CN105770879A - Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN105770879A
CN105770879A CN201610124433.7A CN201610124433A CN105770879A CN 105770879 A CN105770879 A CN 105770879A CN 201610124433 A CN201610124433 A CN 201610124433A CN 105770879 A CN105770879 A CN 105770879A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
tumor
cell
tumor stem
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610124433.7A
Other languages
English (en)
Inventor
周良学
郭刚
仝爱平
罗林丽
魏于全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN201610124433.7A priority Critical patent/CN105770879A/zh
Publication of CN105770879A publication Critical patent/CN105770879A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5152—Tumor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种能够治疗人肿瘤的靶向基因疫苗及其在制备瘤靶向基因免疫治疗药物中的用途。本发明要解决的技术问题是为刺激宿主打破对肿瘤细胞甚至是肿瘤干细胞多重免疫麻痹从而治疗肿瘤提供一种新的有效手段。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种肿瘤干细胞疫苗。该肿瘤干细胞疫苗以经过灭活处理至失去分化、增生能力，但仍能表达IL‑15的含有IL‑15表达载体的肿瘤干细胞作为主要活性成分。肿瘤干细胞疫苗能增强个体的免疫反应，是一种长效的、有针对性的治疗方案，对肿瘤的治疗或预防具有显著效果。本发明制剂具有靶向抗肿瘤效果，可直接作用于肿瘤干细胞而抑制肿瘤的发生、演进和转移，从根源阻止肿瘤的发生发展，为肿瘤治疗提供了一种新的策略。

Description

IL-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种白介素15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤的发病率日益升高，而传统的治疗方式难以有效地清除肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞，因此其治愈率很低，复发率和死亡率较高，严重威胁人类的健康。恶性肿瘤具有多种免疫逃逸机制，肿瘤细胞抗原免疫原性弱以及缺乏一些免疫辅助因子的表达等，导致现有的肿瘤治疗临床治疗效果欠佳[Grivennikov SI,Greten FR,Karin M.Immunity,inflammation,and cancer.Cell,2010,140:883–899.]。
在肿瘤治疗中，肿瘤细胞疫苗治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫细胞治疗是通过恢复、增强或激发肿瘤患者自身的免疫监测、抑制肿瘤细胞增殖或杀灭肿瘤细胞，达到有效地清除肿瘤细胞以治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的。肿瘤细胞疫苗的制备方式是灭活自体或异体的肿瘤细胞至其增值受到抑制，但保留其免疫原性。理论上可以杀灭所有肿瘤细胞，且具主动性好、有特异性强、副作用轻等优点,正在逐步成为继手术、放疗和化疗后的第四种肿瘤治疗模式。目前，基于肿瘤细胞免疫治疗的基础研究和临床应用已成为研究热点与发展方向[Ogi C,Aruga A.Immunological monitoring of anticancervaccines in clinical trials.Oncoimmunology,2013,2:e26012.]。
白细胞介素15(interleukin15,IL-15)是1994年Grabstein发现的，随着研究的深入，我们认识到IL-15一个重要的参与免疫调节及诱导抗肿瘤免疫反应的细胞因子。该细胞因子可以促进T细胞的增殖，同时促进T细胞产生IFN-γ和TNF-α等抗肿瘤因子，增强其抗肿瘤的活性。此外还具有调节B细胞、NK细胞的功能，诱导免疫球蛋白的分泌，对细胞疫苗亦有较好的免疫增强作用等。研究还表明，IL-15在免疫佐剂等方面表现出巨大的应用前景。[MishraA,Sullivan L,Caligiuri MA.Molecular pathways:interleukin-15signaling in health and in cancer.Clin Cancer Res,2014,20:2044–2050.]
肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力，其运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能。另外，肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。因此，研究能刺激宿主打破对肿瘤细胞甚至是肿瘤干细胞多重免疫麻痹的治疗手段是本领域目前要解决的重要问题。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是为刺激宿主打破对肿瘤细胞甚至是肿瘤干细胞多重免疫麻痹从而治疗肿瘤提供一种新的有效手段。
本发明解决技术问题的技术方案是提供一种肿瘤干细胞疫苗。该肿瘤干细胞疫苗以经过灭活处理至失去分化、增生能力，但仍能表达IL-15的含有IL-15表达载体的肿瘤干细胞作为主要活性成分。
其中，上述的肿瘤细胞疫苗中所述的肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞、前列腺癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞、肝癌干细胞、乳腺癌干细胞、胃癌干细胞、肾癌干细胞、鼻咽癌干细胞、皮肤癌干细胞、食道癌干细胞、黑色素瘤干细胞中至少一种。
其中，上述的肿瘤细胞疫苗中所述的灭活处理为辐照细胞灭活法、微波细胞灭活法、电磁波细胞灭活法、激光细胞灭活法、高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融灭活法，酶学消化细胞灭活法中的至少一种。只要能够不破坏肿瘤干细胞，使其至失去分化、增生能力，但仍能表达IL-15即可。
进一步的，上述的IL-15表达载体为可表达IL-15的重组质粒载体或者病毒载体。
其中，上述的的可表达IL-15的重组质粒载体包括以下的至少一种：
1)、根据编码IL-15的基因构建的重组质粒载体；或
2)、根据编码IL-15的基因序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有IL-15基因功能的基因构建的重组质粒载体；或
3)、在生物体内被吸收转染后具有能分泌IL-15生物的活性的质粒载体。
进一步的，上述的肿瘤干细胞疫苗还含有免疫佐剂。
更进一步的，上述的肿瘤干细胞疫苗的剂型为注射剂。
本发明同时还提供了一种制备上述的肿瘤干细胞疫苗的方法。该方法包括以下步骤：(1)获得肿瘤干细胞；(2)肿瘤干细胞的基因修饰：用含人IL-15基因的表达载体转染肿瘤干细胞，获得能稳定表达IL-15的肿瘤干细胞；(3)将能稳定表达IL-15的肿瘤干细胞灭活至细胞增殖活性受到抑制，但仍能分泌IL-15；(4)将灭活的后肿瘤干细胞灭活制成肿瘤干细胞疫苗。
本发明的有益效果在于：创造性地将能表达白介素IL-15修饰的肿瘤干细胞灭活处理，制备细胞干肿瘤疫苗，同时IL-15可以协同灭活的肿瘤干细胞增强个体的免疫反应，可以有效地激活机体产生特异性的免疫反应，是一种长效的、有针对性的治疗方案。实验证明，本发明肿瘤干细胞疫苗对肿瘤的治疗或预防具有显著效果，具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1是本发明分离的脑肿瘤干细胞形成的单克隆细胞球图。
图2是对本发明分离的脑肿瘤干细胞的鉴定图。是对肿瘤干细胞的标志分子CD133的免疫荧光结果图。
图3是本发明对皮下C6/Wistar胶质瘤模型治疗后肿瘤的体积生长曲线。横坐标表示肿瘤细胞接种的时间，纵坐标表示肿瘤的体积。
图4是本发明治疗颅内C6/Wistar胶质瘤模型的疗效比较，为治疗前后肿瘤MRI扫描图。
图5是本发明对颅内C6/Wistar胶质瘤模型治疗处理后肿瘤的体积生长曲线。横坐标表示肿瘤细胞接种的时间，纵坐标表示肿瘤的体积。
图6是本发明对颅内C6/Wistar胶质瘤模型治疗处理后大鼠的生存曲线。横坐标表示肿瘤细胞接种的时间，纵坐标表示存活率。
具体实施方式：
本发明的肿瘤干细胞疫苗以经过灭活处理至失去分化、增生能力，但仍能表达IL-15的含有IL-15表达载体的肿瘤干细胞作为主要活性成分。
本发明的肿瘤干细胞疫苗的，具体分为以下几个步骤：
(1)肿瘤干细胞的获得；(2)肿瘤干细胞的基因修饰：传代5次后的肿瘤干细胞已具有很好的贴壁稳定性。通过含人IL-15基因的表达载体转染肿瘤干细胞，建立稳定高表达IL-15的肿瘤干细胞；(3)IL-15修饰的肿瘤干细胞的细胞灭活：IL-15修饰的肿瘤干细胞经过细胞灭活至细胞增殖活性受到抑制，但仍能分泌IL-15。该制备方法一般是应在无菌条件下进行。
