CN110734875A - 一种用于防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域,具体提供了一株新的枯草芽孢杆菌VB1700(Bacillus subtilis VB1700),保藏编号CCCTCC NO:M2019441,并提供了其在农业生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌筛选自江苏抚州枯萎病高发病地块,对尖孢镰刀菌具有显著抑制作用,可有效防治常见作物病害,应用前景广泛。

Description

一种用于防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域,具体涉及一种用于防治植物病害的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高,生物防治已成为继农业、化学防治之后的又一重要防治方法,许多生物杀菌剂已相继问世,并广泛应用于生产,取得显著效果。
生防菌的种类繁多,生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌、病毒等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等;细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌(PGPR)、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等;放线菌主要有链霉菌及其变种;病毒的弱毒株系;病原菌的无致病力突变菌株。
生防菌的生防机制是多种多样的,如产生抗菌素、重寄生、溶菌作用、竞争作用和诱导抗性等。由于大多数据是在试验条件下获得的,而田间条件要复杂的多,所以实际上可能两种或三种机制同时起作用,也可能是在植物不同部位或不同发育时期某一机制在起主要作用。此外,生防机制可能还包括(1)在逆境中如干旱、养分的胁迫下,通过加强根系和植株的发育提高耐性;(2)可诱导植物对病菌的抗性;(3)增加土壤中营养成分的溶解性,并促进其吸收;(4)使病原菌的酶钝化。
目前,生防菌在植物病害防治中存在以下问题:一是生防菌在田间自然条件下定殖能力差。大多数生防菌是在试验条件下筛选鉴定的,与田间自然条件有很大区别,这些生防菌在田间施用后往往因定殖能力弱,形不成足够的生物群体而降低防效。二是生防菌的抗药能力差。在试验条件下,有的生防菌生防效果不错,但在田间由于田间残留的农药或施用农药后,种群数量迅速下降。三是菌株稳定性问题。目前生防菌制剂多为活菌制剂,田间应用时常受到温度、湿度、土壤pH值等外界因素的影响,因此防治效果不稳定。因此,筛选具有稳定性好、抗药能力强等特征的新型生防菌株,具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并提供了其在植物病害防治中的应用。所述枯草芽孢杆菌筛选自江苏抚州枯萎病高发病地块,对尖孢镰刀菌具有显著抑制作用,可有效防治常见作物病害,应用前景广泛。
本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌VB1700(Bacillussubtilis VB1700),已于2019年6月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心,其保藏号为CCTCC NO:M2019441。
本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。
所述植物病害包括枯萎病、死棵病、烂脖子病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、烂果病、灰霉病、褐斑病和果腐病中的任意一种。
本发明还提供了一种微生物制剂,包含上述枯草芽孢杆菌VB1700。
所述微生物制剂还包含芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或两种或多种的组合。
所述微生物制剂中枯草芽孢杆菌VB1700的活菌量至少为108CFU/g。
本发明还提供了上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。
本发明筛选到的枯草芽孢杆菌VB1700对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用,抑菌带宽度超过24mm。所述枯草芽孢杆菌可广泛应用于常见植物病害的防治,其中对西红柿枯萎病、甜瓜死棵病和姜烂脖子病的防治效率分别高达94.7%、88.8%和82.1%,取得了意料不到的技术效果。
