CN113769095B - 神经调节素1促进皮肤创面修复的方法及其应用 - Google Patents

神经调节素1促进皮肤创面修复的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NRG1和其受体在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。所述的NRG1通过促进ErbB4的磷酸化，从而促进皮肤创面修复。本发明同时公开了一种促进皮肤创面修复的的药物组合物，所述药物组合物为含有NRG1基因的载体。另外，本发明还提供了一种用于筛选促进皮肤创面修复的潜在物质的方法。本发明的NRG1及其药物组合物对皮肤创面修复有较好的促进作用，在皮肤创面修复中具有重要的参考和现实意义。另外，本发明提供的用于筛选促进皮肤创面修复的潜在物质的方法筛选皮肤创面修复的药物和物质有良好的作用，对筛选合适的用于皮肤创面修复的物质时具有较好的衡量和指导作用。

Description

神经调节素1促进皮肤创面修复的方法及其应用
技术领域
本发明涉及与皮肤创面修复相关的蛋白及其在促进皮肤创面修复中的应用，具体所述蛋白为NRG1及其受体。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。
背景技术
皮肤是人体最大的感觉器官，具有屏障、感觉、免疫体温调节、内分泌排泄等功能，各种急性损伤如烧伤、皮肤撕脱伤、外科手术等所导致的皮肤大面积缺损十分常见。另外，慢性致伤因素导致的皮肤难愈性创面如压力性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡等的发病率也在逐年上升，严重影响着患者的经济与生活质量，给创面修复外科医师带来巨大的挑战。皮肤创面修复的过程是一个由各种不同类型的细胞、细胞外基质、细胞因子及生长因子等共同参与的精密协调的复杂而有序的过程。近年来人们对皮肤创面修复的研究取得许多重要的进展，但是目前对于创面愈合过程中不同修复因子在创面愈合过程中的作用及机制仍不明晰，这亟需人们从新的角度深入探讨皮肤创伤修复的调控机制。
当前研究证明，周围神经系统可通过分泌神经肽、神经递质、神经激素等多种物质调控皮肤的生理及修复再生的过程。目前研究较多的是神经肽，包括：P物质(substance P，SP)、降钙素基因相关肤(Calcitonin gene related peptide，CGRP)血管活性肠肽(vasoactive intestinal polymetric，VIP)等。研究表明神经肽在皮肤创伤修复过程中不仅起到信号传导和协调的作用，而且还可能是启动创伤修复的原始信号。最近的研究还发现皮肤神经可通过分泌血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)在小鼠皮肤创伤修复中发挥重要的作用。以上证据表明，周围神经可通过分泌神经递质和细胞因子等方式介导神经与皮肤创伤修复之间信号转导作用，但是基于这些研究的相关治疗未见有效应用于临床。因此研究神经分泌的关键分子在皮肤创伤修复过程中的调控作用，对创伤或慢性致伤因素导致的周围神经病变的皮肤修复再生至关重要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种蛋白标志物在促进皮肤创面修复的产品中的用途；本发明的目的之二在于提供一种评价该蛋白表达水平的试剂盒。
为了研究与皮肤创面修复相关的蛋白在皮肤创面修复中的作用，从而筛选合适的蛋白。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从皮肤创面组织中找到了可以作为皮肤创面修复标志物的NRG1。
因此，本发明一方面提供了一种蛋白，所述蛋白为NRG1，所述的NRG1的靶基因为ErbB酪氨激酶受体家族，所述的NRG1在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用。
优选地，本发明所述的药物或试剂为提高NRG1表达量的药物或试剂。
优选地，本发明所述的提高NRG1表达量的药物或试剂包含：(1)NRG1及其编码基因；(2)含有NRG1编码基因的重组载体。
优选地，本发明所述的提高NRG1表达量的药物或试剂包含重组载体rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry。
优选地，本发明所述的rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry是通过皮肤电转导入皮肤。
再一方面，本发明还提供了一种ErbB4磷酸化促进剂，所述的ErbB4磷酸化促进剂在制备皮肤创面修复药物和试剂中的应用。
优选地，本发明所述的ErbB4磷酸化促进剂为ErbB4的特异性配体和/或ErbB4磷酸化激酶区域激活剂。
优选地，本发明所述的ErbB4磷酸化促进剂为NRG1。
再一方面，本发明还提供了一种促进皮肤创面修复的药物组合物，所述药物组合物包括NRG1基因或其上调剂。
优选地，本发明所述的药物组合物为含有NRG1编码基因的重组载体。
优选地，本发明所述的含有NRG1编码基因的重组载体为rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry。
再一方面，本发明还提供了一种NRG1和/或ErbB4的用途，所述的NRG1和/或ErbB4用于筛选促进皮肤创面修复的潜在物质。
再一方面，本发明还提供了一种使用NRG1和/或ErbB4筛选促进皮肤创面修复的潜在物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将候选物质与表达NRG1和/或ErbB4的体系接触；(b)检测NRG1的表达或活性，若所述候选物质在统计学上提高NRG1的表达或活性，则表明该候选物质是促进皮肤创面修复的潜在物质；和/或检测ErbB4的磷酸化水平，若所述候选物质在统计学上提高ErbB4的磷酸化水平，则表明该候选物质是促进皮肤创面修复的潜在物质。
优选地，本发明所述方法步骤(a)中，所述的体系表达NRG1和ErbB4，两者发生相互作用；步骤(b)中，检测NRG1和ErbB4相互作用情况，若所述候选物质在统计学上NRG1和ErbB4的相互作用，则表明该候选物质是促进皮肤创面修复的潜在物质。
