CN105612259A

CN105612259A - B型肝炎慢性化素因的检测方法

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Publication number: CN105612259A
Application number: CN201480047093.1A
Authority: CN
Inventors: 德永胜士; 泽井裕美; 沟上雅史; 西田奈央
Original assignee: University of Tokyo NUC; National Center for Global Health and Medicine
Current assignee: University of Tokyo NUC; National Center for Global Health and Medicine
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2016-05-25
Also published as: EP3040422A4; JPWO2015030142A1; US20160304976A1; BR112016004317A2; EP3040422A1; WO2015030142A1; KR20160040677A; JP6521382B2

Abstract

本发明的课题是提供包括与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因在内的B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的检测方法。所述课题可通过提供包括：比较工序，鉴定能正确反映B型慢性肝炎患者组与健康者组的差异的对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性和抵抗性的等位基因，并将该等位基因与检测体中与所述等位基因相对应的碱基序列或氨基酸序列进行比较；分析工序，对检测体中的对应于所述碱基序列中的等位基因的位点的碱基是否与等位基因的碱基一致进行分析；确定工序，确定检测体的B型肝炎是否发生慢性化和/或病症是否发展的方法、使用该方法进行检测的方法、以及该方法中使用的试剂和包含该试剂的检测试剂盒来解决。

Description

B型肝炎慢性化素因的检测方法

技术领域

本发明涉及包括与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因在内的B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的检测方法、对慢性B型肝炎或其病症发展进行检测的方法、用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂、以及包含该试剂的B型肝炎慢性化和/或病症发展的检测试剂盒。

背景技术

据称，世界人口的1/3比例的人感染B型肝炎病毒(HBV)。B型肝炎可大致分为一时性终止的一时性感染和慢性肝炎。对于急性肝炎，在感染后经1～6个月的潜伏期即出现症状，几周后进入恢复阶段。然而，在急性肝炎的发病患者中，有1～2％的人具有暴发性肝炎的发病危险性，暴发性肝炎的发病患者中有70～80％会死亡。

另外，由于感染的HBV不从体内清除而在肝脏中停留6个月以上会成为携带者。8～9成的携带者在历经无症状期、一时性肝炎期、肝炎平静期之后，以无症状携带者的状态度过。然而，其中的1～2成会转变成慢性肝炎，其中的一部分会进一步转变成肝硬化、肝癌。据称，B型肝炎病毒慢性携带者多数分布在东南亚、东太平洋地区，特别是在日本约有150万人为B型肝炎感染者。

HBV感染后的过程有许多分支，人们主要探究了与慢性肝炎、肝癌有关的病毒一方的遗传因素。然而，近年来，关于宿主一方的遗传因素的探究也在开展之中，根据使用包括日本人在内的亚洲人样本的全基因组关联分析(GenomeWideAssociationStudy:GWAS)，报告了与B型慢性肝炎(CHB)有关的新的遗传因素。提出了在HBV持续感染、病毒清除方面，HLA-DPA1和HLA-DPB1与其相关(非专利文献1、非专利文献2)，还提出了HLA-DR与具有连锁不平衡的HLA-DQ的关联性(非专利文献3)。然而，在使用GWAS的分析中，与慢性化相关的其他影响力较大的遗传因素未被发现。另外，针对癌变而言，根据近年的GWAS可见，中国报告了几个宿主遗传因素(非专利文献4和5)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：KamataniY,WattanapokayakitS,OchiH,KawaguchiT,TakahashiA,etal.(2009)Agenome-wideassociationstudyidentifiesvariantsintheHLA-DPlocusassociatedwithchronichepatitisBinAsians.NatGenet41:591-595.

非专利文献2：NishidaN,et.al.,Genome-WideAssociationStudyConfirmingAssociationofHLA-DPwithProtectionagainstChronicHepatitisBandViralClearanceinJapaneseandKoreanPlosONEJune2012vol.7,Issue5,e39175

非专利文献3：MbarekH,OchiH,UrabeY,KumarV,KuboM,etal.(2011)Agenome-wideassociationstudyofchronichepatitisBidentifiednovelrisklocusinaJapanesepopulation.HumMolGenet20:3884-3892

非专利文献4：LiS,QianJ,YangY,ZhaoW,DaiJ,etal.(2012)GWASIdentifiesNovelSusceptibilityLocion6p21.32and21q21.3forHepatocellularCarcinomainChronicHepatitisBVirusCarriers.PloSGenet7(5):e39175

非专利文献5：JiangDK,SunJ,CaoG,LiuY,LinD,etal.(2013)GeneticvariantsinSTAT4andHLA-DQgenesconferriskofhepatitisBvirus-relatedhepatocellularcarcinoma.NatGenet45:72-5

发明内容

发明要解决的课题

对于HLA-DP而言，虽然已存在通过B型慢性肝炎患者组和比较对照组对等位基因频率进行比较的报告(非专利文献1)，但是，在该等位基因频率的研究中，由于使用非肝炎患者组作为比较对照组，因而所引起的问题是，尚不明确该实验结果是否反映了B型慢性肝炎患者组和健康者组的差异。另外，关于病症发展，与HLA-DPB等位基因的关联也未作研究。

因此，本发明的目的在于，使用健康者组、HBV患者组、B型慢性肝炎组和B型肝炎病症发展组(肝硬化或肝癌)来进行分析，鉴定对B型慢性肝炎和病症发展具有敏感性和抵抗性的等位基因，从而提供包括与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因在内的B型肝炎慢性化和/或病症发展的遗传素因的检测方法、慢性B型肝炎、肝硬化或肝癌的检测方法、用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂和包含该试剂的B型肝炎慢性化和/或病症发展的检测试剂盒。

解决课题的方法

本发明者等人使用健康者组、HBV患者组、B型慢性肝炎组和B型肝炎病症发展组(肝硬化或肝癌)，实施关于HLA-DP的分型，找出了与B型肝炎慢性化有关的等位基因。由此，建立了使用该等位基因的B型肝炎慢性化和病症发展的素因的检测方法、对慢性B型肝炎、肝硬化或肝癌进行检测的方法、用于检测B型肝炎慢性化和病症发展的素因的试剂和包括该试剂的B型肝炎慢性化和病症发展的检测试剂盒。

即，本发明提供了如下技术方案。

(1)一种B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的检测方法，所述方法包括：

a)比较工序：将与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较；

b)分析工序：对检测体中对应于所述等位基因的位点的碱基或氨基酸残基是否与等位基因的碱基或氨基酸残基一致进行分析；以及，

c)确定工序：对检测体的B型肝炎是否发生慢性化和/或病症是否发展进行确定。

(2)如(1)所述的方法，与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性或者抵抗性。

(3)如(2)所述的方法，所述与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的组合是下述组合中的任意一种：仅所述具有敏感性的等位基因的组合、仅所述具有抵抗性的等位基因的组合、或者所述具有敏感性的等位基因与所述具有抵抗性的等位基因的组合。

(4)如(2)或(3)所述的方法，对所述B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，对所述B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01，对所述B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。

(5)如(2)～(4)中任一项所述的方法，所述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因的组合是HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*04:02和HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01。

(6)根据(1)～(5)所述的方法，对B型肝炎慢性化和/或病症发展进行检测的方法。

(7)一种用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂，其含有检测与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的引物。

(8)如(7)所述的试剂，与所述B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性或者抵抗性。

(9)如(8)所述的试剂，与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的组合是下述组合中的任意一种：仅所述具有敏感性的等位基因的组合、仅所述具有抵抗性的等位基因的组合、或者所述具有敏感性的等位基因和所述具有抵抗性的等位基因的组合。

(10)如(8)或(9)所述的试剂，所述对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，对所述B型肝炎慢性化具抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01，对所述B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。

