CN117618570A

CN117618570A - eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物中的应用

Info

Publication number: CN117618570A
Application number: CN202311556796.4A
Authority: CN
Inventors: 徐广超; 汪小燕; 黄广涛; 魏亚婷; 邓嘉雯; 木兰; 尹美芳; 吴军
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2023-11-21
Filing date: 2023-11-21
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物中的应用。本发明提供了eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用；提供一种eIF6基因及其蛋白在制备调控KRT6B基因表达量药物的应用；还提供一种eIF6基因及其蛋白在制备调控角质形成细胞增殖药物的应用。本发明为促进皮肤组织损伤修复开辟新的途径，为制定调节eIF6表达和/或活性以治疗伤口愈合疾病的策略提供重要的基础。

Description

eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物中的应用。

背景技术

皮肤是外界的重要屏障，皮肤内稳态对维持屏障功能至关重要。一旦体内平衡失衡，各种外因损伤因素、内因疾病将导致皮肤组织损伤并引起创伤发生。复杂伤口正在成为一个全球性问题，大面积烧伤伤口和慢性不愈合伤口不仅难以修复，还会导致感染、截肢甚至死亡，损害人类健康，因此成为家庭和社会的沉重负担。尽管有许多关于伤口愈合和治疗的研究，但其疗效有限。因此，探索皮肤创面愈合方法，寻找新的治疗靶点促进创面愈合具有重要意义。

真核生物翻译起始因子6(Eukaryotic translation initiation factor 6,eIF6)作为起始因子在调节核糖体生物发生和翻译、维持多个器官和系统的稳态、参与调节细胞能量代谢、组织发育和肿瘤发生，例如，现有技术专利“eIF6在调控黑色素合成中的用途”中公开了eIF6在调控黑色素合成、改善毛发色泽的药物中的用途等。然而，目前仍无eIF6在调控皮肤组织创面愈合方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的问题，提供一种eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用；

本发明的另一目的在于提供一种eIF6基因及其蛋白在制备调控KRT6B基因表达量药物的应用；

本发明的另一目的在于提供一种eIF6基因及其蛋白在制备调控角质形成细胞增殖药物的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用，所述eIF6的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述eIF6的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

SEQ ID No.1：

MAVRASFENNCEVGCFAKLTNAYCLVAIGGSENFYSVFEGELSDAIPVVHASI

AGCRIIGRMCVGNRHGLLVPNNTTDQELQHIRNSLPDSVQIRRVEERLSALGN

VTTCNDYVALVHPDLDRETEEILADVLKVEVFRQTVADQVLVGSYCVFSNQ

GGLVHPKTSIEDQDELSSLLQVPLVAGTVNRGSEVIAAGMVVNDWCAFCGLDTTSTELSVVESVFKLNEAKPSTIATSMRDSLIDSLT；

SEQ ID No.2：

atggcggt cagagcgtcg ttcgagaaca actgtgaggt cggttgtttt gccaaactcacaaacgccta ctgcctggtg gccatcggag gctcagagaa cttctatagt gtgttcgagg gtgagctctccgatgccatt cccgtggtgc acgcatccat cgccggctgc cgaatcatcg ggcgcatgtg tgtggggaacaggcatgggc tcctggtacc caacaacacc accgaccagg agctgcagca catccgcaac agcctgcctgactccgtgca gatacggcgg gtggaggagc ggctctcggc ccttggcaat gtcaccacct gcaatgactatgtggccttg gtccacccag acttggacag ggagacagaa gagatcctgg ctgatgtcct caaggtggaagtcttcagac agacagttgc tgaccaggtg ctagtaggaa gctactgtgt cttcagtaat cagggggggctggtgcaccc taaaacttct atcgaggacc aggatgagtt gtcctccctt cttcaggtcc cccttgtggcaggcactgtg aaccgaggga gtgaggtgat tgctgctggg atggtggtga acgattggtg tgctttctgtggtctggaca cgaccagcac ggagctgtca gtggtggaga gcgtcttcaa gctgaatgaa gccaagccaagtaccattgc caccagcatg cgggattccc tcattgacag cctcacatga。

进一步地，所述皮肤组织创面为由一种或多种损伤因素导致，包括刀割、针刺、灼烧、烫伤。

优选地，所述皮肤组织创面为由一种或多种损伤因素导致，包括刀割、化学烧伤。

本发明通过构建C57BL/6小鼠皮肤全层缺损创面模型、SD大鼠皮肤化学烧伤模型，创新的提出了利用eIF6负调控皮肤组织创面愈合进程，特别是在创面愈合早期，本发明适用于由一种或多种损伤因素导致的皮肤组织创面，包括刀割、针刺、灼烧、烫伤等。

优选地，调控皮肤组织创面愈合的靶细胞位于角质形成细胞。

一种eIF6基因及其蛋白在制备调控KRT6B基因表达量药物的应用，所述eIF6氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明利用eIF6敲除(KO)小鼠和eIF6条件敲除(CKO)小鼠的角质形成细胞和成纤维细胞全层皮肤创面，控制eIF6基因及其蛋白，可调控KRT6B基因的表达量，且由此调控皮肤组织创面愈合速度。

