CN102178960B

CN102178960B - TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用

Info

Publication number: CN102178960B
Application number: CN 201110083745
Authority: CN
Inventors: 陈剑鸿; 夏培元; 王显凤; 孙凤军; 刘耀; 杨波; 刘芳
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2011-04-02
Filing date: 2011-04-02
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2031-04-02
Also published as: CN102178960A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用，有助于提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。

Description

TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及TAp73基因的新应用，特别涉及TAP73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。例如，胶质瘤（glioma）是由神经外胚层分化而来的胶质细胞（星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等）引发的肿瘤，在颅内肿瘤中发病率位列第一，而且，因其呈浸润性无限制增生、与正常脑组织无明显界限并富含血管，还具有高复发率和低治愈率。

目前对恶性肿瘤的治疗，主要采用手术治疗、放射治疗、化学治疗等相结合的综合治疗方式。尽管随着细胞毒性药物、分子靶向治疗药物、生物反应调节剂、肿瘤血管生成抑制剂等的迅猛发展，部分恶性肿瘤已能通过化学治疗治愈，但由于肿瘤耐药以及抗肿瘤药物本身毒副作用较大导致最大给药浓度较低等问题，化学治疗的疗效至今仍难以令人满意。其中，肿瘤耐药是目前化学治疗的主要障碍，也是困扰肿瘤临床治疗的关键性难题。因此，研究肿瘤耐药的产生与调控机制、发展新的耐药增敏剂是增强化疗药物疗效、提高肿瘤患者生命质量的重要策略。

肿瘤干细胞（tumor stem cell, TSC）是肿瘤中一小部分具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的特殊细胞群体，通过不均一分裂能够产生与上一代完全相同的子代细胞及不同表型的肿瘤细胞，并在体内形成新的肿瘤，促成肿瘤的异质性和多样性。其与正常成体干细胞在功能上的差异主要反映在基因表达水平上。随着干细胞在肿瘤研究领域的不断深入，肿瘤干细胞是肿瘤发生、异常增殖、侵袭、转移、耐药以及复发的根源这个观点已得到普遍认同。根据肿瘤干细胞理论，文献报道的肿瘤耐药产生机制主要有两种：（1）原发性耐药，由于肿瘤干细胞通常处于静止期、有较强的DNA修复能力、表达ABC转运蛋白而获得的与生俱来的耐药性，它不仅对作用于其本身的药物产生耐药性，而且对其它多种结构和作用机制迥异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性；（2）获得性耐药，长期暴露于辐射和/或致癌物后，肿瘤干细胞及与其相近的子代细胞可通过与正常干细胞积累突变的同样机制（点突变、基因激活、基因扩增等）而出现新的耐药性。由于肿瘤干细胞产生耐药的机制相当复杂，针对肿瘤干细胞耐药机制的研究近年来已成为肿瘤研究领域的热点和难点。

20世纪80年代至今，一直采用RESCIT评价实体瘤的疗效，该标准曾在临床中广泛发挥作用。但肿瘤干细胞在肿瘤组织中为数极少且具有超强耐药的特性，RESCIT标准难以评价出相应治疗对肿瘤干细胞的杀伤效果，而以减少肿瘤复发和转移、降低患者死亡率等指标作为肿瘤治疗的评价标准则更能反映肿瘤干细胞的治疗疗效。目前，很多治疗手段都能使肿瘤在短时间内得到控制和缩小，但多数患者会出现复发、转移，从而导致治疗失败。这种治疗模式的失败从另外一个角度也说明了肿瘤中存在极少数的能重建发展为肿瘤的干细胞。由于肿瘤的复发、转移和耐药等恶性表型都与肿瘤干细胞有关，因此，选择性地确认并杀死这些肿瘤干细胞是本领域技术人员希望达到的最终目标。