(11)如(8)～(10)中任一项所述的试剂，对所述B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因的组合是HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*04:02和HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01。

(12)一种试剂盒，其含有(7)～(11)中任一项所述的用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂，所述试剂包含与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因。

发明效果

在本发明中，对于HBV患者组，通过进行与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的分析，能阐明B型肝炎慢性化和/或病症发展的分子机理、并能鉴定药物靶点候选分子。另外，通过对HBV携带者进行分析，可对该携带者进行分类，从而分成易于发生慢性化和病症发展的组、以及难以发生慢性化和病症发展的组，其优势在于，能够提供有助于确定后续治疗方针的信息。从而能预防B型肝炎慢性化和/或病症发展，防止恶化，且能进行合适的治疗。

另外，关于B型肝炎慢性化和病症发展的遗传因素，没有明确包括日本人在内的亚洲人和西方人之间是否存在同样的倾向。通过本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展相关的等位基因，能确定专用于包括日本人在内的亚洲人的B型肝炎慢性化和/或病症发展的治疗方针、鉴定药物靶点候选分子。

进而，还能开发精度更高的检测试剂盒，除了含有该等位基因之外，还含有其他免疫相关基因的单核苷酸多态性(SNP)。

附图说明

图1是表示根据本发明的等位基因和DPB1*01:01:01的氨基酸序列的序列比对的图。

具体实施方式

本发明涉及包括与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因在内的B型肝炎慢性化和/或病症发展的遗传素因的检测方法、对慢性B型肝炎和/或其病症发展进行检测的方法、用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂、以及包括该试剂的B型肝炎慢性化和/或病症发展的检测试剂盒。下面对本发明进行说明。

(1)本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展相关的等位基因

本发明涉及与B型肝炎慢性化和/或病症发展相关的等位基因。所谓与B型肝炎慢性化、病症发展相关的等位基因，是指对B型肝炎慢性化、病症发展具有敏感性(B型肝炎容易发生慢性化、容易发生病症发展)或具有抵抗性(B型肝炎难以发生慢性化、难以发生病症发展)的等位基因。

在本发明中，“B型肝炎慢性化”是指HBV持续感染的状态，作为发病的主要原因，可以举出下述情况：来自于HBV持续感染者的母婴感染(垂直感染)的情况；在婴幼儿时期，由于医疗行为等原因，导致HBV持续感染者的血液、体液侵入至体内的情况；在使用如使身体的免疫力降低的免疫抑制剂、抗癌剂期间感染HBV，结果是无法从体内排出HBV而造成持续感染的情况；以及健康者感染了近年称为基因型A的西方型、亚洲/非洲型等的外来种类的HBV的情况等。像这样，一旦感染HBV，8～9成则成为无症状携带者，1～2成则转变成慢性肝炎。其中的一部分进一步转变成肝硬化、肝癌。因此，将由HBV的慢性化转变成肝硬化、肝癌的组称作本发明的“B型肝炎的病症发展”。所谓“肝硬化”，是指由于肝炎病毒感染所造成损伤的肝脏在进行修复时所产生的纤维在肝脏中扩散的状态，其是导致下述症状的原因：由于肝脏变硬而产生腹水、食道静脉瘤、或者由于肝脏机能下降而产生肝性脑病、黄疸。“肝癌”是指由肝炎病毒感染引发的肝细胞癌。

与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因可通过如下方式进行搜索：从慢性B型肝炎患者、肝硬化或肝癌患者、或者健康人中采集生物样品，由所述生物样品制备基因组DNA，并通过直接测序法等对基因序列进行分析。以这样的方式所得到的新的等位基因是从慢性B型肝炎患者或肝硬化或肝癌患者中找到的。因此，所述新的等位基因与B型肝炎慢性化和/或病症发展的相关性较高，有望作为本发明的等位基因的候选基因。为确认如上述选出的等位基因和B型肝炎慢性化和/或病症发展的相关性，能够通过统计检验的方式进行。例如，分别计算B型肝炎慢性化的组和健康人组中的该候选等位基因的出现率，对该候选等位基因与B型肝炎慢性化之间的关联进行统计检验。对于检验，能够根据χ2检验、费希尔精确检验(Fischer’sexacttest)等统计学的适当方法进行检验，根据需要，还可以进行显著性水平的校正。

对于检测上述等位基因的方法，没有特别的限定，对本领域技术人员而言，能够从公知方法中选择。例如，能够根据目的等，从TaqManPCR法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)法、等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO(allele-specificoligonucleotide))法、直接测序法、限制性片段长度多态性(RFLP)法、侵染(invader)法、温度梯度凝胶电泳(TGGE)法、变性梯度凝胶电泳(DGGE)法、MutY酶法、微阵列芯片法(microarray)、蛋白质截短测试法(Proteintruncationtest(PTT))法、Snipper法等公知的分型方法中进行选择。虽然有很多应用PCR法的方法，但是也存在不依赖于PCR法的方法。

本发明人等针对于日本人HBV患者组中的489个检测体和健康对照组中的467个检测体、韩国人HBV患者组中的340个检测体和健康对照组中的140个检测体进行HLA-DPB1分型，鉴定HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01为对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因，鉴定HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01为对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因。另外，鉴定HLA-DPB1*02:01为对B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因。HLA是人的主要组织相容性复合体(MHC；MajorHistocompatibilityComplex)，其是与移植片、细菌、病毒等外来抗原肽进行结合从而提呈给T细胞的膜蛋白质。已知HLA中存在有许多等位基因，关于它们的信息，在HLA系统命名(HLAnomenclature)(http://hla.alleles.org/announcement.html)等中有记载。此外，本说明书中的等位基因、多态性的记号是基于HLA系统命名法的表记方法。

例如，与上述等位基因相关的序列数据可以使用GenBank(NIH基因序列数据库，NIHgeneticsequencedatabase)、DDBJ(日本DNA数据库，DNADataBankofJapan)等的登记在数据库中的数据。例如，HLA-DPB1*05:01的cDNA为917个碱基、在GenBank中登记为AY804138(序列号1)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78743(序列号2)。HLA-DPB1*09:01的cDNA为907个碱基、在GenBank中登记为AY804139(序列号3)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78744(序列号4)。HLA-DPB1*04:02的cDNA是917个碱基、在GenBank中登记为AY804137(序列号5)、氨基酸是258个残基、且登记为AAW78742(序列号6)。HLA-DPB1*04:01的cDNA为883个碱基、在GenBank中登记为AY804136(序列号7)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78741(序列号8)。HLA-DPB1*02:01的cDNA为908个碱基、在GenBank中登记为AY804134(序列号9)、氨基酸为258个残基、且登记为AAW78739(序列号10)。将DPB1*01:01:01的氨基酸序列示于序列号11(AAW78748)，图1表示其与本发明的上述等位基因的序列比对。

此外，上述等位基因HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01有时称作“本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因”、“本发明的与B型肝炎慢性化有关的等位基因”“本发明的等位基因”、或者有时称作多态性、SNP来替代等位基因。

对于在本发明中使用的等位基因而言，除单链和双链的DNA以外，还包括与它们互补的RNA链，其可以是天然所得的物质、也可以是人工制备的产物。例如，在DNA中，可以举出基因组DNA、对应于所述基因组DNA的cDNA、化学合成的DNA、由PCR进行扩增的DNA、以及它们的组合、DNA与RNA的杂交产物，但并不限于上述物质。此外，在本发明中，多核苷酸是指2个以上的核苷酸进行结合而成的物质，通常含有被称作寡核苷酸的长度的物质。另外，本发明中的多核苷酸既可以是DNA，还可以是RNA。

这些碱基序列可通过本领域技术人员所公知的方法、使用合适的片段以制备探针，并使用所述探针通过菌落杂交法、斑点杂交法、Southern印迹法等公知的杂交法从cDNA库和基因组库等中获得。

