CN111758743A - 一种防控苹果或梨重茬障碍的土壤杀菌剂及其应用 - Google Patents

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    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus

Abstract

本发明公开了一种土壤杀菌剂，由以下步骤制备而成：(1)将新鲜蚯蚓中加入水进行匀浆，制得组织匀浆，将组织匀浆进行消毒；(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液进行发酵，制得土壤杀菌剂。本发明土壤杀菌剂绿色环保、抑菌效果好，将本发明土壤杀菌剂应用到防控苹果、梨重茬障碍中，能够有效抑制灭杀有害真菌、优化重茬土壤微生物环境，达到防控重茬障碍的效果。

Description

一种防控苹果或梨重茬障碍的土壤杀菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及农业栽培技术领域，具体涉及一种防控苹果或梨重茬障碍的土壤杀菌剂及其应用。
背景技术
苹果、梨等果树重茬障碍表现为成活率低，树势弱，病虫害发生严重，产量变低，品质变劣等，损失巨大等现象。已有研究结果表明，有害微生物是引起苹果、梨重茬障碍的主要因素。
土壤添加剂(杀菌剂)是减轻果树重茬障碍的有效措施之一，常用的土壤添加剂主要有化学熏蒸剂、生物熏蒸剂和菌肥等，但不同的土壤添加剂均存在一定的局限性。常用化学熏蒸剂如溴甲烷、石灰氮和氯化苦等，对重茬障碍的防治效果好，但存在成本高、危害环境及人类健康等诸多问题。生物熏蒸剂如芥菜籽粕、万寿菊和农家粪肥等，利用自身分解时产生的具有灭杀作用的气体来抑制或者杀死重茬土壤中的微生物，从而减轻有害微生物对植株造成的危害，该方法是一种绿色无污染、对环境不造成伤害的绿色防治技术，但通常存在见效慢、效果不彻底等缺点。菌肥是另一种常用的土壤添加剂，是将对重茬障碍中有害真菌有拮抗、灭杀作用的有益微生物，经过培养发酵配合载体研制而成，菌肥可绿色有效地抑制有害微生物的生长，改善重茬土壤环境，减轻重茬障碍造成的危害，但同时也存在效果不稳定等缺点。因此，一种绿色、稳定、有效，且经济、易推广的土壤杀菌剂，对防控果树重茬障碍具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防控苹果或梨重茬障碍的土壤杀菌剂及其应用，本发明将蚯蚓匀浆后，经消毒后接种发酵菌种，在规定条件下充分发酵，形成富含大量抗菌肽的发酵产物，将该发酵产物作为土壤杀菌剂，在重新建园时，将其施入定植穴土壤中，能够有效抑制灭杀有害真菌、优化重茬土壤微生物环境，达到防控重茬障碍的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种土壤杀菌剂，由以下步骤制备而成：
(1)将新鲜蚯蚓中加入水进行匀浆，制得组织匀浆，将组织匀浆进行消毒；
(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液进行发酵，制得土壤杀菌剂。
优选的，步骤(1)中，新鲜蚯蚓与水的质量比为(3-6):1。
优选的，步骤(1)中，匀浆是在组织匀浆仪中进行。
优选的，步骤(1)中，消毒是采用巴氏消毒，消毒温度为70℃，消毒时间为30min。
优选的，步骤(2)中，所述发酵菌液为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，发酵菌液与组织匀浆的加入质量比为1:1000。
优选的，枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的质量比为1:1。
优选的，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/ml，黑曲霉菌的孢子浓度为1.2×109CFU/ml。
优选的，步骤(2)中，所述发酵为有氧发酵，发酵温度为35-38℃，发酵时间为8-12天。
本发明的第二方面，提供上述土壤杀菌剂在防控苹果或梨重茬障碍中的应用。
本发明的第三方面，提供一种防控苹果或梨重茬障碍的方法，包括如下步骤：在苹果或梨重茬土壤上挖定植沟，在定植沟内挖定植穴，将上述土壤杀菌剂施入定植穴，4-6天后进行幼树定植。
