CN115232835A - 一种降低可复制性腺病毒的细胞株nhek-c28的建立与应用 - Google Patents

一种降低可复制性腺病毒的细胞株nhek-c28的建立与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK‑C28的建立与应用，包括以下步骤:步骤S1:针对E1A基因，设计sgRNA序列；步骤S2:构建PX459‑sgRNA载体；步骤S3:将PX459‑sgRNA1～6质粒分别转染到单克隆细胞JH293‑Cl one21中；步骤S4:验证各sgRNA的敲除效率；步骤S5:选PX459‑sgRNA 6质粒敲除的细胞进行单克隆的筛选；步骤S6:筛选出的单克隆细胞鉴定敲除效果，选择一株敲除效果好的单克隆；步骤S7:再次敲除筛选出的C14细胞；步骤S8:敲除细胞NHEK‑C28中E1A蛋白水平表达；步骤S9:敲除细胞NHEK‑C28功能验证；本发明，通过改造腺病毒的包装细胞系，增强病毒使用的安全性，从而不影响腺病毒产毒同时降低可复制型腺病毒的单克隆细胞株NHEK‑C28，并在GMP条件下建立三级细胞库，便于用于后续腺病毒的大规模生产应用。

Description

一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用
技术领域
本发明涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用。
背景技术
重组腺病毒载体因其高的生物安全性、对人无致病性而成为一种应用广泛的基因治疗载体。目前通常所用的腺病毒载体是去除了E1/E3等与腺病毒复制相关的基因，由包装细胞如HEK293提供E1等基因来保证非复制型的腺病毒的包装和扩增，从而增加了使用的安全性。但是在包装过程中，HEK293细胞系中的E1基因和病毒本身的E1基因可能发生同源重组而产生有复制能力的腺病毒(Replication competent adenovirus,RCA)而使目的基因表达框丢失。因此在非复制型腺病毒载体生产中，减少RCA的产生是非常重要的。E1A是最早被转录的片段，是起始病毒复制的关键分子，E1A蛋白包括三个比较保守的区域：CR1，CR2和CR3，而CR2基因由于能与视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Retinoblastoma,RB)基因结合而促使细胞复制进入S期，为病毒复制提供条件。肿瘤细胞普遍存在RB调控缺陷，因此删除CR2不影响溶瘤腺病毒在肿瘤细胞的复制，而在正常细胞中由于受到RB调控而阻碍了E1A驱动的周期调控，达到特异性在肿瘤细胞中复制的目的。
Crispr/Cas9基因编辑技术有两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，另一种是具有导向功能的sgRNA(single guide RNA)，当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白与sgRNA结合，靶向到目的DNA上发挥DNA双链切割功能。而DNA被切割产生断裂后，通过细胞内的同源重组修复或非同源重组修复引起目标DNA移码或插入突变。
现有非复制型腺病毒包装过程中会出现可复制型的腺病毒,不仅会影响病毒使用的安全性，而且也不利于腺病毒的大规模应用,因此,设计一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用是很有必要的。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用，通过改造腺病毒的包装细胞系，解决非复制腺病毒包装过程中出现可复制型腺病毒的问题，增强病毒使用的安全性，从而不影响腺病毒产毒同时降低可复制型腺病毒的单克隆细胞株NHEK-C28，并在GMP条件下建立三级细胞库及GMP生产的工艺流程，用于后续腺病毒的大规模生产应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用，包括以下步骤:
步骤S1:针对E1A基因，设计sgRNA序列；
1)根据NCBI查询E1A基因序列；将其CDS序列输入到gRNA设计网站中，选择分数较高的gRNA；
2)将预测的数条gRNA输入到二级结构预测网址，选择出合适的6条gRNA序列；
3)第三方公司合成gRNA序列；
步骤S2:构建PX459-sgRNA载体；
1)将合成的6条gRNA分别退火成双链sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5，sgRNA6；
2)含Cas9酶的PX459质粒用限制性内切酶BbsI酶切，胶回收；将双链sgRNA1～6分别与酶切胶回收产物连接反应；连接产物转化到Stabl3感受态细胞中，涂板；挑菌落，经PCR初步鉴定；
3)将初步鉴定阳性的菌落摇菌，菌液送第三方公司测序鉴定构建的结果；
步骤S3:将PX459-sgRNA1～6质粒分别转染到单克隆细胞JH293-Clone21中；
1)前一天JH293-Clone21细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的PX459-sgRNA1质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)其他质粒转染按相同步骤操作；
4)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；
步骤S4:验证各sgRNA的敲除效率；
1)转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选，筛选72h后，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，western检测E1A蛋白水平；
步骤S5:选PX459-sgRNA 6质粒敲除的细胞进行单克隆的筛选；
1)细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜，培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn，待做标记的细胞长满后，扩增培养；
步骤S6:筛选出的单克隆细胞鉴定敲除效果，选择一株敲除效果好的单克隆；
1)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，Western-blot检测E1A蛋白水平；
步骤S7:再次敲除筛选出的C14细胞；