其中，上述的肿瘤干细胞来可以为胶质瘤干细胞、前列腺癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞、肝癌干细胞、乳腺癌干细胞、胃癌干细胞、肾癌干细胞、鼻咽癌干细胞、皮肤癌干细胞、食道癌干细胞、黑色素瘤干细胞中至少一种。
其中，介导人IL-15基因表达的载体可以为真核质粒载体、腺病毒载体以及慢病毒载体等。研究表明，IL-15参与免疫调节和诱导抗肿瘤免疫反应。它可以促进T细胞的增殖，同时促进T细胞产生IFN-γ和TNF-α等抗肿瘤因子，增强其抗肿瘤的活性。IL-15可以增强宿主对肿瘤干细胞的免疫反应，可以起免疫佐剂的作用。另外，IL-15参与炎症反应过程，可以通过炎症相关的信号通路发挥抗肿瘤的作用。
其中，细胞灭活可以采用如下方法：辐照细胞灭活法，电磁波细胞灭活法，微波细胞灭活法，高温细胞灭活法，激光细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，酶学消化细胞灭活法，反复细胞冻融、离心、匀浆、沉淀细胞灭活法。以上细胞灭活方法至少采用一种，只要能够不破坏肿瘤干细胞，使其至失去分化、增生能力，但仍能表达IL-15即可。而这些方法是本领域制备细胞疫苗的常规方法，本领域技术人员容易根据前述要求进行灭活。比如采用G060灭活的方式，灭活条件可采用10～30Grays的剂量照射10～30分钟。
本发明肿瘤干细胞疫苗引入体内的途径包括：皮下单点注射、皮下多点注射、瘤周注射、瘤内注射、静脉注射、腹腔注射、胸腔注射、蛛网膜下腔注射、肌肉注射、淋巴结内或周围注射等。其使用的剂量可根据具体情况进行调整。比如，用皮下注射的方式时，一般大鼠每只注射的肿瘤疫苗数目为1×105-1×108个/次。
目前，本领域一般认为造血干细胞抗原(CD133)的表达为阳性的肿瘤细胞即视为肿瘤干细胞。因此，本发明中使用的肿瘤干细胞均按此标准选择。
下面通过实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例一.IL-15修饰的肿瘤干细胞疫苗制剂的制备
以大鼠C6胶质瘤细胞模型和C6/Wistar大鼠胶质瘤动物模型为实例。
1.肿瘤干细胞的获得
(1)肿瘤干细胞分离：将C6细胞以2×106个接种大鼠，待肿瘤形成后，分离胶质瘤组织。将组织置于无血清的DMEM/F12培养基，培养基含2％B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、2mmol/L左旋谷氨酰胺、4u/L胰岛素、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。无血清的培养基冲洗3次，将组织剪碎，反复吹打成单细胞悬液，74μm孔径滤网过滤。将过滤后的单细胞悬液进行台盼蓝染色、计数活细胞，以活细胞2×105个/ml接种于75cm2的培养瓶，置于37℃，5％CO2，饱和湿度95％的培养箱培养，每3-4天换液。
(2)肿瘤干细胞的单克隆形成：取传代的肿瘤干细胞，吹打成细胞悬液，梯度稀释至每200μl细胞培养液中含有1个、5个、10个20个细胞的细胞悬液，以200μl每孔接种于96孔板，观察细胞生长情况。培养5-7天，可见悬浮的单克隆细胞形成单克隆细胞球(图1)。
(3)肿瘤干细胞的传代及分化：当细胞悬液中的肿瘤干细胞球比较稳定后，吸取细胞培养基离心，弃掉一半旧培养基，吹打成单细胞悬液，以1:2或1:3的比例传代，一般6天左右传代。
细胞传至3到4代后，取细胞悬液离心，弃培养基，用含有10％FBS，不添加EGF和bFGF的DMEM/F12培养基重悬细胞，置于细胞培养瓶内继续培养，动态观察。一般2到3天后大部分的肿瘤干细胞球开始贴壁生长，一周后肿瘤干细胞球完全贴壁，失去球体形态，传代后细胞亦贴壁生长。
(4)肿瘤干细胞的鉴定：取原代或次代的肿瘤干细胞球，4％多聚甲醛固定，正常血清封闭，抗CD133的一抗4度孵育过夜，荧光素标记的二抗37度孵育30分钟，封片后荧光显微镜观察CD133的表达，结果显示CD133的表达呈阳性(图2)。
2.肿瘤干细胞基因修饰：将传代5次的肿瘤干细胞球，反复吹打至成单细胞悬液，计数，以活细胞2×105个/ml接种于6孔板中培养，2个孔。过夜培养后，用包装有IL-15质粒或空质粒的腺病毒载体(pAd/PL-DEST-IL-15或pAd/PL-DEST)转染干细胞，MOI值为10。转染72小时后，用1μg/ul的青霉素筛选，直至获得稳定转染的细胞株，转染率90％左右。
3.肿瘤细胞疫苗的制备：