进一步的，KRT6B基因的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示、核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示：

SEQ ID No.3：

MSTKTTIKSQTSHRGYSASSARVPGLNRSGFSSVSVCRSRGSGGSSAMCGGAG

FGSRSLYGVGSSKRISIGGGSCGIGGGYGSRFGGSFGIGGGAGSGFGFGGGVGF

GGGYGGAGFPVCPPGGIQEVTINQNLLTPLNVQIDPTIQRVRTEEREQIKTLNN

KFASFIDKVRFLEQQNKVLDTKWALLQEQGTKTVRQNLEPMFEQYISNLRRQ

LDSIIGERGRLDSELRNMQDTVEDYKSKYEDEINKRTKAENEFVTVKKDVDA

AYMTKVELQAKADSLADEINFLRVIYEAELSQMQTHISDTSVVLSMDNNRSL

DLDSIIAEVKAQYEDIAQRSRAEAESWYQTKYEELQVTAGRHGDDLRNTKQE

IAEINRMIQRLRSEIDHVKKQCANLQAAIADAEQRGEMALKDARGKLEGLED

ALQKAKQEMARLLKEYQELMNVKLALDVEIATYRKLLEGEECRLNGEGVGP

VNISVVQSTVSSGYGSAGGASSSLGLGGSSSYSYGSSHGLGGGFSAGSGRAIGGGLSSSGGLSSSTIKYTTSASSSRKSYRH；

SEQ ID No.4：

atgtctacca aaaccaccat caagagtcaa actagccacc gtggctacag tgccagctcagccagagtgc ctgggctcaa ccgctctggc ttcagcagtg tgtccgtgtg ccgctcccgg ggcagcggtggctccagtgc aatgtgtgga ggagctggct ttggcagcag gagcctctat ggtgtgggga gctccaagaggatctccatc ggagggggca gctgtggcat tggaggaggc tatggcagcc gatttggagg aagcttcggcattggaggtg gagctggtag tggctttggc ttcggtggtg gagttggctt tggtggtggc tatggcggagctggcttccc ggtgtgcccc cctggaggca tccaagaggt caccatcaac cagaacctcc tcacccctctgaacgtgcaa atcgacccca ccatccagcg ggtcaggact gaggagaggg agcagatcaa gaccctcaacaacaagtttg cctccttcat cgacaaggtc cggttcctgg agcagcagaa caaggtcctg gacaccaagtgggccctgct gcaagagcag ggcaccaaga ccgtgaggca gaacctggag cctatgtttg agcagtacatcagcaacctc cgcagacagc tggacagcat cattggagag aggggtcgcc tggactcaga gctgaggaacatgcaggaca cagtggagga ctacaagagc aaatatgaag atgaaatcaa caagcgtaca aaagcagagaatgaatttgt aaccgtgaaa aaggatgtag atgctgccta catgaccaag gttgaactgc aagccaaggcagatagtctt gcagacgaga tcaacttcct gagagttatt tatgaggcag aactgtctca gatgcaaactcacatctcag acacatctgt ggtcctctcc atggacaaca accgtagcct ggacctggac agcatcatcgctgaggtcaa ggcccagtat gaggacattg ctcagagaag tcgggctgaa gctgagtcct ggtaccagactaaatatgag gagctgcagg tcacagctgg cagacatggg gacgacctgc gcaacaccaa gcaggagattgctgagatca accgcatgat ccagaggctg agatctgaga tcgaccacgt taagaagcag tgtgccaacctgcaagctgc tattgctgat gctgagcaac gtggggagat ggccctgaag gatgccaggg gcaagctggaagggctggag gatgccctgc agaaggccaa acaggaaatg gccaggctgc tgaaggagta ccaggaactcatgaatgtca agctggccct ggatgtggaa attgccacct acaggaagct gctggaagga gaggagtgcaggttgaatgg tgaaggtgtt ggaccagtca acatctctgt ggtgcagtcc accgtgtcca gcggctatggcagtgccggg ggtgccagca gcagcttagg cctgggtgga agcagcagct actcctatgg cagcagccatggccttggag gtggcttcag tgctggcagt ggcagagcca tcggaggtgg cctcagctct tctggtggcctcagctcttc caccatcaaa tacaccacca gcgcctcctc cagcaggaag agctacaggc actga。

一种eIF6基因及其蛋白在制备调控角质形成细胞增殖药物的应用，所述eIF6氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明检测eIF6角质形成细胞条件性敲除小鼠表皮中的Ki67表达以了解角质形成细胞的增殖情况，通过测量创面HE染色切片中新生表皮厚度评测角质形成细胞激活周期。通过CCK8试验检测eIF6敲低稳转HaCaT细胞株的增殖能力。证实eIF6可通过调控KRT6B基因表达量，促进细胞增殖，加速皮肤组织创面愈合的进程。