优选的，将土壤杀菌剂加水稀释后施入定植穴，其中土壤杀菌剂和水的体积比为100ml：(8-9)L。
优选的，所述定植穴为40cm见方。
本发明的有益效果：
1、本发明将蚯蚓匀浆后，经消毒后接种发酵菌种，在规定条件下充分发酵，形成富含大量抗菌肽的发酵产物，将该发酵产物作为土壤杀菌剂，在重茬建园时，将其施入定植穴土壤中，能够有效抑制灭杀有害真菌、优化重茬土壤微生物环境，达到防控苹果、梨重茬障碍的效果。
2、本发明土壤杀菌剂绿色环保、抑菌效果好，是一种绿色、有效、简单易推广的防控苹果、梨重茬障碍新制剂；本发明土壤杀菌剂中富含抗菌小肽，其抑菌效果良好。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，目前常用的土壤杀菌剂主要有化学熏蒸剂、生物熏蒸剂和菌肥等，常用化学熏蒸剂对重茬障碍的防治效果好，但存在成本高、危害环境及人类健康等诸多问题，生物熏蒸剂是一种绿色无污染、对环境不造成伤害的绿色防治技术，但通常存在见效慢、效果不彻底等缺点，菌肥可绿色有效地抑制有害微生物的生长，改善重茬土壤环境，减轻重茬障碍造成的危害，但同时也存在着易受环境因素影响、有益菌定殖不稳定等缺点。目前没有一种绿色环保、抑菌效果好且稳定性好的土壤杀菌剂。
基于此，本发明公开了一种绿色环保、抑菌效果好且稳定性好的土壤杀菌剂，本发明将蚯蚓匀浆后，经消毒后接种发酵菌种，在规定条件下充分发酵，形成富含大量抗菌肽的发酵产物，将该发酵产物作为土壤杀菌剂，在重茬建园时，将其施入定植穴土壤中，能够有效抑制灭杀有害真菌、优化重茬土壤微生物环境，达到防控苹果、梨重茬障碍的效果。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
一种土壤杀菌剂的制备，包括如下步骤：(1)将新鲜蚯蚓中加入水在组织匀浆仪中进行匀浆，制得组织匀浆，新鲜蚯蚓与水的质量比为4:1；将组织匀浆进行巴氏消毒；
(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液在温度为37℃的条件进行有氧发酵10天，发酵后的产物即为土壤杀菌剂，所述发酵菌液为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，发酵菌液与组织匀浆的加入质量比为1:1000，接种的发酵菌液中，枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的质量比为1:1，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/ml，黑曲霉菌的孢子浓度为1.2×109CFU/ml。
实施例2：
一种土壤杀菌剂的制备，包括如下步骤：(1)将新鲜蚯蚓中加入水在组织匀浆仪中进行匀浆，制得组织匀浆，新鲜蚯蚓与水的质量比为3:1；将组织匀浆进行巴氏消毒；
(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液在温度为38℃的条件进行有氧发酵8天，发酵后的产物即为土壤杀菌剂，所述发酵菌液为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，发酵菌液与组织匀浆的加入质量比为1:1000，接种的发酵菌液的枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的质量比为1:1，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/ml，黑曲霉菌的孢子浓度为1.2×109CFU/ml。
实施例3：
一种土壤杀菌剂的制备，包括如下步骤：(1)将新鲜蚯蚓中加入水在组织匀浆仪中进行匀浆，制得组织匀浆，新鲜蚯蚓与水的质量比为6:1；将组织匀浆进行巴氏消毒；
