在针对CD16b的测试线的下游对照线处的结合配偶体结合,并因此确认测试已成功完成;并且任选地还包含:
v.测试(和对照,在存在的情况下)线下游的吸收材料,以吸收过多的样品。
第一测试条可包含这样的区域:在其中检测乳酸和/或确定乳酸水平。图12中显示了示例性的形式。第一测试条可配置成进行可基于乳酸脱氢酶的酶活性的乳酸测定。
因此,乳酸测定可依赖于乳酸脱氢酶,染料,例如黄色四唑(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑氮溴化物(MTT)),其在乳酸存在下,在乳酸转化为丙酮酸期间,通过将NAD+还原为NADH而可转化为称为甲(Formazan)((E,Z)-5-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-1,3-二苯基甲)的紫色沉淀。本领域技术人员知晓另一些试剂可用于测定以形成不同的甲染料形成可视觉上评估或通过其他方式测量。
因此,例如,测试条可包含例如为经固定形式的乳酸脱氢酶和为黄色四唑(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑氮溴化物(MTT))形式的染料。
在测定乳酸浓度之前,可对样品进行过滤以去除红细胞。例如,样品施加垫可捕获红细胞并允许例如乳酸的组分移动到检测区。
例如,可将样品施加至第一过滤器以捕获白细胞;没有被第一过滤器捕获的组分可施加至第二过滤器以捕获红细胞,使得可确定不含任何细胞的样品中的乳酸水平。
在使用中,含有未知浓度分析物的样品可施加至样品垫并移动至缀合垫,在该缀合垫上分析物与检测部分结合并沿硝酸纤维素膜向捕获线移动。该测试线包含对目标分析物具有特异性的经固定结合试剂。如果存在于样品中的话,则该分析物(与检测部分结合)与经固定结合试剂形成复合物,从而形成可见的测试线。对照线(如果存在的话)包含对标记的对照试剂具有特异性的经固定结合试剂。对照线处的可见标记确认检测已成功运行。捕获线处标记的存在和量可通过肉眼或使用合适的侧流装置读取器例如Cube(Optricon,Germany)来确定。
测试装置、套件、系统或物质组合物可具有任何适合家庭使用或在初级护理环境(例如诊所)中使用的形式。在一些具体实施方案中,测试装置、套件、系统或物质组合物可包含一次性使用装置,样品施加至该装置。通常,其可包含样品施加区,样品添加至该样品施加区。通常,样品施加区可以接收适当体积的样品,例如一滴或更多滴血液的体积。装置、套件、系统或物质组合物通常还包含固体支持物,样品一旦施加至样品施加区,该固体支持物就为样品限定液体/毛细管流动路径。这可以是微流体流动路径。样品施加区可以是固体支持物的组成部分。固体支持物可包含色谱介质,例如膜材料,其可优选地为硝酸纤维素。施加至样品施加区的血液样品通常会再水合必要的试剂以检测标志物(例如CD16b)。取决于样品的黏度,也可施加追加流体(chase fluid)(稀释剂)。该试剂可包含检测部分,例如与标志物(例如与CD16b)特异性相互作用的结合试剂,或用于测量活性的效应分子的底物。另外的试剂还可沿着流动路径被固定。该试剂可和标志物与结合试剂的复合物结合。结合试剂通常被标记以在标志物与结合试剂的复合物(通过与另外的试剂结合)的固定位点处提供信号。合适的标记包括本领域技术人员容易理解的荧光标记、磁性标记、胶乳或金。
结合试剂和另外的试剂通常是抗体(如本文所限定的)。因此,在一些具体实施方案中,装置、套件、系统或物质组合物可包括侧流测试条。
装置、套件、系统或物质组合物还可包含对照区以确认样品已令人满意地通过该装置。在没有对照区的确认的情况下,装置、套件、系统或物质组合物可以例如通过显示器向使用者指示无效结果。如本文所讨论的,装置、套件、系统或物质组合物可充当竞争性或夹心测定。ELISA(酶联免疫吸附测定)是可并入本发明中使用的测试装置中的合适测定形式的一个实例。同样,通常用于检测一种或更多种标志物水平的所有试剂均预加载到装置、套件、系统或物质组合物上,使得它们一旦添加至装置就可与血液样品相互作用。这使干预和由此由对象引起的错误最小化。因此,有效地,装置、套件、系统或物质组合物可以只需要使用者施加样品并随后观察测定的输出。
装置、套件、系统或物质组合物可合并合适的读取器以提供定量输出(与处理器和存储介质结合)。该输出可以是绝对输出或相对输出。合适的读取器可包含照明器以将装置暴露于特定波长的光,以及用于反射或发射光的合适的检测器。装置、套件、系统或物质组合物还可合并合适的处理器和计算机应用程序(用于基于检测到的信号来输出确定的CD16b或中性粒细胞水平)。因此,运行计算机应用程序的处理器可与读取器可操作地连接。“可操作连接”意指允许元件之间信号或信息的交换的功能连接。这样的读取器的一个实例是‘Cube’读取器(opTricon Gmbh)。其他包括ESEQuant LR3读取器(Qiagen)和Lumos读取器(Lumos)。或者,在一些实施方案中,合适的处理器和计算机应用程序(用于基于检测到的信号来输出确定的CD16b或中性粒细胞水平)可以并入与容纳在读取器中的计算机应用程序/处理器可操作连接的远程计算装置(例如平板电脑、电话或计算机)。这可采取基于例如基于云的计算服务的连接平台的形式。因此,基于检测到的信号所选择的治疗的输出可以显示在与读取器的处理器/计算机应用程序远程连接(例如无线互联网连接、蓝牙或任何其他近场通信连接)的合适的显示模块(例如平板电脑、电话或计算机)上。这样的一个实例是LumiraDx Connect(LumiraDx)。因此,容纳在读取器中的计算机应用程序/处理器可配置成确定装置、套件、系统或物质组合物上的标志物的水平,并将数据传输至配置成分析数据并输出确定的水平的远程计算装置(例如平板电脑、电话或计算机)。在另一些实施方案中,可通过基于云的计算服务将数据传输至远程计算装置(例如平板电脑、电话或计算机)。
装置、套件、系统或物质组合物可包含一种或更多种特异性结合试剂以结合标志物,其水平在血液样品中进行检测。如上所述,在测量蛋白质水平的情况下,该试剂可包含抗体(包括衍生物、片段和适配体)。
本文提供的方法可包括确定(例如基于CD16b水平)对象需要合适治疗的步骤和/或施用合适治疗的步骤。合适的治疗可包含一种或更多种抗生素或由其组成。抗生素优选地为广谱抗生素,或者两种或更多种抗生素的混合物。合适的抗生素包括大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素)、头孢菌素类(例如头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼)、酮内酯类(例如泰利霉素)、氟喹诺酮类(例如莫西沙星、吉米沙星、左氧氟沙星)、多西环素、甲氧苄啶/磺胺甲唑和阿莫西林/克拉维酸盐。这些可以视情况与一种或更多种其他治疗组合。
如实施例中所示,本发明人已证明当多克隆抗体AF1597的组合以1mg/mL沉积在硝酸纤维素上并且还以30μg/mL与金缀合时,可建立用于测量缓冲液中的重组CD16b的成功测定。通过系统的优化,实现了10至1,000ng/mL的测定范围。
然后,该系统使用血浆进行以评估基质效应,以查看该测定是否会在比全血更简单的基质中加标(spike)并回收。结果显示,该测试系统可以测量血浆中的CD16b,并给出50至1,000ng/mL的曲线。
然后使用histopaque梯度分离方法研究血沉棕黄层制剂,其中将血液分离成红细胞和血浆/细胞混合物,其可被进一步处理以获得可重现的白细胞制剂。对这些细胞在纯的和添加裂解/溶解缓冲液的情况下进行了研究,并且其显示测定信号会随着裂解而增加,这表明“细胞内”CD16b从细胞中释放。
使用五名血液供体进行了另外的实验,以确定分离和溶解的中性粒细胞的CD16水平与通过流式细胞术计数的中性粒细胞数目之间是否存在相关性。将细胞进行处理并浓缩以得到一系列细胞(2x、纯的和1/2),其通过流式细胞术进行测定和测量。中性粒细胞计数与细胞CD16b(裂解细胞的立方单位)的相关性显示R2=0.861,这是一个很好的相关性。
应当注意,在整个说明书通篇,术语“包含”旨在表示开放式(即包括)语言。然而,为避免疑义,无论在哪里使用术语“包含”,预想,相应的特征可以根据需要限制为指定的(即组成)。
本发明的另一些方面和实施方案在以下条款中阐述:
1.CD16b作为样品中中性粒细胞的标志物的用途,其中检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
2.在样品中检测CD16b的方法,所述方法包括检测CD16b,和/或确定CD16b的水平。
3.在样品中检测中性粒细胞和/或确定中性粒细胞水平的方法,所述方法包括检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
4.用于在对象中预测、诊断、排除和/或监测中性粒细胞减少和/或脓毒症的方法,所述方法包括在样品中检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
5.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中通过侧流测定来检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
6.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中CD16b水平指示样品中的中性粒细胞水平。
7.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述CD16b包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:膜锚定形式的CD16b(更特别是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的CD16b)和/或细胞内形式的CD16b,优选地其中CD16b主要包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:膜锚定形式的CD16b和细胞内形式的CD16b。
8.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中使用一种或更多种CD16b特异性检测部分、优选结合试剂、优选一种或更多种CD16b特异性抗体来检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
9.根据条款8所述的方法或用途,其包括使用与CD16b特异性结合的至少第一经标记的结合试剂和也与CD16b特异性结合的至少第二结合试剂,其中第二结合试剂优选地为经固定的。
10.根据条款9所述的方法或用途,其中所述标记是金,优选胶体金。
11.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中对样品中的中性粒细胞水平进行半定量或定量确定。