NRG1及其相关用途：
神经调节蛋白1(Neuregulin 1，NRG1)是广泛存在于中枢和外周神经系统的细胞外生长因子，通过作用于ErbB酪氨酸激酶受体家族成员(包括ErbB2、ErbB3和ErbB4)，可产生广泛的生物学功能，在细胞的增殖、分化及迁移中发挥重要的调控作用。发明人在研究中发现，NRG1及其ErbB4信号通路活性可响应皮肤创伤刺激而上调升高，这种效应在皮肤损伤修复的过程发挥着重要的调控作用。
(1)ErbB4受体蛋白在正常皮肤及损伤后表达及变化情况：
动物模型中观察发现，皮肤损伤引起创缘皮肤中的NRG1表达急剧升高并激活创缘组织中ErbB4信号通路。Western Blot检测结果显示，皮肤中NRG1蛋白表达和ErbB4磷酸化活性在皮肤损伤后第1天开始即升高，随着皮肤创面的的逐渐愈合表达水平也逐渐降低。
(2)NRG1/ErbB4信号通路在皮肤损伤修复中的重要作用：
首先利用皮肤电转基因过表达的技术，成功将小鼠NRG1全长基因过表达质粒转入皮肤细胞内，在皮肤及创缘中成功表达NRG1蛋白，发现皮肤局部过表达NRG1蛋白可促进小鼠皮肤创面愈合。
创面分别局部应用ErbB4抑制剂AG1478(500μM)和ErbB2受体抑制剂AG879，结果AG1478可导致皮肤创面愈合延迟，而AG879对皮肤创缘愈合未产生显著性影响。说明ErbB4受体特异性地发挥调控小鼠创面愈合修复的作用。
为了屏蔽药理学实验的局限性和副作用，增加实验的特异性，我们进一步使用ErbB4敲除小鼠进行研究，通过观察皮肤创伤后第1、3、5、7天的情况，ErbB4敲除小鼠创面愈合速度低于其野生型对照组，说明基因敲除后小鼠皮肤创面延迟愈合。
附图说明
图1各基因PCR引物序列图。
图2SDS-PAGE凝胶配制图。
图3小鼠皮肤创伤后ErbB4 mRNA表达上调。
图4小鼠皮肤损伤后激活了ErbB4受体。其中(A)Western blot典型结果显示小鼠正常及皮肤损伤后第1、3、5、7天皮肤创缘皮肤组织中ErbB4及p-ErbB4的表达变化。(B)定量分析Westernblot检测ErbB4及p-ErbB4的结果。GAPDH和β-actin作为实验内参，每个时间点取3只以上小鼠的样品，N：正常皮肤，d1：术后第1天，d3：术后第3天，d5：术后第5天，d7：术后第7天。
图5NRG1过表达质粒在293T细胞的转染及过表达效率。其中(A)NRG1过表达质粒(NRG1-OE)及对照质粒(control)结构设计示意图。(B)免疫荧光显示NRG1-OE和control质粒转染293细胞24h后荧光蛋白mcherry的表达情况(4x)，标尺＝100μm。(C)Western blot检测结果显示NRG1-OE组293细胞NRG1蛋白表达显著升高。(D)Western blot结果显示HA标记的NRG1在NRG1-OE和control的表达情况。
图6皮肤电转NRG1过表达质粒较过表达效果验证。(A)皮肤电转流程图。(B)皮肤电转NRG-OE质粒48小时后，活体成像检测皮肤中mcherry荧光蛋白的表达情况。(C)westernblots检测NRG1的标签蛋白HA的表达情况。(D)westernblots检测结果显示NRG1-OE组皮肤中的NRG1的表达情况。
图7NRG1过表达对皮肤创面愈合率的影响。其中(A)皮肤电转移HA-NRG1过表达质粒创面愈合实验流程图，皮肤电转质粒48h后建立全层皮肤缺损创面，记录术后第0、1、3、5天创面面积。(B)NRG1-OE和对照组在术后第0、1、3、5天创面局部图。(C)比较NRG1-OE与对照组在术后第0、1、3、5天创面愈合率。n＝9。
图8NRG1对皮肤全层缺损创面上皮化的影响。其中(A)NRG1-OE和对照组术后第5天创面组织HE及免疫荧光染色结果(10x)。(B)创缘上皮爬行长度测量计算公式，上皮爬行长度＝W1W2+W3W4。(C)NRG1-OE和control组术后第5天皮肤创面上皮爬行长度统计分析
图9AG1478对创面愈合率的影响。其中(A)小鼠皮肤创面AG1478、AG879及DMSO用药示意图。(B)westernblots结果显示创面局部应用ErbB4受体抑制剂AG1478可有效抑制创缘中的p-ErbB4的表达，ErbB2受体抑制剂AG879未能有效抑制皮肤创缘中的ErbB2的受体抑制剂。(C)用药不同时间点实验组和对照组创面局部图(D)比较实验组合对照组在术后各时间点的创面愈合率，n≥10。
图10AG1478对皮肤创面上皮爬行的影响。其中(A)AG1478用药及对照创面术后第7天创面组织HE及免疫荧光染色结果(10x)。(B)用药第7天皮肤创面上皮爬行统计分析。
图11ErbB4+/-小鼠的表征及皮肤中ErbB4的敲除效果验证。其中(A)ErbB4敲除小鼠PCR基因鉴定结果：野生型小鼠能扩增出一条150bp的条带，ErbB4敲除的杂合子能扩增出150bp和320bp两条条带。(B)Westernblots检测ErbB4杂合子和野生型小鼠皮肤中ErbB4的表达情况，ErbB4杂合子皮肤中ErbB4的表达明显变弱。(C)ErbB4杂合子和野生型小鼠的外观(D)HE染色观察ErbB4杂合子和野生型小鼠的皮肤的结构。
图12野生型与ErbB4杂合子小鼠的创面愈合率分析。其中(A)术后各时间点E野生型及ErbB4杂合子小鼠的创面面积大小典型图片。用皮肤打孔器在小鼠皮肤背部制造两个对称直径为6mm的全层皮肤缺损创面，选择小鼠背部左侧创面进行测量和统计分析。(B)比较ErbB4杂合子和野生型小鼠在术后各时间点创面愈合率。
图13WT and ErbB4+/-小鼠皮肤创面愈合上皮化分析。其中(A)H&E及免疫荧光染色观察ErbB4杂合子和野生型小鼠创面愈合过程上皮爬行情况(10X)。(B)ErbB4杂合子和野生型小鼠创面上皮长度统计分析结果。n＝5，标尺500μm，“S”代表痂皮，箭头代表创缘，三角形箭头代表上皮爬行最远端。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及各种原料，如无特别说明，均为市售。