(1)肿瘤细胞疫苗的灭活：将1×106个高表达IL-15的肿瘤干细胞株，分别经过G06020Grays剂量照射5、10、15、20、30min，收集不同时间点细胞观察其增殖情况，同时提取细胞蛋白检测IL-15的表达。结果发现，肿瘤干细胞株，经过G060 20Grays剂量照射20min时，细胞增殖受到抑制，但还能分泌IL-15。按此制备了灭活的肿瘤干细胞疫苗组。此外还制备了空载质粒感染的肿瘤干细胞疫苗以备后继试验所用。显然，在重复试验时，G060照射的剂量和时间可根据具体情况进行调整，以达到要求为准。
(2)肿瘤细胞疫苗灭活的鉴定：①体外试验:将灭活的肿瘤干细胞接种到96孔板，检测其生长曲线，发现肿瘤干细胞不再出现分裂和增生，则说明灭活成功；②体内试验：将灭活肿瘤干细胞以2×106个(100μl)接种裸鼠，观察裸鼠的成瘤情况。裸鼠不成瘤，则说明灭活成功。
实施例二.本发明制剂用于治疗C6/Wistar皮下脑胶质瘤动物模型
1.模型的建立与评估
(1)Wistar雄性大鼠，体重200g±20g，每组12只；
(2)将大鼠的右后肢去毛，用碘酒和75％酒精局部予以消毒；
(3)用灭菌的微量进样器将2×106个(100μl)C6胶质瘤细胞接种于大鼠右后肢皮下，建立C6胶质瘤皮下模型；
(4)术后的前3天，每天给予每只大鼠青霉素10‐20万U/只腹腔注射，以预防感染；
(5)观察大鼠生长情况，体重改变、毛色、饮食、活动情况以及注射部位有无肿胀和包块等。
2.C6皮下脑胶质瘤动物模型分组及治疗
接种8天后，肿瘤细胞成瘤(直径大于5mm)。将建模成功的大鼠随机分成3组，每组12只。将生理盐水或实施例1中的细胞疫苗，以局部注射方式进行注入大鼠体内。分别为生理盐水对照组(100μl/只)、肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组(5×106个，100μl/只)、肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组(5×106个，100μl/只)。分别对上述分组进行干预，每3天治疗一次，连续8次。
3.皮下脑胶质瘤动物模型观察指标
每周量大鼠体重3次，每日观察大鼠的接触反应、意识、运动情况、颅内神经损害与视觉反应，是否有偏瘫与癫痫发作等。
游标卡尺每3天检测一次皮下肿瘤的大小，测量肿瘤的短径(a)与最大径(b)，根据公式计算出各组肿瘤的体积：皮下肿瘤体积＝1/2×肿瘤短径2×肿瘤长径(a2b/2)。根据肿瘤体积平均值与生长时间的变化绘成生长曲线。按公式[1-(治疗组平均体积变化/对照组平均体积变化)]×100％，计算抑瘤率。
记录各组大鼠的生存天数，用公式(治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100％，计算出延长生存期。
4.治疗效果
皮下接种大鼠45只，接种5-7天后，右后肢接种肿瘤处有包块隆起，是实体性包块。当包块直径大于5mm时认为建模成功，其中3只未出现明显肿瘤，成瘤率93.3％。从建模成功的大鼠中挑出36只，随机分成3组予以相应措施干预。随着时间延长肿瘤逐渐长大，大多数肿瘤随瘤龄延长其体积明显增大。从14天开始，大部分肿瘤逐步增加，个别肿瘤开始变小。每次治疗之前测量一次肿瘤体积，治疗实施后每3天测量一次肿瘤体积，直至肿瘤完全消失或者大鼠死亡。
根据测得的肿瘤体积，各组体积均呈现出增大的趋势，以对照组最为明显。肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组和肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组体积增加趋势变缓，其中肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组较为显著，大部分肿瘤的生长受到了抑制，部分的肿瘤完全消失。到44天时，肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组肿瘤全部消失，肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组肿瘤体积明显减少，对照组肿瘤体积也体现出体积变小的趋势。到62天时，各组肿瘤均全部消失(图3)。计算各组肿瘤的平均体积并对其称重，根据公式计算与对照组相比，肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组的最大抑瘤率约为86.1％，明显高于其他两组。