12.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中中性粒细胞水平被确定为高于或低于一个或更多个预定阈值,优选地其中
(i)低于预定阈值的中性粒细胞水平指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(ii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(iii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;或者
(iv)低于预定阈值的中性粒细胞指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者存在或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险不显著。
13.根据条款12所述的方法或用途,其中使用一个或更多个阈值,其中所述阈值选自:
(a)少于1000个中性粒细胞/μL血液,其指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(b)1000至1500个中性粒细胞/μL血液,其指示需要进一步监测对象的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的发生;
(c)超过1500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(d)超过7500个中性粒细胞/μL血液,其指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;和/或
(e)少于7500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者存在或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的的风险不显著,
优选地,其中阈值(a)、(b)和/或(c)中任一个可被称为“中性粒细胞减少性”阈值和/或阈值(d)和/或(e)中任一个可被称为“(非中性粒细胞减少性)脓毒症”阈值。
14.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中中性粒细胞水平用于预测、诊断或排除对象患有中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或脓毒症,或者发生中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或脓毒症的风险显著。
15.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品来自中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性或非中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著的对象,和/或怀疑患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性或非中性粒细胞减少性脓毒症的对象。
16.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品来自尚未被诊断为患有和/或不知道患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性或非中性粒细胞减少性脓毒症的对象。
17.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品来自患有癌症和/或正在接受化学治疗和/或放射疗法的对象。
18.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品来自以下的对象:(i)已暴露于辐射;(ii)已接受或正在接受能够引起中性粒细胞减少的药物,例如抗精神病药物或甲状腺药物;(iii)患有HIV、肝炎和/或自身免疫性病症,例如类风湿性关节炎;(iv)已接受或正在接受化学治疗和/或放射治疗;(v)正表现出或正在经历感染症状;和/或(vi)最近接受过手术。
19.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品(i)来自住院的对象;或(ii)来自未住院的对象。
20.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述样品是血液样品,优选毛细血管血液样品,例如手指针刺血液样品。
21.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述方法或用途包括在确定CD16b的水平之前的细胞裂解步骤,优选使用表面活性剂,其可以是离子或非离子的,例如TritonX-100。
22.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中CD16b包含可溶性形式的CD16b。
23.根据条款18所述的方法或用途,其中使用参考来校正可溶性形式的CD16b的存在,从而允许确定膜锚定形式的CD16b(更特别是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的CD16b))和/或细胞内形式的CD16b的水平。
24.根据条款1至21中任一项所述的方法或用途,其中CD16b不包含可溶性形式的CD16b。
25.根据条款24所述的方法或用途,其中从所述样品中去除可溶性形式的CD16b,优选地通过使用允许将中性粒细胞与可溶性CD16b分离的过滤器过滤样品,例如通过尺寸排阻和/或吸附。
26.根据条款25所述的方法或用途,其中去除发生在细胞裂解步骤之前。
27.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中所述方法或用途还包括检测指示样品中存在脓毒症的一种或更多种不同的标志物。
28.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中在不同时间从对象获取至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个样品并检测CD16b,并且优选地确定CD16b的水平。
29.根据条款28所述的方法或用途,其中每6至24小时,例如每天,或者每2、3、4、5、6、7或14天获取样品。
30.根据任一前述条款所述的方法或用途,其中对即将发生的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的预测,或者对中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的诊断导致决定对所述对象进行治疗和/或用抗细菌剂,优选广谱抗生素对所述对象进行治疗。
31.预测对象对使用抗生素进行治疗的响应性和/或选择用于使用抗生素进行治疗的对象的方法,其包括进行任一前述条款所述的方法,以及预测响应性,和/或在预测出或诊断出中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的情况下,选择所述对象以进行治疗。
32.治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法,其包括向患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的对象施用抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变和/或其中通过进行任一前述条款所述的方法,所述对象被选择进行治疗。
33.用于治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法中的抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变和/或通过进行任意前述条款中任一项所述的方法而被选择进行治疗。
34.条款30至32中任一项所述的方法或条款33所述应用的抗生素,其中所述抗生素静脉内施用和/或选自:大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素)、头孢菌素类(例如头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼)、酮内酯类(例如泰利霉素)、氟喹诺酮类(例如莫西沙星、吉米沙星、左氧氟沙星)、多西环素、甲氧苄啶/磺胺甲唑和阿莫西林/克拉维酸盐。
35.测试装置、测试套件或测试物质组合物,其包含:
a.样品接收区,来自对象的样品添加至所述样品接收区
b.缀合区,其包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分
c.固体支持物,其限定样品的液体流动路径,并且包含:(i)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b特异性结合,从而将CD16b固定在所述测试线处以通过也与CD16b特异性结合的经标记检测部分来产生信号;或者(ii)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤(b)的CD16b特异性经标记检测部分特异性结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号;并且任选地还包含:
d.至少一种经标记的对照结合试剂,其与固定在针对CD16b的测试线的下游对照线处的结合配偶体结合,并因此确认测试已成功完成;并且任选地还包含:
e.测试(和对照,在存在的情况下)线下游的吸收材料,以吸收过多的样品。
36.条款35所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其中所述样品接收区成比例地接收10至100μL之间的血液,例如约40μL的血液。
37.条款35至36中任一项所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其中所述固体支持物包含色谱介质和/或毛细管流动装置。
38.条款35至37中任一项所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其为测试条。
39.用于诊断或监测对象的系统或测试套件,其包含:
a.测试装置,其用于确定样品中至少CD16b的水平,优选根据条款35至38中任一项所述的
b.处理器;和