枯草芽孢杆菌VB1700在防治西红柿枯萎病和甜瓜死棵病的同时,还可以显著提高西红柿和甜瓜的产量和品质。与冲施化学药剂的阳性对照组相比,冲施枯草芽孢杆菌VB1700菌粉的处理组2西红柿的产量、VC含量和糖度分别提高15.1%、12.1%和7.8%。与空白对照组相比,处理组甜瓜的产量普遍提高了10.4%-20.1%,甜瓜中可溶性固形物含量提高了12.3%-24.4%,维生素C含量提高了10.6%-36.2%,取得了意料不到的技术效果。
本发明提供的枯草芽孢杆菌VB1700可单独作为防治西红柿枯萎病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防菌剂等,广泛应用于农业生产领域,还可与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合,用于其他常见植物病害的防治,防治效率达到70%以上,效果显著,应该前景广阔。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料,本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上,根据已有的技术进行常规的替换选择,而不仅限于本发明实施例的具体记载。
对于本发明所涉及的培养基配方如下:
PDA培养基:马铃薯洗净去皮,称取200g马铃薯切成小块,加蒸馏水煮烂(煮沸20-30min,能被玻璃棒戳破即可),用八层纱布过滤,加热,加入20g葡萄糖,搅拌均匀,加入15-20g琼脂,继续加热搅拌混匀,待琼脂溶解完后,稍冷却后再补足水分至1000mL,分装试管或者锥形瓶,封口膜封口,115℃灭菌20min,冷却后贮存备用。
PSA培养基:马铃薯200g,蔗糖20g,蒸馏水定容至1000mL,115℃灭菌20min(配制方法同上,不需加入琼脂);LB培养基:950ml去离子水中加入:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,溶解,用5mol/L NaOH调pH至7.0用去离子水定容至1L,灭菌条件为121℃20min。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例1土壤中微生物的筛选
1、土壤微生物的分离纯化:
(1)土壤样品:采集自黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块。
(2)称取0.5g土壤样品溶于4.5ml无菌水中制成1:10的土壤溶液,然后从中吸取0.5ml土壤溶液置于4.5ml无菌水中,制成1:100的土壤溶液,以此方法类推,制备1:106-107的土壤稀释溶液。
取3-4个适宜浓度的稀释液0.1ml均匀涂布于LB固体平板上;37℃培养2d后取出,挑取单个菌落继续分离纯化,直至每个平板上长出的菌落形态颜色一致,即为单一菌株。
采用上述方法,申请人共筛选出18株菌,分别命名为HK1、HK2、HK3、……、HK18。
2、生防菌初筛
将上述分离纯化的18株菌分别接种于营养肉汤培养基中,37℃,220r/min培养14h,制备成供试菌液备用。
将病原菌尖孢镰刀菌(山东省农科院植保所提供)在PDA培养基上培养5天后备用。
在营养琼脂培养基的中央接种尖孢镰刀菌菌饼,在菌饼两侧距离培养皿中心2.5cm处分别接种上述供试菌液,然后30℃培养箱中培养72h后,取出测量抑菌带的宽度,以此来判断抑菌效果。具体结果见表1。
表1不同菌株对尖孢镰刀菌的抑制效果
菌株 抑菌带宽度mm
HK1 21.0±1.0
HK2 23.0±1.5
HK3 21.0±1.0
HK4 20.0±1.5
HK5 20.0±1.0
HK6 18.0±1.5
HK7 16.0±0.5
HK8 24.0±0.5
HK9 21.0±1.0
HK10 19.0±1.5
HK11 18.0±0.5
HK12 23.0±1.5
HK13 20.0±1.0
HK14 19.0±0.5
HK15 18.0±1.0
HK16 22.0±1.0
HK17 17.0±1.5
HK18 19.0±0.5
从表1中的数据可以看出,本发明从土壤中筛选到的菌株中HK2、HK8、HK12和HK16对尖孢镰刀菌的抑制作用最强。其中,HK8菌株的抑菌效果最好,抑菌带宽度超过24mm。
3、传代稳定性分析
申请人采用打孔法对HK2、HK8、HK12和HK16四株菌各进行了18代的传代稳定性测试。结果显示,所述四株菌对尖孢镰刀菌的抑菌效果稳定性强,传代间无明显差异。
实施例2西红柿枯萎病防治实验
1、菌粉制备
将HK2、HK8、HK12和HK16四株菌分别在3吨发酵罐中进行液体发酵,当镜检芽孢率达到90%以上时停止发酵;5000rpm离心10min,去除发酵上清液,将菌泥进行喷雾干燥,制得活菌量为10亿/g的菌粉。
2、西红柿枯萎病防治实验
实验地点:青岛市城阳区夏庄西红柿种植大棚;
选取10m×8m的区域作为一个实验区,每个实验区内有10垄西红柿,约800±20株。共设置18个实验区,每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。
(1)空白对照组:清水冲施;
