KR100912469B1 - 정신분열증 진단용 ｓｎｐ와 그를 포함하는 마이크로어레이및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국인 정신분열증 환자를 유전학적 방법으로 검출할 수 있는 SNP 및 초위성체를 이용한 바이오 마커에 관한 내용으로서, 정상인과 신경정신외과학적으로 정신분열 판정을 받은 환자의 혈액으로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 문헌상에 정신분열증에 관련되었다고 보고된 인터페론 감마 유전자와 인터페론 감마 유전자가 결핍된 생쥐를 정신분열 모델로 하여 발굴된 TPI1(TriosePhosphate Isomerase 1) 유전자 및 CKB(Creatine Kinase, Brain-specific) 유전자의 SNP 위치로부터 유전자형 분석(SNP 대립 유전자 빈도와 CA 염기서열의 초위성체 다형성 분석)를 통해 유의성 있는 세가지 SNP 및 초위성체를 정신분열 진단 마커로 활용하기 위함이다.

본 발명은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 rs2430561의 상보서열인서열번호 1의 폴리뉴클레오티드, TPI1 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 2의 rs2071064 폴리뉴클레오티드, 및 CKB 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 3의 rs2765042 폴리뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 2의 경우 61번째, 및 나머지 서열번호의 경우 301번째) 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 SNP를 제공한다. 또한, 본 발명은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 rs2430561의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 302번째부터 CA 염기서열이 연속 반복되는 초위성체 다형성을 포함하고 40개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 초위성체를 제공한다.

본 발명의 SNP 또는 초위성체를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 의하여, 정신분열증의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단할 수 있다.

정신분열증, 인터페론감마 유전자, TPI1 유전자, CKB 유전자, 단일 염기 다형성, SNP, 초위성체, Microsatellite

Description

정신분열증 진단용 ＳＮＰ와 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트{SNP for diagnosing schizophrenia, microarray and kit comprising the same}

본 발명은 정신분열증 진단용 SNP와 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.

인간 유전체 염기서열 중에 99.9%가 동일하지만, 일부분 0.1%의 차이에 의해 개인간의 모습이나, 행동, 그리고 질환감수성에 차이가 생긴다. 30억개 인간 유전체 염기서열 중에서 대략 1,000bp 마다 1회의 빈도로 서로 다른 염기가 올 수 있고, 이는 총 3백만개가 되며, 이를 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)이라고 부른다. 즉, 인간 유전체의 전체 염기서열중에서 다형성을 보이는 3백만개 정도의 염기를 분석한다면, 개인간이나 집단간의 차이, 또는 질환군과 정상인의 차이를 알 수 있을것이다.

SNP는 세대를 통한 새로운 돌연변이율이 작고, 적은 비용으로 빠르고 정확한 분석이 가능하기 때문에 인구집단의 유전학적 통계분석에 유리하고, 다른 유전학적 지표에 비해서 더욱 중요하게 사용되고 있다. 또한 SNP는 그 빈도가 높고, 안정하며 유전체 전체에 골고루 잘 분포되어 있어 자동화로 대단위 발굴이 가능하다. SNP 는 DNA 칩 기술, 초고속 염기서열 분석 기술 등과 접목되어 개인의 질병 예측 및 의약품에 대한 개인 차이를 규명하는 등의 새로운 분야에 크게 기여할 것이다.

SNP는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP가 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수 있다. SNP가 비코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 이들 중 일부는 RNA 스플라이싱에 영향을 주어 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다. 이들 SNP가 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 SNP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용할 수 있다.

현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능분석에 관한 연구를 수행하고 있고, 이렇게 찾아낸 SNP의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개함으로써 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다. 그러나 이러한 SNP는 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 SNP가 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.

초위성체(microsatellite) 또는 SSR(simple sequence repeat)는 반복 길이 6개 이하로 비교적 짧게 앞뒤로 나란히 반복되는 DNA를 가지는 서열이다(도 1). 이들은 진핵세포 게놈에서 매우 풍부하게 존재하며, 주어진 집단에서 개체 사이의 반 복 유닛에서 고변이(hypervariable)이다. 반복수에 품종 간 다형이 있는 경우, 초위성체의 인접영역에서 디자인한 프라이머('SSR 프라이머'라고 함)를 이용하여 PCR을 행하면, PCR 산물의 길이에 따라 다형성이 관찰되고, DNA 다형성을 검출하는 것이 가능하게 된다. 초위성체 마커와 SSR 마커는 분석이 용이하고 높은 재현성을 가지는 장점으로 인하여 생물종의 동정에 자주 사용되고 있다. 또한 계통적 및 유전적 지도 분석의 수행 뿐 아니라 집단의 다양성과 유전적 구조를 조사 하기 위한 유전적 마커로서 사용되어져 왔다(Akkaya et al., 1992; Ashkenazi et al., 2001; Chen et al., 1997; Senior et al., 1998; Mohan et al., 1997; Xiao et al., 1996). 특히 초위성체 마커 또는 SSR 마커를 이용한 다형성 검출은 외부 환경의 영향을 전혀 받지 않는다는 장점이 있다. 따라서 다형성을 검출하는데 초위성체 또는 SSR 마커가 가장 효율적인 것으로 사료되고 있어 최근 이들에 대한 개발이 한창 진행중에 있다.