p73基因作为第一个p53基因的类似物，于1997年在cos细胞中被偶然发现。其定位于1号染色体短臂（lp36.2~36.3），全长22kb，含14个外显子，表达产物可因羧基端或氨基端的选择性剪切而产生不同的亚型，分别为TAp73和DNp73。其中，TAp73 cDNA（GenBank登录号NM_005427）全长2845bp，主要由转录激活区、DNA结合区和寡聚区组成，编码由636个氨基酸组成的TAp73（NCBI登录号NP_005418.1），能够诱导不可逆的细胞周期停滞、促进细胞凋亡。但TAp73基因在肿瘤干细胞中的表达与功能活性，如TAp73基因的表达水平在肿瘤干细胞与肿瘤细胞中有无显著性差异等都未见文献报道，因此，TAp73基因是否能够增强肿瘤干细胞的化疗敏感性还有待深入研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于通过考察TAp73基因在肿瘤干细胞中的表达与功能活性，确认TAp73基因是否能够增强肿瘤干细胞的化疗敏感性，用于制备肿瘤干细胞化疗增敏药物，从而增强肿瘤的临床治疗效果、提高肿瘤患者的生命质量。

为达到上述目的，发明人考察了TAp73基因在胶质瘤干细胞中的表达与功能活性，结果发现，TAp73在胶质瘤干细胞中的表达显著低于胶质瘤细胞，胶质瘤干细胞的耐药性显著高于胶质瘤细胞，TAp73表达与胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞的耐药性均呈显著负相关；通过siRNA干扰，可以成功下调胶质瘤细胞中TAp73的表达，细胞耐药性明显增强；通过TAp73重组质粒转染，能够成功上调胶质瘤干细胞中TAp73的表达，细胞耐药性明显降低。

由于脑胶质瘤是最常见的成人颅内恶性肿瘤，具有高复发率和低治愈率，且死亡率和致残率均很高。因此，对其耐药机制和基因靶向治疗进行的研究可作为其它肿瘤的实验依据和理论参考。同时，根据细胞表面的某些特异性标记，一些实体瘤的肿瘤干细胞也陆续被鉴定出来，如乳腺癌、脑肿瘤、肺腺癌、视网膜母细胞瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌等，这些肿瘤干细胞的共同特点是：均具有自我更新、增殖和自我分化的能力，都能导致体内成瘤性，都对各种化疗药物表现出不同程度的耐药。因此，根据本发明的记载和本领域的公知常识，本领域技术人员可以推测出TAp73基因同样对除胶质瘤干细胞以外的其它肿瘤干细胞的化疗具有增敏作用。TAp73基因重组表达载体例如本申请中构建的TAp73-pCDNA3.1myc/ his a(-)重组表达载体可以单独或与其它具有功能活性的基因重组表达载体联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备肿瘤干细胞化疗增敏的药物。

进一步，根据本发明的记载和本领域的公知常识，本领域技术人员还可以推测出：TAp73基因编码蛋白质以及包含TAp73基因编码蛋白质的融合蛋白都可以单独或与其它具有功能活性的多肽、蛋白质、融合蛋白等联合，再辅以药学上可接受的载体，用于制备肿瘤干细胞例如胶质瘤干细胞的化疗增敏药物。

本发明的有益效果在于：本发明首次公开了TAp73基因可以用于制备肿瘤干细胞化疗增敏药物，有助于提高肿瘤干细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。

附图说明

图 1显示了无血清培养前（A）和无血清培养后（B）CD₁₃₃阳性细胞的比率。

图 2显示了临床分离培养的原代胶质瘤细胞（A），经无血清培养后形成的胶质瘤干细胞球（B、C）以及胶质瘤干细胞球中存在的CD₁₃₃阳性细胞（D为细胞核染色，蓝色荧光；E为CD₁₃₃阳性细胞标记，红色荧光；F为D和E的融合）。

图 3显示了胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的表达（A），经顺铂处理后胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的表达（B）以及胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对顺铂的耐药性（C）。