本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测皮肤创面组织中蛋白的表达水平，发现其中具有明显表达差异的蛋白片段，探讨其与皮肤创面修复的发生之间的关系，从而为促进皮肤创面修复的寻找更好的途径和方法。通过实验，本发明发现皮肤创面组织中NRG1显著性上调，进一步的实验证明，改变NRG1的表达水平可以影响皮肤创面修复，提示NRG1以及NRG1相关的ErbB4通路可以作为药物靶标用于促进皮肤创面修复。
基于发明人的发现，本发明提供了一种NRG1在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用以及由此制备的药物组合物和该药物组合物在促进皮肤创面修复的应用，所述药物组合物的性质对本发明来说并不重要，只要它含有NRG1基因的功能性即可，举例来说，本发明的药物组合物可以是以NRG1基因的合成序列构建的重组质粒、其能促进皮肤创面修复(本发明的优先实施例中有详细介绍)。在此基础上，本发明根据NRGl的核苷酸序列，以及NRG1在皮肤创面修复的作用机制(NRG1蛋白在皮肤创面修复中激活ErbB4信号通路，从而促进皮肤创面修复。)从而设计出的针对提高NRG1的基因表达的试剂或者其他组分，另外还可以设计直接提高ErbB4的基因表达的试剂或其他组分，这些试剂或组分都能起到促进皮肤创面修复的作用，都应属于本发明的保护范围之内。例如，本发明提供的可以上调NRG1的质粒(载体)或上调ErbB4的质粒(载体)。当然，人工直接合成的NRG1也属于本专利的范围之内。
本发明的NRG1或ErbB4可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内或组织内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内或组织内。如本发明所述的皮肤电转。
当然，本发明的药物组合物还可与其他促进皮肤创面修复的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的NRG1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。另外，本发明的NRG1可以通过人工合成的方法或蛋白重组表达的方法获得。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1Neuregulin-1/ErbB4信号通路在皮肤创面修复中的变化
1、实验材料
实验动物：本发明使用的C57BL/6小鼠购买于维通利华公司(实验动物生产许可证号：SCXK京2015-001)及广西医科大学动物中心(实验动物生产许可证号SCXK桂2003-0003)，还使用了各种转基因小鼠进行皮肤创面愈合实验，包括ErbB4敲除小鼠(ErbB4+/-)、各系条件性基因敲除小鼠如Krt14-Cre；ErbB-/-、ErbB4-Floxed；Nestin-CreER；Nestin-GFP小鼠进行实验。其中ErbB4敲除小鼠(ErbB4+/-)来自于瑞士巴塞尔大学的MartinGassmann教授实验室，ErbB4-Flox小鼠来源于来自美国印第安纳大学的Cary Lai教授实验室，Krt14-Cre小鼠购买于上海南方模式生物科技股份有限公司(实验动物生产许可证号SCXK沪2017-0010)，Nestin-GFP(Stock No.033927)小鼠来源于Jackson Laboratory，Nestin-CreER小鼠来源于美国德克萨斯大学西南医学中心，饲养标准为每笼饲养5-7只，动物自由饮食，12小时制的光照与黑暗进行循环，维持室温25℃。
2实验方法
2.1建立小鼠背部皮肤全层缺损创面模型：1)小鼠脱毛备皮：实验前一天，用5％的腹腔注射水合氯醛溶液(0.1ml/10mg)进行麻醉，先使用电动理发刀剃除小鼠背部皮肤的毛发，再均匀涂抹脱毛膏(薇婷)，3-5分钟后用水清洗小鼠背部脱毛膏，小鼠单笼饲养，注意保暖。2)次日，用5％的水合氯醛腹腔注射(0.01mL/g)后，使用碘伏消毒小鼠背部皮肤。3)沿小鼠的背部正中线画一虚线，小鼠背部皮肤做一直线垂直于正中线，左右两侧距离正中线1mm标记对称的两点A1和A2。4)助手沿着背部正中线提起小鼠背部皮肤，用皮肤打孔器在A1和A2两点为中心，制造直径约6mm的皮肤全层缺损创面。5)建立皮肤全层缺损创面模型的小鼠单笼饲养，创面裸露让其白行愈合，防止相互咬伤创面，保证充足水分和食物。6)术后第1、3、5、7天小鼠处死后，将创面为中心1cm×1cm范围大小的皮肤及皮下组织及创面完整剪下来，注意避免对创面进行牵拉变形，将标本水平放置于锡箔纸上，用锡箔纸包好后立即置于-80℃冰箱中存放。7)将收集好的创面组织标本用冰冻切片包埋剂(Optimum CuttingTemperature，OCT)包埋后在恒冷式冰冻切片机进行冰冻切片，厚度为12μm，采用直接贴片法进行贴片，切好后存于-80冰箱中保存备用。8)收集正常皮肤组织及术后第1、3、5、7皮肤及创缘组织样品：5％的水合氯醛腹腔麻醉后，颈椎脱臼处死，剪下创面周围2-3mm皮肤组织，用DEPC生理盐水冲洗3遍去除血凝块，用显微器械去除皮下脂肪及创面痂皮组织，用滤纸擦拭干，避免皮下组织的残存，放入预冷的2mlEP管中，用眼科剪碎后立即装入RNAfree的EP管中置于液氮中，置于-80℃保存，其中每一时间点各取3组样品，-80℃冰箱保存。
2.2逆转录PCR(RT-PCR)
2.2.1Trizol法提取总RNA：1)从-80℃冰箱中取出收集的正常皮肤创缘组织及L4、L5DRGs样品；2)称量好的组织样品中加入Trizol(1ml/50-100mg)，解冻后(约10min)加入预冷的磁珠1颗。3)于组织匀浆机中进行匀浆，60HZ 30s使组织充分研磨裂解。4)冰浴5-10min，每1 mL上清液中加入500μL的氯仿，快速振荡15S，冰浴10min。5)12000rcf，4℃，离心5min，吸取上清液于新的离心管中。6)缓慢吸上层水相至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，进行多次颠倒并充分混匀。7)冰浴10min，1200rcf，4℃，10min。8)每管加入75％乙醇400μL/管(DEPC)，颠倒混匀。9)7600rcf，4℃，5min。10)丢弃上清，简短离心15s，用白色枪头将剩余液体尽量吸干，将EP管倒扣晾干(约5min)。11)每管加入30μLDEPC-ddH2O，溶解RNA样品。12)取1μL样品RNA+1μL loading buffer，1.2琼脂糖电泳检测RNA提取的纯度和完整性。