与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：

本发明创新地提供了eIF6基因及其蛋白的应用。eIF6负调控皮肤组织创面愈合进程，并且在基底层相关角质形成细胞中敲除eIF6可以显著促进皮肤创面愈合进程。角质形成细胞中敲低eIF6后，加速了角质形成细胞的激活周期，通过高表达KRT6B促进细胞增殖，加速皮肤组织创面愈合的进程。总的来说，本发明eIF6基因及其蛋白的应用，角质形成细胞中eIF6的下调通过上调KRT6B的表达和促进角质形成细胞的增殖来加速皮肤伤口的修复，为促进皮肤组织损伤修复开辟新的途径，为制定调节eIF6表达和/或活性以治疗伤口愈合疾病的策略提供重要的基础。

附图说明

图1：A为免疫组化检测小鼠全层缺损创面愈合过程中的eIF6蛋白水平半定量统计分析；B为免疫组化检测小鼠全层缺损创面愈合过程中的eIF6表达情况(D0、D3、D5、D7、D10分别表示正常皮肤、伤后3、5、7、10天)；

图2：大鼠化学烧伤模型建立；A为大鼠滤纸氢氧化钠模型造创后当天(D0)和第3天(D3)创面大体图；B为HE染色检测大鼠化学烧伤后第三天创面烧伤程度；C为免疫组化检测大鼠化学烧伤创面愈合过程中的eIF6表达情况(D0、D3、D5、D16分别表示正常皮肤、伤后第3、5、16天)。

图3：eIF6敲除后创面愈合加快；A为WT和eIF6^+/-小鼠创面修复大体图；B为创面愈合率定量分析；C为WT和eIF6^+/-小鼠第10天创面愈合距离统计分析(migration distance定义为创面初始直径10mm与wound gap之差)；D为WT和eIF6^+/-小鼠第10天创面HE染色代表性图片(浅色虚线标注区域为增值的上皮，实线箭头标注为增值上皮终点，虚线双箭头标注为未上皮化区域，即wound gap，比例尺为500μm)；

图4：eIF6角质形成细胞条件性敲除小鼠创面愈合加快；A为eIF6^f/+；Krt5-Cre^-和eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠创面修复大体图：B为创面愈合率定量分析；C为eIF6^f/+；Krt5-Cre^-和eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠第5天创面HE染色代表性图片(三角箭头分别标注为增值的上皮终点和增值上皮起点，虚线标记基底膜，实线箭头标记距离为上皮迁移距离，即migrationdistance ofkeratinocytes，比例尺为250μm)；D为eIF6^f/+；Krt5-Cre^-和eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠第5天创面上皮化距离统计分析；

图5：eIF6角质形成细胞条件性敲除小鼠皮肤中KRT6B水平升高；A为蛋白免疫印迹检测eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠皮肤中KRT6B水平；B为eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠正常皮肤中KRT6B蛋白半定量统计；C为组织免疫荧光染色检测eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠皮肤中KRT6B表达部位与水平；D为eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠正常皮肤中KRT6B荧光强度半定量统计分析；

图6：干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO图谱；

图7：eIF6敲低稳转HaCaT细胞株中KRT6B表达下调；A为eIF6敲低细胞株KRT6B细胞免疫荧光染色(比例尺为20μm)；B为eIF6敲低细胞株KRT6B细胞免疫荧光强度半定量统计分析；C为eIF6敲低细胞株KRT6B蛋白免疫印迹检测；

图8：eIF6敲低稳转HaCaT细胞株增值能力增强，eIF6敲低稳转HaCaT细胞株的CCK8在450nm的OD值统计分析；

图9：eIF6角质形成细胞条件性敲除小鼠Ki67阳性细胞个数显著增加；A为组织免疫组化检测eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠表皮Ki67阳性细胞；B为eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠表皮中Ki67阳性细胞统计分析。(星号为Ki67阳性细胞，比例尺为50μm)；

图10：eIF6角质形成细胞条件性敲除小鼠创面角质形成细胞激活周期加快；A为eIF6^f/+；Krt5-Cre^-和eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠伤后第3、5、10天创面HE染色代表性图片(浅色虚线标记为增殖上皮，比例尺为250μm)；B为eIF6^f/+；Krt5-Cre^-和eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠创面愈合过程中的新生上皮厚度统计。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

一、小鼠皮肤全层缺损创面制造及皮肤样本采集

1、对实验小鼠采用异氟烷吸入麻醉；

2、用剃毛刀剔除小鼠背部毛发；

3、创面造模：75％酒精消毒背部皮肤，采用动物创面造模打孔器及剪刀在背部正中制造全层皮肤缺损创面(直径10mm)；

4、按照既定时间点取材小鼠皮肤创面组织并采用液氮暂存后保存于-80℃或直接4％PFA固定液固定以待后续实验；

5、按时间点使用数码相机记录创面愈合情况，创面大体图愈合率统计分析采用Image J软件，t时刻的创面愈合率(wound healing rate)按照以下公式进行计算:

Woundhealing rate(％)＝(A₀-A_t)/A₀×100％

其中A₀表示初始创面面积，A_t表示t时刻创面面积。

二、组织石蜡切片制备

待皮肤组织固定24小时后冲水过夜并后续行梯度酒精脱水(75％乙醇1小时→85％乙醇1小时→95％乙醇Ⅰ2小时→95％乙醇Ⅱ2小时→无水乙醇Ⅰ2小时→无水乙醇Ⅱ2小时→无水乙醇Ⅲ2小时→二甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ30min)、石蜡包埋、标本切片、烘片过夜后可常温保存待后续实验。