实施例3.本发明疫苗用于治疗C6/Wistar颅内脑胶质瘤动物模型
1.模型的建立与评估
(1)接种前3天，灌胃给予地塞米松10μg/g，降低大鼠的免疫力，减少排斥反应；
(2)参照Paxinos和Wastson的《大鼠脑立体定位图谱》，确定右尾状核区靶点，然后接种。坐标为前颅中点钱1.0mm，矢状缝右旁开3-3.5mm，硬膜下4-5.0mm；
(3)10％水合氯醛注射大鼠(3μl/g),使其麻醉后固定于脑立体定位手术台(DW-2000，中国)，俯卧位，将上齿固定以保持气道通畅，双侧用耳杆固定；
(4)在双侧内玼连线和头正中矢状线交点后1cm处为切口，剃去头部的顶毛，75％酒精、碘酒消毒。在选定的切口处向后纵向切开皮肤，露出颅骨标志，按上面的坐标点定位。牙科钻在颅骨上钻孔，孔径为1.2mm，用25μl微量注射器的针头刺破硬膜，在立体定向引导下接种针垂直缓慢延伸至硬膜下6.0mm，上提1.0mm于硬膜下5.0mm靶点处接种细胞，将细胞悬液1×106个细胞以1μl/min的速度缓慢注入靶区(10μl/只)。留针5-10min，让细胞充分沉淀；
(5)缓慢拔针，用骨蜡封闭颅骨钻孔处，缝合头皮，侧卧，保温，置于干燥环境，分笼饲养；
(6)术后的前3天，每天给予每只大鼠青霉素10-20万U/只腹腔注射，以预防感染；观察大鼠生长情况，体重改变、毛色、饮食、活动情况等。
手术后第8天进行核磁共振检查，观察颅内肿瘤的形成情况及形态特征等。
2.C6颅内脑胶质瘤动物模型分组及治疗
通过MRI检测观察成瘤后，挑选36只随机分成3组，每组12只。将生理盐水或实施例1中的细胞疫苗，以局部注射方式进行注入大鼠体内。分别为生理盐水对照组(100μl/只)、肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组(5×106个，100μl/只)、肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组(5×106个，100μl/只)。分别对上述分组进行干预，每3天治疗一次，连续8次。
3.实验结果
肿瘤接种第8天，按照预定的实验方案对各组给予干预，在皮下以多点局部注射的方式进行，每3天治疗一次，连续8次。
经过干预治疗后，MRI检测(治疗后12天)肿瘤生长情况，发现肿瘤体积总体呈增大趋势，以对照组最为明显，肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组和肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组肿瘤体积增加趋势减缓。其中肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组减缓趋势较为明显，部分肿瘤几乎没有生长，小部分肿瘤开始变小(图4)。对各组数据进行统计学分析，后两组同对照组相比具有统计学意义，后两组之间比较肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组效果更佳(图5)。根据公式计算与对照组相比，肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组的最大抑瘤率约为94.8％
自接种35天后(治疗28天后)，对照组的大鼠只有2只存活，肿瘤干细胞+空载质粒疫苗组和肿瘤干细胞+IL-15质粒疫苗组的大鼠也大部分死亡，分别存活5只和7只。计算各组生存率后得到生存曲线(图6)。

Claims (9)

1.肿瘤干细胞疫苗，其特征在于：以经过灭活处理至失去分化、增生能力，但仍能表达IL-15的含有IL-15表达载体的肿瘤干细胞作为主要活性成分。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞疫苗，其特征在于：所述的灭活处理为辐照细胞灭活法、微波细胞灭活法、电磁波细胞灭活法、激光细胞灭活法、高温细胞灭活法，超声破碎细胞灭活法，反复细胞冻融灭活法，酶学消化细胞灭活法中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞疫苗，其特征在于：所述的肿瘤干细胞为胶质瘤干细胞、前列腺癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞、肝癌干细胞、乳腺癌干细胞、胃癌干细胞、肾癌干细胞、鼻咽癌干细胞、皮肤癌干细胞、食道癌干细胞、黑色素瘤干细胞中至少一种。
4.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞疫苗，其特征在于：所述的IL-15表达载体为可表达IL-15的重组质粒载体或者病毒载体。