2.2.2RNA逆转录为cDNA：1)提取RNA样品(2μg)加入1μL oligo(dT)和Depc.H20共12μL。2)PCR仪中65℃5min。3)20μL转录体系：
Figure BDA0003264059890000071
4)温和震荡，简短离心。5)置于PCR仪中，42℃60min，70℃ 5min。6)分装，-20℃保存备用。
2.2.3RT-PCR反应
1)基因引物序列(由上海生工生物科技有限公司合成)，具体序列见图1所示。
2)PCR反应体系
Figure BDA0003264059890000081
3)PCR反应条件：
(1)ErbB4
Figure BDA0003264059890000082
2)PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，150mA，并使用BIO-RAD chemiDOCTMMP凝胶成像系统进行图像采集和分析。
2.3Western blotting：1)将小鼠及人的皮肤及创面样品从-80℃冰箱中取出，置于冰上转移。2)蛋白提取，按照常规裂解提取即可。3)BCA法进行蛋白浓度测定(购自美国赛默飞公司)：按照说明书操作即可。4)SDS-PAGE凝胶的制备：SDS-PAGE凝胶配方如下所示(体积为1块1.5mm凝胶)。本实验依次配制下层分离胶9％，上层胶5％，配胶试剂购于上海生工。具体见图2所示。5)蛋白电泳6)转膜：7)抗体孵育：a)转膜结束后，取出PVDF膜，正面朝上并放入含5％脱脂奶粉的TBST中，置于摇床上慢摇，室温封闭1h。b)根据目标蛋白及内参分子量大小及Marker位置剪膜。c)剪好的PVDF膜分别置于相应的一抗稀释液中进行孵育，Rabbit anti-NRG1 antibody(1：200，abcam)，Mouse anti-ErbB4 antibody(1∶200，stantacruz)，Rabbit anti-P-ErbB antibody(1∶200，abcam)，GAPDH Antibody(V-18)HRP(1：10000)4℃过夜(16小时左右)。d)回收一抗至EP管并使用1×TBST于摇床上震荡清洗3×10min。e)用5％脱脂奶粉稀释将二抗到相应浓度，室温孵育2h，HRP-anti-rabbit(1：10000)HRP-anti-mouse IgG(1∶10000)。f)弃去1×TBST，更换1×PBS，清洗10min，一共3次。8)将ECL增强发光试剂盒中AB液等比例混合后，均匀滴在PVDF膜上进行孵育约1min，使用Biored全自动成像系统进行扫描成像。
3实验结果
为了明确在小鼠皮肤创面愈合过程中ErbB4的表达及其活性的变化情况，我们小鼠背部皮肤建立皮肤全层缺损创面模型，收集小鼠正常皮肤和创伤后第1天皮肤创缘3mm组织，首先针对小鼠ErbB4设计特异性PCR引物并以Gapdh作为内参，RT-PCR检测小鼠正常皮肤及创缘中ErbB4的表达及变化，结果如图3所示：小鼠正常皮肤和创缘皮肤组织均可检测到ErbB4表达，正常皮肤组织中ErbB4表达相对较低，皮肤创缘皮肤组织中的ErbB4的表达水平较正常皮肤上调，结果表明了小鼠皮肤中有ErbB4 mRNA的表达，并且皮肤损伤后ErbB4mRNA的表达上调。
上述实验结果显示：小鼠皮肤损伤后ErbB4和p-ErbB4均升高，ErbB4蛋白水平较正常皮肤增高约1倍，而p-ErbB4蛋白的表达水平约为正常皮肤组织的3倍；第7天皮肤创面完全愈合p-ErbB4的表达水平趋于正常，但是ErbB4表达仍然高于正常皮肤(图4)。这说明了皮肤创伤后创缘中ErbB4磷酸化活性水平显著升高。
实施例2Neuregulin-1/ErbB4信号通路在皮肤创面修复中的作用
1实验材料
1.1实验动物：C57BL/6小鼠来源同实施例1，我们采用ErbB4+/-进行交配繁殖，对他们的后代进行基因鉴定，因ErbB4敲除的纯合子容易导致心脏发育不良胚胎致死难以获得，因此本实验使用ErbB4+/-进行创面愈合观察实验，ErbB4+/-小鼠组作为实验组和野生型小鼠作为对照组。根据广西医科大学实验动物中心的相关伦理学法则，实验中均已尽力减轻对动物的伤害。
2实验方法
2.1ErbB4受体抑制药理学实验
2.1.1AG1478(500μm)对创缘ErbB4活性的影响验证实验：1)术前一天脱毛备皮：8周龄雄性C57小鼠，用5％水合氯醛按0.1mL/10mg剂量麻醉，待小鼠麻醉后，电动剃毛刀剔除背部皮肤鼠毛，脱毛膏涂于皮肤上待3分钟后用水轻轻擦洗脱毛膏，防止脱毛膏残留对皮肤的损伤。2)AG1478药物的配制，参照文献中在体外细胞培养中应用的药物浓度(5μM)，估算出在体内中的药物使用浓度500μM，将AG1478混匀于K-Y凝胶中制备成500μM，配制浓度为500μM的DMSO K-Y凝胶作为对照。3)实验时将小鼠用5％水合氯醛麻醉后，按照上述皮肤打孔的方法在小鼠背部皮肤制造2个皮肤全层缺损创面，保证两个创面之间的距离要大于1cm，将皮肤打孔器打下来的皮肤收集于EP中，眼科剪剪碎后立即置于液氮中，存于-80℃冰箱。4)左侧创面用移液枪吸取500μM的DMSO凝胶(20μL/孔)作为对照，右侧创面应用抑制剂AG1478作为实验组，在气体麻醉下，每天两次。用药后单笼饲养，正常提供饮食和水。5)24h第4次用药30分钟后立即取创面周围3mm皮肤组织，剪碎后置于液氮中，存于-80℃冰箱中WB备用。
2.1.2AG1478对小鼠皮肤创面影响实验：1)将C57小鼠背部皮肤按上述方法制造左右两个对称的全层皮肤缺损创面，共10只。2)应用气体麻醉下，按照上述方法创面使用AG1478(浓度为500μM)，每日两次，单笼饲养。3)分别于0d、1d、3d、5d、7d观察创面愈合情况，放置标尺，固定相机高度采集不同时间点创面照片。4)于7d处死小鼠，取创面标本，用锡箔纸包好后立即存于-80冰箱中，注意让让创面充分展平，勿牵拉导致创面变形，备用冰冻切片HE染色及免疫染色，观察创面上皮爬行。
2.2转基因小鼠的鉴定
2.2.1小鼠鼠尾DNA的提取：1)小鼠出生1周左右用剪刀剪掉根脚趾和在耳朵上标记进行编号，剪取约1mm鼠尾组织置于1.5mL EP管中，每剪完一只小鼠用75％酒精消毒清洗剪刀，同时注意避免污染，并标示清楚，以免混淆。2)每个EP管中加入450μL的裂解液和10μL的蛋白酶K，剧烈震荡混匀，50℃水浴直至小鼠鼠尾被完全消化。3)充分混匀后离心分钟12000rcf，5min，取400μL上清移入己标一记样品号的清洁EP管中，加入400μL的氯仿、苯酚及异戊醇混合物，震荡混匀离心分离水相机和有机相18000rcf，10min。4)转移上层水相至一新的EP管中。5)加入等体积的异丙醇沉淀DNA，然后18000rcf，15min。6)小心甩去除异丙醇，加入500μL的75％的乙醇，18000rc璃心，5min。7)小鼠去除75％乙醇，离心管置于无菌操作台中干燥。加入的双蒸水，用枪头吹打混匀。
2.2.2PCR技术鉴定小鼠基因型
1)基因引物序列
Figure BDA0003264059890000101
2)按如下配制PCR反应体系
Figure BDA0003264059890000102
Figure BDA0003264059890000111
3)按如下条件进行PCR反应
Figure BDA0003264059890000112
4)称取一定量的琼脂糖，1×TAE加热溶液配制1.3％的凝胶，并插入上样梳凝胶冷却30min。5)将配制好的琼脂糖凝胶上样梳拔除后，放入1×TAE电泳缓冲液中，10μL/孔，180伏恒压电泳20min。6)在紫外成像仪中扫描成像，并根据条带的大小确定对应的基因型。
2.3ErbB4敲除小鼠皮肤全层缺损创面模型实验：1)准备WT和ErbB4+/-雌性小鼠各25只，8-10周龄，体重18-25g2)按上述方法术前一天用薇婷脱毛膏进行脱毛，单笼饲养，3)按上述方法在小鼠背部皮肤制造左右两个对称的直径为6mm全层皮肤缺损创面。4)术后第0、1、3、5、7天进行拍照记录创面愈合情况。使用小型气体动物麻醉机进行异氟烷气体麻醉下，小鼠旁放置直尺做标尺，数码相机固定在一定高度进行拍照记录，注意拍照时确保拍照角度同时垂直于创面和标尺。创面愈合率＝(原始创面面积-现有创面面积)/原始创面面积×100％。5)分别在d1、d3、d5、d7各个时间点处死小鼠(n＝5)，收集创面标本，避免创面牵拉变形，存于-80℃冰箱，记好标本类型，备用冰冻切片HE染色及免疫荧光染色。
2.4HE染色实验：1)将实验组和对照组皮肤创面组织，于恒温冰冻切片机中包埋在OCT中，切片，一半存于-80℃冰箱免疫荧光染色备用，一半进行HE染色，切片厚度为12μm，用载玻片直接贴片法进行贴片，奇数的切片存于-80℃冰箱中，偶数切片进行HE染色。2)后续操作为常规步骤，在此不在赘述。
2.5鼠源性NRG1过表达质粒的构建及效率验证实验
2.5.1质粒设计及构建：我们在GenBank中查询鼠源性的NRG1 β1α全长基因(GenBank登录号NM-001364421.1)序列，化学合成携带有全长鼠源性NRG1基因cDNA序列的质粒，以cDNA为模板通过PCR扩增出NRG1基因cDNA序列。再将NRG1基因的cDNA克隆于载体rAAV-CMV-3*flag-3*HA-IRES-mcherry，获得重组质粒rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry(武汉枢密科技公司合成)。
2.5.2感受态细胞的制备：1)在感受态DH5α受体菌株接种E.coli。2)次日，挑选一个单独的菌落加入1mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中的摇床上进行培养过夜，转速为220rpm。3)12h后将培养皿从37℃的培养箱中拿出，在100ml的LB液体培养基中进行转接进行培养，在37℃的培养箱中进行剧烈振荡培养约2～3h，转速为300rpm。4)0.1M的Ca C12溶液在冰上提前预冷，然后进行如下的操作，取1.5m L的培养菌液加入2mL离心管，置于冰上进行冷却10min。5)配平后以进行冷冻离心，转速3000g，5min。6)弃除上清，然后加入100μL提前预冷过的0.1M Ca Cl2溶液，并用移液枪轻轻吹打混匀，使得细胞重新悬浮，混匀后置于冰上冷却20分钟；7)离心：转速3000g，4℃，5分钟。8)丢弃上清，再加入提前预冷的0.1MCa Cl2溶液100μL，用移液枪轻轻吹打混匀，使细胞重新悬浮。9)上述所得到的细胞悬浮液冷冻贮存在超低温冰箱中，或立即用于质粒转化实验。
2.5.3转化感受态细菌DH5α：1)在感受态细菌DH5a中加入10μL的连接产物，用移液枪进行吹打混匀后，置于冰上进行冷却30min。2)将上述混合的连接产物在42℃的水中进行水浴90s，立即置于冰上进行冷却。3)将上述连接产物加入1mL无抗体的LB液体培养基中，在37℃的培养箱中进行振荡孵育培养60min。4)将上述培养菌液进行高速离心，转速为1000g，1min，弃除大部分上清液，混匀剩余的小部分上清和沉淀的菌体，然后含有抗生素的L B培养基上使用涂菌棒均匀涂布，自然晾干待菌液干燥后，在37℃的恒温培养箱中倒置培养12h。5)挑出上述转化完成后较大的阳性克隆菌株，在PCR管中加入10μLLB培养液的并吹打混匀，抽取1μL混合液使用rTaq酶(Takara公司)进行PCR鉴定，鉴定总体系20μL如下。
Figure BDA0003264059890000121
6)吸取8μL剩余的阳性克隆菌液，并将其转接于带有抗性的6mL LB液体培养基中，在37℃培养箱中的摇床上进行小摇培养12h，转速220rpm。7)次日，抽取小摇的一小部分溶液进行测序，将等体积的80％甘油加入剩余的一小部分混匀后冻存于超低温冰箱里保种，对剩余的大部分混合液进行质粒抽提。