图 4显示了TAp73表达量与耐药性的相关性，其中A为胶质瘤细胞，B为经顺铂处理的胶质瘤细胞，C为胶质瘤干细胞，D为经顺铂处理的胶质瘤干细胞。

图 5显示了胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的基因表达水平，其中WT为未转染组，Mock为空质粒转染组，siR为pGCsi/U6/TAp73 siRNA重组质粒转染组，TAp73为TAp73-pCDNA3.1myc/his a(-)重组质粒转染组。

图 6显示了改变胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73表达对细胞耐药性的影响，其中WT为未转染组，Mock为空质粒转染组，siR为pGCsi/U6/TAp73 siRNA重组质粒转染组，TAp73为TAp73-pCDNA3.1myc/his a(-)重组质粒转染组。

图 7显示了改变胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73表达对顺铂诱导的细胞凋亡的影响，其中WT为未转染组，Mock为空质粒转染组，TAp73si为pGCsi/U6/TAp73 siRNA重组质粒转染组或TAp73-pCDNA3.1myc/his a(-)重组质粒转染组。

上述图3~7中NSC代表胶质瘤细胞，SC代表胶质瘤干细胞。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 胶质瘤干细胞的分离及鉴定

一、实验材料

胶质瘤组织源自中国人民解放军第三军医大学第一附属医院神经外科手术切除的无菌新鲜标本；无血清培养基DMEM/F12（1:1）、B27购自Gibco公司；表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）购自 PeproTech公司；磷酸缓冲液（PBS）购自Gibco-BRL公司；CD₁₃₃抗体、PE标记的小鼠抗人CD₁₃₃抗体、磁珠细胞分选系统购自Miltenyi Biotec公司；Cy3标记的山羊抗小鼠IgG购自Sigma公司；Hoechest 33258染色液购自浙江碧云天生物公司。

二、实验方法与结果

1、胶质瘤原代细胞的培养

将在无菌状态下收集的新鲜胶质瘤手术标本制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×10⁶~1.0×10⁶/ml，接种至6孔培养板中，加入无血清培养基DMEM/F12，置含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中，37℃常规培养。根据细胞生长速度和培养基的pH值变化，每3~4天更换新鲜培养基1次。

2、胶质瘤干细胞的分离获取

选取上述在无血清培养基DMEM/F12中生长状况良好的细胞，低密度接种至含有DMEM培养基的24孔培养板中（孔底部铺有经多聚赖氨酸预处理的盖玻片），培养12~18小时后半量更换新鲜的DMEM培养基，再加入神经干细胞培养基（即含有1×B27、20 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基）培养，之后每24小时重复上述换液过程1次，96小时后将培养基全部更换为神经干细胞培养基继续培养，直至获得胶质瘤干细胞球。

采用磁力架（Dynal）和免疫磁珠细胞分选系统分离胶质瘤干细胞。取上述在神经干细胞培养基中生长状况良好的胶质瘤干细胞球，镜下计数使细胞密度达到1×10⁷个细胞，严格无菌操作，按1:11的体积比加入PE标记的小鼠抗人CD₁₃₃抗体，4℃避光孵育15分钟后，用PBS洗涤细胞2次去除多余的抗体，再用PBS重悬细胞，按1:5的体积比加入抗PE磁珠，4℃避光孵育15分钟后，用PBS洗涤细胞（1000 r/min离心10分钟），再用PBS重悬细胞，制得细胞悬液备用。将分离柱置磁场中，用500 ul缓冲液洗柱，再将上述制好的细胞悬液过柱，用500 ul缓冲液洗柱3次去除未标记的阴性细胞，再将柱移出磁场，用1 ml缓冲液在加压条件下洗柱，收集洗液，即得CD₁₃₃阳性细胞悬液。