实施例1

小鼠皮肤全层缺损创面愈合实验

一、构建C57BL/6小鼠皮肤全层缺损创面模型

二、免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining,IHC)

1、组织石蜡切片脱蜡至水；

2、选择柠檬酸抗原修复液(pH＝6)行抗原热修复；

3、用迈新超敏免疫组化试剂盒中的内源性过氧化物酶阻断剂孵育切片30min；

4、非特异性染色阻剂或阻断剂室温封闭60min；

5、一抗孵育：用阻断剂对相应一抗(eIF6抗体，1:50，Santa-Cruz，USA)进行稀释，滴加抗体到切片上，4℃孵育过夜；

6、PBS清洗3次后，滴加山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(生物素标记)，室温孵育30min，PBS清洗同上；

7、滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育30min，PBS清洗3次；

8、DAB显色液(MAX，CN)显色

9、苏木素复染细胞核6min，自来水冲洗去除多余的染色液，采用1％盐酸乙醇分化5s，流水冲洗返蓝8min，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下拍照。

10、eIF6的蛋白水平使用ImagePro Plus 6.0进行测量。蛋白水平用Meanintensity表示，按照以下公式计算：

Mean Intensity＝IODsum/Areasample

其中IODsum代表阳性信号总累积光密度值，Areasample代表图片中的样品面积。

图1结果表明，在小鼠的全层缺损创面愈合过程的eIF6 IHC染色中，eIF6的水平在第3、5天升高、在第7天下降、第10天升高。同时，eIF6在伤后第3、5天的创缘表皮基底层细胞中表达下降。基底层的角质形成细胞在伤口愈合过程中的再上皮化过程中起着重要的作用，这些再上皮化需要被激活，然后增殖和分化形成新表皮。得出结论，eIF6与创面愈合过程呈负相关，在创面愈合早期，基底层角质形成细胞中eIF6水平较低，在创面愈合中起重要作用。

实施例2

化学烧伤皮肤组织创面愈合实验

一、构建SD大鼠皮肤化学烧伤模型

1、大鼠麻醉及备皮；

2、画线标记拟损伤区域，利用细砂纸轻轻摩擦去除表面角质，在大鼠背部正中用3M膜贴皮保护周围皮肤。中间留出边长为1cm的正方形拟损伤区域；

3、将吸满2.5％NaOH的边长为1cm的正方形滤纸放在裸露的皮肤上1min，造成碱烧伤；

4、1min揭去滤纸，静待5min；

5、流水冲洗30min，伤后第3、5、16天处死大鼠留取皮肤组织进行组织学分析。

二、免疫组织化学染色

对各时间点碱烧伤后的创面进行eIF6的免疫组织化学染色。

图2结果表明，在大鼠碱烧伤创面中，eIF6在第3、5天表达量降低。eIF6在创面早期第3天表达量较低，且在基底层和基底层以上的角质形成细胞中分布较为均匀，大部分均在细胞质中表达，少量在细胞核中表达，此时细胞之间的连接较为松散，新生上皮中细胞数量增多，到了第16天时，eIF6在角质形成细胞中的表达量已同正常皮肤。综上，即使在特殊化学烧伤类型碱烧伤创面中，eIF6在皮肤组织创面愈合过程中仍出现差异性表达，伤后早期基底层角质形成细胞eIF6低表达在促进创面愈合中具有重要作用。

实施例3

eIF6-KO小鼠创面实验

一、eIF6敲除(KO)小鼠的制作与鉴定

1、设计、构建载体gRNA，验证载体序列。体外转录gRNA纯化备用。所用gRNA序列如表1所示。

表1gRNA序列

2、显微注射CRISPR/Cas9系统样品到C57BL/6J背景小鼠的受精卵，注射后存活的受精卵将被移植到假孕雌鼠体内，等待受孕生仔；

3、生下的F₀代小鼠在生后5-7天剪尾，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型；

4、阳性F₀代小鼠性成熟后，与C57BL/6J背景小鼠进行交配；

5、生下的F1代小鼠在出生后5-7天剪尾，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型。由于eIF6纯合敲除小鼠胚胎致死，因此本实验所用小鼠突变型均为eIF6敲除杂合子，即基因型为eIF6^+/-。

6、通过PCR和Western blot分析验证了基因编辑策略和高效敲除。

以wild type(WT)小鼠作为对照。

二、eIF6-KO小鼠全层皮肤创面模型建立

三、HE染色

1、石蜡切片脱蜡至水；

2、苏木素浸染6min，流水冲洗去除多余染液；

3、1％盐酸乙醇分化液快速分化切片；

4、流水冲洗浸泡8min待组织返蓝；

5、伊红染色10min，流水冲洗去除多余染液；

6、切片脱水透明后采用中性树脂行封片处理，显微镜拍照。

图3结果表明，eIF6 KO小鼠创面模型中，对比WT小鼠，eIF6^+/-小鼠创面愈合在伤后第10天明显加快(P＜0.05)，同时对第10天创面HE染色切片进行迁移距离测量，发现eIF6^+/-小鼠创面迁移距离显著大于WT小鼠(P＜0.05)。因此，当eIF6被敲除时，eIF6 KO小鼠的伤口愈合过程加快。