(2)阳性对照:化学药剂36%甲基硫菌灵悬浮剂500倍液冲施;
(3)菌粉处理组:在西红柿移栽后,将菌粉(活菌量10亿/g)按3kg/亩的用量随水浇施于西红柿根部,间隔7天用一次,连续使用三次。其中:
处理组1:HK2菌粉,用量为3kg/亩;
处理组2:HK8菌粉,用量为3kg/亩;
处理组3:HK12菌粉,用量为3kg/亩;
处理组4:HK16菌粉,用量为3kg/亩。
在西红柿结果期,统计各组西红柿枯萎病发病株数,计算发病率以及HK2、HK8、HK12和HK16四株菌对西红柿枯萎病的防治效率,具体结果见表2。
发病率=发病株数/总株数×100%。
防治效率%=(空白对照组发病率-处理组发病率)/空白对照组发病率×100%。
表2不同菌株对西红柿枯萎病的防治效果
实验分组 化学药剂/菌粉 平均发病率 平均防治效率
空白对照组 - 21.80% -
阳性对照组 36%甲基硫菌灵悬浮剂 1.20% 94.5%
处理组1 HK2 2.89% 86.7%
处理组2 HK8 1.15% 94.7%
处理组3 HK12 2.78% 87.2%
处理组4 HK16 1.58% 92.7%
从表2的结果可知,本发明筛选到的HK2、HK8、HK12和HK16四株菌对西红柿枯萎病均有显著的防治效果。其中,HK8菌株对西红柿枯萎病的防治效果最好,防治效率高达94.7%,与冲施化学药剂的阳性对照组相当。而进一步的检测结果显示,与冲施化学药剂的阳性对照组相比,冲施HK8菌粉的处理组2西红柿的产量、VC含量和糖度分别提高15.1%、12.1%和7.8%。从而说明,本发明筛选获得的HK8菌株不仅能有效防治西红柿枯萎病,还可显著提高西红柿的产量和品质,取得了意料不到的技术效果。
实施例3 HK8菌株的鉴定
对HK8菌株进行分子生物学鉴定,测得其16S rDNA序列,并在GenBank核酸数据库中进行Blast比对。结合HK8菌株的生物学特性和16S rDNA比对结果,申请人确认MC7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为枯草芽孢杆菌VB1700(Bacillus subtilisVB1700)。
申请人已于2019年6月6日将上述枯草芽孢杆菌VB1700(Bacillus subtilisVB1700)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCM2019441。
实施例4枯草芽孢杆菌VB1700在甜瓜死棵病防治中的应用
1、实验地点:
青岛市莱西市邹家许村甜瓜种植大棚。
2、甜瓜死棵病防治实验:
选取10m×8m的区域作为一个实验区,每个实验区内有10垄甜瓜,约400±10株。共设置12个实验区,每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。
(1)空白对照组:清水浇施甜瓜苗根部;
(2)VB1700菌粉处理组:将VB1700菌粉(活菌量为10亿/g)按1-5kg/亩的用量在甜瓜苗移栽后随水冲施,每隔7天用一次,连续用三次。其中:
处理组1:VB1700菌粉用量为1kg/亩;
处理组2:VB1700菌粉用量为3kg/亩;
处理组3:VB1700菌粉用量为5kg/亩。
在甜瓜收获期,分别统计各组甜瓜的死棵数,计算发病率和枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜死棵病的防治效率,具体结果见表3。
发病率=死棵数/总棵数×100%。
防治效率%=(空白对照组发病率-处理组发病率)/空白对照组发病率×100%。
表3枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜死棵病的防治效果
实验分组 发病率 防治效率-
空白对照组 24.1% -
VB1700处理组1 10.2% 57.6%
VB1700处理组2 5.8% 75.9%
VB1700处理组3 2.7% 88.8%
从表3的数据可以看出,施用枯草芽孢杆菌VB1700菌粉的各处理组甜瓜死棵病的发病率仅有2.7%-10.2%,远远低于对照组。从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜死棵病具有显著的防治效果,防治效率最高达到88.8%,取得了意料不到的技术效果。
3、枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜产量和品质的影响
进入成熟期后,每天6:00-8:00集中采摘成熟度超过8成的甜瓜,称重,记录各实验区每天的甜瓜产量;并从每个实验区每天采摘的甜瓜中随机挑取20个甜瓜,分别检测其可溶性固形物含量(质量百分比)和维生素C的含量(mg/100g)。
全部甜瓜收获完毕后,统计各实验区甜瓜的总产量,分别计算对照组和处理组甜瓜的平均总产量和增产率,具体结果见表4;分别计算对照组和处理组甜瓜中可溶性固形物和维生素C的平均含量,具体结果见表5。