关于杂交法的详细步骤，可以参见“MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.”(ColdSpringHarborPress(2001)；重点参见Section6-7)、“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(JohnWiley&Sons(1987-1997)；重点参见Section6.3-6.4)、“DNACloning1:CoreTechniques,APracticalApproach2nded.”(OxfordUniversity(1995)；关于杂交法条件重点参见Section2.10)等。

(2)使用本发明的等位基因来检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的方法

本发明涉及一种使用上述本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因(在下述的记载中，有时也称作“多态性”“SNP”)来对B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因进行检测的方法(分型方法)。具体而言，包括下述工序：，a)比较工序：将与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较；b)分析工序：对检测体中对应于所述等位基因的位点的碱基或氨基酸残基是否与等位基因的碱基或氨基酸残基一致进行分析；以及，c)确定工序：对检测体的B型肝炎是否发生慢性化和/或病症是否发展进行确定。本发明的上述方法是基于下述发现：如“(1)本发明的与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因”中所述，对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01，对B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。下面，针对上述方法进行详细说明。

对于“a)比较工序：将与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较”，换言之，即是检测序列号1～10所示的碱基序列和氨基酸序列的等位基因。

在本发明中，对于等位基因的检测而言，能够在基因水平或蛋白质水平下进行。例如，能够由检测体制备基因组DNA或mRNA，基于碱基序列，对基因组DNA或mRNA中的本发明的与B型肝炎慢性化有关的等位基因进行检测。另外，能够由检测体制备人HLA-DP分子蛋白质，通过使用例如抗体等，对DP分子中的HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因进行检测。下面，对这些方法进行简单说明。

(2-1)由检测体制备基因组DNA或mRNA

对于在本发明的方法中所使用的样品而言，能够使用基于从检测体中采集的生物样品并根据本领域技术人员所公知的方法制成的基因组DNA或mRNA，所述检测体是要对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性还是具有抵抗性进行检测的个体。对于在本发明的方法中使用的从检测体中采集的生物样品而言，例如能够使用检测体的细胞或从组织、毛发、粪便、尿液、唾液、细胞、鼻腔粘膜中通过摩擦而取得的细胞等，但并不限于此。

基因组DNA能够通过任何公知的方法进行制备，例如，可举出酚/氯仿法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法等。另外，对于mRNA，也能够通过任何公知的方法来进行制备，例如，可举出异硫氰酸胍法等。在基因组DNA或mRNA的制备中，可以使用市售的试剂盒。作为该试剂盒，例如，作为用于制备基因组DNA的试剂盒，可举出Wizard基因组DNA纯化试剂盒(WizardGenomicDNAPurificationKit)(普洛麦格公司制造)等，作为用于制备mRNA的试剂盒，可举出NucleoTrap(注册商标)mRNA试剂盒(Clontech公司制造)等。此外，为了对下述等位基因进行检测，可以由mRNA合成cDNA。对于cDNA的合成方法，可以使用本技术领域中所公知的任何方法，例如，能够使用随机引物或多聚T引物，并通过RNA逆转录酶－聚合酶链式反应(RT－PCR)来合成cDNA。

(2-2)等位基因的检测

对如上述制备的基因组DNA或mRNA中的HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因的检测而言，能够使用本技术领域所公知的任何基因多态性检测方法进行检测。例如，可以举出使用直接测序法、聚合酶链式反应(PCR)法、限制性片段长度多态性(RFLP)法、杂交法、引物延伸反应法、质谱法等的方法，但并不限于这些方法。但是，在HLA-DRB1基因中，特别是在第2外显子中存在大量多态性位点，因此，为了检测这些等位基因，需要对大量多态性进行判别。下面，针对该方法进行说明。

(2-2-1)直接测序法

在本发明中，通过使用来自基因组DNA或mRNA的cDNA进行的直接测序法，能够检测HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因。直接测序法通过下述步骤进行：由上述制备的基因组DNA或mRNA来制备cDNA，将含有作为检测对象的HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因的区域克隆至载体中，或者通过PCR进行扩增；测定该区域的碱基序列。作为克隆的方法，能够通过使用合适的探针从cDNA库中进行筛选的方式来进行克隆。另外，还可以使用合适的引物通过PCR反应进行扩增，并连接到合适的载体中，由此，能够进行克隆。进而，还能够亚克隆至其它载体中，但是并不限于上述方法。作为载体，例如，能够使用pBlue-Script(商标)SK(+)(Stratagene公司制造)、pGEM-T(普洛麦格公司制造)、pAmp(TM:Gibco-BRL公司制造)、p-Direct(Clontech公司制造)、PCR2.1-TOPO(Invitrogene公司制造)等市售的质粒载体、病毒载体、人工染色体载体、粘粒载体。作为测定碱基序列的方法，能够使用公知的任何方法，例如，可以举出使用放射性标记核苷酸的手动测序法、使用染料标记终止物的自动测序法，但并不限于这些方法。基于通过这样的方法所得到的碱基序列，来确定检测体是否具有相当于HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因的序列。

(2-2-2)PCR法

本发明的等位基因还能够利用PCR法来进行检测。使用寡核苷酸引物进行PCR，所述寡核苷酸引物只与具有本发明的等位基因的序列或具有其他等位基因的序列进行杂交。使用该引物组合对检测体的来自基因组DNA或mRNA的cDNA进行扩增。在只有本发明的等位基因用引物生成了PCR产物的情况下，检测体以纯合的形式具有本发明的等位基因，当产生了由本发明的等位基因用引物和其他等位基因用引物所生成的PCR产物时，检测体以杂合的形式具有本发明的等位基因。在只有其他等位基因用引物生成了PCR产物时，检测体中不含有本发明的等位基因。

(2-2-3)PCR-RFLP法

对于本发明的等位基因，还能够利用限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism；RFLP)法进行检测。首先，通过PCR法对含有作为检测对象的本发明的等位基因的区域进行扩增。接着，使用适于本发明的等位基因的限制性内切酶对该PCR产物进行切断。对于由限制性内切酶消化了的PCR产物，可通过凝胶电泳进行分离，并使用溴化乙锭进行染色以使其可见。将该片段长度与通过分子量标记以及其他等位基因和本发明的等位基因的对比产生的片段长度进行比较，从而能够对检测体中是否存在本发明的等位基因进行检测。

(2-2-4)杂交法

对于本发明的等位基因而言，还能够利用杂交法进行检测。杂交法是基于来自检测体的基因组DNA或mRNA可与对其互补的DNA分子(例如，寡核苷酸探针)进行杂交的性质，来确定本发明的等位基因是否存在的方法。能够利用菌落杂交法、斑点杂交法、Southern印迹法等公知的杂交法等的用于杂交和检测的各种技术来实施所述杂交法。关于杂交法的详细步骤，能够参见“MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.”(ColdSpringHarborPress(2001)；重点参见Section6-7)、“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(JohnWiley&Sons(1987-1997)；重点参见Section6.3-6.4)、“DNACloning1:CoreTechniques,APracticalApproach2nded.”(OxfordUniversity(1995)；关于杂交条件，重点参见Section2.10)等。进而，杂交还能够利用DNA芯片来进行检测。作为该方法，其使用将针对本发明的等位基因设计的特异性寡核苷酸探针粘贴在固体支持物上而制成的DNA芯片。而且，使来自检测体的DNA样品与该DNA芯片接触以对杂交体进行检测。