2.5.4质粒抽提：1)在400mL含有抗性的LB液体培养基中加入上述测序正确的质粒的菌株，在37℃培养箱中的摇床中培养12h。2)次日，用离心瓶收集上述菌液，然后用超高速离心机进行低温(4℃)离心7min，以7000g的转速，弃除上清。3)加入P1溶液10mL进行溶解菌体沉淀，并振荡混匀，待菌块完全消失后，加入P2溶液10mL，轻轻上下颠倒进行混匀使得细菌充分裂解，可看到液体呈现蓝色，5min后加入的10mL P3溶液，待蓝色消失后立即置于冰上进行孵育20min使得蛋白沉淀析出。4)配平后在超高速离心机离心，4℃离心，转速12000g，30min。5)提前将过滤柱装好，并加入的QBT溶液10mL平衡过滤柱柱子1次。6)将离心后的上清液加到过滤柱中过滤，然后每次加入30m L QC进行清洗过滤完后的柱子，一共进行2次。7)将含有质粒的柱子转移离心管(50mL)上，对质粒收进行集用，用QF(15mL)进行洗脱质粒。
2.5.5HEK 293细胞验证NRG1过表质粒效率验证实验：1)感染前1天，将人的HEK293细胞以合适的密度传代在孔板中。2)第2天，当细胞的汇合率达到约70％时，进行质粒转染，将NRG1过表达质粒(rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry)和对照质粒(rAAV-CMV-mcherry)结合脂质体转染的方法转入HEK293细胞内，分成NRG1-OE和Control组，继续培养24小时。3)24h后，在荧光显微镜下通过观察表达红色荧光的强度和细胞的数目来判断质粒转染的效率。4)用1.5×loading裂解细胞组织，然后提取细胞总蛋白。5)WesternBlot检测control和NRG1-OE中HA及NRG1蛋白表达情况。
2.6皮肤电转实验：1)实验分为两组：对照组(Control)和NRG1过表达实验组(NRG1-OE)，实验前2天按上述方法小鼠脱毛备皮(n＝10)，小鼠分开单笼饲养，注意保暖。2)实验日，用5％的水合氯醛腹腔注射(0.01ml/g)麻醉后。3)设置电转参数为100V，持续时间为10ms，间隔1s。4)用75％的酒精对小鼠背部皮肤进行消毒，用29G胰岛素针头在小鼠背部皮肤左侧皮肤皮内注射(Intra-dermal)对照质粒(rAAV-CMV-mcherry，1μg/μL)，对照小鼠的左侧A点注射对照质粒(rAAV-CMV-mcherry)50μl，注射过程不少于5秒钟，避免溶血性性转染，用marker笔画出皮肤将注射范围进行标记。5)注射质粒后2min，让质粒充分浸润皮肤，助手将小鼠背部皮肤沿着小鼠背部皮肤中线提起，将皮肤电极板(1cm×1cm)均匀涂抹导电膏，正极版对准质粒注射区域将皮肤夹住，两电极板之间的距离为4mm，按照以上设置的参数进行。6)电转结束后，用75％酒精清洗电极板，在小鼠背部左侧皮肤皮内注射过表达质粒(rAAV-CMV-3*flag-Nrg1-3*HA-IRES-mcherry)50μL，用同样的方法进行左侧皮肤电转NRG1过表达质粒。7)皮肤电转结束后，单笼饲养，注意保暖，48小鼠后活体成像仪观察皮肤内红色荧光的表达情况，观察皮肤质粒电转效率。8)活体成像仪确认皮肤电转成功后，用5％的水合氯醛麻醉腹腔注射麻醉成功后，助手沿着背部提起小鼠背部皮肤，将皮肤打孔器对着电转区域的皮肤区域制造直径约6mm的全层缺损创面，注意避免偏移，将皮肤打孔下来的皮肤组织收集置于-80冰箱保存，Westernblot备用。9)术后第0、1、3、5天用相机进行拍照收集创面照片。10)将制造创面后的小鼠单笼饲养。11)收集实验组(NRG1-OE)和对照组(Control)的小鼠术后底天的创面标本，冰冻切片备用。12)HE染色步骤同2.5(n＝5)。13)皮肤免疫组织荧光实验步骤同实施例1。
2.7Western blotting实验：具体操作见实施例1。
3实验结果
3.1NRG1对皮肤全层缺损创面愈合的影响
3.1.1NRG1过表达质粒在293T细胞中过表达的结果
上一部分实验结果表明了皮肤损伤显著激活了皮肤中的ErbB4信号通路。因此，我们拟通过在皮肤中过表达NRG1来激活皮肤中的ErbB4信号通路，观察其对皮肤创面愈合的影响。首先我们构建全长鼠源性NRG1基因的cDNA序列的质粒，将NRG1过表达质粒(NRG1-OE)和携带空载的质粒作为阴性(Control)对照结合脂质体转染的方法共同转入HEK293细胞内，通过荧光显微镜、Western Blot进行评估质粒转染及过表达效率，结果如图5所示：NRG1过表达质粒及对照质组质粒转染24h后，在荧光显微镜下观察到Control组293细胞中表达红色荧光，NRG1-OE组的荧光相对较弱，实验组和对照组几乎100％的细胞表达红色荧光(图5-B)。应用WesternBlot检测Control及NRG1-OE处理的293T细胞中HA标签蛋白可在110KD处检测到NRG1前体蛋白和70KD处的胞内段(图5-C)，而Control组中未监测到HA标签蛋白。这一结果与Vullhors等的应用该质粒在神经元细胞中的过表达后检测的结果相一致。应用NRG1的抗体检测同时NRG1在蛋白水平的表达升高(图5-D)。
3.1.2在体皮肤电转NRG1过表达质粒的结果
上述实验中，我们在293T细胞上证实构建的NRG1质粒可以成功过表达NRG1蛋白，接下来我们需要验证使用皮肤电转是否可将NRG1过表达质粒转入皮肤细胞中并使皮肤局部组织中NRG1蛋白过表达。我们通过C57小鼠随机分为实验组(NRG1-OE)和对照组(Control)，皮内注射注射50μL质粒，应用皮肤电转移技术将质粒转入皮肤组织，皮肤电转术后48小时我们进行活体成像实验，验证皮肤电转移技术能否成功将质粒转入皮肤组织及细胞。结果如图(6A-B)所示；皮肤电转48小时后皮内注射过表达实验组(NRG1-OE)及对照质粒组(Contro1)，可观察到局部皮肤有红色荧光蛋白表达。接下来我们需要验证成功将过表达质粒转入的质粒能否达到过表达皮肤组织中NRG1蛋白，我们将皮肤电转后48小时的电转区域的皮肤提取蛋白后行Western Blot检测组织中HA标签蛋白标记的NRG 1(HA-NRG1)及NRG1蛋白的表达水平，NRG1-OE组可检测到HA标签蛋白，对照组未能检测到HA标签蛋白(图6-C)，NRG1-OE与对照组(Control)相比，皮肤中的NRG1的表达水平显著升高(图6-D)，上述结果说明，应用皮肤电转移技术可以让皮肤组织成功过表达NRG1蛋白。
3.1.3NRG1过表达对皮肤全层缺损创面愈合的影响