한편, 정신분열증(Schizophrenia)은 조발성 치매증이라고도 하며, 한국에서는 전체 정신병원 입원환자의 2/3 이상을 이 환자가 차지한다. 정신병 중에서 흔히 발생하는 병으로서 한국에서의 조사결과는 전인구 중 0.31∼0.54%의 이환율을 나타내고 있다.

이 병에 대해서는 아직 규명되지 못한 것이 많아 병의 원인이 무엇이라고 단정적으로 말할 수는 없으나, 현재 지배적인 견해는 정신분열증은 여러 원인적 요인들이 복합적으로 작용하여 발병하는 증후군 내지 복합질병이라는 견해이다. 따라서, 정신분열증의 원인에 대해 유전적, 생물학적 및 사회 심리학적 연구 모두 필요 하다. 유전문제에서 보면 일란성 쌍생아의 발병일치율은 이란성 쌍생아보다 약 5배나 높은 것으로 보아 유전문제를 무시할 수는 없다.

정신분열증을 진단, 혹은 조기 예측하는데 가장 큰 문제점은 증상이 서서히 진행하므로 초기 단계임을 알지 못하는 경우가 대부분이고, 병이 진행함에 따라 괴상한 행동, 무의미한 말, 이상한 감각을 가지게 되며, 이런 상태가 적어도 6개월이상 지속될 때 이를 정신분열증 이라고 진단하게 된다는 점이다. 정신분열증의 진단은 병력과 임상자료에 근거하여 다른 장애를 배제해 나가는 방법에 의하며, 정신분열증 증상과 비슷한 증상이되 6개월 이하이면 정신분열형 장애(Schizophreniform Disorder)로, 1일 이상 1개월 이내이면 단기 정신병적 장애(Brief Psychotic Disorder)로 진단한다.

정신분열증과 관련하여 자가 면역 질환에서 전형적으로 나타나는 T세포 사이토카인시스템의 이상 현상 (인터루킨-2의 증가, 인터루킨-2 수용체의 증가, 인터페론 감마의 감소)이 보고되었으며, 임상적으로 인터페론 감마의 중요성이 강조되어 왔다. 정신분열증 환자의 유전학적인 연구는 다 방면에서 진행되고 있고, 임상적으로 중요성을 가진 인터페론에 대한 연구도 진행되고 있지만, 한국인의 정신분열증 환자와의 연관성을 찾아 구분할 수 있는 유전학적 특징을 찾는 연구는 미미한 상태이다

본 발명자들은 정신분열증의 발병 및 그 확률을 조기에 진단할 수 있는 SNP를 발굴하기 위하여 정신분열증과 연관성이 있는 유전자를 탐색하여 선별하고, 각 유전자의 특이적 염기서열을 탐색한 결과, 정신분열증에 특이적인 특정 SNP 및 상기 특정 SNP를 이용하여 정신분열증의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한 정신분열증에 특이적인 특정 초위성체 및 상기 특정 초위성체를 이용하여 정신분열증의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 정신분열증의 진단 및 치료와 같은 정신분열증과 관련된 용도로 사용될 수는 SNP 또는 초위성체를 제공하는 것이다. 또한, 정신분열증의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단하기 위한 상기 SNP 또는 초위성체를 포함하는 마이크로어레이 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 폴리뉴클레오티드, TPI1 유전자의 일부를 구성하는 폴리뉴클레오티드, 및 CKB 유전자의 일부를 구성하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서, 각 SNP 위치 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 SNP를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 초위성체를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 정신분열증 진단용 마이크로어레이 또는 상기 마이크로어레이를 포함하는 정신분열증 진단용 키트를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 SNP 또는 초위성체에 의하면, 정신분열증의 진단 및 치료와 같은 정신분열증과 관련된 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 SNP 또는 초위성체를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 의하여, 정신분열증의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명을 달성하기 위하여 본 발명자들은 인터페론 감마(Interferon-γ, 이하 IFNG)에서 나타나는 특이한 염기서열을 문헌 및 웹사이트(ensembl human SNPView; http://www.ensembl.org) 검색을 통해 인터페론 감마 유전자 내의 여러 가지 유전적 다형 현상 중 다른 인종에서 유전적 다형성이 분석되어 있는 단일염기다형성들을 골라서 이를 바탕으로 소규모 그룹의 샘플을 통해 예비 분석한 결과 rs2430561(SNP의 NCBI GenBank 등록번호) SNP와 CA 반복 초위성체(microsatellite)에서 환자와 정상인간의 유전적 다형성 차이가 통계적으로 유의한 것으로 사료되어 좀 더 큰 그룹의 환자군과 정상인군과의 샘플을 대상으로 유전적 분석을 실시하였 다.