(2-2-5)其他方法

例如，TaqManPCR法是使用等位基因特异性Taqman探针和Taq聚合酶来同时进行SNP检测以及对包含SNP的区域进行扩增的方法。Taqman探针是5’末端用荧光物质标记、3’末端用淬灭剂标记的约20个碱基左右的寡核苷酸，且其被设计成与目标SNP位点进行杂交。Taq聚合酶具有5’-3’核酸酶活性。在这些Taqman探针和Taq聚合酶的存在下，使用设计成对含有目标等位基因的区域进行扩增的PCR引物对该等位基因区域进行扩增时，在进行扩增的同时，Taqman探针与模板DNA的目标等位基因部位进行杂交。如果从正向引物侧开始的延伸反应到达与模板进行杂交的Taqman探针处，根据Taq聚合酶的5’核酸酶活性，与Taqman探针的5’末端结合的荧光物质被切断。其结果是，游离的荧光物质不再受到淬灭剂的影响，因而发出荧光。通过对荧光强度进行测定，能对SNP进行检测。

作为应用MALDI-TOF/MS法的SNP分型方法，还可以举出与引物延伸法进行组合的方法。该方法可进行高通量分析，通过1)PCR、2)PCR产物纯化、3)引物延伸反应、4)延伸产物的纯化、5)质量分析、6)确定基因型的步骤进行分析。首先，通过PCR，从基因组DNA对含有目标SNP位点的区域进行扩增。将PCR引物设计成不与等位基因位点的碱基重叠。而且，使用核酸外切酶和虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatase)通过酶清除方法进行纯化，或使用乙醇沉淀法进行纯化。接下来，使用设计成3’末端与SNP位点直接相邻的基因分型引物来进行引物延伸反应。将PCR产物在高温进行变性，并通过添加过剩的基因分型引物以进行退火。如果将ddNTP和DNA聚合酶添加至反应体系中以使它们进行热循环反应，则生成比基因分型引物长1碱基长度的低聚物。通过基因分型引物的上述设计，该延伸反应中生成的1碱基长度的低聚物根据等位基因的不同而变化。针对已纯化的延伸反应产物进行质量分析，根据质谱进行分析。

作为可实现高通量的SNP分型法，可举出应用1分子荧光分析法的方法。例如，MF20/10S(奥林巴斯制造)是采用了该方法的系统。具体而言，其是使用激光共聚焦光学系统和高灵敏度光检测器，在约1飞升(1千万亿分之1升)的超微小区域中，对于通过PCR法而扩增了的荧光标记引物的1分子水平的平移扩散时间进行测量和分析的方法，所述PCR法使用了互补/非互补的引物。

另外，基于DNA芯片进行的方法也是一种可实现高通量的分型法。DNA芯片是在基板上将多种DNA探针进行排列并固定而制成，将标记的DNA样品在芯片上进行杂交，并基于探针的荧光信号进行检测。

作为利用除PCR法以外的基因扩增法的SNP分型方法的示例，可以举出Snipper法。该方法是应用了滚环扩增(RCA(rollingcircleamplification))法的SNP分型法，所述RCA法是以环状单链DNA为模板，使DNA聚合酶在其上移动的同时合成互补链DNA的DNA扩增方法。探针为80-90碱基长度的寡聚DNA，两末端含有与目标SNP的5’和3’末端附近区域分别互补的10-20碱基长度的序列，被设计成退火为目标DNA而形成环状。另外，探针的3’末端被设计成与目标等位基因互补的序列。如果探针的3’末端与目标等位基因完全互补，则探针形成环状，但是，如果探针3’末端不匹配，则探针不会形成环状。另外，在探针中，存在40-50碱基长度的主干序列，并且含有与2种RCA扩增引物互补的序列。

作为利用除PCR法以外的基因扩增法的SNP分型方法，例如可以举出利用UCAN法、环介导等温扩增(LAMP)法的分型方法。UCAN法是应用了ICAN法的方法，所述ICAN法是日本宝生物工程公司开发的基因等温扩增法。在UCAN法中，使用DNA-RNA-DNA嵌合性寡核苷酸(DRD)作为引物前驱物。对于该DRD引物前驱体，其3’末端的DNA已经修飾，从而使基于DNA聚合酶进行的模板DNA的复制不会发生，且所述DRD引物前驱体被设计成RNA部分与SNP位点进行结合。如果将该DRD引物前驱体与模板进行孵育，则只有在DRD引物与模板完全匹配的情况下，共存的RNaseH才会切断所配对的DRD引物的RNA部分。由此，引物3’末端由于修饰DNA的脱落而形成新的末端，因而促进基于DNA聚合酶进行的延伸反应，模板DNA进行扩增。另一方面，在DRD引物与模板DNA不匹配的情况下，RNaseH不会切断DRD引物，因而DNA扩增也不会发生。完美匹配的DRD引物前驱体被RNaseH切断后的扩增反应是根据ICAN反应机理来进行的。

LAMP法是由荣研化学公司所开发的基因等温扩增法，其定义目标基因的6个区域(从3’末端侧开始的F3c、F2c、F1c、从5’末端侧开始的B3、B2、B1)，使用与所述6个区域相对应的4种引物(FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物)进行扩增。当以分型为目的时，F1-B1之间可以仅为目标SNP位点(1碱基)，对FIP引物和BIP引物进行设计以使SNP的1碱基将会结合它们的5’末端。在野生型等位基因(WT等位基因)的情况下，以作为LAMP法的起点结构的哑铃结构开始进行DNA合成反应，从而连续进行扩增反应。在存在等位基因的情况下，不会发生以哑铃结构为起始的DNA合成，因而也不进行扩增反应。

侵染(Invader)法是不使用核酸扩增法而使用2种非荧光标记探针(等位基因探针、侵染探针)和1种荧光标记探针(FRET探针)以及核酸内切酶(cleavase)的一种方法。相对于模板DNA，等位基因探针具有从SNP位点与3’末端侧互补的序列，且在探针5’侧具有与称为瓣片(flap)的模板DNA无关的序列。侵染探针具有从模板DNA的SNP位点与5’侧互补的序列，且相当于SNP位点的部分的碱基可以是任意的碱基。FRET探针在其3’侧具有与瓣片序列互补的序列。另一5’侧由荧光色素和淬灭剂进行标记，但是，对FRET探针进行设计以使分子内形成双链，且通常不发光。如果使它们与模板DNA进行反应，则在等位基因探针与模板DNA形成双链时，侵染探针的3’末端(任意碱基部分)侵入SNP位点。核酸内切酶识别该碱基侵入的结构，从而切断等位基因探针的瓣片部分。接下来，如果该游离的瓣片与FRET探针的互补序列进行结合，则瓣片的3’末端侵入FRET探针的分子内双链部分。与上述等位基因探针和侵入探针的情况相同，核酸内切酶识别该FRET探针中瓣片的碱基侵入的结构，从而切断FRET探针的荧光色素。由于荧光色素脱离淬灭剂而发出荧光。在等位基因探针与等位基因不匹配时，由核酸内切酶进行识别的上述特异性结构不会形成，因而瓣片也不会被切断。

(2-2-6)在等位基因的检测中使用的物质

下面，针对本发明的方法中的对等位基因进行检测的多核苷酸进行说明。

当在等位基因的检测中使用引物时，将其设计成符合扩增区域和分型方法的引物。例如，优选能够完全对上述区域进行扩增，能够基于上述区域的两端附近的序列来设计序列。引物的设计方法在本技术领域中是公知的，对本发明中可使用的引物进行设计以满足可进行特异性退火条件，例如，将引物设计为具有可进行特异性退火的长度和碱基组成(融解温度)。对于进行扩增的区域的长度而言，只要不阻碍分型，就没有限定，可根据检测方法适当地进行增减。另外，虽然被扩增的区域中的一部分含有等位基因，但是，并不限于被扩增的区域内的该位点的位置，可根据检测方法(分型方法)配置在适当的位置。因此，在设计引物时，对于引物与等位基因位点的位置关系，可根据检测方法自由设计，只要与含有要检测的等位基因的序列号1、3、5、7和9所表示的碱基序列的一部分区域(例如，连续50个碱基长度以上且500个碱基长度以下)进行杂交，就能够鉴于分型方法的特性对引物进行设计。对于可使引物发挥其功能的长度而言，则优选是10～100碱基以上，通常为15～50碱基、优选为15～30碱基。另外，在进行设计时，优选对引物的融解温度(Tm)进行确认，所述融解温度是任意核酸链的50％与其互补链形成杂交体的温度。为了使作为模板的DNA和引物形成双链以进行退火，需要优化退火温度，但是，另一方面，如果比该温度低得过多，则发生非特异性反应，因而不优选。在进行Tm确认时，能够利用公知的引物设计用软件。

