CN104988114A - 一种稳定高效包装病毒的293t 细胞株及其应用 - Google Patents
一种稳定高效包装病毒的293t 细胞株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104988114A CN104988114A CN201510404992.9A CN201510404992A CN104988114A CN 104988114 A CN104988114 A CN 104988114A CN 201510404992 A CN201510404992 A CN 201510404992A CN 104988114 A CN104988114 A CN 104988114A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- cell strain
- cell
- packaging
- atcc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种稳定高效包装病毒的293T细胞株及其应用。具体地，本发明提供一种稳定高效包装病毒的293T细胞株，所述细胞株的保藏号为：CCTCC C2015110。该293T细胞株，转染效率高于商品化的293T细胞；能够稳定高效地对病毒进行包装，并且细胞毒性低于商品化293T细胞株；而且细胞传代12次后，通过滴度检测，病毒滴度始终保持在1.0E+9TU/ml以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定高效包装病毒的293T细胞株及其应用。
背景技术
293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用磷酸钙法转染，293T细胞转染效率可高达50％；蛋白表达水平高。主要用于病毒包装或瞬时转染来过表达各种外源目标蛋白。
目前，美国细胞培养库(American Type Culture Collection,ATCC)已将该细胞系开发成商业化，并广泛用于体外检测和生产重组蛋白质和病毒。然而，目前使用的293T细胞转染效率仍不能达到生产要求，其包装病毒的病毒滴度不高。因此，筛选高转染效率和高出毒滴度的293T细胞成为本领域中需要克服和解决的重要问题。
利用病毒载体传送外源基因组进入细胞，进行包装感染，该分子机制可将遗传物质带入细胞。可发生于完整活体或是细胞培养中，用于基础研究、基因疗法或疫苗。可供利用的病毒载体可分为逆转录病毒载体、慢病毒载体与腺病毒载体。病毒载体已成为当前基因治疗载体研究的热点。
慢病毒的类型有人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、马传染性贫血EIA等。具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定高效包装病毒的293T细胞株及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种293T细胞株,所述细胞株为保藏号为CCTCCC2015110的人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株、或所述GC-293T细胞株的衍生细胞株。
在另一优选例中，所述GC-293T细胞株的病毒转染效率比商品化的ATCC 293T细胞株(货号为ATCC CRL-3216TM)的病毒转染效率高，优选地高10％以上。
在另一优选例中，针对同种病毒，所述GC-293T细胞株包装病毒滴度比ATCC293T细胞株包装病毒滴度高，优选地高出5倍以上，更优选地高出10倍以上。
在另一优选例中，所述GC-293T细胞株包装病毒滴度在3.0E+8TU/ml以上，优选地在1.0E+9TU/ml以上。
在另一优选例中，所述GC-293T细胞株包装的病毒的细胞毒性低于ATCC 293T细胞株包装的病毒的细胞毒性。
本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的293T细胞株，在病毒包装中的应用。
在另一优选例中，所述病毒选自下组：逆转录病毒、慢病毒、和腺病毒。
在另一优选例中，所述慢病毒选自：人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、和马传染性贫血EIA。
本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为基因工程化的本发明第一方面所述的293T细胞株。
在另一优选例中，所述宿主细胞中含有外源的基因。
在另一优选例中，所述宿主细胞表达外源的蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1-3中4个载体质粒的图谱信息；
图2为实施例1中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株质粒转染后细胞照片和转染效率比较；
图3为实施例1中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较；
图4为实施例2中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株质粒转染后细胞照片和转染效率比较；
图5为实施例2中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较；
图6为实施例3中不同代次的GC-293T细胞株转染后细胞照片和转染效率比较；
图7为实施例3中不同代次GC-293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一株GC-293T细胞株，保藏号为CCTCC C2015110，保藏时间为2015年7月7日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学校内。实验结果表明，与商业化的293T细胞株相比，该GC-293T细胞株的病毒感染效率、包装病毒滴度有显著提高，并且所包装的病毒具有较低的细胞毒性。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明提供了一种用于包装病毒的293T细胞株及其应用，该细胞株具有比商品化293T细胞株更高的转染效率和病毒包装稳定性，而且该细胞株转染效率和包装的病毒滴度较商品化293T细胞株高，包装的病毒细胞毒性较商品化293T细胞株低。
本发明的目的是提供一种稳定高效包装病毒的293T细胞株。该细胞株出毒效率、转染效率和病毒滴度高，且病毒包装效果稳定；能够解决现有生产中的问题，提高病毒包装效果。