또한, 본 발명자들은 인터페론 감마 유전자가 결핍된 생쥐를 정신분열 모델로 삼아 2차원 전기영동 및 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight) 질량분석을 시행한 결과, 몇 가지의 후보 단백질을 찾아내었다.

후보 단백질 중 TPI1(TriosePhosphate Isomerase 1)은 중요한 해당효소(Glycolytic enzyme)의 한 가지로서 당 대사에서 핵심적인 역할을 하는 효소로 알려져 있다. 또한, 당대사가 뇌에서의 중요한 에너지 보급경로이기 때문에 뇌질환인 정신분열증과 관계를 유추할 수 있다. 이에 본 발명자들은 TPI1 에서 나타나는 특이한 염기서열을 웹사이트(ensembl human SNPView; http://www.ensembl.org) 검색을 통해 TPI1 유전자 내의 여러 가지 유전적 다형 현상 중 다른 인종에서 유전적 다형성이 분석되어 있는 단일염기다형성들을 골라서 이를 바탕으로 소규모 그룹의 샘플을 통해 예비 분석한 결과 rs2071064(SNP의 NCBI GenBank 등록번호) SNP에서 환자와 정상인 간의 유전적 다형성의 차이가 통계적으로 유의한 것으로 사료되어 좀 더 큰 그룹의 환자군과 정상인군과의 샘플을 대상으로 유전적 분석을 실시하였다.

또 다른 후보 단백질 CKB(Creatine Kinase, Brain-specific)는 ATP와 크레아틴(Creatine)을 생성하기 위해 크레아틴인산(Phosphocreatine)에서부터 인산화기(N-phosphoryl group)을 ADP에 옮겨 주는 역할을 하는 효소로서, 신경조직에서 에너지 대사에 중요한 역할을 하는 효소로 알려져 있으며 또한 정신질환 (양극성장 애, 정신분열증 등)에서 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 CKB에서 나타나는 특이한 염기서열을 웹사이트(ensembl human SNPView; http://www.ensembl.org) 검색을 통해 CKB 유전자 내의 여러 가지 유전적 다형 현상 중 다른 인종에서 유전적 다형성이 분석되어 있는 단일염기다형성들을 골라 이를 바탕으로 소규모 그룹의 샘플을 통해 예비 분석한 결과 rs2765042(SNP의 NCBI GenBank 등록번호) SNP에서 환자와 정상인 간의 유전적 다형성 차이가 통계적으로 유의한 것으로 사료되어 좀 더 큰 그룹의 환자군과 정상인군과의 샘플을 대상으로 유전적 분석을 실시하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 rs2430561의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 SNP를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TPI1 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 2의 rs2071064 폴리뉴클레오티드에 있어서, 61번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 SNP를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CKB 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 3의 rs2765042 폴리뉴클레오티드에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 SNP를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 2의 경우 61번째, 및 나머지 서열번호의 경우 301번째) 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 다중 SNP를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 rs2430561의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 302번째부터 CA 염기서열이 연속 반복되는 초위성체 다형성을 포함하고 40개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정신분열증 진단용 초위성체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 정신분열증 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 정신분열증 진단용 키트를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일면은 정신분열증 진단용 SNP에 관한 것이다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP는 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP는 TPI1 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 61번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP는 CKB 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 301번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP는 서열번호 1 내지 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 2의 경우 61번째, 및 나머지 서열번호의 경우 301번째) 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, SNP(단일 염기 다형성; single nucleotide polymorphism)는 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차 이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태(약 1개/ 1kb)를 말한다.

상기 서열번호 1 내지 3은 상기 각 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 존재하는 각 SNP의 특성에 관하여는 하기 표 1에 기재되어 있다. 서열번호 1은 rs2430561의 상보적인 염기서열(Reverse strand)을 나타내고, 서열번호 2는 rs2071064의 염기서열을 나타내며, 서열번호 3은 rs2765042의 염기서열을 나타낸다.

SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호	SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드	유전자	SNP 역할	대립 유전자
rs2430561의 상보서열	서열번호 1	interferon-γ	intron	A/T
rs2071064	서열번호 2	triosephosphate isomerase 1	untranslated	C/T
rs2765042	서열번호 3	creatine kinase, brain-specific	untranslated	C/T

상기 서열번호 1 내지 3의 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 실시예 2에서는 정신분열증과의 관련성이 매우 큰 SNP를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳐 선택된 세가지의 SNP에 대한 환자군과 정상인군간의 단일 염기 다형성 분석을 실시하였다. 즉, 정신분열증 환자들 및 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, 상기 DNA 중 선택된 세가지 SNP 부위의 염기 서열을 분석하였다. 본 발명의 실시예 2에서 확인된 SNP의 유전자형 및 대립 유전자 빈도의 분석결과를 표 2 및 표 3에 나타내었고, 상기 세가지 SNP는 정신분열증 진단에 유용한 바이오 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP는 각 SNP 위치(서열번호 2의 경우 61번째, 및 나머지 서열번호의 경우 301번째) 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나의 폴리뉴클레오티드로 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어짐으로써, 정신분열증의 존재 또는 위험의 유무를 더 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 SNP를 구성하는 상기 폴리뉴클레오티드는 20개 이상의 연속 뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 20 내지 70개의 연속 뉴클레오티드인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 또 다른 일면은 정신분열증 진단용 초위성체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 초위성체는 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 302번째부터 CA 염기서열이 연속 반복되는 초위성체 다형성을 포함하고 40개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예 3에서는 정신분열증과의 관련성이 매우 큰 바이오 마커를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳐 선택된 환자군과 정상인군간의 인터페론 감마 유전자에 대해 초위성체 다형성 분석을 실시하였다. 즉, 정신분열증 환자들 및 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, 상기 DNA의 초위성체 부위의 염기 서열을 분석하였다. 본 발명의 실시예 3에서 확인된 초위성체 다형성의 분석결과를 표 4에 나타내었고, 상기 초위성체는 정신분열증 진단에 유용한 바이오 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 정신분열증 진단용 초위성체는 정신분열증의 존재 또는 위험의 유무를 더 효과적으로 진단하기 위하여, 인터페론 감마 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, SNP 위치인 301번째 염기 및 302번째부터 CA 염기서열이 연속 반복되는 초위성체 다형성을 포함하고 40개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 초위성체를 구성하는 상기 폴리뉴클레오티드는 40개 이상의 연속 뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 40 내지 70개의 연속 뉴클레오티드인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 서열번호 1 내지 3의 폴리뉴클레오티드 및 초위성체를 구성하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또한, 정신분열증 진단에 유용한 바이오 마커로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적이다.

상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1 내지 3의 각 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기서, 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 보통 수행된다. 예를 들면, 5×SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 그 3′말단이 서열번호 1 내지 3의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction : LCR)에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위(즉, 15 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 7번 위치가, 16 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 8 또는 9번 위치)가 상기 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명의 다른 일면은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 3의 폴리뉴클레오티드 및 초위성체를 구성하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이에 관한 것이다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에 게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방 법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 정신분열증 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

이차원 전기영동 및 질량분석을 통한 후보 단백질 선별

인터페론 감마 형질전환 생쥐는 Charlers Liver 회사에서 주문 제작하였다. 수령 12주된 수컷 생쥐 (B6.129S7-Ifng ^tm1Ts ) 를 경추이탈 방법으로 희생시켜 뇌 조직 전체를 외과적인 방법으로 적출하여 생리 식염수에 보관하였다. 뇌 조직 1~2 g으로부터 단백질 분해효소 저해제인 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 포함된 시료 완충용액 (10U DNase, 3.75U RNase A, 50mM Tris-HCl, pH 8, 50mM MgCl₂)에서 균질화 시켰다.

균질체액 15,000g 을 냉장상태에서 15분간 원심분리하고 최종적으로 10%(w/v) TCA(Trichloroacetic acid) 용액으로 침전시켰다. 수용성 단백질들을 재 수화 완충용액 (8 M urea, 2% (x/v) CHAPS, 60 mM DTT, 0.5% IPG buffer)에 녹이고 IPG strip gel (pH 4-7, nonlinear gradient strips, 18cm)을 이용하여 등전점 포커싱을 총 81,300 Vㆍhr 동안 수행하였다.

IPG strip gel들을 평형 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH 8.8, 6M urea, 30%(v/v) glycerol, 2%(w/v) SDS, 75mM DTT, 135mM iodoacetamide, 0.002%(w/v) bromophenol blue)에서 15분간 평형화시킨 다음 12% 폴리아크릴 아미드 SDS-PAGE 겔에 전기영동 한 후, 은 염색을 통해 단백질 스팟들을 비교 확인하였다.

