CN111228291B

CN111228291B - miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用及药物

Info

Publication number: CN111228291B
Application number: CN202010202806.4A
Authority: CN
Inventors: 王新兴; 邓致荣; 陈照立; 李超
Original assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences; Rocket Force Characteristic Medical Center of PLA
Current assignee: Environmental Medicine and Operational Medicine Institute of Military Medicine Institute of Academy of Military Sciences; Rocket Force Characteristic Medical Center of PLA
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111228291A; AU2020101886A4

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种miR‑541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用及药物，所述的miR‑541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的应用和药物可以减少缺氧所致的神经元细胞凋亡。

Description

miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用及药物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用及药物。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

缺氧是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，脑、心脏等生命重要器官缺氧也是导致死亡的重要原因。神经系统对缺氧尤其敏感，如脑梗塞、外伤等导致的极短时间缺氧即可导致神经元细胞的不可逆损伤，致残、致死率极高。

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在机体中参与转录后基因表达调控，调节着多种生命活动进程。microRNA-541(miR-541)因为发现时间比较晚，是microRNA中较少被研究的分子之一。有研究发现miR-541可通过直接靶向HMGA2抑制鳞状细胞肺癌的增殖和侵袭。miR-541在人肝癌组织中表达下调，与肝癌的临床病理表型、复发和生存有关，进一步研究显示miR-541在体内外均能抑制肝癌细胞的生长、转移和自噬，可能与其调控肝癌进展有关。截止目前为止，并未见microRNA-541与缺氧损伤特别是在神经元缺氧损伤的相关性研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用及药物。本发明的药物能够减少缺氧所致的神经元细胞凋亡。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种抗神经元细胞缺氧损伤药物，所述的药物包括miR-541，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述的药物包括药学上miR-541可接受的载体。

进一步的，所述的载体为胆固醇，病毒，纳米颗粒或脂质体。

进一步的，所述的药物由miR-541与所述的载体连接形成。

进一步的，所述的药物为注射制剂，口服制剂，喷雾制剂，软膏制剂或贴剂。

本发明具有如下有益效果：

miR-541能够抑制缺氧所致的神经元细胞线粒体膜电位的下降、降低缺氧神经元细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性、减少缺氧所致的神经元细胞凋亡。

附图说明

图1为本发明一实施例miR-541腺病毒载体对神经元细胞中miR-541表达水平的影响(*P<0.05，与缺氧组比较)。

图2为本发明一实施例miR-541腺病毒载体对缺氧神经元细胞线粒体的影响(*P<0.05，与缺氧组比较)。

图3为本发明一实施例miR-541腺病毒载体对缺氧神经元细胞培养液LDH活性的影响(*P<0.05，与缺氧组比较)。

图4为本发明一实施例miR-541腺病毒载体对缺氧神经元细胞凋亡率的影响(*P<0.05，与缺氧组比较)。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

本发明提供了一种miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

miR-541序列：UCAGGUCUAAGACACGGGUGGU(SEQ ID NO.1)序列来源：homo sapiens，智人。

本发明提供了一种抗神经元细胞缺氧损伤药物，所述的药物包括miR-541，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些实施例中，所述的药物包括药学上miR-541可接受的载体。

在本发明的另一些实施例中，所述的载体为胆固醇，病毒，纳米颗粒或脂质体。

在本发明的另一些实施例中，所述的药物由miR-541与所述的载体连接形成。

在本发明的另一些实施例中，所述的药物为注射制剂，口服制剂，喷雾制剂，软膏制剂或贴剂。

以下实施例中的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂，所有的方法均为常规方法。

实施例1将miR-541进行腺病毒包装

一、miR-541腺病毒载体的制备

首先通过Pubmed检索miR-541的前体基因序列，共84个氨基酸，据此设计pre-miR-541表达载体的正义链和反义链DNA序列(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的小写字母部分)，并手动加酶切位点EcoRI和BamHI以及它们的保护碱基(大写部分)。采用化学合成法合成DNA序列。

具体操作如下：

1、采用化学合成法合成以下单链DNA oligo(上海吉凯基因有限公司)：5’to3’

CCGGAATTCacgtcagggaaaggattctgctgtcggtcccactccaaagttcacagaatgggtggtgggcacagaatctggactctgcttgtgCGCGGATCC(SEQ ID NO.2)

CGCGGATCCcacaagcagagtccagattctgtgcccaccacccattctgtgaactttggagtgggaccgacagcagaatcctttccctgacgtGAATTCCGG(SEQ ID NO.3)

2、把上述合成的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温，产生双链。

3、连接

通过T4 DNA连接酶将双酶切(EcoRI和BamHI)线性化的RNAi腺病毒载体GV119(上海吉凯基因有限公司)和上述DNA片段进行连接反应，连接后的产物进行转化实验。连接反应体系如下，于16℃连接过夜，连接产物(连接液)进行转化实验。所用试剂如表1所示。

表1

4、转化

感受态细胞的制备：

配制下述溶液：

1)0.1M CaCl₂溶液，以0.45μm过滤除菌；

2)250mM KCl₂溶液；

3)2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

4)SOB:1ml 250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液。

用氯化钙制备新鲜的DH5α大肠杆菌感受态细胞

1)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300rpm)。

2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

3)于4℃,以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

9)将细胞分装成小份，放于-70℃。

转化过程：

配制下述溶液：

1)250mM KCl₂溶液

2)2M MgCl₂溶液，高压灭菌；

3)SOB培养基:1mL 250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液；

4)SOB琼脂培养基：0.49396g MgSO₄.7H₂O溶于100mlSOB培养基，加入1.5g琼脂粉，高压灭菌，冷至温度低于60℃，加入Amp至终浓度到100μg/ml，混匀铺板，一般90mm直径平皿需要30-50ml培养基；

5)1M葡萄糖溶液，过滤除菌；

6)SOC培养基：2ml 1M葡萄糖溶液加入100ml SOB培养基；

转化步骤：

1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管，再快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。

3)每管加800μl SOC培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO₄和Amp抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

4)将平板置于室温直至液体被吸收，再倒置平皿，于37℃培养，16小时；

5)进行阳性克隆PCR。

5、阳性克隆的PCR鉴定

挑取转化子重悬于10μl LB溶液，混匀取1μl作为模板；使用GV119通用引物(上海吉凯基因有限公司)，进行菌落PCR鉴定实验。

PCR鉴定体系和PCR程序：

试剂及使用量参见表2

表2

PCR程序(参见表3)：

表3

阳性克隆测序:将PCR阳性克隆进行测序，序列如序列表中的SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，测序结果正确，与合成的序列一致。

二、siRNA腺病毒的包装与滴度检测

1.腺病毒包装

1.1 HEK293(ATCC，cat#CRL-1573)细胞培养

1)活细胞计数

用无血清DMEM培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml(一般稀释倍数为100倍)，在0.1ml的细胞悬液中加入0.1ml的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

2)细胞株的冻存

取培养2～3天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×10⁶～2×10⁷/ml。在1ml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ml FBS和0.1ml DMSO(或甘油)，混匀后密封。4℃放置1小时，-20℃放置2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。

3)细胞复苏

从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70％酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10％FBS的DMEM培养基，置温箱培养。次日更换一次培养液后再继续培养。

4)细胞传代

弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。加入1ml 0.25％胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。加入含10％FBS和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。混匀细胞后分按照1：5或1：6传入新的培养瓶中，继续培养。3天左右、待细胞长满时，重新进行传代。

1.2 DNA溶液的制备

将腺病毒穿梭质粒(上述制备的siRNA腺病毒载体)和辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3Cre(Microbix.Canada))用大肠杆菌菌株DH5α进行扩增，方法如下：

1)用冷却的无菌吸头取200μl DH5α转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl腺病毒穿梭质粒或辅助包装质粒，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

5)挑取单克隆加入Amp抗性(100ug/ml)的LB液体培养基上，于37℃摇床培养，12-16小时。

6)将步骤5中得到的菌液以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒(Cat.12145)提取质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。