我们用皮肤打孔器在在皮肤电转过表达质粒的皮肤区域制造直径约为6mm的全层皮肤缺损创面，在术后第0、1、3、5天采用相机拍照记录创面大小，用ImageJ测量各个不同时间点小鼠背部皮肤创面面积，创面愈合率＝(最初创面面积-未愈合创面面积)/最初创面面积)×100％，根据公式计算NRG1-OE组和Control对照组小鼠在各个不同时间点的创面愈合率，上述实验重复3次，得出的数据进行统计分析，结果如图7-A所示：随着时间的推移两组创面面积均逐渐缩小，其中NRG1-OE组创面愈合速度较对照组快，计算各个不同时间点的创面愈合率，结果如图7-B所示，两组皮肤创随着时间推移逐渐缩小，第5天NRG1-OE组的创面基本完全愈合，NRG1-OE组在术后第3、5天创面愈合率高于对照组，术后第5天对照组和NRG1-OE组的创面愈合率分别为81.3％和95％，以上差异均具有统计学意义。
上述实验结果表明局部过表达NRG1可促进皮肤创面的愈合，我们收集术后d5创面标本进行病理组织冰冻切片并行HE染色及Krt14染色验证上述结果。结果如图8所示：术后第5天过表达NRG1组创面以全部上皮化，而实验组仍有少部分未完全上皮化(图8-A)，实验组创面上皮爬行速度明显低于对照组，差异具有统计学意义(图8-B)。
3.2阻断ErbB4信号通路对皮肤全层缺损创面愈合的影响
3.2.1AG478抑制ErbB4的磷酸化活性对皮肤创面愈合的影响
上述实验结果表明，在皮肤中过表达NRG1可促进皮肤创面愈合，那么阻断皮肤中的ErbB4信号通路是否会导致皮肤创面愈合延迟呢？为了回答这一问题，我们在皮肤中应用AG1478抑制皮肤中的ErbB4磷酸化活性，首先我们需要验证AG1478是否可特异性抑制皮肤创缘组织中ErbB4的活性水平，我们在C57小鼠背部皮肤制造四个直径为6mm皮肤全层缺损创面，将药物或DMSO混匀于K-Y凝胶中制备成500μM的浓度，局部应用DMSO(500μM)的创面作为对照，局部应用AG1478(500μM)和AG879(500μM)作为实验创面(如图9-A)，2次/日，第1天最后一次用药后30分钟收集创面周围3mm皮肤组织进行Western Blot检测NRG1和p-ErbB4。结果如图9-B显示：皮肤损伤后第1天皮肤创缘组织中的NRG1均显著增高，与我们第一部分的实验相一致，应用ErbB4受体抑制剂AG1478可导致皮肤创缘中的p-ErbB4显著降低，而ErbB2受体抑制剂AG879对皮肤创缘组织中的p-ErbB4表达未见明显影响，因此创面局部应用AG1478(500μM)可特异性抑制皮肤创缘中ErbB4磷酸化水平，阻断皮肤创缘中的ErbB4信号通路。接着我们建立小鼠背部全层皮肤缺损创面，左侧为DMSO对照侧，右侧为AG1478(500μM)或者AG879(500μM)，术后创面局部用药2次/日，术后第0、1、3、5、7天分别用相机拍照记录创面面积，结果显示：AG1478组的皮肤创面愈合时间明显延迟，第7天仍未完全愈合(图9-C)。按上述方法用ImageJ软件计算用药组和对照组各时间点的创面愈合率，结果如图9-D所示：AG879用药组与对照组相比，创面愈合率无明显差别。AG1478用药组在第3、5、7天的创面愈合率较对照组明显降低，对照组和AG879组创面第7天对照组创面愈合率分别为95％和92％，而AG1478(500μM)组术后第7天的创面愈合率为87.5％，以上实验结果表明抑制皮肤中的ErbB4磷酸化活性会导致皮肤创面愈合延迟。
上述实验结果抑制皮肤中的ErbB4磷酸化活性会导致创面愈合延迟，为了验证上述统计结果，我们收集对照组及用药组术后d7创面标本进行冰冻切片并行HE染色及Krt14染色观察各时间点创面上皮爬行长度，用ImageJ测量统计分析。结果如图10所示：术后第7天对照组创面以全部上皮化，而AG1478组仍然未完全上皮化(图10-A)，AG1478组创面上皮爬行速度明显低于对照组，差异具有统计学意义(图10-B)。
3.2.2转基因小鼠的ErbB4敲除效率验证结果
上述实验结果表明在抑制皮肤中的ErbB4信号通路会导致皮肤创面愈合延迟，但是药理实验存在浓度依赖的非特异性，为了屏蔽药理学实验的局限性和副作用，增加实验的特异性，我们进一步使用ErbB4敲除小鼠进行研究，因ErbB4敲除纯合子因为心脏发育障碍容易胚胎致死而难以获得，本部分实验我们使用ErbB4+/-进行实验。我们首先应用Genotyping技术对ErbB4+/-小鼠进行基因鉴定，在ErbB4-f/ErbB4-r引物的作用下，杂合子(ErbB4+/-)均能扩增出320bp和150bp的两条带，而野生型小鼠只能扩增出一条150bp的条带(图11-A)。应用Western Blot进一步证实ErbB4在ErbB4+/-小鼠中的敲除效果，结果显示与WT相比ErbB4+/-小鼠皮肤中的ErbB4蛋白表达显著降低(图11-B)。为了观察敲除ErbB4对皮肤外观及结构的影响，我们对WT与ErbB4+/-小鼠的皮肤毛发外观进行观察，结果显示如图11-C所示：ErbB4杂合子存活良好，与野生型小鼠相比，皮肤毛发外观未见明显异常，为明确ErbB4敲除对皮肤形态结构的影响，我们对野生型小鼠相比ErbB4+/-小鼠皮肤切片后进行HE染色，结果如图11-D所示：ErbB4+/-小鼠皮肤结构未见明显异常，皮肤和脂肪厚度无明显差异，皮肤毛囊结构的观察，两者毛囊排列方向上未见明显差异。
3.2.3ErbB4敲除对皮肤全层缺损创面愈合的影响
上述实验结果表明，应用药理学方法在皮肤中抑制ErbB4信号通路会导致皮肤创面愈合延迟，为了进一步明确ErbB4信号在皮肤创伤修复过程中的作用，我们观察ErbB4基因敲除对皮肤创面愈合的影响，我们按照2.2的方法在实验组ErbB4+/-小鼠(n＝25)和野生型小鼠组(n＝25)的背部皮肤制造左右对称的直径为6mm皮肤全层缺损创面，在术后第0、1、3、5、7天在气体麻醉下使用相机采集小鼠备皮皮肤创面的照片，计算不同时间点皮肤创面愈合率的情况。结果如图12所示：实验组和对照组左侧层创面在总体上随着时间的推移，各组创面面积均逐渐减小，其中在第7天对照组的创面几乎完全愈合，而实验组仍有少部分创面未完全愈合(图12-A)。实验组在术后第3、5、7天创面愈合率低于对照组，第5天两组间的创面愈合率差异最为显著，实验组的创面愈合率为85％，对照组的创面愈合率为72％(图12-B)，上述差异均具有统计学意义。