3、胶质瘤干细胞的鉴定

（1）流式细胞仪分析

采用流式细胞仪（BD FACS Aria Cell Sorter）分选并检测分离前后CD₁₃₃阳性细胞的比率，光源为488 nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光，每份标本收集10000个细胞以上。结果显示，经无血清培养处理后，CD₁₃₃阳性细胞的比率明显增加（图1）。

（2）免疫荧光检测胶质瘤干细胞表型

将培养获得的胶质瘤干细胞球接种至经多聚赖氨酸包被的载玻片上，加入含有体积分数为10%的胎牛血清的DMEM/F12培养基培养4小时，用质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定20分钟，再用正常山羊血清封闭以阻断非特异性反应，之后去除血清，加入抗CD₁₃₃抗体，4℃反应过夜，用PBS洗涤细胞3次，加入Cy3标记的山羊抗小鼠IgG，用 Hoechest 33258对比染色细胞核，缓冲甘油封固，置激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2）下观察并拍照。结果显示，经CD₁₃₃鉴定，所得细胞球为胶质瘤干细胞球（图2）。

实施例2 胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中TAp73的表达以及TAp73表达与耐药性的相关性分析

一、实验材料

逆转录酶M-MLV、Rnasin、dNTP、TUNEL试剂盒（Dead End^TMColorimetric TUNEL System）购自Promega公司；Trizol^TM试剂购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶购自MBI 公司；PCR 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；顺铂（Cisplatin, DDP）注射液购自江苏豪森药业股份有限公司，规格为6 ml（30 mg）；MTT试剂购自武汉生命技术有限公司。

二、实验方法与结果

1、RT-PCR法检测细胞中TAp73的表达

分别取原代胶质瘤细胞（NSC）、胶质瘤干细胞（SC）以及经顺铂处理（用含有20 umol顺铂的DMEM培养基孵育48小时）的NSC和NSC，用Trizol试剂提取总RNA，按照试剂说明操作。所得总RNA用紫外分光光度仪测定A_260nm/280nm值以计算RNA纯度和浓度，并通过甲醛变性凝胶电泳观察28s、18s带以检查RNA有无降解。再分别以上述不同细胞的总RNA为模板，采用M-MLV逆转录酶进行逆转录，按照逆转录试剂盒说明书操作，获得上述不同细胞的cDNA。根据TAP73 cDNA序列（GenBank登录号NM_005427），利用Primer Premier 5.0软件设计如下引物：TAp73正义引物：5’-caccacgtttgagcacctct-3’（SEQ ID No.1），反义引物：5’-ggcgatctggcagtagagttt-3’（SEQ ID No.2），扩增片段全长433bp；内参照β-actin正义引物：5’-cttcctgggcatggagtc-3’（SEQ ID No.3），反义引物5’-gccgatccacac-ggagta-3’（SEQ ID No.4），扩增片段全长232bp。引物均委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。采用多重PCR方式，分别以上述不同细胞的cDNA为模板，利用Taq DNA聚合酶同时扩增内参照β-actin基因和TAp73基因，按照PCR试剂盒说明书操作。循环参数为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，50℃退火45秒，72℃延伸45秒，共22个循环；最后72℃延伸5分钟。取20 ul PCR产物进行质量分数为1.5%的琼脂糖（含5 ug/ml溴化乙锭）凝胶电泳，通过FR200图像分析软件（上海复日公司）读取电泳条带的斑点密度扫描值，以各组β-actin条带的扫描值标化其相应组的TAp73表达量。结果显示，TAp73在胶质瘤干细胞中的表达显著低于胶质瘤细胞（图3A）；将胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞用化疗药物顺铂处理后，TAp73在两种细胞中的表达均增加，但在胶质瘤干细胞中的增加幅度显著低于胶质瘤细胞（图3B）。