1)前一天C14细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的PX459-sgRNA4质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选；筛选72h后，细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜；培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn；待做标记的细胞长满后，扩增培养；
4)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序；
步骤S8:敲除细胞NHEK-C28中E1A蛋白水平表达；
1)分别收集六孔板中1个孔的JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞，用PBS缓冲液洗两遍；各加入150μL的细胞裂解液，冰上裂解15min；按照蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度；
2)分别取20μg的蛋白，加入一定量的上样缓冲液，煮沸5min；按照常规Western-Blot实验操作进行跑胶、转膜、封闭、孵育一抗和二抗；按照ECL发光液说明书进行检测；
步骤S9:敲除细胞NHEK-C28功能验证；
1)细胞增殖能力
(1)前一天，分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板24孔板，1x10^4/孔，记为第0天；
(2)分别在第1～7天，按下列程序进行计数，每次均三孔重复：
弃上清，用PBS洗一遍，弃掉；
加入100μL的消化液，培养箱中放置1min；
加入400μL的培养基终止消化，吹打混匀；
取20μL的细胞悬液加入20μL的台盼蓝中，混匀，吸取10μL在显微镜下计数；
根据体积换算成实际的细胞数目；
(3)根据细胞数目作图；
2)细胞产毒能力
(1)前一天分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板6孔板，5x10^5/孔；
(2)第二天，分别将等量的无复制能力的Ad-cre病毒与含2％FBS的DMEM混合，弃孔内上清，将感染液加入到六孔板中；
(3)三天后，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；
(4)经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(5)分别将上清用试剂，20mM Tris,25mM NaCl,2.5％glycerol(w/v),pH 8.0，稀释10倍后，室温孵育15min；
(6)检测260nm吸光度值；
(7)换算成每毫升病毒颗粒数，即VP/mL；
3)作为包装细胞产生可复制型病毒能力
(1)前一天Hela细胞铺板24孔板，1x10^5/孔，每组设立三孔重复；
(2)第二天加入等量VP的由JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞产生的Ad-cre病毒，同时以野生型的Ad5为阳性对照，Ad5为1000VP，不加任何病毒为阴性对照；记为第0天；
(8)第1天收毒，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(9)第2天铺板，同样再次铺板Hela细胞；
(10)第3天收毒和感染，同步骤(8)，将取得上清的1/4按步骤(2)进行感染；
(11)第4天收毒，同步骤(8)；
(12)第5天铺板，同步骤(9)；
(13)第6天收毒和感染，同步骤(10)；
(14)第7天收毒，同步骤(8)；
(15)第8天铺板，同步骤(9)；
(16)第9天收毒，同步骤(8)；
(17)次收的病毒上清提取病毒基因组；
(18)Taqman探针法测定含有的RCA的量。
本发明的有益效果是：本发明，通过改造腺病毒的包装细胞系，解决非复制腺病毒包装过程中出现可复制型腺病毒的问题，增强病毒使用的安全性，从而不影响腺病毒产毒同时降低可复制型腺病毒的单克隆细胞株NHEK-C28，并在GMP条件下建立三级细胞库及GMP生产的工艺流程，用于后续腺病毒的大规模生产应用。
附图说明
图1为本发明的NCBI查询到的E1A的基因序列示意图；
图2为本发明的设计合成的6条gRNA序列及在E1A基因上的位置示意图；
图3为本发明的PX459质粒图谱；
图4为本发明的菌落PCR引物及测序引物和PX459载体的部分序列图；
图5为本发明的构建成功的6个质粒PX459-sgRNA测序序列图谱以及插入位置图；
图6为本发明的提取细胞基因组DNA后PCR测序峰图及测序序列与理论序列对比图；
图7为本发明的提取细胞蛋白后Western检测E1A蛋白的水平变化图；
图8为本发明的提取单克隆细胞C4、C11、C14、C22和C23基因组DNA后PCR测序峰图及C11和C14测序序列与理论序列对比图；
图9为本发明的提取单克隆细胞C4、C6、C11、C14、C22和C23蛋白后Western检测E1A蛋白的水平变化图；
图10为本发明的提取单克隆细胞NHEK-C28基因组DNA后PCR测序峰图；
图11为本发明的提取单克隆细胞NHEK-C28基因组DNA后PCR测序序列与理论序列对比图；
图12为本发明的NHEK-C28细胞中E1A蛋白水平表达情况示意图；
图13为本发明的NHEK-C28细胞的增殖能力示意图；
图14为本发明的验证NHEK-C28细胞的产毒能力示意图；
图15为本发明的改造后的NHEK-C28细胞RCA形成能力示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面给出具体实施例。
参见图1-15，一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用，其特征在于，包括以下步骤:
步骤S1:针对E1A基因，设计sgRNA序列；
1)根据NCBI查询E1A基因序列，见图1；将其CDS序列输入到gRNA设计网站中，选择分数较高的gRNA；
2)将预测的数条gRNA输入到二级结构预测网址，选择出合适的6条gRNA序列，见图2；
3)第三方公司合成gRNA序列；
步骤S2:构建PX459-sgRNA载体，见图3-5；
1)将合成的6条gRNA分别退火成双链sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5，sgRNA6；
2)含Cas9酶的PX459质粒用限制性内切酶BbsI酶切，胶回收；将双链sgRNA1～6分别与酶切胶回收产物连接反应；连接产物转化到Stabl3感受态细胞中，涂板；挑菌落，经PCR初步鉴定；
3)将初步鉴定阳性的菌落摇菌，菌液送第三方公司测序鉴定构建的结果；
由测序图谱及插入序列可以看出，PX459-sgRNA1～6质粒构建成功；