在使用探针进行等位基因检测的情况下，对探针进行设计以使其识别等位基因位点。在设计探针时，根据分型方法，等位基因部位可以由探针内的任意位置进行识别，根据分型方法，还可以由探针的末端进行识别。在将等位基因检测用多核苷酸作为探针的情况下，与基因组DNA互补的碱基序列的长度通常为15～200碱基，优选为15～100碱基，更优选为15～50碱基，但是，根据分型方法，可以长于或短于所述长度。

(2-2-7)本发明中优选的等位基因检测方法

作为本发明的方法，其优选的等位基因的检测方法可以是使用PCR进行的PCR-SSOP(SequenceSpecificOligonucleotideprobe)法，且能够利用该方法对HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因进行检测。对于PCR-SSOP，具体而言，使用生物素标记的引物，并通过PCR对检测体中含有上述等位基因的区域进行扩增。将扩增DNA设为单链DNA，并使其与作为特异性序列的探针进行特异性结合。例如，将探针固定在由荧光色素进行颜色编码的微珠上，从扩增DNA所结合的微珠获得通过生物素的荧光标记链霉亲和素的结合而产生的荧光信号，因此，通过对所述荧光信号的种类和由扩增DNA的结合而产生的荧光进行识别的同时进行检测，来根据扩增DNA所结合的微珠的种类来确定基因类型。该方法中，可以使用市售的试剂盒。作为该试剂盒，例如，可举出xMAP(注册商标)技术(Luminex公司)等的能够一次辨别大量多态性的试剂盒，但并不限于此。下面，对使用本方法的本发明的方法的概要进行说明。

首先，使用能对含有HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因的区域进行扩增的引物、探针等多核苷酸，并以制备的基因组DNA作为模板进行扩增反应，对具有上述碱基序列的核酸片段进行扩增。

在等位基因的检测中所使用的多核苷酸能够基于由序列号1、3、5、7和9所示的碱基序列，且结合其他的引物或探针和适当的检测方法，并通过公知的寡核苷酸合成方法进行化学合成，也可以使用市售的化学合成装置进行合成。只要是本领域技术人员，就能够基于序列号1、3、5、7和9中示出的碱基序列和它们的互补链、以及本发明的等位基因的位置信息，使用公知的方法来合成多核苷酸。进而，在该寡核苷酸的合成过程中，可以利用由荧光色素、生物素等修饰过的核苷酸衍生物来修饰多核苷酸，或者，在已合成的多核苷酸上结合荧光色素等，其合成方法也是公知的。

而且，在由检测体制成的基因组DNA中，使上述引物和耐热性DNA聚合酶等发挥作用以进行PCR反应。对于上述方法，作为本领域技术人员，能够依据“MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.”(ColdSpringHarborPress(2001))”等容易地实施。作为本发明的PCR反应的条件，例如，可举出下述条件。

变性温度：90～100℃

退火温度：40～70℃

延伸温度：60～75℃、

上述循环次数：30～50次左右

为了提高扩增的特异性，可以使用2组以上的引物来进行2次以上的扩增反应。此时，可将各扩增反应中使用的引物设置在相同的位置，也可以设置在比最初进行扩增的引物位置更内侧的位置。通过这种方式，能够以检测体的基因组DNA为模板，特异性地对含有本发明等位基因的碱基序列的区域的核酸片段进行扩增。

接着，对扩增的核酸片段进行纯化，然后确定碱基序列，并将所确定的碱基序列和本发明的等位基因的碱基序列进行比较。由此，能够确定检测体是否具有本发明的等位基因。在对所得到的PCR产物进行纯化时，能够使用公知的方法。例如，可举出：使用WizardSVGelandPCRclean-UPSystem(普罗麦格(Promega)公司制造)、GENECLEAN(船越公司制造)、QIAquickPCRpurificationKits(凯杰(QIAGEN)公司制造)、ExoSAP-IT(GE医疗生物科学有限公司制造)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维滤纸的方法、使用透析管的方法等。在使用琼脂糖凝胶的情况下，能够进行琼脂糖凝胶电泳，然后从琼脂糖凝胶中切取碱基序列片段，并通过WizardSVGelandPCRclean-UPSystem(普罗麦格公司制造)、GENECLEAN(船越公司制造)、QIAquickGelextractionKits(凯杰公司制造)、冷冻挤压法等进行纯化。对于测序而言，可以使用本技术领域中公知的任何方法，例如，可举出直接序列法，其是不将扩增的核酸片段克隆到载体中而直接进行测序的方法，但并不限于这些方法。作为该测序法，例如，能够使用CEQTMDTCSQuickStartKit(贝克曼库尔特(BECKMAN)公司制造)、BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKitABI310(美国应用生物系统(AppliedBiosystems)公司制造)等市售的试剂盒来简单地实施。在实施上述直接序列法的情况下，优选使用能够特异性地确定含有本发明的等位基因区域的碱基序列的引物。所使用的引物组能够通过公知方法进行设计。

以这样的方式，在确定检测体中与本发明的等位基因相对应的区域的碱基序列后，将所述碱基序列与本发明的等位基因的碱基序列进行比较。

(2-3)将与B型肝炎慢性化有关的等位基因和由检测体得到的氨基酸序列中对应于所述等位基因的氨基酸序列的氨基酸序列进行比较的工序

作为本发明的方法，能够在蛋白质水平对本发明的等位基因进行检测。具体而言，通过使用能够特异性识别DP分子的抗体，能够对本发明的等位基因进行检测，所述DP分子具有本发明的等位基因。能够以肽作为抗原，通过免疫学方法来制造该抗体，所述肽由序列号2、4、6、8和10中示出的氨基酸序列的任意区域所形成。对于抗体的制造方法、以及使用抗体来对具有本发明的等位基因的DP分子进行检测的方法，能够使用本技术领域所公知的方法来进行。

(2-4)对B型肝炎慢性化或病症发展的发病抵抗性或敏感性的判定

在本发明中，对于HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01等位基因，显示出该检测体对B型肝炎慢性化具有发病抵抗性。对于HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01等位基因，显示出该检测体对B型肝炎慢性化具有发病敏感性。对于HLA-DPB1*02:01等位基因，显示出该检测体对B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性。从这一点也可以说，本发明的方法是一种使用本发明的等位基因对慢性B型肝炎或病症发展进行检测的方法。

进而，将对B型肝炎慢性化或病症发展为发病敏感性等位基因和发病抵抗性等位基因用于诊断实用性的计算中，也可通过分析B型肝炎患者中B型肝炎慢性化或病症发展的阳性率来进行评价。所谓与B型肝炎慢性化等相关的“阳性率”是指：在全部患者中，具有1个以上的与B型肝炎慢性化等有关的敏感性等位基因的患者的比例，或者，没有或仅具1个与B型肝炎化慢性化等有关的抵抗性等位基因的患者的比例。例如，针对本说明书实施例中记载的日本人HBV患者488人而言，具有1个或2个与B型肝炎慢性化相关的敏感性等位基因即HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01中任一个的患者为410人，两种都不具备的患者为78人，因此，阳性率为84.02％。进一步而言，没有或仅具有1个与B型肝炎慢性化相关的抵抗性等位基因即HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*02:01的患者为450人，具有任意两个的患者为38人，因此，阳性率为92.21％。另外，对于与B型肝炎的病症发展相关的“阳性率”而言，在肝硬化和肝癌患者206人中，没有或仅具有1个与B型肝炎的病症发展相关的抵抗性等位基因即HLA-DPB1*02:01的患者为203人，具有2个的患者为3人，因此，阳性率为98.5％。其中，与B型肝炎的病症发展有关的“阳性率”是指与肝硬化和肝癌患者有关的阳性率。