本发明还提供了上述293T细胞株的驯化方法。
本发明另一个目的是将这种293T细胞株用于包装慢病毒。
本发明还比较了上述293T细胞株和商品化293T细胞的转染情况和病毒包装情况。
本发明提供的人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株，保藏号为CCTCC C2015110,以下称为GC-293T细胞(中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学校内；邮编:430072培养物名称:人胚肾上皮细胞GC-293T；2015年7月7日保藏)。
该GC-293T细胞属于人胚肾上皮细胞，培养方法为:DMEM培养基(血清含量10％)，5％C02，37℃培养。
在本发明较佳的实施方式中，本发明还提供了该GC-293T细胞株的衍生细胞株，所述衍生细胞株可以是GC-293T细胞株经传代获得的，或者经改造(包括但不限于基因改造)获得的。
上述人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株的驯化方法，包括如下步骤：
(1)取对数生长期的人胚肾上皮细胞293T细胞进行去支原体操作；
(2)去除支原体后的293T细胞稀释(每个细胞培养孔内一个细胞)后进行贴壁培养，使其形成单克隆；
(3)形成单克隆后，进行扩大培养，筛选长势好的单克隆进行进一步扩大培养；
(4)将单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，挑选转染效率高，出毒效率高；包装病毒滴度高，对细胞毒性小的单克隆细胞株，即获得了GC-293T细胞株。
上述GC-293T细胞株传代12次后，仍保持稳定的转染与病毒包装效果(包括病毒滴度和细胞毒性)。
本发明的主要优点在于：
(1)GC-293T细胞株转染效率高达80％以上；
(2)包装病毒的病毒滴度可以达到1.0E+9TU/ml以上，并且传代多次后，病毒包装效果稳定可靠；
(3)GC-293T细胞株所包装的病毒具有较低的细胞毒性。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
1、比较GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株(购自ATCC，货号为ATCCNO.CRL-3216TM)的磷酸钙-DNA转染效率和病毒包装效果，包括病毒滴度和细胞毒性。
2、将本发明GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株接种到6cm细胞培养皿上，培养约24h至对数生长期(细胞密度约80％)。
3、进行转染前换液，并进行可见光拍照观察，保证两株细胞生长状态和细胞密度都非常接近。
4、将GFP标记的空载质粒与慢病毒元件质粒混合，用磷酸钙-DNA沉淀进行三质粒病毒包装系统转染GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株：其中，空载质粒GV248(吉凯基因产品货号：PCONGC248028254)的顺式元件顺序为：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，通过本发明GC-293T细胞株和ATCC293T细胞株包装的病毒分别命名为GC-293T-GV248和ATCC 293T-GV248；病毒元件质粒为Helper1.0和Helper2.0(吉凯基因产品货号：LPK 001Lenti-Easy Packaging system)；GV248、Helper1.0和Helper2.0图谱信息如图1所示。两株细胞的各项转染条件均保持一致。
5、转染8h后，进行转染后换液，继续培养。
6、转染24h后，荧光显微镜下观察包装细胞，进行拍照和转染效率比较，结果如图2，结果表明本发明GC-293T细胞株的转染效率为85％,高于ATCC 293T细胞株(70％)。
7、换液培养48h后，收集细胞上清液，过滤去除细胞碎片。
8、低温超速离心(Beckman XE-90，32000R，4℃)80min，收集病毒颗粒，两种病毒颗粒中均加入同体积病毒保存液重悬病毒颗粒，冻存。
9、提前一天在96孔板中接种正常293T细胞，每孔密度为2×104个细胞，体积为50μl/孔，于37℃，5％CO2条件下培养。
10、加入100μl不同梯度稀释的病毒液，共5个梯度，每个梯度间10倍关系递变，根据浓度高低，依次标注为E2，E1，E0，E-1，E-2。
11、感染后24小时，贴壁补加细胞培养基100μl，继续培养。
12、感染后72小时，荧光拍照并滴度检测，结果如图3。可以看出，本发明GC-293T细胞株的病毒滴度为2.1E+9TU/ml,高于ATCC 293T细胞株(5.0E+8TU/ml)；可见光的照片对比可以看出本发明GC-293T细胞株所包装病毒颗粒GC-293T-GV248的细胞毒性较ATCC 293T-GV248低，其对细胞的影响小，细胞生长正常，而ATCC 293T细胞株所包装病毒ATCC 293T-GV248感染的细胞生长状态较差，细胞密度明显较低。
实施例2
选择插入基因构建的质粒对GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株进行病毒包装测试和比较。
1、选择插入基因构建的质粒：
GV208-HMOX1质粒是在GV208(吉凯基因产品货号：PCON063)载体上(顺式元件顺序为：Ubiquitin-MCS-EGFP)插入HMOX1基因的质粒，在GC-293T细胞株上包装的病毒命名为GC-293T-HMOX1，在ATCC 293T上包装的病毒命名为ATCC 293T-HMOX1；GV208载体图谱如图1中所示。
2、GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株进行磷酸钙-DNA转染，转染GV208-HMOX1质粒。使用6cm细胞培养皿进行转染和培养。
3、转染前后荧光显微镜拍照比较转染效率，结果如图4。可以看出，GC-293T细胞株的转染效率(80％)高于ATCC 293T细胞株(70％)。
4、病毒颗粒收集和保存操作同实施例1中所述。
5、病毒GC-293T-HMOX1和ATCC 293T-HMOX1感染操作同实施例1。
6、病毒GC-293T-HMOX1和ATCC 293T-HMOX1感染结果如图5所示。病毒GC-293T-HMOX1滴度测定为2.0E+9TU/ml,明显比ATCC 293T细胞株包装的病毒滴度(2.0E+8)高；而且从图5可以明显判断，GC-293T细胞株包装的病毒感染293T细胞时，对细胞的毒性远小于ATCC 293T细胞株所包装的病毒。综合本实施例和实施例1中结果，说明本发明GC-293T细胞株的转染效率和病毒包装滴度明显比商品化的ATCC 293T细胞株好。