c.存储介质,其包含计算机应用程序,当由所述处理器执行时,所述计算机应用程序被配置成:
i.访问和/或计算所述测试装置上的所述样品中至少CD16b的确定水平
ii.计算来自所述样品中至少CD16b的水平的测试评分,其任选地包括将所述水平与一个或更多个阈值和/或在一个或更多个较早时间点确定的CD16b水平进行比较,从而预测或诊断中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症、或(非中性粒细胞减少性)脓毒症;并且
iii.从所述处理器输出对象的预测或诊断结果。
40.根据条款1至30中任一项所述的方法或用途,其中所述方法或用途包括使用侧流装置套件或组合物,优选如条款35至39中任一项所述的侧流装置套件或组合物。
41.在样品中检测CD16b的方法,所述方法包括使用侧流测定检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
42.根据条款41所述的方法,其包括通过检测CD16b来检测样品中的中性粒细胞和/或通过确定CD16b的水平来确定样品中的中性粒细胞水平。
43.用于在对象中预测、诊断、排除和/或监测中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或非中性粒细胞减少性脓毒症的方法,所述方法包括在样品中检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
44.根据条款41至43中任一项所述的方法,其中CD16b包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:膜锚定形式的CD16b和/或细胞内形式的CD16b,优选地其中CD16b主要包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:膜锚定形式的CD16b和细胞内形式的CD16b。
45.根据条款41至44中任一项所述的方法,其中使用一种或更多种CD16b特异性检测部分、优选经标记的结合试剂,优选一种或更多种CD16b特异性抗体来检测CD16b和/或确定CD16b的水平。
46.根据条款41至45中任一项所述的方法,其中中性粒细胞水平被确定为高于或低于一个或更多个预定阈值,优选地其中
(i)低于预定阈值的中性粒细胞水平指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(ii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者发生或存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(iii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;或者
(v)低于预定阈值的中性粒细胞水平指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者发生或存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险不显著。
47.根据条款46所述的方法,其中使用一个或更多个阈值,其中所述阈值选自:
(a)少于1000个中性粒细胞/μL血液,其指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(b)1000至1500个中性粒细胞/μL血液,其指示需要进一步监测对象的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的发生;
(c)超过1500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(d)超过7500个中性粒细胞/μL血液,其指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;和/或
(e)少于7500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者存在或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险不显著。
48.根据条款41至47中任一项所述的方法,其中所述样品来自以下的对象:(i)已暴露于辐射;(ii)已接受或正在接受能够引起中性粒细胞减少的药物,例如抗精神病药物或甲状腺药物;(iii)患有HIV、肝炎和/或自身免疫性病症,例如类风湿性关节炎;(iv)患有癌症和/或已接受或正在接受化学治疗和/或放射治疗;(v)正表现出或正在经历感染症状;和/或(vi)最近接受过手术。
49.根据条款41至48中任一项所述的方法,其中所述方法包括在确定CD16b的水平之前的细胞裂解步骤,优选地使用表面活性剂,其可以是离子或非离子的,例如Triton X-100。
50.根据条款41至49中任一项所述的方法,其中CD16b包含可溶性形式的CD16b。
51.根据条款50所述的方法,其中使用参考来校正可溶性形式的CD16b的存在,从而允许确定膜锚定形式的CD16b和/或细胞内形式的CD16b的水平。
52.根据条款41至49中任一项所述的方法,其中CD16b不包括可溶性形式的CD16b。
53.根据条款52所述的方法,其中从所述样品中去除可溶性形式的CD16b,优选地,其中去除发生在细胞裂解步骤之前。
54.根据条款41至53中任一项所述的方法,其中所述方法或用途还括检测指示样品中存在(中性粒细胞减少或非中性粒细胞减少性)脓毒症的一种或更多种不同的标志物。
55.根据条款41至54中任一项所述的方法,其中在不同时间从对象获取至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个样品,并检测CD16b,并且优选地确定CD16b的水平,优选地其中每6至24小时,例如每天,或者每2、3、4、5、6、7或14天获取样品。
56.根据条款41至55中任一项所述的方法,其中对即将发生的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的预测,或者对中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的诊断导致决定对所述对象进行治疗和/或用抗细菌剂,优选广谱抗生素对所述对象进行治疗。
57.预测对象对使用抗生素进行治疗的响应性和/或选择用于使用抗生素进行治疗的对象的方法,其包括进行条款41至56中任一项所述的方法,以及预测响应性,和/或在预测出或诊断出中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的情况下,选择所述对象以进行治疗。
58.治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法,其包括向患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的对象施用抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变和/或其中通过进行条款41至57中任一项所述的方法,所述对象被选择进行治疗。
59.用于治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法中的抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变和/或通过进行41至58中任一项所述的方法而被选择进行治疗。
60.条款56至58中任一项所述的方法或条款59所述应用的抗生素,其中所述抗生素静脉脉内施用和/或选自:大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素)、头孢菌素类(例如头孢呋辛、头孢泊肟、头孢地尼)、酮内酯类(例如泰利霉素)、氟喹诺酮类(例如莫西沙星、吉米沙星、左氧氟沙星)、多西环素、甲氧苄啶/磺胺甲唑和阿莫西林/克拉维酸盐。
61.测试装置、测试套件或测试物质组合物,其包含:
a.样品接收区,来自对象的样品添加至所述样品接收区
b.缀合区,其包含至少一个与CD16b特异性结合的经标记检测部分
c.固体支持物,其限定样品的液体流动路径,并且包含:(i)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b特异性结合,从而将CD16b固定在所述测试线处以通过也与CD16b特异性结合的经标记检测部分来产生信号;或者(ii)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤(b)的CD16b特异性经标记检测部分特异性结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号;并且任选地还包含:
d.至少一种经标记的对照结合试剂,其与固定在针对CD16b的测试线的下游对照线处的结合配偶体结合,并因此确认测试已成功完成;并且任选地还包含:
e.测试(和对照,在存在的情况下)线下游的吸收材料,以吸收过多的样品。
62.条款61所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其中所述固体支持物包含色谱介质和/或毛细管流动装置。
63.条款61或62所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其为测试条。
64.用于诊断或监测对象的系统或测试套件,其包含:
a.测试装置,其用于确定样品中至少CD16b的水平,优选根据条款61至63中任一项所述的
b.处理器;和
c.存储介质,其包含计算机应用程序,当由所述处理器执行时,所述计算机应用程序被配置成:
i.访问和/或计算所述测试装置上的所述样品中至少CD16b的确定水平
ii.计算来自所述样品中至少CD16b的水平的测试评分,其任选地包括将所述水平与一个或更多个阈值和/或在一个或更多个较早时间点确定的CD16b水平进行比较,从而预测或诊断中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症、或(非中性粒细胞减少性)脓毒症;并且
iii.从所述处理器输出对象的预测或诊断结果。
65.根据条款41至60中任一项所述的方法,其中所述方法包括使用如条款61至64中任一项所述的侧流装置套件或组合物。
参考文献
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附图说明
现在将就附图以实例方式来描述本发明,其中:
图1是表示以下的条形图:随着不同浓度分析物加标到血浆中,以1mg/mL(PBS+1%蔗糖)沉积在CN95上的AF1597(AF1597与金缀合)的测试线测量值(立方单位)的变化。