是否对B型肝炎慢性化等具有发病敏感性这一点，无论是对B型肝炎的慢性患者还是对非慢性患者而言都是重要的信息，例如，是与慢性B型肝炎的治疗方法、治疗药的选择、以及慢性B型肝炎的预防/预防发病有关的重要信息。此外，所述HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01等位基因的存在方式可以为纯合或杂合中的任意一种。这是因为人的各基因具有源自父系和源自母系这两种类型。

另外，本发明人等还在对B型肝炎慢性化具有抵抗性的抵抗性等位基因和对B型肝炎慢性化具有敏感性的敏感性等位基因中，针对具有某种特定的抵抗性等位基因和敏感性等位基因的组合的受试者，求出HBV患者组1380人和健康对照组1225人的95％置信区间中的比值比(OR；OddsRatio)。其中，比值比OR是指，在具有某种等位基因组合的受试者组中，HBV患者组的比值OsP和健康对照组的比值OsC的比。所述HBV患者组的比值OsP可根据HBV患者数中具有某种特定等位基因组合的HBV患者数的比例来求出。另外，所述健康对照组的比值OsC可根据健康对照组人数中具有某种特定等位基因组合的健康对照组的人数的比例来求出。下面，作为某种特定等位基因组合的具体例，针对仅具有1个HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、或HLA-DPB1*02:01中任一者作为抵抗性等位基因、且仅具有1个HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01中任一者作为敏感性等位基因的受试者的组进行说明。

在所述具体例中，在HBV患者组1380人中，具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者为411人。即，对于具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者，HBV患者组的比值OsP为0.42。另外，在所述具体例中，在健康对照组1225人中，具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者为477人。即，对于具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者，健康对照组的比值OsC为0.63。因此，对于具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者，比值比OR，即，HBV患者组的比值OsP和健康对照组的比值OsC的比为0.67。

此处，在比值比OR小于1的情况下，具有特定等位基因组合的受试者对B型肝炎慢性化具有抵抗性。在该具体例中，仅具有1个HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、或HLA-DPB1*02:01中的任意一者作为抵抗性等位基因、且仅具有HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01中的任意一者作为敏感性等位基因的受试者对B型肝炎慢性化具有抵抗性。

即显然，当源自父系和源自母系的2种HLA-DPB1等位基因的存在方式是抵抗性等位基因和敏感性等位基因的杂合体的情况下，对于至少HLA-DPB1等位基因是上述具体例中所示的组合的情况，该检测体具有对B型肝炎慢性化的抵抗性。

即，本发明人等推导出，仅具有1个抵抗性等位基因、且仅具有1个敏感性等位基因的受试者对B型肝炎慢性化具有抵抗性。由此，源自父系和源自母系的2种等位基因分别仅具有1个抵抗性等位基因和敏感性等位基因的受试者对B型肝炎慢性化具有抵抗性。即，通过使用本发明的等位基因，并基于源自父系和源自母系的2种等位基因的组合，能够判定对B型肝炎慢性化或病症发展的发病抵抗性或敏感性。

(3)包括本发明的等位基因在内的用于检测B型肝炎慢性化或病症发展的素因的试剂

使用本发明的等位基因，能够对B型肝炎慢性化或病症发展的素因进行检测。因此，对上述等位基因进行检测的试剂作为B型肝炎慢性化或病症发展的检测用试剂是有效的。该试剂也能够用于判定对B型肝炎慢性化的发病抵抗性或敏感性，或者用于判定病症发展。具体而言，除了上述本发明的等位基因、各种引物、探针；能够与本发明的等位基因进行特异性结合的抗体；在进行SNP分型的同时使用的试剂类(例如，脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)、DNA聚合酶、缓冲液等)、阳性对照等以外，还能够与其他溶剂、溶质进行组合来制备试剂。例如，能够与蒸馏水、pH缓冲剂、盐、蛋白质、表面活性剂等进行组合。

另外，根据分型法，探针或引物等本发明的等位基因检测用多核苷酸的一部分可以包括与HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因等无关的序列。进而，本发明的等位基因检测用多核苷酸也可以是DNA和RNA的嵌合体。另外，本发明的等位基因检测用多核苷酸还可以被如荧光物质、生物素或地高辛那样的结合亲和性物质进行标记。

另外，在本发明的试剂中，除了检测特定等位基因的方法，还可以包括：构成反应液的缓冲液、dNTP混合物、酶类(聚合酶等)等的反应试剂。所谓反应试剂是指，具有可通过适当的化学或物理检测方法进行检测的标记的试剂。作为使用这种标记物的测定法中所用的标识剂，例如，可使用荧光物质、酶、放射性同位素、发光物质等。使用酶为标记的ELISA法被广泛地使用。作为荧光物质，可举出荧光胺，异硫氰酸荧光素等，作为酶，可举出过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶等，作为放射性同位素，可举出125I、131I、3H、14C等，作为发光物质，可举出荧光素、光泽精、鲁米诺、鲁米诺衍生物等。

进而，作为反应介质，包括可赋予反应最佳条件的、或对反应生成物的稳定性等有效的缓冲液、反应物的稳定剂等。

(4)含有本发明的等位基因在内的用于检测B型肝炎慢性化或病症发展的素因的试剂盒

在使用本发明的等位基因对B型肝炎慢性化或病症发展的素因进行检测的情况下，不需要特殊的条件、操作等。可根据各种方法中的一般性条件、操作来进行检测，根据需要，能够稍作修改以构建优选的测定体系。

使其能以最简单且有效的方式进行测定的方法是将上述本发明的试剂制成试剂盒。通过制成试剂盒，无需特殊的分析仪器、熟练的操作、高度的知识，即能够在一般的检测室或实验室中有效地进行定量。对测试试剂盒的组成和形式没有特别限定，而且，只要能够达成规定的目的，对其内容物也没有限定。通常，所述试剂盒是由关于本发明等位基因检测方法的使用说明书，反应试剂、作为反应环境的反应介质、提供测试环境的基底材料等所构成。进而，根据需要，还可以包括用于作为比较基准或用于制作校正曲线的校正样本、检测器等。作为本发明的基因导入的检测确认装置，可以举出光谱仪、辐射检测器、光散射检测器等的能检测上述标记的装置。

(5)与其他等位基因的组合

本发明的上述方法可以与其他的与B型肝炎慢性化或病症发展有关的等位基因进行组合使用。对于使用的等位基因，可以是与HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和/或HLA-DPB1*02:01等位基因有关的等位基因，进而，只要与B型肝炎慢性化或病症发展相关，也可以是除上述序列以外的序列中的等位基因。本发明的方法，换言之，是基于等位基因的检测。通常，将碱基变异以人口的1％以上的频率而存在的基因定义为等位基因，不足1％的称为罕见变异。作为本发明所组合的等位基因，除上述等位基因以外，无论作为等位基因的存在频率如何，可以是频率不足1％的基因。另外，与本发明进行组合的等位基因可以存在于与B型肝炎慢性化相关的基因中的任何位置，也可以存在于外显子、内含子、3’-UTR或5’-UTR和其相邻区域、以及启动子区域。对于用来检测所述其他等位基因的多核苷酸，只要是本领域技术人员，即能够使用所述“(2-2)等位基因的检测”中所记载的方法等进行制作。另外，对等位基因的数目也没有特别限定，可以对1至数十个碱基进行替代、缺失、插入、添加中的任意处理。另外，还可以是单碱基多态性(SNP:singlenucleotidepolymorphism)、限制性片段长度多态性(RFLP：restrictionfragmentlengthpolymorphism)、VNTR(variablenumberoftandemrepeat)、微卫星多态性等多态性。