增产率=(处理组甜瓜产量-空白对照组甜瓜产量)/空白对照组甜瓜产量×100%。
表4枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜产量的影响
实验分组 平均产量kg/亩 增产率%
空白对照组 2315 -
实验组1 2556 10.4%
实验组2 2643.2 14.2%
实验组3 2779.6 20.1%
表5枯草芽孢杆菌VB1700对甜瓜品质的影响
实验分组 可溶性固形物含量 VC含量mg/100g
空白对照组 8.2% 5.2
实验组1 9.2% 5.75
实验组2 9.3% 6.12
实验组3 10.2% 7.08
从表4和表5中的数据可知,通过在甜瓜苗期施用枯草芽孢杆菌VB1700菌粉,不仅可以有效防治甜瓜死棵病,还可以显著提高甜瓜的产量,提升甜瓜的品质。与空白对照组相比,处理组甜瓜的产量普遍提高了10.4%-20.1%,增产效果明显;处理组甜瓜中可溶性固形物含量提高了12.3%-24.4%,维生素C含量提高了10.6%-36.2%,取得了意料不到的技术效果。
实施例5枯草芽孢杆菌VB1700在姜烂脖子病防治中的应用
1、实验地点:
昌邑市围子街道姜种植地,该地块连年种姜,有严重的重茬病害—烂脖子病。
2、实验设计:
选取10m×8m的区域作为一个实验区,每个实验区内种10垄姜,约400±20株。共设置12个实验区,每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。
(1)空白对照组:不撒施任何菌粉,直接在姜沟中种姜;
(2)VB1700粉处理组:先将VB1700菌粉(活菌量为10亿/g)按1-5kg/亩的用量均匀撒施于姜沟内,然后在姜沟中种姜。其中:
处理组1:VB1700菌粉用量为1kg/亩;
处理组2:VB1700菌粉用量为3kg/亩;
处理组3:VB1700菌粉用量为5kg/亩;
在姜的生长过程中,对各实验区均采用相同的田间管理方法。在姜收获时,统计姜烂脖子病的发生情况,计算枯草芽孢杆菌VB1700对姜烂脖子病的防治效率,具体结果见表6。
病害分级标准:0级,姜株健康无病;1级,母姜株局部发病,子孙姜株健康无病;2级,子孙姜株有病斑,但无枯死;3级,姜丛局部枯死(30%~50%);4级,姜丛基本枯死或完全枯死,姜肉变色腐烂60%以下;5级,姜丛完全枯死,姜肉腐烂60%以上。
病情指数和防治效率计算公式分别为:
病情指数=(∑(各级发病株数×对应发病级数)/(调查总株数×最高发病级数))×100;
防治效率(%)=[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100%。
表6枯草芽孢杆菌VB1700对姜烂脖子病的防治效果
实验分组 病情指数 防治效率
空白对照组 74.8 -
VB1700处理组1 38.6 48.3%
VB1700处理组2 22.5 67.2%
VB1700处理组4 13.4 82.1%
从表6的数据可以看出,与对照组相比,在种姜前撒施枯草芽孢杆菌VB1700菌粉的各处理组姜的烂脖子病病情指数得到大幅度降低,从而说明本发明提供的枯草芽孢杆菌VB1700对姜烂脖子病具有显著的防治效果,防治效率最高达到82.1%,取得了意料不到的技术效果。
综上所述,本发明提供的枯草芽孢杆菌VB1700可单独作为防治西红柿枯萎病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防菌剂等,广泛应用于农业生产领域,还可与其他芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或多种进行组合,用于其他常见植物病害的防治,防治效率达到70%以上,效果显著,应该前景广阔。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO:M2019441。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的植物病害包括枯萎病、死棵病、烂脖子病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、烂果病、灰霉病、褐斑病和果腐病中的任意一种。
4.一种微生物制剂,其特征在于,所述的微生物制剂包含权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求5所述的微生物制剂,其特征在于,所述的微生物制剂还包含芽孢杆菌、假单胞菌、土壤杆菌、固氮菌、根瘤菌、青霉菌、曲霉菌、根霉菌、链霉菌中的任意一种或两种或多种的组合。
6.如权利要求4或5所述的微生物制剂,其特征在于,所述的微生物制剂中枯草芽孢杆菌的活菌量至少为108CFU/g。
7.权利要求4-6任一所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用。
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