1.3 质粒转染过程

1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％～40％，重新接种于T25瓶，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50％～60％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清DMEM培养基。

3)向一灭菌离心管中加入所制备的DNA溶液(穿梭质粒(上述siRNA腺病毒载体)5μg和辅助包装质粒(pBHG loxΔE1,3Cre(Microbix.Canada))5μg)与DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，在室温下温育5分钟。

4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取10μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与50μl DMEM混合，在室温下温育5分钟。

5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。

6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至HEK293细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO₂细胞培养箱中培养。

8)培养6h～8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入2ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养。

10)每天观察转染后细胞生长状况，若细胞培养基明显变黄，酌情补加适量的新鲜全培养液。

1.4 重组腺病毒的收获

转染后大约10～15天时，HEK 293细胞开始飘落，部分细胞出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃,7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

2.腺病毒的扩增

2.1 第1轮扩增

将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞4倍稀释后传入另1个T25细胞培养瓶中，以含10％FBS的DMEM培养液在37℃,5％CO₂下培养(以下扩增中均使用此条件培养细胞)。待细胞达到60％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入复制缺陷型腺病毒重组成功后收获的粗提液2mL，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液3mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃,7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

2.2 第2轮扩增将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的HEK293细胞全部传入1个T75细胞培养瓶中，以完全培养基继续培养。待细胞达到90％汇合时，弃去旧培养液，向培养瓶中加入第1轮扩增所得的病毒液2ml，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液10mL并继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％的细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于10ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，于4℃，7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

3.腺病毒纯化

按Adeno-X^TM Virus Purification Kit(BD Biosciences,Clontech)的步骤纯化重组腺病毒，主要步骤如下:

1)取出BD Adeno-X纯化装置，将10ml的病毒粗制液用0.45μm孔径的滤膜过滤，滤液保存在收集瓶中；

2)往病毒滤液中加入4μl 25U/ul的Benzonase.混匀，37℃保温30min；

3)往收集瓶中加入10ml的l×dilution buffer，使之与病毒滤液混合均匀；

4)将20ml的注射器中吸入5ml灭菌PBS，把注射器插入滤器，推入PBS使之流经套管，将滤器和套管中的空气排尽；

5)将套管插入收集瓶中的病毒滤液中；

6)将病毒滤液吸入注射器中，以5ml/min的速度推出，使之流经滤器。注意避免空气进入系统中；

7)将套管的入口从收集瓶转移到1×Wash Buffer中；

8)通过套管将wash buffer吸入注射器中，将全部wash buffer以5ml/min的速度推入流经滤器；

9)取下滤器；

10)用5ml的BD Luer-Lok注射器洗脱腺病毒：在注射器中吸入3ml的1×EultionBuffer；连接注射器和滤器的凹口，推入lml Elution Buffer流经滤器到5ml的灭菌离心管中；室温下孵育滤器5min，推入剩下的elution buffer流经滤器来收集剩下的腺病毒；

11)将纯化后的腺病毒分装，-70℃保存。

4.腺病毒滴度检测

4.1 腺病毒滴度测定-终点稀释法

1)在实验前24小时，向96孔板的每一个孔加入100μl HEK293细胞悬液，约含1x10³个细胞；

2)准备10个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990μl的完全培养液，其余的9个管子中各加入900μl的完全培养液。

3)待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990μl的Ep管中做1:100稀释(10^-2)；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900μl的Ep管中做1:10稀释(10^-3)，直至稀释到10^-13。

4)从细胞培养箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将10-13至10-6稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行的第1-10每孔加入90μl病毒稀释液，而每一行的第11-12每孔均加入90μl不含病毒的完全培养基作为对照。

5)将96孔板置于置37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养，

6)10d后观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，统计每一行的阳性率，计算病毒滴度(Spearman-Karber Method):