实施例4

eIF6-CKO小鼠创面实验

一、eIF6角质形成细胞和成纤维细胞条件敲除(CKO)小鼠的制作

通过培养Krt5-Cre小鼠(菌株No.T004832，GemPharmatech，中国)与小鼠携带eIF6的浮动等位基因(菌株No.S-CKO-03166，Cyagen，中国)，eIF6杂合子敲除小鼠表皮和毛囊的角质形成细胞。通过培养Col1a1-Cre小鼠(菌株NO.T004734，GemPharmatech，中国)对eIF6-Flox小鼠进行了eIF6-成纤维细胞条件敲除小鼠的实验。

二、eIF6-CKO小鼠全层皮肤创面模型建立

三、HE染色

具体方法参考实施例3。

图4结果表明，在eIF6-CKO小鼠创面模型中，对比eIF6^f/+；Krt5-Cre^-小鼠，eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠创面愈合在伤后第3、5、7天明显加快(P<0.0001，P<0.001，P<0.01)。在伤后第5天创面HE染色切片上测量新生上皮距离，发现eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠的上皮增殖迁移距离显著大于eIF6^f/+；Krt5-Cre^-小鼠(P<0.01)。而eIF6成纤维细胞条件性敲除小鼠创面愈合率无差异。角质形成细胞条件敲除小鼠在受伤开始时表现出更快的愈合速度，这可以在Krt5阳性细胞中产生特异性敲除eIF6基因，这是基底层角质形成细胞的重要标志。结果证实，角质形成细胞中的eIF6在调节皮肤创面愈合过程中起着重要作用。

实施例5

小鼠皮肤角质形成细胞中敲除eIF6，KRT6B表达上调

一、转录组测序(RNA-seq)

1、提取检测RNA：采用eIF6-CKO小鼠皮肤组织RNA提取方法中提取RNA，Agilent2100bioanalyzer进行严格质控分析，确保RNA总量及完整性；

2、对RNA进行转录组测序；

3、对测序结果进行生物信息学分析。

二、免疫印迹试验(western blotting，WB)

采用RIPA裂解液提取皮肤组织蛋白，采用BCA法对蛋白浓度进行测定。根据目标蛋白分子量选用适宜浓度的PAGE凝胶配制试剂盒，按照说明书进行制胶。根据凝胶每孔20μg蛋白加样，按照条件80V，30min(上层胶)+120V，60min(下层胶)进行电泳。采用“三明治”法制备转膜体系，按照100V，70min条件进行湿转。采用TBST配制5％脱脂牛奶室温摇床封闭1小时后，以TBST清洗3遍。根据抗体说明书进行一抗稀释(eIF6，1:1000，CST，USA；β-ACTIN抗体，1:10000，Abclonal，CN)，4℃摇床一抗过夜孵育。以TBST清洗3遍后，根据一抗说明书选择正确的二抗进行稀释，条带室温摇床孵育1小时。TBST清洗3次，加入显影液，经显影仪曝光。

三、组织免疫荧光染色

1、新鲜皮肤组织在冰冻切片机用OCT包埋；

2、裱片，用冷丙酮在-20℃固定10min，PBS洗3次，每次5min；

3、用0.2％Triton-PBS打孔，室温，30min；

4、10％BSA+10％山羊血清室温封闭1-2小时；

5、甩掉封闭液，滴加稀释好的一抗，4℃过夜，Rabbit anti-KRT6B(Proteintech，CN)一抗稀释比例为1：400，Mouse anti-KRT14(Santa-Cruz，USA)一抗稀释比例为1：400；

6、切片复温，PBS洗3次；

7、避光滴加荧光二抗，稀释比例为1：1000，室温，避光孵育2小时，PBS洗3次；

8、DAKO防淬灭荧光封片剂封片，共聚焦显微镜下成像。Image J统计荧光强度。

转录组测序结果表明，eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠与eIF6 KO小鼠皮肤RNA-seq的上调基因中都发现了KRT6B基因，KRT6B编码损伤诱导相关的角蛋白6B(keratin 6B，KRT6B)，且在eIF6^f/+；Krt5-Cre小鼠中的差异更为显著(P adj<0.0001)。由图5可看出，WB验证发现eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠皮肤中的KRT6B水平上升；在eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠KRT14与KRT6B共定位的基底层细胞中，KRT14阳性的细胞表达了较多的KRT6B；免疫荧光染色中发现eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠表皮层的KRT6B显著上升(P<0.001)。小鼠皮肤角质形成细胞中敲除eIF6，KRT6B表达上调。