上述实验中，我们发现实验组(ErbB4+/-)小鼠术后第3、5、7的创面愈合率低于野生型对照小鼠，为进一步验证上述结果，我们观察实验组和对照组在创面不同时间点上皮爬行情况，在第1、3、5、7天各个时间点处死小鼠(n＝5)后收集创面及创缘皮肤标本进行冰冻切片，HE染色后用EV OS II代显微镜在10x下进行拼图，并选择典型的切片进行Krt14免疫荧光染色，两位独立不知情的观测者采用NIH ImageJ图像分析软件测量创面上皮的迁移的长度，结果如图13-A所示，HE染色及Krt14免疫荧光染色均显示随着时间进行，两组皮肤创面创缘新生上皮向创面中心不断爬行，术后第3、5、7天实验组的上皮爬行长度较对照组明显延迟，第7天时对照组上皮化全部覆盖创面，实验组仍有部分创面无上皮覆盖，上皮爬行长度进行测量统计分析，结果如图显示示：在术后第3、5、7天，实验组上皮爬行长度显著低于对照组(图13-B)，差异具有统计学意义，与上述创面愈合率的结果相一致。
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003264059890000181
Figure BDA0003264059890000191
序列表
<110> 申请单位名称 广西医科大学
<120> 神经调节素1促进皮肤创面修复的方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> NRG1的基因序列()
<400> 1
gttcgttgca acaaattgat gagcaatgct tttttataat gccaactttg tacaaaaaag 60
ttggcatgga gatttattcc ccagacatgt ctgaggtcgc cgccgagagg tcctccagcc 120
cctccactca gctgagtgca gacccatctc ttgatgggct tccggcagca gaagacatgc 180
cagagcccca gactgaagat gggagaaccc ctggactcgt gggcctggcc gtgccctgct 240
gtgcgtgcct agaagctgag cgcctgagag gttgcctcaa ctcagagaaa atctgcattg 300
tccccatcct ggcttgcctg gtcagcctct gcctctgcat cgccggcctc aagtgggtat 360
ttgtggacaa gatctttgaa tatgactctc ctactcacct tgaccctggg gggttaggcc 420
aggaccctat tatttctctg gacgcaactg ctgcctcagc tctgtgggtg tcgtctgagg 480
catacacttc acctgtctct agggctcaat ctgaaagtga ggttcaagtt acagtgcaag 540
gtgacaaggc tgttgtctcc tttgaaccat cagcggcacc gacaccgaag aatcgtattt 600
ttgccttttc tttcttgccg tccactgcgc catccttccc ttcacccacc cggaaccctg 660
aggtgagaac gcccaagtca gcaactcagc cacaaacaac agaaactaat ctccaaactg 720
ctcctaaact ttctacatct acatccacca ctgggacaag ccatcttgta aaatgtgcgg 780
agaaggagaa aactttctgt gtgaatggag gggagtgctt catggtgaaa gacctttcaa 840
acccctcgag atacttgtgc aagtgcccaa atgagtttac tggtgatcgc tgccaaaact 900
acgtaatggc cagcttctac agtacgtcca ctccctttct gtctctgcct gaatacccaa 960
ctttcttgta caaagttggc attataagaa agcattgctt atcaatttgt tgcaacgaac 1020
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggaaatgg acagcaaccc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttctgtatg cccaggaatg gt 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actacccaca cctagttcgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgccagatc ccgatgaaca 20

Claims (2)

1.一种NRG1蛋白在制备皮肤创面修复药物或试剂中的应用，其特征在于，所述的药物或试剂为提高NRG1表达量的药物或试剂，所述的提高NRG1表达量的药物或试剂包含：（1）NRG1及其编码基因，（2）含有NRG1编码基因的重组载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的提高NRG1表达量的药物或试剂包含重组载体rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry，所述的rAAV-CMV-3*flag-NRG1-3*HA-IRES-mcherry是通过皮肤电转导入皮肤。
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神经调节因子-1（Nrg1）激活Nrg1-ErbB信号转导并促进小鼠脊髓损伤修复的研究;姚伟城等;《中国当代医药》;20160430;第23卷(第11期);第4-7页 *

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