4.2 病毒滴度计算方法

病毒滴度＝10(x+0.8)(PFU/ml)，x＝10^-1到10^-13依次稀释度下CPE阳性率总和。

最后得到滴度1×10¹⁰PFU/ml。

*公式使用条件:

①阴性对照没有CPE和生长抑制现象；

②加入最小稀释浓度病毒液的孔均有CPE。

实施例2miR-541腺病毒转染SD大鼠乳鼠海马神经元细胞并检测其干扰效率

1)选用SD(Sprague Dawley)大鼠乳鼠(出生3天内)，购自：北京维通利华实验动物技术有限公司，网址：https://www.vitalriver.com/。SD乳鼠麻醉后，立即取出海马，采用胰酶(sigma)消化法获得原代乳鼠海马神经元细胞。

2)将腺病毒以100PFUs/cell的浓度加入细胞培养液中

3)48小时后显微镜下观察细胞，并收集细胞，RT-PCR法检测其细胞内miR-541表达的变化。

如图2所示，转染miR-541腺病毒神经元细胞内转染miR-541的表达水平显著高于对照组。表明所构建的miR-541腺病毒能够有效提升所转染细胞中的miR-541表达水平。

实施例3所制备的miR-541腺病毒对神经元细胞缺氧损伤的治疗作用

原代培养的SD大鼠乳鼠海马神经元细胞，分为三组：

(1)正常对照组(NC)；

(2)缺氧组，1％O₂(体积百分含量)培养6小时；

(3)缺氧细胞miR-541腺病毒干预组，将腺病毒以100PFUs/cell的浓度加入细胞培养液中，在1％O₂的条件下继续培养48小时，收集细胞及其培养上清液，

(4)所收集的细胞用JC-1(Solarbio，M8650)进行染色、用流式细胞术检测线粒体膜电位。或者将收集的细胞用70％的乙醇固定过夜，然后用PI染色液(leagene公司，DA0021)进行染色，流式细胞术检测细胞凋亡。所收集的细胞培养上清液用LDH检测试剂盒(碧云天公司，C0016)。检测乳酸脱氢酶活性。

(5)具体结果如下：

(6)1)流式细胞术检测miR-541腺病毒载体对缺氧海马神经元细胞线粒体膜电位的影响，结果显示：miR-541抑制缺氧海马神经元细胞线粒体膜电位的下降(图1)。线粒体膜电位代表了线粒体的功能状态，而线粒体是神经元细胞的能量工厂和重要的信号通路整合器，这一结果表明miR-541腺病毒载体能够有效保护缺氧损伤的神经元细胞。

2)miR-541腺病毒载体对缺氧海马神经元细胞培养液中LDH(乳酸脱氢酶)活性的影响，结果显示：miR-541抑制缺氧海马神经元细胞培养液中LDH的活性(见图3)。LDH在细胞损伤过程中释放到培养液，培养液中的LDH代表了细胞的损伤程度，这一结果表明miR-541腺病毒载体能够避免缺氧所致的海马神经元细胞损伤，再次说明miR-541腺病毒载体具备对缺氧神经元细胞的保护作用。

3)流式细胞术检测miR-541腺病毒载体对缺氧海马神经元细胞凋亡的影响，结果如图4所示：miR-541干预导致缺氧海马神经元细胞凋亡率显著下降。凋亡是缺氧神经元细胞死亡的主要方式，miR-541腺病毒载体能够明显减少缺氧神经元细胞的凋亡率，这直接证明了miR-541腺病毒载体对缺氧神经元细胞的保护作用。

结果表明，用miR-541与药学上接受的载体组成的药物组合物，具有与miR-541相似的作用。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种miR-541在制备抗神经元细胞缺氧损伤药物中的应用，其特征在于，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗神经元细胞缺氧损伤药物，其特征在于，所述的药物包括miR-541，所述的miR-541的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的药物包括药学上miR-541可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述的载体为胆固醇，病毒，纳米颗粒或脂质体。

5.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于，所述的药物由miR-541与所述的载体连接形成。

6.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述的药物为注射制剂，口服制剂，喷雾制剂，软膏制剂或贴剂。