발현 차이가 반복하여 뚜렷한 스팟을 선택하여 인-겔 트립신 처리하여 펩티드 형태로 분해하고 아세토니트릴(Acetonitrile) 유기용매를 이용하여 추출한 다음 Zip-tip을 이용하여 정제하였다. 이후, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight) 질량분석 및 Mascot 검색 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였다. 상기 MALDI-TOF는 분석하고자 하는 물질이 레이저 빔을 받으면, 이온화된 매트릭스(3-Hydorxypicolinic acid)와 함께 비행하여 진공상태에서 반대편에 있는 검출기까지 날아가는 데 걸린 시간을 계산하여 질량을 분석해내는 원리에 의하여 작동한다.

2차원 전기영동 및 MALDI-TOF 질량분석을 시행한 결과, 정신분열증과 관계가 있을 것으로 사료되는 후보 단백질로서 TPI1(TriosePhosphate Isomerase 1)과 CKB(Creatine Kinase, Brain-specific)를 선택하였다.

실시예 2

본 발명에 따른 SNP 의 유전자형 분석

본 실시예에서는 한국인 중 정신분열증 환자로 판명되어 치료 중인 환자군과 정신분열증 증상이 없는 정상인의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 특정한 SNP의 출현 빈도를 분석하였다. 본 실시예에서는 문헌 분석 등을 통해 미리 선별한 인터페론 감마 유전자, TPI1 유전자 및 CKB 유전자의 특정 SNP의 유전자형을 분석하였고, 각 SNP에 관한 자료를 표 1에 나타내었다. 또한 도 1, 도 2, 및 도 4에 각 SNP의 염기서열을 나타내었다.

2-1. DNA 시료의 준비

정신분열증 환자로 판명되어 치료 중인 한국인 환자군(189 명)과 정신분열증 증상이 없는 한국인 정상인군(383명)의 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. 염색체 DNA 추출은 공지의 추출 방법(Molecular cloning : A Laboratory Manual, p 392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)과 상업용 키트 (Gentra system, D-50K)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도 기준이 UV 측정비율(260/280nm)로 최소 1.7 이상 되는 것만을 선별하여 사용하였다.

2-2. 표적 DNA 의 증폭

분석하고자 하는 SNP가 포함된 일정한 DNA 영역인 표적 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR 방법은 통상적인 방법으로 진행하였으며, 그 조건은 다음과 같았다. 먼저, 표적 게놈 DNA를 2.5 ng/ml로 준비하였다. 다음으로 다음의 PCR 반응액을 준비하였다.

물(HPLC 급) 3.14㎕

10x 버퍼 0.5㎕

MgCl2 25 mM 0.2㎕

dNTP 믹스(GIBCO)(25 mM/각) 0.04㎕

Taq pol(HotStart)(5U/㎕) 0.02㎕

전위/후위 프라이머 믹스 (10μM) 0.1㎕

DNA 1.00㎕

총 반응 부피 5.00㎕

여기서, 상기 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머는 SNP의 상류와 하류로부터, 적당한 위치에서 선택하였다.

PCR의 열 순환은, 95℃에서 15분 동안 유지하고, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분을 45회 반복하고, 72℃에서 3분 동안 유지한 후, 4℃에 보관하였다. 그 결과, 200개 뉴클레오티드 이하의 길이를 가진 표적 DNA 단편을 얻었다.

2-3. 증폭된 표적 DNA 중의 SNP 부위 서열의 분석

표적 DNA 단편 중 인터페론 감마 유전자 및 CKB 유전자의 SNP의 유전자형 은 염기서열분석기를 이용하여 직접적인 단일 염기 다형성을 분석하였다. 표적 DNA 단편 중 TPI1 유전자의 SNP의 유전자형은 제한효소절편길이다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism, 이하 RFLP)의 방법을 사용하여 [EcoRI (5'-G↓AATTC-3'을 인식하여 DNA 절단)]방법을 이용하여 단일 염기 다형성을 분석하였다. 도 3에 RFPL을 이용한 TPI1 유전자의 단일 염기 다형성 분석 사진을 나타내었다.도 2에 나타나는 바와 같이, TT일 경우 SNP을 포함한 PCR 산물이 절단되어 두 개의 band로 나타나고, CC일 경우 잘리지 않아 하나의 band로 보이며, CT일 경우 두가지의 형태가 모두 나타난다.

2-4. SNP 유전자형 분포 분석 결과

표 2는 SNP의 유전자형 분포에 대한 카이제곱 검정 결과를 나타낸다.

칼럼 '서열번호'는 본 명세서에 첨부된 각 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 번호를 의미한다. 칼럼 'P-value'는 각 SNP의 유전자형의 2-by-3 분할표에 대한 카이제곱 검정의 결과인 확률수준을 의미한다. 상기 P-value가 0.05보다 작은 경우 표본집단은 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있음을 의미한다(김동욱외, [통계학 계론], (서울: 박영사, 2004)).