2、流式细胞仪检测细胞凋亡

分别取经顺铂处理（用含有20 umol顺铂的DMEM培养基孵育48小时）的原代胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，用预冷至4℃的PBS洗涤2次，调整细胞密度至1×10⁶/ml，吸取500 ul，加入5 ul Annexin V-FITC和10 ul PI，室温避光孵育15分钟，用流式细胞仪（BD FACS Aria Cell Sorter）对标记比例、AnnexinV-FITC/PI标记情况进行检测，以每次至少10000个事件分析模式测定各样本内阳性标记细胞的比例，Coulter EPICS 分析软件进行数据处理。结果显示，胶质瘤干细胞对顺铂的耐药性显著高于胶质瘤细胞（图3C）。

3、MTT法测定细胞成活率

分别取原代胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞，培养72小时后用倒置显微镜观察细胞生长情况，待细胞长至80%融合时，用PBS洗涤细胞2次，用质量分数为0.25%的胰酶溶液消化细胞，再用含有体积分数为8%的胎牛血清的DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，接种至96孔培养板中，每孔200 ul（2×10⁴个细胞），分别设置空白对照组和药物处理组。待细胞贴壁后，弃去培养基，空白对照组加入新鲜的含有体积分数为8%的胎牛血清的DMEM培养基，药物处理组每孔加入含有20 umol顺铂的DMEM培养基200 ul，置细胞培养箱中孵育48小时，弃去培养基，每孔加入含有体积分数为8%的胎牛血清的DMEM培养基180 ul和5 g/L MTT 20 ul，继续孵育4小时，弃去培养基，每孔加入150 ul DMSO，振荡10分钟使形成的甲臜完全溶解，用酶联免疫检测仪在波长490 nm处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率(%)=[(药物处理组平均A值－空白对照组平均A值)/空白对照组平均 A值]×100%。将耐药性与前述TAp73的表达进行相关性分析，结果显示，胶质瘤细胞的耐药性与TAp73的表达呈显著负相关，即TAp73的表达量越高，胶质瘤细胞的耐药性越低（图4A,C）；TAp73表达的反应性也与耐药性呈负相关（图4B, D），TAp73在胶质瘤干细胞中呈静默状态，而这种静默状态在耐药中发挥作用。

实施例3 TAp73基因干预实验

一、实验材料

DNA片段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DNA Ligation Kit、限制性核酸内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pGCsi/U6质粒购自上海吉凯公司；真核表达载体pCDNA3.1myc/his a(-)购自invitrogen公司；人SH-SY5Y细胞株购自上海细胞研究所。

二、实验方法与结果

1、对顺铂敏感的胶质瘤细胞的TAp73基因干预

根据TAp73 cDNA序列（GenBank登录号NM_005427）设计siRNA，选取siRNA干扰靶序列5’-ggaccaccgcatctctaca-3’，设计ShRNA的DNA模板的两条单链，两条单链退火即为DNA双链模板，在模板两端分别添加BamHⅠ和Hind Ⅲ的酶切位点，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。将pGCsi/U6质粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ在37℃条件下进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳回收线性化空质粒。将ShRNA的DNA双链模板与线性化空质粒在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化入大肠杆菌JM 109感受态细胞，蓝白斑筛选法筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒，用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，并测序验证，即获得pGCsi/U6/TAp73 siRNA重组质粒。将顺铂敏感的胶质瘤细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基在含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中37℃常规培养。取处于对数生长期的细胞，离心，用电穿孔法转染pGCsi/U6/TAp73 siRNA重组质粒，分别设置未转染组、空质粒转染组和重组质粒转染组。电穿孔条件为：电压540v，脉宽30us，脉冲次数3次，脉冲间隔时间1分钟，室温，缓冲液pH 7.2。电穿孔完成后，将电转杯静置10分钟，再将细胞转移至6孔培养板中，加入细胞培养液2 ml，在含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中37℃常规培养。按照实施例2所述方法分别检测细胞中TAp73的表达量和用顺铂处理后的细胞成活率。结果显示，通过siRNA干扰，成功下调了顺铂敏感的胶质瘤细胞中TAp73的表达（图 5），细胞对顺铂的耐受性明显增强（图 6），顺铂诱导的细胞凋亡减弱（图7）。