实施例6

敲除eIF6通过高表达KRT6B促进培养的角质形成细胞的增殖

用带有eIF6-shRNA的慢病毒转染的永生化人角质形成细胞(HaCaT)，验证eIF6在角质形成细胞中促进伤口愈合。

一、eIF6敲低稳转细胞株的建立

(一)慢病毒载体构建

1、载体信息：所选用的干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO图谱见图6。

2、干扰靶点设计和引物合成：

对照病毒载体siRNA序列和shRNA序列如下：

siRNA序列：TTCTCCGAACGTGTCACGTAA

shRNA序列：

Top strand:

GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACAC

GTTCGGAGAATTTTTTC Bottom strand:

AATTGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGAATTACGTG

ACACGTTCGGAGAACG

目的基因siRNA序列和shRNA序列：

siRNA1序列：GTGCATCCCAAGACTTCAATT

shRNA1序列：

Top strand:

GATCCGTGCATCCCAAGACTTCAATTctcgagAATTGAAGTCTTGGGATG

CACTTTTTTG Bottom strand:

AATTCAAAAAAGTGCATCCCAAGACTTCAATTctcgagAATTGAAGTCTTGG

GATGCACG siRNA2序列：ACAGAAGAAATTCTGGCAGAT

shRNA2序列：

Top strand:

GATCCGACAGAAGAAATTCTGGCAGATTTCAAGAGAATCTGCCAGAA

TTTCTTCTGTTTTTTTG

Bottom strand：

AATTCAAAAAAACAGAAGAAATTCTGGCAGATTCTCTTGAAATCTGCCAGAATTTCTTCTGTCG

siRNA3序列：AGAGAACTTCTACAGTGTGTT

shRNA3序列：

Top strand：

GATCCGAGAGAACTTCTACAGTGTGTTctcgagAACACACTGTAGAAGTTCTCTTTTTTTG

Bottom strand：

AATTCAAAAAAAGAGAACTTCTACAGTGTGTTctcgagAACACACTGTAGAAGTTCTCTCG

3、退火形成粘性末端：引物稀释至100μM，反应体系见表2，反应条件见表3所示：

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

4、载体酶切：

如表4中，按照顺序加入下面的试剂，吸打混匀，在37℃水浴锅中进行反应，1-2小时后酶切结束，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收；

表4载体酶切体系

5、干扰片段与载体连接

配制连接反应体系(20μL)如表5所示，22℃反应1-2小时，或者16℃反应过夜。

表5载体连接反应体系

(二)转化

1、转化使用DH5α感受态细胞，

2、挑取单菌落进行PCR鉴定，体系和反应程序如表6、表7、表8所示；

表6菌液PCR鉴定体系

表7菌液PCR鉴定程序

表8PCR反应引物序列

3、阳性产物交由测序公司测序；

4、测序成功之后，扩增菌液，抽提质粒纯化，按照质粒提取试剂盒的说明书进行质粒抽提。抽提的质粒经质检验证合格之后用于转染细胞。质检合格原则是浓度大于200ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间。

(三)病毒包装与浓缩纯化

1、种板293T细胞用于转染。操作完毕后放在37℃，5％CO₂的培养箱培养中；

2、细胞密度在70～80％的融合即可进行转染；

3、配脂质体转染complex，转染10cm培养皿的complex成分如表9所示。脂质体转染complex混匀，室温温育15min，缓慢滴加至293T细胞中，放回细胞培养箱中培养；

表9脂质体转染complex体系

4、转染16小时后换10％FBS的完全培养基；

5、转染后48小时收集病毒上清于50mL离心管中，再加入10mL新鲜完全培养基继续培养；

6、转染后72小时收集病毒上清于50mL离心管中；

7、4℃，2000g，离心10min，去除50mL离心管中的病毒上清里的细胞碎片；将上清转到于超速离心管中，4℃，82700g，离心120min，用完全培养基重悬病毒沉淀，分装；

(四)病毒感染HaCaT细胞

1、细胞铺板：将状态良好的HaCaT细胞接种到6孔板，保证细胞在第二天感染的时候细胞融合率在50％至70％；

2、病毒感染：更换的新鲜培养基2mL，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒并根据最佳MOI计算所需病毒液体积加入六孔板中，每孔加入终浓度为8μg/mL polybrene；4小时后加入2mL新鲜培养基以稀释polybrene：

3、24小时后更换新鲜培养基2mL；

4、48小时后观察荧光，一般48小时、72小时都可以观察到荧光；

5、加压筛选：含有puromycin的完全培养基培养细胞，2-3天换液，至未感染的WT细胞被puromycin杀光，筛选后的细胞进行传代，并继续施加低浓度puromycin进行维持性筛选培养，细胞传代3次后，可以冻存稳转细胞株。

6、转染效率的鉴定：收集细胞，RT-qPCR和免疫印迹检测eIF6的表达效率，

(五)实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

1、按Trizol法提取组织总mRNA

2、根据上述RNA测定的浓度，按试剂盒说明书进行后续逆转录，本实验选取20μL逆转录体系：

冰上配制逆转录反应液体系：4μL 5X Reaction buffer、1μL Random Hexamerprimer、1μL RiboLock RNase Inhibitor、2μL 10 mM dNTP Mix、1μL RevertAid M-MulVRT，按照20μL体系应加入0.1ng至5μg RNA计算相应加入RNA体积后，加入RNase Free dH₂O补足至20μL；