칼럼 '카이제곱'은 각 SNP의 유전자형의 2-by-3 분할표에 대한 카이제곱 검정의 결과인 카이제곱 값을 의미하며, 관찰값과 기대값의 차이가 얼마나 큰가를 보여준다. 실제 카이제곱 값이 확률수준과 자유도{자유도=(행의 수 - 1)×(열의 수 -1)}를 고려하여 카이제곱 분포표로부터 구해지는 카이제곱 값보다 큰 경우 각 SNP의 유전자형은 정신분열증 유무에 따라 통계적으로 차이가 있음을 의미하며, 실제 카이제곱 값이 클수록 통계적 차이가 더 크다는 것을 의미한다.

서열번호	SNP의 유전자형 분포(%)				카이제곱	P-value
1		유전자형			8.8396	0.0120
		AA	AT	TT
	환자군	56.08	35.45	8.47
	정상인군	67.89	27.68	4.44
2		유전자형			6.0617	0.0483
		CC	CT	TT
	환자군	44.44	43.39	12.17
	정상인군	55.09	36.29	8.62
3		유전자형			7.5614	0.0228
		CC	CT	TT
	환자군	37.57	46.03	16.40
	정상인군	26.37	53.79	19.84

표 2에서 보이는 바와 같이 세가지의 SNP에서 모두 P-value는 0.05보다 작은 값을 나타내어 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있었다. 또한 세가지의 SNP에서 모두 실제 카이제곱 값은 확률수준이 95%이고 자유도가 2인 카이제곱 분포표의 카이제곱 값 5.991보다 컸으며, 각 SNP의 유전자형은 정신분열증 유무에 따라 통계적으로 차이가 있었다.

따라서 세가지의 SNP는 각각 정신분열증 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있으며, 특히 세가지 SNP를 모두 포함하는 경우 매우 효과적인 정신분열증 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있다고 판단된다.

2-5. SNP 유전자형의 대립유전자 빈도 분석 결과

표 3은 SNP의 대립 유전자 빈도에 대한 카이제곱 검정 결과를 나타낸다.

칼럼 '서열번호'는 본 명세서에 첨부된 각 SNP를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 번호를 의미한다. 칼럼 'P-value'는 각 SNP의 대립유전자 빈도의 2-by-2 분할표에 대한 카이제곱 검정의 결과인 확률순준을 의미한다. 상기 P-value가 0.05보다 작은 경우 포본집단은 정신분열증 유무에 따른 각 SNP의 대립유전자의 빈도는 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있음을 의미한다.

칼럼 '카이제곱'은 각 SNP의 대립유전자 빈도의 2-by-3 분할표에 대한 카이제곱 검정의 결과인 카이제곱 값을 의미하며, 관찰값과 기대값의 차이가 얼마나 큰가를 보여준다. 실제 카이제곱 값이 확률수준과 자유도{자유도=(행의 수 - 1)×(열의 수 -1)}를 고려하여 카이제곱 분포표로부터 구해지는 카이제곱 값보다 큰 경우 각 SNP의 대립유전자 빈도는 정신분열증 유무에 따라 통계적으로 차이가 있음을 의미하며, 실제 카이제곱 값이 클수록 통계적 차이가 더 크다는 것을 의미한다.

칼럼 'OR(대립유전자)'은 해당 SNP의 특정 대립유전자를 기준으로 정상인군 중에서 해당 SNP의 특정 대립유전자를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 SNP의 특정 대립유전자를 가질 확률인 오즈비(odds ratio)를 나타낸다. 오즈비의 기준이 되는 특정 대립유전자를 a로 하고, 환자군과 정상인군의 빈도가 다음과 같을 때

오즈비(odds ratio) = ad/bc

환자군 빈도 a b

정상군 빈도 c d

상기 오즈비가 1 보다 큰 경우에는 오즈비 그 자체, 1보다 작은 경우에는 오즈비의 역수로서 해당 SNP가 정신분열증이라는 질병의 발병과의 연관성의 크기를 의미한다. 상기 오즈비가 클수록 상기 연관성도 증가한다. 칼럼 'CI(95%)'는 해당 오즈비가 어떤 구간에 존재할 확률이 95%인 95% 신뢰구간의 하한 및 상한을 의미한다. 상기 오즈비의 95% 신뢰구간이 1을 포함하지 않는 경우 해당 SNP의 질병과의 연관성을 통계적으로 유의하다고 판단할 수 있다(김동욱외, [통계학 계론], (서울: 박영사, 2004)).

또한 해당 SNP의 특정 대립유전자를 기준으로 환자군에서의 상기 특정 대립 유전자의 빈도가 정상인군에서의 상기 특정 대립 유전자의 빈도 보다 큰 경우, 즉 오즈비가 1보다 큰 경우에는 상기 특정 대립 유전자는 위험 대립인자로 작용함을 의미한다. 그 반대의 경우에는 상기 특정 대립유전자 이외의 대립 유전자가 위험 대립인자가 된다. 위험 대립인자를 많이 가질수록 정신분열증 발병 가능성이 높음을 의미한다.

서열번호	SNP의 대립 유전자 빈도(%)			카이제곱	P-value	OR(대립유전자)	CI(95%)
1		대립유전자		9.9509	0.0020	0.6303 (A)	0.4700 ~ 0.8453
		A	T
	환자군	73.81	26.19
	정상인군	81.72	18.28
2		대립유전자		6.1830	0.0129	0.7137 (C)	0.5468 ~ 0.9316
		C	T
	환자군	66.14	33.86
	정상인군	73.24	26.76
3		대립유전자		5.4391	0.0191	1.3486 (C)	1.0498 ~ 1.7323
		C	T
	환자군	60.58	39.42
	정상인군	53.26	46.74

표 3에서 보이는 바와 같이 세가지의 SNP에서 모두 P-value는 0.05보다 작은 값을 나타내어 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있었다. 또한 세가지의 SNP에서 모두 실제 카이제곱 값은 확률수준이 95%이고 자유도가 1인 카이제곱 분포표의 카이제곱 값 3.841보다 컸으며, 각 SNP의 대립유전자 빈도는 정신분열증 유무에 따라 통계적으로 차이가 있었다.

또한, 세가지의 SNP에서 모두 오즈비의 95% 신뢰구간이 1을 포함하지 않으므로 해당 SNP의 질병과의 연관성은 통계적으로 유의하였으며, 인터페론 감마 유전자의 SNP(rs2430561의 상보서열), TPI1 유전자의 SNP(rs2071064), 및 CKB 유전자의 SNP(rs2765042)에서 위험 대립인자는 각각 T, T, C 염기에 해당하는 대립유전자이었다.

실시예 3

본 발명에 따른 초위성체의 분석

본 실시예에서는 한국인 중 정신분열증 환자로 판명되어 치료 중인 환자군과 정신분열증 증상이 없는 정상인군의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 인터페론 감마 유전자의 초위성체 다형성을 분석하였다. 본 실시예서는 실시예 2의 2-1 과 2-2의 방법으로 표적 DNA를 증폭하고, 염기서열분석기를 이용하여 초위성체의 다형성을 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 또한, 도 1에 인터페론 감마 유전자의 CA 반복 초위성체 다형성을 나타내었다.

피검체의 SNP의 유전자형	초위성체의 분포(%)
	질병 유뮤	CA 염기의 반복 수
		12	13	14	15
AA	환자군	1.47	77.94	3.68	16.91
	정상인군	0	75.38	4.62	20
AT	환자군	78.72	6.38	0	14.90
	정상인군	41.51	40.56	7.55	10.38
TT	환자군	100	0	0	0
	정상인군	100	0	0	0
AA+AT+TT	환자군	23.81	57.67	2.65	15.87
	정상인군	15.93	62.40	5.22	16.45

표 4에서 보이는 바와 같이 환자군과 정상인군과의 사이에서 인터페론 감마 유전자의 CA 반복 초위성체 다형성은 전체적인 변화양상이 크기 때문에 정신분열증의 진단표지로 이용될 있다. 또한, 인터페론 감마 유전자 내의 rs2430561의 상보서열인 서열번호 1의 SNP 위치를 동시에 포함하는 경우 매우 효과적인 정신분열증의 진단표지로 이용될 수 있다고 판단된다.

실시예 4

본 발명에 따른 SNP 또는 초위성체가 고정된 마이크로어레이의 제작

상기에서 선별된 SNP 또는 초위성체를 기판상에 고정하여 마이크로어레이를 제작하였다. 즉, 서열번호 1 내지 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 2의 경우 61번째 및 나머지 서열번호들의 경우 301번째) 염기를 포함하는 20개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들(각 SNP는 상기 20개 중 11번째에 위치 함)을 기판상에 고정하였다.

먼저, 상기 각 폴리뉴클레오티드의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem 사)에 스팟팅 하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2×SSC(pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS로 2분간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH4, PBS(pH 7.4) 300 mL, EtOH 100 mL)으로 15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 5

본 발명에 따른 마이크로어레이를 이용한 정신분열증 진단

상기 실시예 2의 2-1 단계 및 2-2 단계에 설명되어 있는 방법을 이용하여 정신분열증 발병 또는 발병 가능성을 진단하고자 하는 대상의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, 형광 표지 시켰다. UniHyb 혼성화 용액(TeleChem 사) 하에서 상기 실시예 3에서 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분간 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000; GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover 사)로 분석하여 상기 대상이 본 발명에 따른 SNP 또는 초위성체를 갖고 있는지를 확인함으로써, 정신분열증의 발병 가능성 및 정신분열증에 대한 감수성을 측정하였다.

도 1은 인터페론 감마 유전자의 SNP인 rs2430561의 상보서열 및 CA 반복 초위성체 다형성을 나타낸 그림이다. 도 1에서 rs2430561의 상보서열의 SNP 위치를 나타내는 +874는 인터페론 감마 유전자 전체 서열을 기준으로 한 염기 위치를 의미하며, 이는 서열번호 1의 301번째 염기에 해당한다.

도 2는 TPI1 유전자의 SNP인 rs2071064의 서열을 나타낸 그림이다.

도 3은 TPI1 유전자의 단일 염기 다형성을 RFLP 방법을 사용하여 나타낸 그림이다.

도 4는 CKB 유전자의 SNP인 rs2765042의 서열을 나타낸 그림이다. 도 4에서 rs2765042의 SNP 위치를 나타내는 -1575는 CKB 유전자 전체 서열을 기준으로 한 염기 위치를 의미하며, 이는 서열번호 3의 301번째 염기에 해당한다.

<110> Korea Basic Science Institute <120> SNP for diagnosing schizophrenia, microarray and kit comprising the same <130> eruum <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgattttctc caaaaagtga tttcaacatt ctgcttctct atctatatta cttgtgaagt 60 attccggaac ttcgttgctc actgggattt tggaagaatt atgattctgg ctaaggaatg 120 tttaaaaatt ttaagtgaat tttttgagtt tcttttaaaa ttttattgat ggttaatgaa 180 aagtttttac attttaaata tttcattatt tgtttaaaac ttagctgtta taattatagc 240 tgtcataata atattcagac attcacaatt gattttattc ttacaacaca aaatcaaatc 300 wcacacacac acacacacac acacactcgc acatgtttgg aactatcttt taaagctcgt 360 ataataatac cctacaggaa ggcacagtag atgtaataga aacctgtacc attggggggc 420 agtattttat agtggggtgg ctttgctgtt ttttgttttt gtatttttta gcctagcttg 480 aaaatacttt ctttagctta ctatagtttt tgggaccttt ggagtatcag ctttgttgag 540 ctcatttgtg acattgcaat ttaatggtta tattgggaaa taaaaaagct aaaagaacat 600 a 601 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acgggagggg ccggccacct gtctgtaagg agactttgtt gcttcccctg cccccggaat 60 ycacagtgct ctgcttctct gtgtcgcccc gcccagcccc ctggtgtgga gggaggggtc 120 t 121 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aagcccttca ggttttgtgg ggtagcaggt gggcagctgc agaaatttct aaaactgggc 60 gaagaggctg cacggggcac agagtgcagg aattccaggc ttaagggaca cctgctgtct 120 ggccagccca gaggggccgt ttgccttttt acatgggttg gttttattaa gtctaaaaaa 180 tgctggcttg gaacaggacg aagcatgcca aggagcaaag aggcatgtgt ctcctctgca 240 gtgaccatgg ggatgagaca ggagaaaagg cccccacacc gatgctcaca taggcagagg 300 ygaacaggct tcccctgcct ttgggccttg gctctggtgc cttctgctct gaggcaccta 360 ttcggggtcc cttatacctg gaacgccact gctctgtgtc cccctggccc cagcagcacc 420 gatctgatgt catctggttt gttgggctgc tggctcatgg ccagtcttcc tccagcagca 480 ggcgctgtgt acctcgctgc ctgctgtatc cccagcggct ggcacctgtt aggtgctcat 540 tgtgccactg ctggagggat ttgtatcaaa tatacccaca gataagagtt ccccccttct 600 t 601

Claims (7)

1. TPI1 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 2의 rs2071064 폴리뉴클레오티드에 있어서, 61번째 염기를 포함하고 20개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 정신분열증 진단용 SNP.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 20개 이상의 연속 염기는 20 내지 70개의 연속 염기인 것을 특징으로 하는 정신분열증 진단용 SNP.
4. 제 1항 또는 제 3항 중 어느 한 항의 정신분열증 진단용 SNP를 형성하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 정신분열증 진단용 마이크로어레이.
5. 제 4항에 있어서, 상기 정신분열증 진단용 마이크로어레이를 구성하는 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판에 고정되는 것을 특징으로 하는 정신분열증 마이크로어레이.
6. 제 5항에 있어서, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정신분열증 진단용 마이크로어레이.
7. 제 4항의 마이크로어레이를 포함하는 정신분열증 진단용 키트.

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