对于等位基因，作为多态性，可以是公知的多态性，也可以是新的多态性。在以公知多态性作为检测对象的情况下，例如，能够从公共数据库：GenBank等公开的公知多态性中选出作为检测对象候选的多态性。另外，也能够利用公共数据：ENSEMBL(http://www.ensembl.org/)来进行选择，还能够使用单倍型。关于构成单倍型的SNP的选择方法和分型方法而言，如上述所示。如实施例中所示，对该单倍型是否与B型肝炎慢性化或病症发展有关的评价能够通过统计学检验进行判断。

如果将本发明的等位基因与其他等位基因等进行组合使用，则能够以更快速且精度良好的方式对B型肝炎慢性化或病症发展进行判断，因而诊断的可靠性也提高，在这一点上优选。

下面，根据实施例对本发明进行说明，但是，本发明并不限于这些实施例，而是可以包括多种多样的变形例。

实施例

(本发明的等位基因的检测)

本实施例的目的在于，对包括本发明在内的HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01进行检测。

对于来自日本人HBV患者488人和健康者464人、韩国人HBV患者251人和健康者140人的各样品，可使用人类组织和细胞提取试剂盒(QIAampDNAMinikit)(凯杰公司制造)来通过下述方式进行制备。首先，通过移液方式将凯杰公司制造的蛋白酶20μl移至微型离心管中，然后添加各样品200μl。进而加入缓冲液AL混合15秒以后，在56℃孵育10分钟以使样品溶解。然后，对微型离心管进行数秒钟的瞬时离心，以收集附着在盖内侧的溶液。进而，在样品中加入乙醇(100％)200μl，再进行涡流混合15秒钟，然后对1.5ml微型离心管进行数秒钟的瞬时离心，以收集附着在盖内侧的溶液。将该溶液加入到QIAamp旋转滤柱(QIAampMiniSpinColumn)中的离心柱中，在6,000×g条件下进行1分钟的离心分离。打开QIAamp旋转滤柱，加入500μl的缓冲液AW1，并在6,000×g条件下进行1分钟的离心分离。打开QIAamp旋转滤柱，加入500μl的缓冲液AW2，在20,000×g的条件下进行3分钟的离心分离。打开QIAamp旋转滤柱，加入200μl的缓冲液AE或纯水。在室温条件下进行1分钟的孵育，然后在6,000×g的条件下进行1分钟的离心分离，从而回收来自各检测体的DNA。

使用制备的DNA样品，使用基于PCR-SSOP法的LABTypeSSOHLADPA1/DPB1试剂盒(OneLambda公司制造)或WAKFlowHLA-DPB1分型试剂盒(涌永制药公司制造)来进行4位数的HLA分型。可按照说明书进行试验，使用基于xMAP技术的多重测定系统(Luminex公司制造)。具体而言，在上述2μl的DNA样品中加入扩增试剂24.5μl、DNA聚合酶液0.5μl，并在下述条件下进行PCR反应。

变性温度：93℃(30秒)

退火温度：60℃(30秒)

延伸温度：72℃(30秒)

上述循环次数：40次

在上述循环前进行93℃(3分钟)的反应，在上述循环后进行72℃(5分钟)的反应，反应结束后在4℃进行保存。

该PCR结束后，将扩增DNA5μl加入到分注有变性液5μl的96孔PCR板的各孔中，并进行涡流混合，在室温条件下放置5分钟。将上述变性扩增DNA加入到混合了杂交液20μl、微珠混合物3μl和SAPE2μl的25μl的杂交混合试剂中，以制备杂交混合液，并进行涡流搅拌。将上述杂交混合液置于设定为55℃的热循环仪中，进行30分钟的杂交。在各孔中加入清洗液75μl，在1000×g条件下进行1分钟的离心分离。然后除去上清液，在各孔中加入清洗液75μl。将LuminexXYP的模块温度设定为37℃，并使用与微珠混合物的Lot号相对应的模板文件进行测定。使用WAKFlow(注册商标)分型软件打开保存有测定结果的CSV文件，基于记载在判定表中的截止值对各荧光微珠的阳性/阴性进行自动判定。在该自动判定中，荧光强度表示为截止值以上的微珠设为阳性、表示为截止值以下的微珠设为阴性，由各微珠的阳性/阴性，确定HLA的基因型。

将结果示于表1和表2中。

表1中示出了日本和韩国中HBV患者组和健康者组的HLA-DPB1等位基因频率的比较。由此可见，在日本人中，对于HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01等位基因而言，显示出该检测体具有对B型肝炎慢性化的发病抵抗性，对于HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01等位基因而言，显示出该检测体具有对B型肝炎慢性化的发病敏感性。在韩国人中，对于HLA-DPB1*04:02等位基因而言，显示出该检测体具有对B型肝炎慢性化的发病抵抗性，对于HLA-DPB1*05:01等位基因而言，显示出该检测体具有对B型肝炎慢性化的发病敏感性。

表1中所示出的针对B型肝炎慢性化的发病敏感性等位基因(HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*09:01)和发病抵抗性等位基因(HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01)，计算B型肝炎患者中的阳性率。其结果是，在日本人HBV患者488人中，对具有敏感性等位基因的情况进行计算时，具有1或2个HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01中任一者的患者为410人，相对于此，不具有该等位基因的患者为78人。因此，阳性率为84.02％。同样地，针对抵抗性等位基因的情况进行计算时，不具有或具有1个HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*02:01的患者为450人，相对于此，具有任意2个的患者为38人。因此，阳性率为92.21％。

表2表示对日本和韩国的HBV病症发展组和B型慢性肝炎组的HLA-DPB1等位基因频率进行比较的结果。由此可见，在日本和韩国中，HLA-DPB1*02:01等位基因均对B型慢性肝炎的病症发展具有抵抗性。

对于表2中所示的对B型肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因(HLA-DPB1*02:01)，计算肝硬化和肝癌患者中的阳性率。其结果是，在肝硬化和肝癌患者206人中，不具有或仅具有一个HLA-DPB1*02:01的患者为203人，具有2个所述等位基因的患者为3人。因此，阳性率为98.5％。

(本发明的等位基因的检测：第2部分)

本实施例的目的在于，当包含本发明在内的源自父系和源自母系的2种HLA-DPB1等位基因的存在方式为杂合体的情况下，确定该检测体对B型肝炎慢性化是具有抵抗性还是具有敏感性。对于来自日本人HBV患者1380人和健康者1225人的各样品，对HLA的基因型进行确定。此外，所述确定基因型的步骤与上述本发明的等位基因的检测的步骤相同，因而省略。

将其结果示于表3～5中。

表3中示出了日本人HBV患者组和健康对照组的对单一HLA-DPB1等位基因的持有频率。所述表3中，左表(第一组，1stset)表示日本人HBV患者488人和健康者464人的结果，右表(第二组，2ndset)表示日本人HBV患者892人和健康者761人的结果。

本发明人等在第一组中对来自HBV患者组和健康对照组的15种HLA-DPB1等位基因进行检测。在所述15种HLA-DPB1等位基因中，含有HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*29:01、和HLA-DPB1*41:01。对于这15种HLA-DPB1等位基因，分别对检测出某一种HLA-DPB1等位基因的受试者是属于HBV患者组还是健康对照组进行计数。作为一例，对于检测出HLA-DPB1*02:01等位基因的受试者，有182人属于HBV患者组，有227人属于健康对照组。即，在检测出HLA-DPB1*02:01等位基因的受试者中，HBV患者数为182人，健康者数为227人。

另外，本发明人等在第二组中对来自HBV患者组和健康对照组的18种HLA-DPB1等位基因进行了检测。所述18种HLA-DPB1等位基因中，含有HLA-DPB1*01:01、HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*02:02、HLA-DPB1*03:01、HLA-DPB1*04:01、HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*05:01、HLA-DPB1*06:01、HLA-DPB1*09:01、HLA-DPB1*13:01、HLA-DPB1*14:01、HLA-DPB1*17:01、HLA-DPB1*19:01、HLA-DPB1*21:01、HLA-DPB1*29:01、HLA-DPB1*36:01、HLA-DPB1*38:01、和HLA-DPB1*41:01。对于这18种HLA-DPB1等位基因，分别对检测出某种HLA-DPB1等位基因的受试者是属于HBV患者组还是健康对照组进行计数。作为一例，对于被检出HLA-DPB1*02:01等位基因的受试者而言，HBV患者组包括333人，健康对照组包括368人。即，在检出HLA-DPB1*02:01等位基因的受试者中，HBV患者数为333人，健康者数为368人。

另外，本发明人等分别对第一组和第二组求出HBV患者组和健康对照组的95％置信区间中的比值比(OR*；OddsRatio)。其中，比值比OR*是指，对于具有某种HLA-DPB1等位基因的受试者的组，HBV患者组的比值OsP*与健康对照组的比值OsC*的比。该HBV患者组的比值OsP*可根据HBV患者数中的具有某种特定HLA-DPB1*等位基因的HBV患者数的比例来求出。另外，该健康对照组的比值OsC*可根据健康对照组的人数中的具有某种特定HLA-DPB1*等位基因的健康对照组的人数的比例来求出。其中，在比值比OR*小于1时，该检测体对B型肝炎慢性化具有抵抗性。另外，在比值比OR*为1以上时，该检测体对B型肝炎慢性化具有敏感性。

由此可见，在日本人中，对于HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*04:02等位基因而言，显示出该检测体对B型肝炎慢性化具有抵抗性。对于HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01等位基因而言，显示出该检测体对B型肝炎慢性化具有敏感性。

进一步地，本发明人等针对上述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的HLA-DPB1等位基因，以及对B型肝炎慢性化具有敏感性的HLA-DPB1等位基因的组合，如表4所示地进行探讨。

表4表示日本人HBV患者组和健康对照组中，源自父系和源自母系的2种HLA-DPB1等位基因的组合的持有频率。在所述表4中，左表中示出了关于HBV患者1380人的结果，右表中示出了关于健康者1225人的结果。其中，本发明人等着眼于，源自父系和源自母系的2种HLA-DPB1等位基因的存在方式为杂合的情况下，该检测体对B型肝炎慢性化具有抵抗性还是具有敏感性。特别是着眼于，在对B型肝炎慢性化具有抵抗性的HLA-DPB1等位基因和对B型肝炎慢性化具有敏感性的HLA-DPB1等位基因的组合中，该检测体对B型肝炎慢性化具有抵抗性还是具有敏感性。将结果示于表5中。表5

表5中示出了在日本人HBV患者组和健康对照组中的源自父系和源自母系的2种HLA-DPB1等位基因的组合中，特别是着眼于对B型肝炎慢性化具有抵抗性的HLA-DPB1等位基因和对B型肝炎慢性化具有敏感性的HLA-DPB1等位基因的组合时，HLA-DPB1等位基因的持有频率。

作为一例，对于具有1个HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*02:01中任一者作为抵抗性等位基因、且具有1个HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01中任一者作为敏感性等位基因的受试者而言，其中有411人属于HBV患者组，有477人属于健康对照组。在HBV患者组1380人中，具有该具体例中所示的等位基因的组合的受试者为411人。另外，在健康对照组1225人中，具有该具体例中所示的特定等位基因组合的受试者为477人。即，HBV患者具有该具体例中所示的等位基因的组合的概率Pp为0.297，健康者具有该具体例中所示的等位基因的组合的概率Ph为0.388。因此，对于具有该具体例中所示的等位基因的组合的受试者，HBV患者组的比值OsP为0.42，健康对照组的比值OsC为0.63。由此可以推导出，对于具有该具体例所示的等位基因的组合的受试者而言，HBV患者组的比值OsP和健康对照组的比值OsC的比，即，比值比OR为0.67。

如上，针对本发明人实施的发明，基于其实施方式进行了具体说明，但是，本发明并不受到所述实施方式的限定，能够在不脱离本发明的主旨的范围内进行各种改变。

工业实用性

本发明的工业实用性在于，对于HBV患者组，通过对本发明的与B型肝炎慢性化有关的等位基因进行分析，特别是能阐明针对包括日本人在内的亚洲人的B型肝炎慢性化的分子机理、能鉴定药物靶候选分子。另外，本发明还具有的工业实用性在于，通过对HBV携带者进行分析，能将该携带者分成易于发生慢性化的组以及难以发生慢性化的组，能够为确定后续治疗方针提供有用的信息。进而，本发明具有的工业实用性在于，通过开发除含有该等位基因以外还含有其他免疫相关基因的SNP的检测试剂盒，能降低医疗费用。

Claims

1.一种B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的检测方法，其中，所述方法包括以下工序：

a)比较工序，将与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因和检测体中对应于所述等位基因的碱基序列或氨基酸序列进行比较；

b)分析工序，对检测体中对应于所述等位基因的位点的碱基或氨基酸残基是否与等位基因的碱基或氨基酸残基一致进行分析；以及

c)确定工序，对检测体的B型肝炎是否发生慢性化和/或病症是否发展进行确定。

2.如权利要求1所述的方法，其中，与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性或者抵抗性。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的组合是仅所述具有敏感性的等位基因的组合、仅所述具有抵抗性的等位基因的组合、或者所述具有敏感性的等位基因与所述具有抵抗性的等位基因的组合中的任意组合。

4.如权利要求2或3所述的方法，其中，所述对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，所述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01，所述对B型肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。

5.如权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，所述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因的组合是HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*04:02和HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01。

6.一种对B型肝炎慢性化和/或病症发展进行检测的方法，其中，其是根据权利要求1～5中任一项所述的方法进行检测。

7.一种用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂，其中，所述试剂含有检测与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的引物。

8.如权利要求7所述的试剂，其中，所述与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因对B型肝炎慢性化和/或病症发展具有敏感性或者抵抗性。

9.如权利要求8所述的试剂，其中，与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因的组合是仅所述具有敏感性的等位基因的组合、仅所述具有抵抗性的等位基因的组合、或者所述具有敏感性的等位基因和所述具有抵抗性的等位基因的组合中的任意组合。

10.如权利要求8或9所述的试剂，其中，所述对B型肝炎慢性化具有敏感性的等位基因是HLA-DPB1*05:01和HLA-DPB1*09:01，所述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*04:02、HLA-DPB1*04:01和HLA-DPB1*02:01，所述对B型肝炎的病症发展具有抵抗性的等位基因是HLA-DPB1*02:01。

11.如权利要求8～10中任一项所述的试剂，其中，所述对B型肝炎慢性化具有抵抗性的等位基因的组合是HLA-DPB1*02:01、HLA-DPB1*04:01或HLA-DPB1*04:02和HLA-DPB1*05:01或HLA-DPB1*09:01。

12.一种试剂盒，其中，其含有权利要求7～11中任一项所述的用于检测B型肝炎慢性化和/或病症发展的素因的试剂，所述试剂包含与B型肝炎慢性化和/或病症发展有关的等位基因。