步骤S3:将PX459-sgRNA1～6质粒分别转染到单克隆细胞JH293-Clone21中；
1)前一天JH293-Clone21细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的PX459-sgRNA1质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)其他质粒转染按相同步骤操作；
4)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；
步骤S4:验证各sgRNA的敲除效率；
1)转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选，筛选72h后，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，见图6；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，western检测E1A蛋白水平，见图7；
从图6-7，可以看出，PX459-sgRNA1～6质粒仅有PX459-sgRNA6测序出现套峰，说明在该处可能出现了敲除；同时结合检测E1A蛋白水平降低最明显，说明PX459-sgRNA6质粒的敲除效果较好；
步骤S5:选PX459-sgRNA 6质粒敲除的细胞进行单克隆的筛选；
1)细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜，培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn，待做标记的细胞长满后，扩增培养；
步骤S6:筛选出的单克隆细胞鉴定敲除效果，选择一株敲除效果好的单克隆；
1)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序，见图8；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，Western-blot检测E1A蛋白水平，见图9；
从图8-9结果可以看出，单克隆细胞C11和C14敲除效果较好；且从测序序列与理论序列对比，C14的敲除效果最好
步骤S7:再次敲除筛选出的C14细胞；
1)前一天C14细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的Cas9-sgRNA4质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选；筛选72h后，细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜；培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn；待做标记的细胞长满后，扩增培养；
4)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序，见图10-11；
图10-11结果可以看出，改造后细胞E1A基因与原始基因相比，大多出现了移码突变，并且此位置在CR2基因附近；证明此株细胞再次敲除成功；
步骤S8:敲除细胞NHEK-C28中E1A蛋白水平表达；
1)分别收集六孔板中1个孔的JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞，用PBS缓冲液洗两遍；各加入150μL的细胞裂解液，冰上裂解15min；按照蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度；
2)分别取20μg的蛋白，加入一定量的上样缓冲液，煮沸5min；按照常规Western-Blot实验操作进行跑胶、转膜、封闭、孵育一抗和二抗；按照ECL发光液说明书进行检测，见图12；
从结果看出，改造后的NHEK-C28细胞E1A表达水平明显下降；
步骤S9:敲除细胞NHEK-C28功能验证；
1)细胞增殖能力
(1)前一天，分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板24孔板，1x10^4/孔，记为第0天；
(2)分别在第1～7天，按下列程序进行计数，每次均三孔重复：
弃上清，用PBS洗一遍，弃掉；
加入100μL的消化液，培养箱中放置1min；
加入400μL的培养基终止消化，吹打混匀；
取20μL的细胞悬液加入20μL的台盼蓝中，混匀，吸取10μL在显微镜下计数；
根据体积换算成实际的细胞数目；
(3)根据细胞数目作图，见图13；
从结果看出，改造后的NHEK-C28细胞增殖能力不受影响；
2)细胞产毒能力
(1)前一天分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板6孔板，5x10^5/孔；
(2)第二天，分别将等量的无复制能力的Ad-cre病毒与含2％FBS的DMEM混合，弃孔内上清，将感染液加入到六孔板中；
(3)三天后，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；
(4)经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(5)分别将上清用试剂，20mM Tris,25mM NaCl,2.5％glycerol(w/v),pH 8.0，稀释10倍后，室温孵育15min；
(6)检测260nm吸光度值；
(7)换算成每毫升病毒颗粒数，即VP/mL，见图14；
从结果看出，改造后的NHEK-C28细胞其产毒能力不受影响；
3)作为包装细胞产生可复制型病毒能力
(1)前一天Hela细胞铺板24孔板，1x10^5/孔，每组设立三孔重复；
(2)第二天加入等量VP的由JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞产生的Ad-cre病毒，同时以野生型的Ad5为阳性对照，Ad5为1000VP，不加任何病毒为阴性对照；记为第0天；
(8)第1天收毒，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(9)第2天铺板，同样再次铺板Hela细胞；
(10)第3天收毒和感染，同步骤(8)，将取得上清的1/4按步骤(2)进行感染；
(11)第4天收毒，同步骤(8)；
(12)第5天铺板，同步骤(9)；
(13)第6天收毒和感染，同步骤(10)；
(14)第7天收毒，同步骤(8)；
(15)第8天铺板，同步骤(9)；
(16)第9天收毒，同步骤(8)；
(17)次收的病毒上清提取病毒基因组；
(18)Taqman探针法测定含有的RCA的量，见图15；
从结果看出，在加入非复制型腺病毒Ad-cre为10^7VP时，三种细胞均未有RCA的产生，而在Ad-cre加入量为10^10VP时，JH293-Clone21和C14细胞均有RCA的产生，与本底相比分别增加了10^4倍和10^5倍，而NHEK-C28仍然没有RCA的产生；说明细胞改造成功。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 一种降低可复制性腺病毒的细胞株 NHEK-C28 的建立与应用
<130> 2022.9.27
<140> 2022103951094
<141> 2022-04-15
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1165
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
tatttatacc cggtgagttc ctcaagaggc cactcttgag tgccagcgag tagagttttc 60
tcctccgagc cgctccgaca ccgggactga aaatgagaca tattatctgc cacggaggtg 120
ttattaccga agaaatggcc gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg 180
ataatcttcc acctcctagc cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag 240
acgtgacggc ccccgaagat cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg 300
taatgttggc ggtgcaggaa gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc 360
cggagccgcc tcacctttcc cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg 420
tttctatgcc aaaccttgta ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc 480
cacccagtga cgacgaggat gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc 540
ccgggcacgg ttgcaggtct tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta 600
tgtgttcgct ttgctatatg aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat 660
gggcagtggg tgatagagtg gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt 720
tttgtggttt aaagaatttt gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga 780
gcctgagccc gagccagaac cggagcctgc aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc 840
tgctatcctg agacgcccga catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta gtacggatag 900
ctgtgactcc ggtccttcta acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc cgctgtgccc 960
cattaaacca gttgccgtga gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga 1020
cttgcttaac gagcctgggc aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccataagg 1080
tgtaaacctg tgattgcgtg tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag ttgatgtaag 1140
tttaataaag ggtgagataa tgttt 1165
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
ccagtctttt ggaccagctg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
agcagccgga gcagagagcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
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cggaggtgtt attaccgaag 20
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
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tgtaccggag gtgatcgatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 6
ccgaagatcc caacgaggag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 7
ctttccaccc agtgacgacg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 8
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 9
tagcccacgg cgcatta 17
<210> 10
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<212> DNA
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<400> 10
gcatatacga tacaaggctg 20
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 11
gaaacaccgg gtcttcgaga agacctgttt taga 34
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 12
ctttgtggcc cagaagctct tctggacaaa atctcgatct 40
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 13
gaaacaccgc tttccaccca gtgacgacgg ttttaga 37
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 14
gaaacaccgg ctctctgctc cggctgctgt tttaga 36
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 15
gaaacaccgc ttcggtaata acacctccgg ttttaga 37
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 16
gaaacaccga tcgatcacct ccggtacagt tttaga 36
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 17
gaaacaccgc tcctcgttgg gatcttcggg ttttaga 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 18
gaaacaccgc tttccaccca gtgacgacgg ttttaga 37
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 19
ctttccaccc agtgacgacg 20
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 20
tgatcctatc agccatgaga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 21
acttccaccc agtgacgacg 20
<210> 22
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 22
cattccacc 9
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 23
ctttccaccc agtgacg 17
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 24
ctttccaccc agtgacgg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 25
ctttccaccc agtgacga 18
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 26
ctttccaccc agtga 15
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 27
ctttccaccc agtgag 16
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 28
ctttccaccc agtga 15
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 29
tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgacgacga 60
gga 63
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 30
tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgagga 57
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 31
tgaggtgatc gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtga 48
<210> 32
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 32
tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgagga 57
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 33
tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgagga 57
<210> 34
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 34
tgaggtgatc gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtga 48
<210> 35
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 35
tgtaccggag gtgatcgatc ttacctgcca cgaggctggc tttccaccca gtgagga 57
<210> 36
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 36
accggaggtg atcgatctta cctgccacga ggctggcttt ccacccagtg acgagga 57

Claims (1)

1.一种降低可复制性腺病毒的细胞株NHEK-C28的建立与应用，其特征在于，包括以下步骤:
步骤S1:针对E1A基因，设计sgRNA序列；
1)根据NCBI查询E1A基因序列；将其CDS序列输入到gRNA设计网站中，选择分数较高的gRNA；
2)将预测的数条gRNA输入到二级结构预测网址，选择出合适的6条gRNA序列；
3)第三方公司合成gRNA序列；
步骤S2:构建PX459-sgRNA载体；
1)将合成的6条gRNA分别退火成双链sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5，sgRNA6；
2)含Cas9酶的PX459质粒用限制性内切酶BbsI酶切，胶回收；将双链sgRNA1～6分别与酶切胶回收产物连接反应；连接产物转化到Stabl3感受态细胞中，涂板；挑菌落，经PCR初步鉴定；
3)将初步鉴定阳性的菌落摇菌，菌液送第三方公司测序鉴定构建的结果；
步骤S3:将PX459-sgRNA1～6质粒分别转染到单克隆细胞JH293-Clone21中；
1)前一天JH293-Clone21细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的PX459-sgRNA1质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)其他质粒转染按相同步骤操作；
4)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；
步骤S4:验证各sgRNA的敲除效率；
1)转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选，筛选72h后，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，western检测E1A蛋白水平；
步骤S5:选PX459-sgRNA 6质粒敲除的细胞进行单克隆的筛选；
1)细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜，培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn，待做标记的细胞长满后，扩增培养；
步骤S6:筛选出的单克隆细胞鉴定敲除效果，选择一株敲除效果好的单克隆；
1)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA；
2)以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序；
3)收集另一部分细胞提取蛋白，Western-blot检测E1A蛋白水平；
步骤S7:再次敲除筛选出的C14细胞；
1)前一天C14细胞铺六孔板，5x10^5/孔，第二天细胞观察细胞融合率，以达到70～80％时为宜；
2)准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释2μg的PX459-sgRNA4质粒，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；再准备一1.5mL的EP管，用无血清DMEM稀释4μg的PEI转染试剂，总体积为125μL，混匀，室温放置5min；将稀释的转染试剂加入到稀释的质粒中，混匀，室温放置20min；将共250μL的转染液加入轻轻均匀加入到细胞中，轻轻混匀；
3)将培养板放入37℃、5％CO2培养箱中；转染后48h加入嘌呤霉素0.25μg/mL筛选；筛选72h后，细胞稀释后铺96孔板，以每孔不大于1个细胞为宜；培养1周后，挑选含有单个克隆群的细胞做标记，标记为Cn；待做标记的细胞长满后，扩增培养；
4)待细胞足够多时，收集一部分细胞提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR扩增含gRNA位置的目的序列，将PCR产物送至第三方进行测序，筛选出现套峰的单克隆细胞，并进行T载体测序；
步骤S8:敲除细胞NHEK-C28中E1A蛋白水平表达；
1)分别收集六孔板中1个孔的JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞，用PBS缓冲液洗两遍；各加入150μL的细胞裂解液，冰上裂解15min；按照蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度；
2)分别取20μg的蛋白，加入一定量的上样缓冲液，煮沸5min；按照常规Western-Blot实验操作进行跑胶、转膜、封闭、孵育一抗和二抗；按照ECL发光液说明书进行检测；
步骤S9:敲除细胞NHEK-C28功能验证；
1)细胞增殖能力
(1)前一天，分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板24孔板，1x10^4/孔，记为第0天；
(2)分别在第1～7天，按下列程序进行计数，每次均三孔重复：
弃上清，用PBS洗一遍，弃掉；
加入100μL的消化液，培养箱中放置1min；
加入400μL的培养基终止消化，吹打混匀；
取20μL的细胞悬液加入20μL的台盼蓝中，混匀，吸取10μL在显微镜下计数；
根据体积换算成实际的细胞数目；
(3)根据细胞数目作图；
2)细胞产毒能力
(1)前一天分别将JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞铺板6孔板，5x10^5/孔；
(2)第二天，分别将等量的无复制能力的Ad-cre病毒与含2％FBS的DMEM混合，弃孔内上清，将感染液加入到六孔板中；
(3)三天后，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；
(4)经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(5)分别将上清用试剂，20mM Tris,25mM NaCl,2.5％glycerol(w/v),pH 8.0，稀释10倍后，室温孵育15min；
(6)检测260nm吸光度值；
(7)换算成每毫升病毒颗粒数，即VP/mL；
3)作为包装细胞产生可复制型病毒能力
(1)前一天Hela细胞铺板24孔板，1x10^5/孔，每组设立三孔重复；
(2)第二天加入等量VP的由JH293-Clone21、C14和NHEK-C28细胞产生的Ad-cre病毒，同时以野生型的Ad5为阳性对照，Ad5为1000VP，不加任何病毒为阴性对照；记为第0天；
(8)第1天收毒，收集细胞和上清，吹打混匀转移至EP管中；经-80℃/37℃三次反复冻融后，3000rpm离心5min，取上清；
(9)第2天铺板，同样再次铺板Hela细胞；
(10)第3天收毒和感染，同步骤(8)，将取得上清的1/4按步骤(2)进行感染；
(11)第4天收毒，同步骤(8)；
(12)第5天铺板，同步骤(9)；
(13)第6天收毒和感染，同步骤(10)；
(14)第7天收毒，同步骤(8)；
(15)第8天铺板，同步骤(9)；
(16)第9天收毒，同步骤(8)；
(17)次收的病毒上清提取病毒基因组；
(18)Taqman探针法测定含有的RCA的量。
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Citations (6)

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