实施例3
多次传代观察GC-293T细胞株的转染效率和病毒包装稳定性。
将复苏的GC-293T细胞株(标记为P0)传代12次，不同代次的细胞分别标记为P1～P12。
选择P0，P4，P12代次的GC-293T细胞株进行质粒转染，和病毒包装。
选用的质粒：GV248质粒；质粒GV248在P0，P4，P12代次的GC-293T细胞株上包装的病毒分别命名为GV248-P0，GV248-P4，GV248-P12。
P0，P4，P12细胞株转染前后拍照观察，结果如图6。可见不同代次GC-293T细胞株转染效率没有明显差别，即随着传代次数增加，细胞的转染效率没有随着下降，仍保持在80％。
病毒GV248-P0，GV248-P4，GV248-P12感染操作同实施例1，滴度检测结果如图7所示。可见不同代次GC-293T细胞株的病毒包装能力稳定，病毒滴度没有随传代次数增加而下降，滴度维持在1.0E+9TU/ml，包装效率稳定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种293T细胞株,其特征在于，所述细胞株为保藏号为CCTCC C2015110的人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株、或所述GC-293T细胞株的衍生细胞株。
2.如权利要求1所述的293T细胞株，其特征在于，所述GC-293T细胞株的病毒转染效率比商品化的ATCC 293T细胞株(货号为ATCC CRL-3216TM)的病毒转染效率高，优选地高10％以上。
3.如权利要求1所述的293T细胞株，其特征在于，针对同种病毒，所述GC-293T细胞株包装病毒滴度比ATCC 293T细胞株包装病毒滴度高，优选地高出5倍以上，更优选地高出10倍以上。
4.如权利要求1所述的293T细胞株，其特征在于，所述GC-293T细胞株包装的病毒的细胞毒性低于ATCC 293T细胞株包装的病毒的细胞毒性。
5.根据权利要求1所述的293T细胞株，在病毒包装中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述病毒选自下组：逆转录病毒、慢病毒、和腺病毒。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述慢病毒选自：人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、和马传染性贫血EIA。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为基因工程化的权利要求1所述的293T细胞株。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有外源的基因。
10.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达外源的蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510404992.9A CN104988114B (zh) | 2015-07-10 | 2015-07-10 | 一种稳定高效包装病毒的293t细胞株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510404992.9A CN104988114B (zh) | 2015-07-10 | 2015-07-10 | 一种稳定高效包装病毒的293t细胞株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104988114A true CN104988114A (zh) | 2015-10-21 |
| CN104988114B CN104988114B (zh) | 2018-10-09 |
Family
ID=54300009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510404992.9A Active CN104988114B (zh) | 2015-07-10 | 2015-07-10 | 一种稳定高效包装病毒的293t细胞株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104988114B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154713A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 郑州大学 | 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102911911A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-06 | 上海黄离生物科技有限公司 | 人胚肾细胞293t-c10单克隆细胞株及其制备和应用 |
-
2015
- 2015-07-10 CN CN201510404992.9A patent/CN104988114B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102911911A (zh) * | 2012-09-29 | 2013-02-06 | 上海黄离生物科技有限公司 | 人胚肾细胞293t-c10单克隆细胞株及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 孙克宁等: "贴壁和悬浮状态293T细胞慢病毒包装效果的比较研究", 《河南农业大学学报》 * |
| 沈原等: "SNCA 基因过表达慢病毒质粒构建及稳定转染293T细胞系", 《脑与神经疾病杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111154713A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-05-15 | 郑州大学 | 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 |