图2是表示如何可以使用histopaque将血液分离成(i)血浆和细胞,以及(ii)红细胞的图。
图3是表示以下的条形图:使用从经histopaque处理的添加和未添加Tritonx100、水和细胞提取缓冲液(CEB)作为裂解缓冲液的EDTA血液中收集的血沉棕黄层(BC)、细胞和经洗涤细胞,以1mg/mL(PBS+1%蔗糖)沉积在CN95上的AF1597(AF1597与金缀合)的立方单位的变化。
图4是表示以下的条形图:使用从经histopaque处理的添加和未添加Triton x100的EDTA血液(1109)中收集的经洗涤细胞,以1mg/mL(PBS+1%蔗糖)沉积在CN95上的AF1597(AF1597与金缀合)的测试线测量值(立方单位)的变化,以及通过流式细胞术进行的相应细胞计数的变化;
图5是表示以下的条形图:使用从经histopaque处理的添加和未添加Triton x100的EDTA血液供体1113和1114中收集的经洗涤细胞,以1mg/mL(PBS+1%蔗糖)沉积在CN95上的AF1597(AF1597与金缀合)的测试线测量值(立方单位)的变化,以及通过流式细胞术进行的相应细胞计数的变化;
图6是表示以下的条形图:使用从经histopaque处理的添加和未添加Triton x100的EDTA血液供体1117和1118中收集的经洗涤细胞,以1mg/mL(PBS+1%蔗糖)沉积在CN95上的AF1597(AF1597与金缀合)的测试线测量值(立方单位)的变化,以及通过流式细胞术进行的相应细胞计数的变化;
图7是表示以下的散点图:对于5个供体的裂解细胞获得的CD16b测量值(立方单位,y轴)与通过流式细胞术获得的相应细胞计数(x轴)之间的相关性,其中y=0.0124x+8.8677并且R2=0.861;图8是典型侧流装置配置的示意图;
图8是典型侧流装置的示意图;
图9是显示40nm金与以15μg/ml缀合的RP02抗体在不同缓冲液和不同pH中的聚集的图片。
图10是显示生物素系统如何工作的方案。
图11是显示在具有AF1597 AuC和CN95 NC上的RP02的湿测定系统中,随着裂解孵育时间增加(每次测定从左到右显示为0、1、3和5分钟),来自两个血液供体的不同浓度的分离细胞的立方单位变化的图。
图13是显示在10分钟读取时间下,一式三份的不同浓度的乳酸钠与在缀合垫(8951)上的干燥的染料混合物的立方单位变化的图。
图14是显示在5或10分钟时,10μL全血与0或10mM加标的Na-L-乳酸钠(追加60μLPBS)的结果的照片。
图15是显示细胞相关(细胞内的和膜锚定的)CD16b与中性粒细胞水平之间的相关性的图。
图16是显示可溶性CD16b与中性粒细胞水平之间的相关性的图。
图17是显示在具有10分钟读取时间的湿测定形式中不同浓度CD16b的立方单位变化的图。
参考以下实验性实施例将进一步理解本发明。
实施例
1.材料与方法
试剂和设备
CD16b抗体与金纳米颗粒的缀合
缓冲液筛选测试
缓冲液类型、摩尔浓度和pH可影响抗体与金颗粒的结合,因为该结合主要是由于电荷和疏水相互作用。为了测试一系列缓冲液,在6.7至9.3的pH范围内配制20mM缓冲液。
对于所研究的所有缓冲液,抗体均以15μg/mL加载。将1.5μL体积的抗体添加至干净的96孔板底部,然后添加5μL缀合缓冲液,并且最后添加100μL金OD5。将这些在室温下同时静置孵育10分钟。然后在550和600nm处使用读板器读取板以测量吸光度;然后计算550/600的比率以给出聚集比率。如果聚集比率≥3.5,则认为该缓冲液适合缀合。
CD16b抗体加载测试
一旦从上面选择了合适的缓冲液,就确定了抗体的最佳载量。在选择的缓冲液中研究了在增量为5μg/mL下的0μg/mL至30μg/mL的载量浓度。将相应体积的抗体(0、0.5、1.0μL等)添加至干净的96孔板底部,添加5μL缀合缓冲液,随后添加100μL OD5金。同样,将这些在室温下孵育10分钟。一旦孵育,将10μL 1M NaCl置于每个孔中。如果金没有被充分包被,则浓缩的盐导致金缀合物变得不稳定并聚集,这通过从亮粉色至紫色/灰色的颜色变化来指示。为了确定聚集程度,在读板器上读取板,并再次测量550和600nm的吸光度。取550/600的比率,并且如果聚集再次满足聚集比率≥3.5,则认为其是合适的。
用于测定的CD16b抗体的缀合
通过以下方法实现了15μg/mL的抗体的缀合:
-将15μL的1mg/mL抗体置于干净的1.5mL离心管底部;
-然后向抗体添加50mL缀合缓冲液;
-向试管添加1000μL OD 540nm金,轻轻涡旋,并且然后静置10分钟;
-10分钟后,添加10μL的200mg/mL BSA(aq.),并静置另外的30分钟;
-将试管置于合适的离心机中,并以4000g离心10分钟;
-去除上清液,并用相同体积的金干燥缓冲液来替换;
通过以下方法实现20μg/mL的抗体的缀合:
-将20μL的1mg/mL抗体置于干净的1.5mL离心管底部;
-然后按照步骤2至6。
通过以下方法实现30μg/mL的抗体的缀合:
-将30μL的1mg/mL抗体置于干净的1.5mL离心管底部;
-然后按照步骤2至6。
硝酸纤维素绘图
使用目的CD16b抗体绘制了三种不同的NC(CN95、CN140和CN180),这些具有不同的孔径,并因此以不同的速度运行。在PBS+1%蔗糖中制备抗体至终浓度为0.5mg/mL至1mg/mL。将抗体绘制成10cm条带,并且然后在37℃下干燥至少30分钟。
条构建将绘制在NC条带上的抗体安装在卡片底部的粘合背衬卡上。吸收垫/接收垫安装在背衬卡的顶部,背衬卡在NC上具有7mm的重叠。然后使用Biodot GuillotineCutter将这些条带切割成3mm宽的条。
使用以下两种操作运行测定:
“湿”测定:
1.将4ml金缀合物(ODS)置于低结合微量滴定板的孔中,并添加20ml样品或在缓冲液(PBS)中的CD16b分析物。
2.将测试条置于孔中并将其运行直至孔是空的。
3.添加30ml追加缓冲液(PBST)并将其运行直至孔是空的。
4.将条置于合适的支持物中,并使用Opticon立方读取器读取线值。
分离的WBC测定:
1.将4μl Triton X-100(0.482%)置于低结合微量滴定板的孔中,并添加28μl的细胞悬液并预孵育5分钟。(TX-100的最终稀释度为0.125%)(裂解的细胞)
2.将20μl裂解的细胞混合物转移到含有4μL金缀合物(ODS)的新孔中。
3.使用‘湿’测定方案,按照步骤2进行处理。
血液样品
根据Human Tissue Act license number 12647,在Mologic Ltd从13名匿名供体中获取血液样品。这些样品如实验要求使用,储存不超过两周,并根据Mologic的实施规程进行处置。
实施例1抗CD16b抗体的初始缀合和测试
缓冲液筛选测试
进行的第一个实验涉及将选择的抗体与金纳米颗粒的缀合与缓冲液筛选(以设定的15μg/mL载量)。选择了8种缓冲液以提供最广泛的pH和缓冲液类型。测试的抗体是AF1597、Mab1597和NBP-2。当进行缓冲液筛选时,在550和600nm处读取金颗粒的吸光度,取550/600nm的比率;如果发现该比率≥3.5,则其符合适合缀合所需的标准。这次测试的结果可见于表1。
表1.显示不同缀合缓冲液在15/Ag/mL(15μg/mL)抗体载量下的聚集比率的表格。
从表1中可以看出,8种受试缓冲液中的7种给出了可接受的AF1597和NBP-2的聚集比率,而且8种中的2种适用于Mab1597。选择用于缀合的缓冲液是TAPS pH 8.5,因为所有三种抗体均给出>4.2的聚集比率。一旦建立金缀合条件,则将制备成批的金,并将所有三种抗体重悬于金干燥缓冲液中并在条上测试。
初始定向测试
然后,通过将PBS+1%蔗糖溶液中的1mg/mL抗体的1μL滴置于NC上来将抗体沉积在硝酸纤维素(NC,CN140)上。这允许对新缀合的金纳米颗粒进行初始定向实验。用空白缓冲液(0ng/mL PBS)和不同浓度的重组CD16b分析物(在PBS中)测试这些条和金颗粒。应当注意的是,测试了NC与金的所有9种组合,但只有给出可见响应的那些组合显示在表2中。
表2.在不同浓度的CD16b分析物下,针对在具有不同的金缀合物的CN140条上手动沉积的抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
从表2中可以看出,当AF1597(AF)在NC上且在金上时,其给出了最佳曲线响应,所见的灵敏度为100ng/mL。
当Mab1597(Mab)和NBP-2沉积在NC上并测试AF1597金时,1000ng/mL样品没有响应。在NC上并且也在金上的NBP-2显示出高的非特异性相互作用(对于0ng/mL看到斑点),并且对于1000ng/mL样品,信号没有真正提高。当NBP-2沉积在NC上并且Mab1597(Mab)与金缀合时,看到相同的响应,看到高的非特异性相互作用并且对100ng/mL样品的信号没有提高。存在某些形式的金聚集,其在NC底部可看到可见的红线。为了确认测定的定向以及确定AF1597自身配对是否正确,使用标准Isoflow机器将小的抗体条带沉积在NC上(10cm条带)以绘制抗体。这给出了线响应,其与点相比,在立方读取器上可以更准确地读取。另外,还测试了另外的单克隆抗体(MM01)。Isoflow沉积的抗体的结果见于表3。
表3.在两种不同浓度的CD16b分析物下,针对在具有不同的金缀合物上的CN140条上Isoflow沉积的抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
NC | 金 | 0ng/mL | 1000ng/mL |
AF1597 | AF1597 | 3.1 | 91 |
Mab1597 | AF1597 | 2 | 6 |
NBP-2 | AF1597 | 3.6 | 17 |
AF1597 | Mab1597 | 2.6 | 31 |
Mab1597 | Mab1597 | 45 | 71 |
NBP-2 | Mab1597 | 110 | 156 |
AF1597 | NBP-2 | 1.5 | 146 |
Mab1597 | NBP-2 | 106 | 72 |
NBP-2 | NBP-2 | 71 | 145 |
AF1597 | MM01 | 1.6 | 4.8 |
Mab1597 | MM01 | 47 | 29 |
从表3中可以看出,当AF1597与金缀合时,当AF1597沉积在NC上时,可以看到最佳特异性信号(具有低空白背景的高的CD16b测试响应)。因此决定继续开发AF1597配对系统(在测试线和金二者上使用该抗体),因为其显示出最可重现的结果。为了确认初始结果,运行缓冲液曲线以确定测定灵敏度和范围。
AF1597自配对系统的开发
缓冲液曲线
为了找到初始的测定灵敏度和范围,将CD16b以10、100、1,000和10,000ng/mL加标到PBS中,并且研究了手动沉积的条、在具有旧的金的NC上Isoflow沉积的抗体,和在具有新的金缀合物的NC上Isoflow沉积的抗体。缓冲液曲线的结果可见于表4。
表4.使用两种不同批次的金和不同浓度的分析物,针对通过不同方法沉积的AF1597抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
浓度 | 手动绘制 | Isoflow/金(旧批次) | Isoflow/金(新批次) |
0 | 1.5 | 4.3 | 3.1 |
10 | 6.3 | 4.3 | 25 |
100 | 32 | 46 | 59 |
1000 | 72 | 72 | 91 |
从表4中可以看出,AF1597配对系统的非特异性对所有三种受试金均是低的,并且所有的在测试范围内均显示出特异性的测试线信号。对于手动绘制的抗体系统,100和1,000ng/mL给出了特异性信号;当在Isoflow绘制的抗体系统上测试时,这些信号是可比的。
无脂肪酸BSA相对于正常BSA
尝试优化以查看金封闭剂的变化是否可以改善测定性能(特定信号的增益)。为此,测试了两种形式的BSA以封闭金缀合物,这些是不含脂肪酸的BSA和正常BSA。该比较的结果可见于表5。
表5.使用不同浓度的分析物,在缀合的金上具有两种不同的封闭剂(不含脂肪酸和正常BSA)的情况下,针对沉积在CN95上的AF1597抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
从表5中可以看出,两种封闭剂的结果非常相似,二者均给出10ng/mL的灵敏度并且特异性信号提高,高至100ng/mL。
金上的抗体载量提高
上面描述了将15、20和30μg/mL与金缀合的方法。为了确定更高的金缀合物载量的作用,再次运行相同浓度的分析物。更高加载的金缀合物的结果可见于表6。
表6.使用不同浓度的分析物,在缀合的金上具有两种不同封闭剂(不含脂肪酸和正常BSA)的情况下,针对沉积在CN95上的AF1597抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
从表6中可以看出,当与15μg/mL涂层相比,20μg/mL金缀合物对所有测试浓度均显示出信号增加;在200至1,000ng/mL之间观察到特异性信号的最低增加。这表明较高的金载量通过为测定提供更大的范围而提供了测定性能的改善。当测试30μg/mL涂层时,这一点更加明显,在两个低端(10ng/mL)处具有特异性信号增益并且在200至1,000ng/mL之间具有增强的特异性信号增益。这表明该阶段的最佳金缀合物加载浓度为30μg/mL。
提高测试线抗体浓度
如上所见,金缀合物上抗体载量的增加产生了更好的测定响应。为了研究这是否还可以改善,还增加了沉积在测试线上的抗体。使用30μg/mL金缀合物,研究的测试线抗体浓度为当前的1.0mg/mL以及1.5和2.0mg/mL;该结果示于表7中。
表7.使用提高的CD16b分析物浓度,针对以不同浓度沉积在CN95上的AF1597抗体(在PBS+1%蔗糖中)获得的原始数据。
从表7中可以看出,1mg/mL数据显示出最佳响应,并且与之前获得的结果非常相似。该结果表明在1mg/mL系统中有足够的抗体。由于在此阶段提高抗体浓度没有益处,因此决定保留沉积在测试线上1.0mg/mL的当前系统。
改变硝酸纤维素
另一个可以提高测定灵敏度和侧流测定范围的变化是使用的NC膜。大部分开发工作是在CN95上进行,因此研究了其他两种NC,以查看是否可以提高测定灵敏度和范围。CN140和CN180 NC是具有较小孔的较慢运行膜,并且可以通过允许在测试线上形成更多的结合事件复合物来提供提高的灵敏度和范围。
表8.使用不同浓度的分析物,针对沉积在CN95、CN140和CN180上的AF1597抗体(在PBS+1%蔗糖中)(AF1597与金缀合)获得的原始数据。
从表8可以看出,当将CN95用作NC时获得了最佳结果,并且这些结果与使用相同NC获得的先前数据非常相似。虽然对所有浓度都给出了良好的特异性信号,但对于200和1,000ng/mL二者,CN140和CN180给出了较低的特异性信号。在10至200ng/mL之间,三种NC给出了非常相似的特异性信号,这表明在此阶段改变NC没有益处。
用于在血浆和血液样品中测试的系统是CN95,以及PBS+1%蔗糖中的沉积的1mg/mL AF1597抗体和以30μg/mL加载在金上的AF1597。
实施例2-检测加标样品中的CD16b
加标的血浆曲线
最初决定查看是否可以在比血液更简单的基质中加标和回收CD16b。为此选择的基质是血浆,抽取全血并将其收集在EDTA和肝素锂管中。一旦收集,就将血液以1,228×g离心10分钟,此时血液分离成三个不同的层;血浆、血沉棕黄层和红细胞。从顶层收集血浆并置于聚丙烯管中。然后将分析物(CD16b)加标到血浆中并在条上运行以查看其是否可以被成功回收;这个实验的结果可见于表9和图1。
表9.在不同浓度的CD16b分析物加标到EDTA或肝素锂收集的血浆中的情况下,针对沉积在CN95上的AF1597抗体获得的原始数据。
NC(AB) | 金(A/B) | 抗凝剂 | 在血浆中的CD16b浓度 | T |
CN95(AF1597 1 | AF1597(30μg/mL) | EDTA | 0ng/mL | 37 |
10ng/mL | 39 | |||
50ng/mL | 50 | |||
100ng/mL | 60 | |||
200ng/mL | 87 | |||
1000ng/mL | 103 | |||
CN95(AF1597 1 | AF1597(30μg/mL) | 锂 | 0ng/mL | 13 |
100ng/mL | 34 | |||
1000ng/mL | 55 |
从表9和图1可以看出,在EDTA血浆中对于50至1,000ng/mL的CD16b获得了特异性的信号(而且,在肝素锂收集的血浆中对于100和1,000ng/mL的CD16b也获得了信号)。EDTA血浆显示出对测量的CD16b浓度的更大的特异性信号差异,表明其是收集静脉血的更好的抗凝剂。
如果使用手指针刺全血,则可能不需要最终形式的抗凝剂收集方法。还应注意的是,在获取的血液样品的血浆中存在一些内源性的可溶性形式的CD16b。这并不奇怪,因为已知中性粒细胞脱落CD16b作为其在血液中周转(turnover)的一部分。可在已离心的血液样品的血沉棕黄层中发现中性粒细胞。为了研究细胞CD16b的测量,需要分离血沉棕黄层。然后可以在测定中对此进行评价,使用洗涤剂裂解/溶解以释放存在的任何细胞CD16b。
实施例3-血沉棕黄层和细胞制剂中的CD16b检测
血沉棕黄层和Histopaque研究
对于可重现的血沉棕黄层收集方法,使用了histopaque梯度分离柱方法。这涉及将1mL histopaque上方的2mL血液小心地分层,并在室温下放置145分钟。然后这将红细胞与血浆和白细胞轻轻分离以留下血浆/细胞混合物,其可在不干扰红细胞的情况下被去除。参见图2。
使用histopaque方法,可以获取血浆/细胞混合物并通过离心分离以得到血浆以及白细胞沉淀。由于使用流式细胞术来计算存在的细胞数目,因此研究了细胞样品以及来自EDTA和肝素锂血液的裂解和不裂解的血浆/细胞混合物。
通过将0.125%Triton x100添加至运行缓冲液(PBS)中进行血沉棕黄层的裂解。还研究了另外的裂解方法,即添加水,这通过渗透作用导致细胞裂解。其结果可见于表10。
表10.使用从具有和不具有裂解缓冲液(TX100和H2O)的肝素锂和EDTA管中收集的细胞和histopaque的血浆/细胞混合物(BC),针对沉积在CN95上的AF1597抗体获得的原始数据。
样品 | 纯的 | +0.125% | +水 |
细胞Prep(GNvC) | 7.5 | 12 | 3.5 |
Histopaque BC EDTA | 81 | 62 | 60 |
Histopaque BC肝素锂 | 58 | 31 | 19 |
从表10中可以看出,当在测定中测试为流式细胞术准备的细胞(因此不是新鲜分离的)时,与血浆相比,信号要低得多。当用Triton或水裂解/溶解细胞时,几乎没有至没有特异性的信号增益。将在该制备中提供的细胞悬浮在对于流式细胞术优选的缓冲液中;所以目前不清楚是否这种缓冲液对现阶段的测定具有有害作用。当从经histopaque处理的血液中去除血沉棕黄层并裂解时,来自用两种裂解方法的纯的中的特异性信号均下降。这表明需要从histopaque方法中收集细胞并将其重悬于当前运行的缓冲液(PBS)中,以查看裂解是否具有期望的作用。
为了从histopaque血沉棕黄层混合物中分离细胞,将两个等分试样以400×g离心10分钟以使细胞充分沉淀。然后移出上清液(保留以用于测试),同时将细胞重悬于相同体积的PBS中,保留一个(并标记为“细胞”),另一个再次离心以完全洗涤细胞的任何可溶性形式的CD16b组分(标记为“经洗涤的细胞”)。使用以下三种裂解方法对这些进行研究:TX100(0.125%)、H2O和由ABCAM在其ELISA包中提供的细胞提取缓冲液。该测试的结果可见于表11和图3中。
表11.使用从有和没有裂解缓冲液(TX100、H2O和CEB)的EDTA管中收集的histopaque血浆/细胞混合物(BC)、细胞和经洗涤的细胞,针对沉积在CN95上的AF1597抗体获得的原始数据。
从图3可以看出,当测量来自histopaque的血沉棕黄层时,用来自细胞制备步骤的上清液获得的信号略有提高。这表明在整个过程中有少量CD16b从细胞中释放,并且这些值不受裂解缓冲液(TX100)的添加的影响。当在PBS中分离和测量细胞时,与血浆相比,信号显著下降。这表明CD16b的可溶性组分存在于血浆中,并且在整个过程中都已被测量。当用TX100裂解细胞时,特异性信号有所提高,这在将水和CEB用作裂解缓冲液时是看不到的。为了查看这种作用是否真实,再次用TX100裂解细胞。这显示出信号再次提高,表明该作用是真实的。为了最终了解裂解是否确实溶解了细胞CD16b和存在的细胞数目,还用所有三种裂解缓冲液测试了经洗涤的细胞。从纯的到被TX100裂解的那些细胞,经洗涤的细胞显示出信号显著提高。CEB的信号略有提高,但其没有TX100那么高。水再次显示出信号没有提高,这表明水不适合用于裂解/溶解。经洗涤的细胞在有和没有裂解的情况下重复两次,并且这再次显示出可以获得显著的信号提高。由于已建立了现在的用于测量细胞CD16b的方法,因此决定观察五名另外的血液供体以确认结果,并通过流式细胞术对细胞进行计数。
实施例4-细胞制剂中的CD16b检测
为了确认实施例3的从裂解细胞中获得的信号与存在的细胞数目相关的结果,研究了五个另外的血液供体。如上所述制备和洗涤细胞。以不同的稀释度制备细胞,以更好地了解细胞数目变化如何影响测定。为第一个血液样品准备的稀释物是4×、2×、纯的和1/2细胞。血液供体1113、1114、1117和1118以2×、纯的和1/2细胞制备。为了制备2×细胞的储液,将800μL血浆/细胞混合物离心,将细胞重悬于400μL PBS中。一旦准备好细胞溶液,将其分成两半,并且一半进入流式细胞术用于中性粒细胞计数并且另一半在测定中读取。五名血液供体的结果与相应的中性粒细胞计数可见于表12和图4至6。
表12.针对沉积在CN95上的AF1597抗体获得的原始数据,使用从具有和不具有裂解缓冲液(TX100)的EDTA管中收集的经洗涤的细胞,以及来自流式细胞术的相应细胞计数。
从图4至6中可以看出,存在以下趋势:中性粒细胞的数目越多,产生的测定信号越高,并且随后这个计数随着测定信号下降,表明两者之间存在明显的关系。血液样品1113中有一个异常点,其中×2样品给出非常高的细胞计数,但测定信号不如1114的2×样品那样高。在测试中发现,×2样品中的白细胞在进行流式细胞术之前已沉淀,因此这可能是计数较高的原因。在图5中发现了血液供体1114的最高测定信号和相应的中性粒细胞计数。来自流式细胞术的细胞计数显示出高的中性粒细胞计数,并且用这些记录的测定信号也相应地高。这表明,如果有更多细胞可供裂解,则中性粒细胞计数越高,测定信号将会越高,这是可以预期的。为了更好地理解中性粒细胞计数与测定信号之间的关系,绘制了相关图。由于血液供体1113包含2×细胞的异常细胞计数,因此将其从相关图中去除。在图7中可以找到立方单位相对于细胞计数的结果。
从图7可以看出,针对裂解细胞获得的测试线测量值(立方单位)与通过流式细胞术获得的中性粒细胞计数之间存在良好的相关性。从图7也可以看出,相关值(R2)为0.861。这表明获得的立方单位与细胞计数之间存在良好的相关性。
由于已发现细胞CD16b(裂解的细胞)与中性粒细胞计数之间的相关性,因此决定查看不同供体的血浆水平和其细胞水平(裂解的细胞)与细胞计数之间是否存在任何联系。由于血浆/细胞混合物包含与全血液样品相同数目的细胞,因此仅与针对纯细胞获得的值进行比较。血浆对裂解的细胞的测试线测量值(立方单位)结果和细胞计数可在表13中找到。
表13.针对来自五名血液供体的离心血浆样品与裂解的经洗涤的细胞的立方单位获得的原始数据,以及从流式细胞术获得的相应细胞计数。
供体 | 血浆 | 细胞裂解(纯的) | 细胞计数 |
1109 | 47 | 11 | 788 |
1113 | 184 | 16 | 1250 |
1114 | 22 | 66 | 4270 |
1117 | 163 | 32 | 790 |
1118 | 103 | 30 | 1180 |
实施例5-血液运输研究
为了确定血液样品在测定中可以储存、处理和使用多长时间,进行了初始稳定性实验。两个不同的血液供体置于Histopaque上的时间点是0、2、3.5和24小时。然后使用PBS+0.06%triton作为裂解缓冲液在2×、纯的和1/2浓度下测量分离的细胞。该血液稳定性实验的结果可在表14中找到。
表14.在湿测定系统中,针对在0、2、3.5和24小时时间点不同浓度的两个供体的经洗涤细胞获得的原始数据(CD16b的立方单位)。
该结果显示0、2和3.5小时时间点的结果具有良好的重现性。在24小时,该结果开始趋于平稳,表明需要在该时间之前处理血液或取样。根据该数据,可以确定血液可以在环境温度下储存3.5小时而不会受到影响。
实施例6-另外的抗CD16b抗体测试
RP02缀合和优化
新抗体(RP02)被确定用于测试,因为其比AF1597抗体更便宜。为了确定RP02的适用性,用该抗体进行了金优化测试(如实施例1中所述)。聚合比率测试(其告知哪种缓冲液最适合用于缀合)的结果可以在图9中找到。从图9可以看出,只有一种缓冲液满足RP02抗体的合适缀合标准,并且该缓冲液是硼酸盐pH 9.3。缀合后,通常将金重悬于金干燥缓冲液中并测试。在这种情况下,没有适合该抗体的干燥缓冲液,因为其在重悬之后会引起聚集。这表明RP02不能用在金上,并且因此其沉积在测试线上并针对AF1597金进行测试。
RP02湿系统测试
为了测试RP02用在硝酸纤维素上的适用性,将RP02沉积在1%蔗糖中的CN140硝酸纤维素上,并针对AF1597 AuC(在30μg/mL)进行测试。初步结果显示,RP02在测试线上的使用提供了非特异性结合(non-specific binding,NSB)的提高,同时提供了良好的特异性信号提高。为了尝试去降低NSB,将运行缓冲液从PBS更改为PBST。还使用两种不同的CD16b抗原(来源于Sinobio和R&D系统)测试了该系统,这些抗原用于产生两种测试抗体RP02和AF1597。
两种类型的CD16b均获得了良好的标准曲线。两种类型的分析物均具有10ng/ml的特定信号增益。两种CD16b抗原在测定的顶端(1000ng/ml)也具有良好的可比性,但在中间CD16b范围(SO-200ng/mL)观察到了差异,与Sinobio系统抗原(RP02免疫原)相比,R&D系统抗原(AF1597免疫原)具有更低的响应。由于AF1597自配对系统对经洗涤的细胞表现出良好的响应,因此决定查看RP02/AF1597系统将如何进行比较。
经洗涤细胞的RP02测试
为了使用CN95 NC和裂解的经洗涤细胞测试RP02/AF1597测试条,获得了两个血液供体,并如实施例3中所述处理白细胞。然后将RP02/AF1597系统与AF1597自配对进行比较以确保良好两个系统之间的相似性。还测量了血液的多种经处理组分以包括血浆(来自离心的血液)、血浆(Histopaque处理后的血沉棕黄层)和不同浓度的经洗涤细胞。
针对不同浓度的经洗涤细胞获得的立方单位为两种系统提供了非常相似的结果。当测量两个供体的不同血浆时观察到差异。当测量两个供体时,AF自配对系统对离心的血浆和血沉棕黄层血浆给出了非常相似的的结果。然而,RP02系统显示出血浆类型之间的差异,当与血沉棕黄层血浆相比时,离心的血浆给出了低得多的值。
初始RP02/AF1597干燥系统(Dry Down System)
为了进一步开发RP02(CN95NC)/AF1597(AuC)测试系统,将试剂干燥。最初,研究了待干燥的金缀合物的体积(2.4、4和6μL),以确定最佳特异性信号增益。CD16b标准品(Sinobio)最初加标到PBST中,并且也加标到PBS中以用于比较。
结果显示当CD16b加标到PBST中时,对于所有沉积的金缀合物体积,特异性信号低于加标到PBS中时获得的信号。当CD16b加标到PBS中并进行测试时,在4和6μL金缀合物体积下在200ng/ml和随后的1μg/ml时观察到良好的特异性信号提高。相比之下,在2.4μL金的情况下,曲线在1μg/ml时趋于平稳,在200ng/ml以上没有信号提高。在顶端,4μI金在PBS中给出了最佳信号,该信号在6μL下降低。为了进一步探究这一点,评估了两个另外的体积以查看是否可以找到更好的信号。
200ng/ml标准品对于所有体积的金缀合物都给出了非常相似的结果。发现500ng/ml标准品对于3μL沉积物最高,然后其对于4和5μL沉积物是较低的但是相当的。1000ng/ml标准品对于3μL和4μL沉积物非常相似,然后其在5μL沉积物中降低。最佳条件在4μL的金沉积物中看到,因为对于所有测试的CD16b浓度都存在良好的特异性信号差异,这与相同体积的湿的金缀合物的高浓度分析物相当。由于4μL表现出最佳性能,因此其被用于进一步测试两个不同的缀合垫(8951和8980)。在这里,使用lsoflow绘图仪将AF1597 AuC缀合物喷涂到两个垫上。
结果显示,在干测定系统中,两个缀合垫都获得了良好的曲线。8980缀合垫的性能优于8951,在标准曲线范围内提供了更好的特异性信号。这表明用于后续部分测试的最佳缀合垫将是8980缀合垫。
实施例7-生物素测试
初始生物素系统测试
为了查看是否可以提高系统的灵敏度,评价了聚链霉亲和素-生物素系统;这也可有助于降低成本,因为抗体通常更昂贵。在该系统中,将聚链霉亲和素绘制在CN140NC的测试线上,并将与生物素和AF1597-金缀合的抗体RP02或AF1597组合并点在缀合垫上。在存在CD16b抗原的情况下,生物素化抗体和金抗体与CD16b形成夹心,并且然后所得复合物将与聚链霉亲和素测试线结合。这在图10中示意性地显示。在此设置中使用了较慢的CN140NC,以允许在到达测试线之前有更多时间形成夹心。
使用Biotinylation Lightning Link试剂盒(@2mg/ml)将抗体RP02和AF1597生物素化,并且随后以1∶100稀释至最终浓度为16.7μg/ml。在初始测试中,将4μL生物素缀合物与4μL金缀合物和20μL CD16b分析物在PBS中混合。
结果显示,AF1597和RP02生物素系统二者均在10至200ng/ml CD16b时获得了良好的特异性信号,两者均在1000ng/ml时表现出钩状效应。还可以看出,在提供完整测定范围的同时,Sinobio CD16b分析物在曲线的下端显示出更低的特异性信号。由于对于高浓度观察到钩状效应,因此这表明缺乏生物素缀合材料并且需要更高的体积。为了测试这一点,将8μL生物素缀合物与相同体积的金一起使用。
结果显示,当生物素缀合物的体积从4μL提高到8μL时,可以获得更好的标准曲线。在200至1000ng/ml之间观察到特定信号的差异,表明使用4μL缀合物观察到的钩状效应已被克服。由于针对生物素系统已获得了良好的标准曲线,因此进行了与其中抗体沉积在硝酸纤维素上的先前系统的比较。在这里,使用4μL的1/50稀释的生物素缀合物来模拟先前实验中使用的8μL的1/100稀释液。
结果显示,生物素与非生物素系统二者之间有良好的相似性,二者都给出了良好的标准曲线。在这种情况下,将生物素系统干燥以评估其与金缀合物系统相比的性能和适用性。
生物素干燥测试
由于最终的装置需要干燥系统,因此将生物素系统干燥以评估其作为要推进的系统的性能和适用性。由于干燥需要两种组分(金和生物素缀合物),因此决定研究这两种缀合物是否可以混合在一起干燥,或者它们是否需要在垫上分离。
结果显示,当生物素和金缀合物混合在一起并干燥时,可以看到高的非特异性结合,同时特异性信号仅小幅提高,以及差的标准曲线分辨率。然而,当将两者单独在缀合垫上干燥时,两种系统都观察到更低的非特异性,表明材料的混合导致了非特异性信号的提高。AF1597生物素缀合物(与AF1597AuC)显示出非常平缓(shallow)的标准曲线,具有在10至200ng/ml之间的低的特异性信号提高。RP02生物素缀合物(与AF1597 AuC)显示出更好的标准曲线响应,其中在10至200ng/ml之间观察到良好的信号差异,这与测试线形式的RP02抗体的初始干燥曲线相似。因此,生物素系统实现了良好的概念验证。
实施例8-全血测试
裂解时间进程
由于该装置的设计需要裂解从全血中分离的细胞,因此尝试并确定该过程将花费的时间是重要的。发现5分钟的裂解时间给出了良好的信号响应。这将需要在侧流条上运行之前,将细胞与裂解缓冲液预孵育。为了确定细胞在哪个时间给出最一致的信号,设置了时间进程,以0、1、3和5分钟的间隔进行采样。此测试的结果可以在图11中找到。