(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液在温度为35℃的条件进行有氧发酵12天，发酵后的产物即为土壤杀菌剂，所述发酵菌液为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，发酵菌液与组织匀浆的加入质量比为1:1000，接种的发酵菌液的枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的质量比为1:1，枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/ml，黑曲霉菌的孢子浓度为1.2×109CFU/ml。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)购自中国普通微生物保藏管理中心，编号：1.14985；黑曲霉菌(Aspergillusniger)来源于中国普通微生物保藏管理中心，编号：3.15297。
枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中，是一种无毒无害无污染的的菌种；同时枯草芽孢杆菌菌体生长过程中自身产生的枯草菌素、多粘菌素和短杆菌肽等活性物质可有效抑制致病菌活性，菌体自身可合成α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶类，对发酵蚯蚓组织匀浆起到关键作用。黑曲霉是发酵中的常用菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶。
1、土壤杀菌剂有效成分的确定：
将发酵后的产物经过滤离心并进一步提纯，经质谱法检测发现，该蚯蚓发酵产物中富含大量蚯蚓抗菌小肽，其中主要成分为蚯蚓抗菌肽。
实验步骤：
(1)取蚯蚓发酵产物2000mL，5000转/分离心10min，取上清液获得蚯蚓发酵产物抗菌肽粗提液。
(2)活化：加入200μLACN，以转速为3000rpm的离心机离心2min，并重复操作一次。
(3)平衡：加入200μL50％ACN-50％0.1％TFA，3000rpm离心2min，重复操作一次。加入200μL0.1％TFA溶液，3000rpm离心2min，重复操作一次。
(4)上样：将样品溶液转移至分子筛层析柱(SephadexG-25，洗脱液：0.033M乙酸)中，收集洗脱液
(5)脱盐：加入200μL0.1％TFA溶液，3000rpm离心2min。
(6)洗脱：加入100μL80％ACN-20％0.1％TFA溶液，3000rpm离心2min，收集上清液待测。
(7)经质谱分析(色谱柱信息：300umi.d.x5mm，packedwithAcclaimPepMapRSLCC18，5um，
Figure BDA0002579348560000041
nanoViperAcclaimPepMap75umX150mm，C18，3um，100A；流动相A：0.1％甲酸；流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速：300nL/min)检测，供试溶液中含有多种序列不同的氨基酸片段，这些氨基酸片段中的某些具有良好的杀菌作用。
2、土壤杀菌剂进行室内抑菌验证：
(1)将实施例1制得的土壤杀菌剂、实施例1制得组织匀浆、无菌水分别加入灭菌后未凝固的PDA培养基，充分混匀后倒入平板培养皿(培养皿直径9cm)中，静置凝固。
(2)将培养好的供试串珠、腐皮、尖孢和层出四种苹果重茬障碍病原镰孢菌菌株用直径0.5cm的打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，并将菌饼接入上述培养基中，于28℃下恒温培养。
(3)7天后测量菌落直径，观察并记录不同处理条件对有害菌的抑制作用。
(4)当加入无菌水的对照组病原菌菌落覆盖满培养皿时，测量并记录土壤杀菌剂(表1中的发酵产物)、组织匀浆两个处理组的病原菌菌落直径，并分别计算抑菌率，抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。
表1发酵产物对连作障碍四种有害真菌的抑制率
Figure BDA0002579348560000051
由表1可以看出，蚯蚓发酵产物对苹果连作障碍中四种主要有害真菌尖孢、层出、腐皮和串珠的抑制率分别达到了83.81％、84.03％、83.79％和86.02％。
3、土壤杀菌剂田间验证：
苹果园更新重建时，在苹果重茬土壤上挖定植沟，在定植沟内挖40cm见方的定植穴，将300ml实施例1制备的土壤杀菌剂(表2中的发酵产物)中加入50斤水稀释后施入定植穴内，5天后进行苹果幼树定植，作为实验组。同时设置对照组和灭菌土处理，对照组(CK)是在定植穴内施入与土壤杀菌剂等量的无菌水，其他条件与实验组均相同。