5.根据权利要求1～4任一项所述肿瘤干细胞疫苗，其特征在于：所述的可表达IL-15的重组质粒载体包括以下的至少一种：
1)、根据编码IL-15的基因构建的重组质粒载体；或
2)、根据编码IL-15的基因序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有IL-15基因功能的基因构建的重组质粒载体；或
3)、在生物体内被吸收转染后具有能分泌IL-15生物的活性的质粒载体。
6.根据权利要求1～5任一项肿瘤干细胞疫苗，其特征在于：还含有免疫佐剂。
7.根据权利要求1～6任一项肿瘤干细胞疫苗.其特征在于：所述的肿瘤干细胞疫苗为注射剂。
8.制备权利要求1～6任一项肿瘤干细胞疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获得肿瘤干细胞；(2)肿瘤干细胞的基因修饰：用含人IL-15基因的表达载体转染肿瘤干细胞，获得能稳定表达IL-15的肿瘤干细胞；(3)将能稳定表达IL-15的肿瘤干细胞灭活至细胞增殖活性受到抑制，但仍能分泌IL-15；(4)将灭活的后肿瘤干细胞灭活制成肿瘤干细胞疫苗。
9.权利要求1～6任一项所述肿瘤细胞疫苗在制备防治肿瘤的药物中的用途。
CN201610124433.7A 2016-03-04 2016-03-04 Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途 Pending CN105770879A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610124433.7A CN105770879A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610124433.7A CN105770879A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105770879A true CN105770879A (zh) 2016-07-20

Family

ID=56387051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610124433.7A Pending CN105770879A (zh) 2016-03-04 2016-03-04 Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105770879A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106668851A (zh) * 2016-12-12 2017-05-17 成都育芽科技有限公司 一种显著提高免疫能力的肺癌干细胞疫苗的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101538554A (zh) * 2009-04-30 2009-09-23 北京弘润天源生物技术有限公司 经耐受性筛选的肿瘤干细胞、其制法、应用和试剂盒及其抗原组合物、制法、应用和试剂盒
CN102178960A (zh) * 2011-04-02 2011-09-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用
CN102343086A (zh) * 2010-05-28 2012-02-08 四川大学 治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101538554A (zh) * 2009-04-30 2009-09-23 北京弘润天源生物技术有限公司 经耐受性筛选的肿瘤干细胞、其制法、应用和试剂盒及其抗原组合物、制法、应用和试剂盒
CN102343086A (zh) * 2010-05-28 2012-02-08 四川大学 治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途
CN102178960A (zh) * 2011-04-02 2011-09-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 TAp73基因在制备肿瘤干细胞化疗增敏药物中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN C. MORRIS ET AL: "Vaccination with Tumor Cells Expressing IL-15 and IL-15Rα Inhibit Murine Breast and Prostate Cancer", 《AUTHOR MANUSCRIPT》 *