从图11可以看出,当将细胞裂解5分钟时,对于两个血液供体均获得了良好的曲线。当将细胞裂解3分钟时,对于两个供体均获得了相似的曲线。注意到×2细胞在裂解3分钟后出现最大差异,此时获得的信号较低。这可能是一个异常结果,因为这是该血液供体对于所有三种浓度记录的最低信号。由于结果显示3分钟和5分钟是最佳的,因此决定保留5分钟作为裂解时间以用于进一步的实验。
实施例9-在CD16b侧流装置内捕获和裂解白细胞
在CD16b侧流测定中,利用样品施加窗口下的为样品垫膜形式的过滤器来捕获细胞,显示了对经洗涤的白细胞的捕获和裂解。使用来自EDTA血液的经洗涤的白细胞。确定了可使用一系列过滤器去捕获中性粒细胞,例如PES10(2个方向)、MLRF-NANO-1(LF1)和MLRF-NANO-2(LF2)或无细胞膜(过滤器)。确定了一系列表面活性剂可用于细胞裂解步骤,例如0.03% TX-100、0.03125% SDS或0.0125% Sarkosyl。
实施例10-干测定标准曲线
在侧流测试的干测定形式中,使用喷洒在两个不同的缀合垫(8951和8980;Ahlstrom Munksjo)上并在其上干燥的CD16b抗体-金缀合物来制备测试条。干的条在底部使用缀合垫(该缀合垫与用抗CD16b抗体(11046-RP02-SIB;Stratech)绘制作为测试线的CN95硝酸纤维素膜(Sartorius)重叠),然后在顶部使用接收垫来构建。将CD16b标准品(Stratech)以10至1000ng/mL的浓度范围加标到PBS中。50μL的每种标准品在干的条上运行,然后是30μL的PBS,以及然后在10分钟时在立方读取器上读取测试。该测试的结果可在表15中找到。
表15:针对在PBS中不同浓度的CD16b、在两个缀合垫(8951和8980)上具有干燥的喷雾的金缀合物、读取时间为10分钟所获得的原始数据。
实施例11-乳酸测定
乳酸测定的形式基于乳酸脱氢酶的酶活性。这是通过将乳酸脱氢酶固定在硝酸纤维素膜上并加入黄色四唑(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑氮溴化物(MTT))形式的染料来实现的,黄色四唑在乳酸存在下,在乳酸转化为丙酮酸期间,通过将NAD+还原为NADH而可转化为称为甲((E,Z)-5-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-1,3-二苯基甲)的紫色沉淀。(NB:这里可以使用其他试剂来形成不同的甲)。总体建议形式可在图12中找到。
乳酸测定标准曲线
使用沉积在缀合垫(8951;Ahlstrom)上并在其上干燥的染料混合物(包含MTT)来构建干的侧流测定,该缀合垫与具有以1mg/mL绘制的LDH测试线的CN95硝酸纤维素膜重叠。将乳酸钠以0.1至10mM的浓度范围加标到PBS中,并且将80μL的每种标准品在干的条(一式三份)上运行,并在10分钟时在立方读数器上读取。此测试的结果可在表16和图13中找到。
表16:针对不同浓度的乳酸钠、在缀合垫上干燥的染料混合物和一式三份以立方单位测量的LDH测试线信号所获得的原始数据。
CD16b和乳酸的组合检测
针对全血的条设计需要血液分离器以保留细胞并阻止它们在运行CD16b部分的测定之前被裂解。这种血液分离器将允许血浆运行通过该条,其将给出乳酸测定结果。待测试的初始全血体积为20μL,以及另外的50μL PBS以可能完全洗涤所有来自血液(以及因此来自样品垫)的血浆。希望更高体积的血液会产生更高体积的血浆,并且因此会产生更好的乳酸响应。
结果显示,当在FR1分离垫上使用20μL血液时,缀合垫上几乎没有至没有溶血,这表明当运行乳酸部分的测定时,血液几乎没有至没有溶解。还可以看出,在5分钟后,对于0mM(非常虚弱)和10mM加标的乳酸二者均有明显的响应,对于更高浓度,这种响应更强烈且更激烈。10分钟后,对于10mM样品的响应强度提高,看到更暗且更宽的线。然而,0mM显示响应略有提高,但与在5分钟时的非常相似。由于对于最终的装置,全血的体积可以更低(手指针刺体积可以是低的),因此决定研究更低体积的全血以及更高体积的PBS是否仍会产生响应,同时更好地将血浆冲洗通过条。该测试的结果可在图14中找到。
从图14中可看出,当使用10μL全血以及60μL PBS洗涤通过血浆时,缀合垫上几乎没有至没有溶血。这再次表明即使使用更低体积的血液和更高体积的PBS,细胞也不受影响。还可以看出,在0mM至10mM加标乳酸之间在5分钟时的强度也有明显差异,其在10分钟时变得更明显。还可以看出,甲产物几乎没有至没有从测试线上移动。这些结果表明,可以测量血液样品中的乳酸含量,同时保留随后可被转移到第二条上以用于测量CD16b的细胞。
实施例12-可溶性CD16b相对于膜锚定和细胞内的CD16b的水平与样品中中性粒细胞数目相关性的比较数据
从11个个体获得血液样品。检查可溶性CD16b水平与中性粒细胞数目的相关性。单独地,检查膜锚定和细胞内CD16b的水平(在去除可溶性CD16b和随后的细胞裂解之后)与中性粒细胞数目的相关性。结果显示,细胞相关的(细胞内和膜锚定)CD16b与中性粒细胞水平正相关(图15),而可溶性CD16b与中性粒细胞浓度负相关(图16)。数据显示,膜锚定和细胞内的CD16b与中性粒细胞计数之间的相关性比可溶性CD16b与中性粒细胞计数之间的相关性更好(r平方相关系数为0.53(细胞内的和膜锚定的)相对于0.41(可溶性))。对异常值(3个样品)进行校正后,细胞内和膜锚定的CD16b的R平方相关系数为0.8014,而可溶性CD16b样品的R平方相关系数为0.3478。
膜锚定和细胞内的CD16b与中性粒细胞数目的相关性显著优于可溶性CD16b与中性粒细胞数目的相关性。因此,检测膜锚定和细胞内的CD16b的水平为确定样品中中性粒细胞的数目提供了更准确的方法。
实施例13-湿测试形式中的典型CD16b标准曲线
在侧流测试的湿测定形式中,条在底部使用CN95硝酸纤维素膜(Sartorius)(其用抗CD16b抗体(AF1597)绘制作为测试线),然后在顶部使用接收垫来构建。将CD16b标准品(R&D Systems)以5至200ng/mL的浓度范围加标到PBS中。将20μL的每种标准品与2.4μL AF金缀合物混合,混合并在湿的条上运行,然后是30μL PBS,以及然后在立方读取器上读取10分钟时的测试读数。该测试的结果可在表17和图1中找到。
表17:在10分钟读取时间下,以湿测定形式,在PBS中不同浓度的CD16b的所获得的原始数据。
Claims (42)
1.通过确定CD16b的水平来确定样品中的中性粒细胞水平的方法,其中所述CD16b包含细胞内形式的CD16b。
2.用于在对象中预测、诊断、排除和/或监测中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症和/或非中性粒细胞减少性脓毒症的方法,所述方法包括确定样品中CD16b的水平,其中所述CD16b包含细胞内形式的CD16b。
3.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述CD16b包含膜锚定形式的CD16b和细胞内形式的CD16b、基本上由其组成,或者由其组成。
4.根据任一前述权利要求所述的方法,其中
(i)所述方法还包括在确定CD16b的水平之前从所述样品中去除至少部分,并且优选大部分或全部可溶性形式的CD16b的步骤;或者
(ii)所述方法对先前已从中去除至少部分,并且优选大部分或全部可溶性形式的CD16b的样品进行。
5.权利要求4所述的方法,其中去除至少部分可溶性形式的CD16b的步骤是过滤步骤,其中所述过滤步骤优选地产生:
(i)包含白细胞的经过滤样品,其中所述经过滤样品优选地耗尽了所述样品的可溶性组分;和
(ii)包含所述样品的可溶性组分,优选可溶性形式的CD16b的溶液;其中所述溶液优选地不含白细胞,但优选地包含红细胞。
6.权利要求4或5所述的方法,其中权利要求4所述的从所述样品中去除至少部分可溶性形式的CD16b的步骤或者权利要求5所述的过滤步骤是在保持所述样品中存在的至少大部分并且优选地基本上全部的中性粒细胞完整且优选地存活的条件下进行的。
7.根据任一前述权利要求所述的方法,其中CD16b的水平使用一种或更多种CD16b检测部分,优选地经标记的结合试剂、优选地一种或更多种CD16b结合抗体来确定。
8.权利要求7所述的方法,其中所述CD16b结合抗体是多克隆抗体或者单克隆抗体。
9.根据任一前述权利要求所述的方法,其中将中性粒细胞水平确定为高于或低于一个或更多个预定阈值,优选地其中:
(i)低于预定阈值的中性粒细胞水平指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(ii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(iii)高于预定阈值的中性粒细胞水平指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;或者
(iv)低于预定阈值的中性粒细胞水平指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者存在或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险不显著。
10.根据权利要求9所述的方法,其中使用一个或更多个阈值,其中所述一个或更多个阈值选自:
(a)少于1000个中性粒细胞/μL血液,其指示中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性脓毒症、发生中性粒细胞减少的风险显著和/或发生中性粒细胞减少性脓毒症的风险显著;
(b)1000至1500个中性粒细胞/μL血液,其指示需要进一步监测对象的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的发生;
(c)超过1500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症,或者存在或发生中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症的风险不显著;
(d)超过7500个中性粒细胞/μL血液,其指示(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险显著;和/或
(e)少于7500个中性粒细胞/μL血液,其指示不存在(非中性粒细胞减少性)脓毒症,或者存在或发生(非中性粒细胞减少性)脓毒症的风险不显著。
11.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述样品来自以下的对象:(i)已暴露于辐射;(ii)已接受或正在接受能够引起中性粒细胞减少的药物,例如抗精神病药物或甲状腺药物;(iii)患有HIV、肝炎和/或自身免疫性病症,例如类风湿性关节炎;(iv)患有癌症和/或已接受或正在接受化学治疗和/或放射治疗;(v)正表现出或正在经历感染症状;和/或(vi)最近接受过手术。
12.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述方法包括在确定CD16b的水平之前的细胞裂解步骤,优选地使用表面活性剂,其可以是离子或非离子的,例如Triton X-100。
13.权利要求12所述的方法,其中所述细胞裂解步骤
(i)在去除至少部分所述可溶性CD16b的步骤之后进行;或者
(ii)对先前已从中去除至少部分可溶性CD16b的样品进行。
14.任一前述权利要求所述的方法,其中CD16b的水平通过侧流测定来确定。
15.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述方法还包括检测指示所述样品中存在(中性粒细胞减少性或非中性粒细胞减少性)脓毒症的一种或更多种不同的标志物。
16.权利要求15所述的方法,其中所述方法包括在所述样品中检测乳酸和/或确定乳酸水平的步骤。
17.权利要求16所述的方法,其中检测乳酸和/或确定乳酸水平的步骤
(i)在确定CD16b的水平之前进行;
(ii)在任何细胞裂解步骤之前进行;
(iii)对包含所述样品的可溶性组分的溶液,例如根据权利要求5(ii)的溶液进行;和/或
(iv)通过侧流测定进行。
18.根据任一前述权利要求所述的方法,其中所述方法包括:
(a)对所述样品进行过滤以产生以下的步骤:
(i)包含白细胞的经过滤样品,其中所述经过滤样品优选地耗尽了所述样品的可溶性组分;和
(ii)包含所述样品的可溶性组分的溶液;其中所述溶液优选地不含白细胞;
(b)来自(i)的经过滤样品的细胞裂解的步骤;
(c)确定来自(b)的样品中CD16b水平的步骤,任选地在第一侧流条上;以及任选地
(d)在(ii)中检测乳酸或确定乳酸水平的步骤,任选地在第二侧流条上,
其中步骤(d),如果存在的话,可以与步骤(b)或(c)同时或顺序进行。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法,其中使用乳酸脱氢酶和试剂检测乳酸和/或确定乳酸水平,优选地,其中所述试剂是显色试剂,更优选地,其中所述试剂在乳酸存在下在乳酸脱氢酶作用时改变颜色。
20.根据任一前述权利要求所述的方法,其中在不同时间从所述对象获取至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个样品,并且确定CD16b以及任选地一种或更多种另外的标志物,例如乳酸的水平,优选地,其中每6至24小时,例如每天,或者每2、3、4、5、6、7或14天获取所述样品。
21.根据任一前述权利要求所述的方法,其中在确定CD16b以及任选地一种或更多种另外的标志物,例如乳酸的水平之前不超过24小时从所述对象中获取样品,优选地在确定CD16b以及任选地一种或更多种另外的标志物,例如乳酸的水平之前不超过4、3、2或1小时或者30、25、20、15或10分钟从所述对象中获取样品。
22.根据任一前述权利要求所述的方法,其中对即将发生的中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的预测,或者对中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的诊断导致决定对所述对象进行治疗和/或用抗细菌剂,优选广谱抗生素对所述对象进行治疗。
23.预测对象对使用抗生素进行治疗的响应性和/或选择用于使用抗生素进行治疗的对象的方法,其包括进行任一前述权利要求所述的方法,以及预测响应性,和/或在预测出或诊断出中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或者(非中性粒细胞减少性)脓毒症的情况下,选择所述对象以进行治疗。
24.治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法,其包括向患有中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的对象施用抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变并且任选地还表现出乳酸水平改变,和/或其中通过进行任一前述权利要求所述的方法,所述对象被选择进行治疗。
25.用于治疗或预防中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症或(非中性粒细胞减少性)脓毒症的方法中的抗生素,其中在样品中,所述对象表现出至少CD16b的水平改变并且任选地还表现出乳酸水平改变;和/或通过进行任意前述权利要求中任一项所述的方法,所述对象被选择进行治疗。
27.测试装置、测试套件或测试物质组合物,其包含:
a.样品接收区,来自对象的样品添加至所述样品接收区;
b.缀合区,其包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分;
c.固体支持物,其限定样品的液体流动路径并且包含:
(i)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b结合,从而将CD16b固定在所述测试线处以通过也与CD16b结合的所述经标记检测部分来产生信号;或者
(ii)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤(b)的CD16b结合的所述经标记检测部分结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号;并且任选地还包含:
d.至少一种经标记的对照结合试剂,其与固定在针对CD16b的所述测试线的下游对照线处的结合配偶体结合,并因此确认测试已成功完成;并且任选地还包含:
e.测试(和对照,在存在的情况下)线下游的吸收材料,以吸收过多的样品。
28.权利要求27所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其中所述固体支持物包含色谱介质和/或毛细管流动装置。
29.权利要求27或权利要求28所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其为测试条。
30.权利要求27至29中任一项所述的测试装置、测试套件或测试物质组合物,其中来自所述对象的所述样品是根据权利要求5(i)所述的包含细胞的经过滤样品。
31.测试装置、测试套件或测试物质组合物,其包含:
a.第一测试条,其包含第一样品施加区,来自对象的样品添加至所述第一样品施加区,其中所述第一样品施加区包含捕获白细胞的过滤器;
b.第二测试条,其包含:
i.第二样品施加区,具有捕获的白细胞的所述过滤器添加至所述第二样品施加区;
ii.缀合区,其包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分;
iii.固体支持物,其限定样品的液体流动路径并且包含:(i)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b结合,从而将CD16b固定在测试线处以通过也与CD16b结合的所述经标记检测部分来产生信号;或(ii)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤ii的CD16b结合的所述经标记检测部分结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号;并且任选地还包含:
iv.至少一种经标记的对照结合试剂,其与固定在针对CD16b的所述测试线的下游对照线处的结合配偶体结合,并因此确认测试已成功完成;并且任选地还包含:
v.测试(和对照,在存在的情况下)线下游的吸收材料,以吸收过多的样品。
32.用于诊断或监测对象的系统或测试套件,其包含:
a.测试装置,其用于确定样品中至少CD16b的水平,优选根据权利要求27至31中任一项所述的;
b.处理器;和
c.存储介质,其包含计算机应用程序,当由所述处理器执行时,所述计算机应用程序被配置成:
i.访问和/或计算所述测试装置上的所述样品中至少CD16b的确定水平;
ii.计算来自所述样品中至少CD16b的水平的测试评分,其任选地包括将所述水平与一个或更多个阈值和/或在一个或更多个较早时间点确定的CD16b水平进行比较,从而预测或诊断中性粒细胞减少和/或中性粒细胞减少性脓毒症、或(非中性粒细胞减少性)脓毒症;并且
iii.从所述处理器输出所述对象的预测或诊断结果。
33.根据权利要求1至24或权利要求26中任一项所述的方法,其中所述方法包括使用如权利要求27至31中任一项所述的侧流装置套件或组合物。
34.根据权利要求1至24中任一项所述的方法,其包括以下步骤:
i.将样品添加至第一测试条的第一样品施加区,以捕获包含在所述第一测试条内的过滤器上的任何中性粒细胞;
ii.将具有捕获的中性粒细胞的所述过滤器转移至第二测试条的第二样品施加区;
iii.向所述过滤器添加裂解试剂以裂解中性粒细胞;以及
iv.确定CD16b的水平。
35.权利要求33所述的方法,其中确定CD16b水平的步骤包括:
i.使裂解的中性粒细胞的溶液与包含至少一个与CD16b结合的经标记检测部分的缀合区接触;
ii.使裂解的中性粒细胞和所述至少一个与CD16b结合的经标记检测部分的混合物与以下接触:
(i)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,其还与CD16b结合,从而将CD16b固定在所述测试线处以通过也与CD16b结合的所述经标记检测部分来产生信号;或者
(ii)针对至少CD16b的测试线,所述测试线包含经固定的另外的检测部分,该检测部分与步骤ii的CD16b结合的所述经标记检测部分结合,从而将其固定在所述测试线处,产生信号。
36.权利要求34或权利要求35所述的方法,其中所述裂解试剂是表面活性剂,其可以是离子或非离子的,例如Triton X-100。
37.权利要求34至36中任一项所述的方法,其中与CD16b结合的经标记检测部分是与金颗粒缀合的抗CD16b抗体。
38.权利要求34至37中任一项所述的方法,其中所述另外的检测部分是抗CD16b抗体,优选多克隆抗体。
39.权利要求34至38中任一项所述的方法,其中将所述样品添加至所述第一施加区的步骤之后是细胞洗涤步骤。
40.权利要求34至39中任一项所述的方法,其中所述过滤器是适合于捕获中性粒细胞的膜,例如微孔膜。
41.权利要求34至40中任一项所述的方法,其中手动或自动地进行转移具有捕获的中性粒细胞的过滤器。
42.权利要求34至41中任一项所述的方法,其中所述方法还包括在所述样品中检测乳酸和/或确定乳酸水平。
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