表2发酵产物对连作条件下苹果幼树生长的影响
Figure BDA0002579348560000052
Figure BDA0002579348560000061
由表2可知，正常水肥管理一年后，实验组的苹果幼树株高、径粗和发枝量分别比对照组提高了18.5％、18.0％和74.1％。
表3发酵产物对有害真菌的影响
Figure BDA0002579348560000062
由表3可以看出，经qPCR检测，施入本发明土壤杀菌剂后，连作土壤中串珠、腐皮、尖孢和层出四种有害菌的数量比对照组减少了49.8％、56.9％、42.4％和56.9％。
因此，通过本发明土壤杀菌剂中的抗菌肽能够抑制连作土壤中有害真菌的生长，改善连作土壤微生物环境，减轻连作对苹果幼树的危害。
应用例
2017年3月起，在山东省烟台市莱州市大沙岭村(37.40°N120.09°E)、凤毛寨村(37.41°N120.07°E)、湾头村(37.09°N119.80°E)进行了田间验证，三地土壤质地分别为砂壤土、壤土和粘壤土。试验用苹果苗木为2年生嫁接苗，砧穗组合为烟富3/T337，嫁接苗茎粗大约10mm,定干至1.4m，栽植株行距为1.5m×4m。建园时，在苹果重茬土壤上挖定植沟，在定植沟内挖40cm见方的定植穴，将300ml蚯蚓发酵产物(实施例1制备得到的土壤杀菌剂)中加入50斤水稀释后施入定植穴内，5天后进行苹果幼树定植，作为实验组，以300ml无菌水施入50斤水中为对照组。正常田间水肥管理，定期测定苹果幼树长势。
表4发酵产物施入一年后果树长势变化
Figure BDA0002579348560000071
表5发酵产物施入后第三年果树长势变化
Figure BDA0002579348560000072
表4和表5中，CK为对照组，FP为实验组。
本发明在山东烟台三种不同土壤质地的连作果园中进行的重茬障碍防治效果已证实，用本办法防治苹果重茬障碍可有效提高连作条件下苹果幼树的成活率，明显提高树势，提高产量，可有效克服苹果重茬障碍。
利用本发明产品和相同技术方法，分别在山东莱阳、冠县及泰安三等进行了梨重茬障碍防控验证，取得良好效果。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种土壤杀菌剂，其特征在于，由以下步骤制备而成：
(1)将新鲜蚯蚓中加入水进行匀浆，制得组织匀浆，将组织匀浆进行消毒；
(2)将步骤(1)消毒后的组织匀浆接种发酵菌液进行发酵，制得土壤杀菌剂。
2.根据权利要求1所述的土壤杀菌剂，其特征在于：步骤(1)中，新鲜蚯蚓与水的质量比为(3-6):1。
3.根据权利要求1所述的土壤杀菌剂，其特征在于：步骤(1)中，消毒是采用巴氏消毒。
4.根据权利要求1所述的土壤杀菌剂，其特征在于：步骤(2)中，所述发酵菌液为枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌，发酵菌液与组织匀浆的加入质量比为1:1000。
5.根据权利要求4所述的土壤杀菌剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌和黑曲霉菌的质量比为1:1。
6.根据权利要求4所述的土壤杀菌剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌的有效活菌数为1×109CFU/ml，黑曲霉菌的孢子浓度为1.2×109CFU/ml。
7.根据权利要求1所述的土壤杀菌剂，其特征在于：步骤(2)中，所述发酵为有氧发酵，发酵温度为35-38℃，发酵时间为8-12天。
8.权利要求1-7任一项所述的土壤杀菌剂在防控苹果或梨重茬障碍中的应用。
9.一种防控苹果或梨重茬障碍的方法，其特征在于，包括如下步骤：在苹果或梨重茬土壤上挖定植沟，在定植沟内挖定植穴，将权利要求1-7任一项所述的土壤杀菌剂施入定植穴，4-6天后进行苹果或梨幼树定植。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：将土壤杀菌剂加水稀释后施入定植穴，其中土壤杀菌剂和水的体积比为100ml：(8-9)L。
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