杨静: "肝脏干细胞疫苗预防和治疗小鼠肝癌移植瘤的免疫应答研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *
赵晓斌: "肿瘤疫苗的研究进展", 《现代免疫学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106668851A (zh) * 2016-12-12 2017-05-17 成都育芽科技有限公司 一种显著提高免疫能力的肺癌干细胞疫苗的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mondovì et al. Increased immunogenicity of Ehrlich ascites cells after heat treatment
CA2939535C (en) Use of alphavirus in preparation of antitumor drugs
CN101481677B (zh) 体外刺激树突状细胞成熟的方法
CN102343086A (zh) 治疗或预防肿瘤的药物、肿瘤全细胞疫苗及其制备方法和用途
CN103212071B (zh) 干细胞融合癌发生模型
CN109568570B (zh) 一种抗肿瘤疫苗复合物及制备方法、注射剂及应用
CN109498651A (zh) 一种抗肿瘤微颗粒的制备方法、药剂及应用
CN106167789A (zh) 低氧处理的间充质干细胞及其应用
CN101538554A (zh) 经耐受性筛选的肿瘤干细胞、其制法、应用和试剂盒及其抗原组合物、制法、应用和试剂盒
CN103800896A (zh) 一种自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用
CN103230600B (zh) HBx修饰的抗肝癌全细胞疫苗及其制备方法和用途
Li et al. Effects of brucine on vascular endothelial growth factor expression and microvessel density in a nude mouse model of bone metastasis due to breast cancer
CN101560496A (zh) 经耐受性筛选的肿瘤干细胞抗原负载的树突状细胞，其制法、应用、试剂盒及包括其的疫苗
CN106867963A (zh) 射线修饰脐带成体干细胞3d微球活制剂及其制备与应用
Ragel et al. A novel model of intracranial meningioma in mice using luciferase-expressing meningioma cells
CN105770879A (zh) Il-15修饰的肿瘤干细胞疫苗及其制备方法和用途
CN104758926B (zh) 用于主动免疫治疗的Th1接种疫苗引发
CN101485917B (zh) 癫痫病治疗系统
Storozynsky et al. Radiation combined with oncolytic vaccinia virus provides pronounced antitumor efficacy and induces immune protection in an aggressive glioblastoma model
CN101288602A (zh) 建立辐射诱导白癜风小鼠模型的方法及其应用
CN102068448A (zh) 淫羊藿次苷ⅱ在制备抗黑色素瘤药物中的用途
CN101837123B (zh) 肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN106047810A (zh) 一种新型DC‑CTLs细胞培养体系及其培养方法
CN108452438A (zh) 磁场约束设备在制备用于抑制肿瘤转移的产品中的应用
CN114403095B (zh) 一种小鼠乳腺癌自发性淋巴结转移模型的建模方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160720