3、实时定量PCR扩增

采用2X SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake，CN)，按照试剂盒说明书进行后续定量扩增反应。

RT-qPCR的引物序列如表10所示。

表10HaCaT细胞qPCR引物序列

将上述PCR反应液混匀后放置在实时荧光定量PCR仪中，按照说明书设置定量扩增程序；对结果使用2^-ΔΔCt法进行分析目的基因表达。

二、细胞免疫荧光染色

1、细胞以合适数量接种与共聚焦皿中，贴壁生长；

2、去除培养基，4％PFA室温固定10-15min。PBS清洗3次，每次5min；

3、用0.2％triton-PBS打孔，室温，10min；

4、5％BSA室温封闭1-2小时；

5、甩掉封闭液，滴加一抗，4℃过夜，Rabbit anti-COL1A1抗体稀释比例为1：400；

6、复温，PBS洗3次；

7、选择山羊抗兔荧光二抗，避光滴加二抗，稀释比例为1：1000，室温避光孵育2小时；

8、PBS洗3次；

9、共聚焦显微镜下成像。

三、免疫印迹试验

以shScramble细胞作为对照，具体操作步骤参考实施例5。

转染eIF6-shRNA的HaCaT细胞中的eIF6水平下降。由图7可看出，与shScramble细胞相比，免疫荧光染色显示eIF6-shRNA HaCaT细胞中KRT6B水平显著上升(P<0.01)，WB同样显示eIF6-shRNA HaCaT细胞中KRT6B表达增多。在HaCaT细胞系中，eIF6基因敲低后，KRT6B水平显著增加。人角质形成细胞中eIF6的下调导致KRT6B的上调。

实施例7

敲除eIF6可促进培养的角质形成细胞的增殖

一、CCK8增殖实验

1、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在37℃，5％CO₂培养箱中培养；

2、在接种后固定的时间(24小时、48小时、72小时)换用新鲜培养基，向每孔加入10μL的CCK-8溶液；

3、将培养板置于培养箱内孵育1-4小时；

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

实验以shScramble细胞作为对照。

二、对eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠表皮中Ki67细胞的IHC染色

具体方法参考实施例1。

在体内，皮肤伤口的再上皮化是由于角质形成细胞的增殖和迁移的增加。由图8可看出，CCK8实验结果表明，eIF6-shRNA转染的HaCaT细胞在72小时的OD值显著高于shScramble细胞(P<0.001)，说明在HaCaT细胞中敲低eIF6，促进细胞增殖。

Ki67是一种增殖细胞的相关抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可缺少的。图9结果表明，eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠表皮中的Ki67阳性细胞个数显著增加(P<0.01)，说明eIF6敲除后，小鼠表皮角质形成细胞增殖能力增强。图10结果表明，eIF6^f/+；Krt5-Cre⁺小鼠的角质形成细胞在创伤早期(伤后第3、5天)较同时期eIF6^f/+；Krt5-Cre^-小鼠角质形成细胞的厚度增加，在创伤后期(伤后第10天)较同时期eIF6^f/+；Krt5-Cre^-小鼠角质形成细胞的厚度降低，说明eIF6在角质形成细胞敲除后，加速了角质形成细胞的激活周期。在角质形成细胞中，eIF6条件敲低的表皮中KRT6B表达显著上调，伴随着再上皮化过程加速和伤口愈合加快。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQ ID No.1：

MAVRASFENNCEVGCFAKLTNAYCLVAIGGSENFYSVFEGELSDAIPVVHASIAGCRIIGRMCVGNRHGLLVPNNTTDQELQHIRNSLPDSVQIRRVEERLSALGNVTTCNDYVALVHPDLDRETEEILADVLKVEVFRQTVADQVLVGSYCVFSNQGGLVHPKTSIEDQDELSSLLQVPLVAGTVNRGSEVIAAGMVVNDWCAFCGLDTTSTELSVVESVFKLNEAKPSTIATSMRDSLIDSLT

SEQ ID No.2：

atggcggt cagagcgtcg ttcgagaaca actgtgaggt cggttgtttt gccaaactcacaaacgccta ctgcctggtg gccatcggag gctcagagaa cttctatagt gtgttcgagg gtgagctctccgatgccatt cccgtggtgc acgcatccat cgccggctgc cgaatcatcg ggcgcatgtg tgtggggaacaggcatgggc tcctggtacc caacaacacc accgaccagg agctgcagca catccgcaac agcctgcctgactccgtgca gatacggcgg gtggaggagc ggctctcggc ccttggcaat gtcaccacct gcaatgactatgtggccttg gtccacccag acttggacag ggagacagaa gagatcctgg ctgatgtcct caaggtggaagtcttcagac agacagttgc tgaccaggtg ctagtaggaa gctactgtgt cttcagtaat cagggggggctggtgcaccc taaaacttct atcgaggacc aggatgagtt gtcctccctt cttcaggtcc cccttgtggcaggcactgtg aaccgaggga gtgaggtgat tgctgctggg atggtggtga acgattggtg tgctttctgtggtctggaca cgaccagcac ggagctgtca gtggtggaga gcgtcttcaa gctgaatgaa gccaagccaagtaccattgc caccagcatg cgggattccc tcattgacag cctcacatga

SEQ ID No.3：

MSTKTTIKSQTSHRGYSASSARVPGLNRSGFSSVSVCRSRGSGGSSAMCGGAGFGSRSLYGVGSSKRISIGGGSCGIGGGYGSRFGGSFGIGGGAGSGFGFGGGVGFGGGYGGAGFPVCPPGGIQEVTINQNLLTPLNVQIDPTIQRVRTEEREQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKVLDTKWALLQEQGTKTVRQNLEPMFEQYISNLRRQLDSIIGERGRLDSELRNMQDTVEDYKSKYEDEINKRTKAENEFVTVKKDVDAAYMTKVELQAKADSLADEINFLRVIYEAELSQMQTHISDTSVVLSMDNNRSLDLDSIIAEVKAQYEDIAQRSRAEAESWYQTKYEELQVTAGRHGDDLRNTKQEIAEINRMIQRLRSEIDHVKKQCANLQAAIADAEQRGEMALKDARGKLEGLEDALQKAKQEMARLLKEYQELMNVKLALDVEIATYRKLLEGEECRLNGEGVGPVNISVVQSTVSSGYGSAGGASSSLGLGGSSSYSYGSSHGLGGGFSAGSGRAIGGGLSSSGGLSSSTIKYTTSASSSRKSYRH

SEQ ID No.4：

atgtctacca aaaccaccat caagagtcaa actagccacc gtggctacag tgccagctcagccagagtgc ctgggctcaa ccgctctggc ttcagcagtg tgtccgtgtg ccgctcccgg ggcagcggtggctccagtgc aatgtgtgga ggagctggct ttggcagcag gagcctctat ggtgtgggga gctccaagaggatctccatc ggagggggca gctgtggcat tggaggaggc tatggcagcc gatttggagg aagcttcggcattggaggtg gagctggtag tggctttggc ttcggtggtg gagttggctt tggtggtggc tatggcggagctggcttccc ggtgtgcccc cctggaggca tccaagaggt caccatcaac cagaacctcc tcacccctctgaacgtgcaa atcgacccca ccatccagcg ggtcaggact gaggagaggg agcagatcaa gaccctcaacaacaagtttg cctccttcat cgacaaggtc cggttcctgg agcagcagaa caaggtcctg gacaccaagtgggccctgct gcaagagcag ggcaccaaga ccgtgaggca gaacctggag cctatgtttg agcagtacatcagcaacctc cgcagacagc tggacagcat cattggagag aggggtcgcc tggactcaga gctgaggaacatgcaggaca cagtggagga ctacaagagc aaatatgaag atgaaatcaa caagcgtaca aaagcagagaatgaatttgt aaccgtgaaa aaggatgtag atgctgccta catgaccaag gttgaactgc aagccaaggcagatagtctt gcagacgaga tcaacttcct gagagttatt tatgaggcag aactgtctca gatgcaaactcacatctcag acacatctgt ggtcctctcc atggacaaca accgtagcct ggacctggac agcatcatcgctgaggtcaa ggcccagtat gaggacattg ctcagagaag tcgggctgaa gctgagtcct ggtaccagactaaatatgag gagctgcagg tcacagctgg cagacatggg gacgacctgc gcaacaccaa gcaggagattgctgagatca accgcatgat ccagaggctg agatctgaga tcgaccacgt taagaagcag tgtgccaacctgcaagctgc tattgctgat gctgagcaac gtggggagat ggccctgaag gatgccaggg gcaagctggaagggctggag gatgccctgc agaaggccaa acaggaaatg gccaggctgc tgaaggagta ccaggaactcatgaatgtca agctggccct ggatgtggaa attgccacct acaggaagct gctggaagga gaggagtgcaggttgaatgg tgaaggtgtt ggaccagtca acatctctgt ggtgcagtcc accgtgtcca gcggctatggcagtgccggg ggtgccagca gcagcttagg cctgggtgga agcagcagct actcctatgg cagcagccatggccttggag gtggcttcag tgctggcagt ggcagagcca tcggaggtgg cctcagctct tctggtggcctcagctcttc caccatcaaa tacaccacca gcgcctcctc cagcaggaag agctacaggc actga

Claims

1.一种eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用，其特征在于，eIF6的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.根据权利要求1所述eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用，其特征在于，所述皮肤组织创面为由一种或多种损伤因素导致，包括刀割、针刺、灼烧、烫伤。

3.根据权利要求1所述eIF6基因及其蛋白在制备调控皮肤组织创面愈合药物的应用，其特征在于，调控皮肤组织创面愈合的靶细胞位于角质形成细胞。

4.一种eIF6基因及其蛋白在制备调控角质形成细胞增殖药物的应用，其特征在于，eIF6氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种eIF6基因及其蛋白在制备调控KRT6B基因表达量药物的应用，其特征在于，eIF6氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求5所述eIF6基因及其蛋白在制备调控KRT6B基因表达量药物的应用，其特征在于，KRT6B基因的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示、核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。