2、对顺铂耐受的胶质瘤干细胞的TAp73基因干预

将人SH-SY5Y细胞株用含有体积分数为10%的胎牛血清的MEM培养基在含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中37℃常规培养，当细胞覆盖率达到90%时，提取细胞总RNA。根据TAp73 cDNA序列（GenBank登录号NM_005427），利用Primer Premier 5.0软件设计如下引物：上游引物：5’-tataagcttatggcccagtc-3’（SEQ ID No.5）；下游引物：5’-tgatctagagg-ccctcagtg-3’（SEQ ID No.6），PCR扩增包含TAp73蛋白编码序列的DNA片段。将所得DNA片段与pMD-18T载体直接连接，测序验证，获得TAp73-pMD-18T重组载体。再以此重组载体为模板，PCR扩增两头带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的包含TAp73蛋白编码序列的DNA片段。将所得DNA片段与真核表达载体pCDNA3.1myc/his a(-)分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收包含TAp73蛋白编码序列的DNA片段和线性化空载体，在T4 DNA连接酶作用下连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，测序验证，即获得TAp73-pCDNA3.1myc/his a(-)重组质粒。将顺铂耐受的胶质瘤干细胞用含有体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基在含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中37℃常规培养。取处于对数生长期的细胞，离心，用电穿孔法转染TAp73-pCDNA3.1myc/his a(-)重组质粒，分别设置未转染组、空质粒转染组和重组质粒转染组。电穿孔条件为：电压540v，脉宽30us，脉冲次数3次，脉冲间隔时间1分钟，室温，缓冲液pH 7.2。电穿孔完成后，将电转杯静置10分钟，再将细胞转移至6孔培养板中，加入细胞培养液2 ml，在含有体积分数为5%的CO₂气体的培养箱中37℃常规培养。按照实施例2所述方法分别检测细胞中TAp73的表达量和用顺铂处理后的细胞成活率。结果显示，通过TAp73重组质粒转染，成功上调了顺铂耐受的胶质瘤干细胞中TAp73的表达（图 5），细胞对顺铂的耐受性明显降低、敏感性增强（图 6），顺铂诱导的细胞凋亡明显增强（图7）。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120> TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAp73正义引物

<400> 1

caccacgttt gagcacctct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TAp73反义引物

<400> 2

ggcgatctgg cagtagagtt t 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin正义引物

<400> 3

cttcctgggc atggagtc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin反义引物

<400> 4

gccgatccac acggagta 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物

<400> 5

tataagctta tggcccagtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 6

tgatctagag gccctcagtg 20

Claims

1.TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞，所述化疗药物为顺铂。

2．根据权利要求1所述的TAp73基因的应用，其特征在于：所述肿瘤干细胞化疗增敏的药物包括TAp73基因重组表达载体和药学上可接受的载体。

3．根据权利要求2所述的TAp73基因的应用，其特征在于：所述TAp73基因重组表达载体是将TAp73 基因插入真核表达载体pCDNA3.1myc/his a(-)的多克隆位点中而得到。

4．TAp73基因编码蛋白质在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞，所述化疗药物为顺铂。

5．根据权利要求4所述的TAp73基因编码蛋白质的应用，其特征在于：所述肿瘤干细胞化疗增敏的药物包括TAp73基因编码蛋白质和药学上可接受的载体。

6．包含TAp73基因编码蛋白质的融合蛋白在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用，所述肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞，所述化疗药物为顺铂。

7．根据权利要求6所述的包含TAp73基因编码蛋白质的融合蛋白的应用，其特征在于：所述肿瘤干细胞化疗增敏的药物包括包含TAp73基因编码蛋白质的融合蛋白和药学上可接受的载体。