| CN111154713B (zh) * | 2020-01-17 | 2022-03-25 | 郑州大学 | 人胚肾上皮细胞293T-Clone3单克隆细胞株及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104988114B (zh) | 2018-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102604889B (zh) | 适应无血清培养的hek293细胞系及其应用 | |
| CN105950544B (zh) | 全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法 | |
| CN113981007B (zh) | 基于hek293t克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法 | |
| Wang et al. | Establishment and characterization of a cell line from tilapia brain for detection of tilapia lake virus | |
| CN102965341B (zh) | 人脐带间充质干细胞系及其建立方法和应用 | |
| JP2004505623A5 (zh) | ||
| US20170204374A1 (en) | Method for evaluating quality of human mesenchymal stem cell, and monoclonal antibody for use in said method | |
| CN110423726A (zh) | 无Sf-RV污染的Sf9细胞株及其筛选方法和应用 | |
| Stephen et al. | Recombinant expression of tandem-HBc virus-like particles (VLPs) | |
| CN107267443A (zh) | 一种适应全悬浮培养的vero E6细胞株及其应用 | |
| CN111073856A (zh) | 一种滋养细胞及其制备方法和在nk细胞扩增中的应用 | |
| CN102911911B (zh) | 人胚肾细胞293t-c10单克隆细胞株及其制备和应用 | |
| CN104560865B (zh) | 抗a亚群禽白血病病毒的细胞系及其构建方法与应用 | |
| CN104988114A (zh) | 一种稳定高效包装病毒的293t 细胞株及其应用 | |
| CN116694575B (zh) | 悬浮培养Marc145细胞的方法 | |
| Frascaroli et al. | Distinct properties of human cytomegalovirus strains and the appropriate choice of strains for particular studies | |
| Vonka et al. | Replication of cytomegalovirus in human epitheloid diploid cell line | |
| CN104830907A (zh) | 骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法 | |
| Watanabe et al. | Development of transplantable genetically modified corneal epithelial cell sheets for gene therapy | |
| Rhim et al. | Activation by 5-bromo-2′-deoxyuridine of particles resembling guinea-pig leukemia virus from guinea-pig nonproducer cells | |
| Frascaroli et al. | Distinct properties of human cytomegalovirus strains and the appropriate choice of strains for particular studies | |
| Fortunato | Using Diploid Human Fibroblasts as a Model System to Culture, Grow, and Study Human Cytomegalovirus Infection | |
| Rhim et al. | Neoplastic transformation of chimpanzee cells induced by adenovirus type 12--simian virus 40 hybrid virus. | |
| JP2023505101A (ja) | 無血清培地で浮遊培養可能な新規のベロ細胞株、その製造方法、及び該新規細胞株を用いたワクチン用ウイルスの製造方法 | |
| Beckmann et al. | Propagation and primary isolation of papovavirus JC in epithelial cells derived from human urine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20151021 Assignee: China (Shanghai) Biological Medicine Co Ltd Assignor: Shanghai Genechem Co., Ltd. Contract record no.: 2017310000070 Denomination of invention: 293T cell line for stably and efficiently packaging virus and application thereof License type: Common License Record date: 20171225 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District Patentee after: Shanghai Jikai gene Medical Technology Co.,Ltd. Address before: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District Patentee before: SHANGHAI GENECHEM Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |