CN114058546A

CN114058546A - 一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用

Info

Publication number: CN114058546A
Application number: CN202111414607.0A
Authority: CN
Inventors: 张波; 张新法
Original assignee: Shandong Weilan Lvyuan Bio Tech Co ltd
Current assignee: Shandong Weilan Lvyuan Bio Tech Co ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114058546B

Abstract

本发明提供了一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用。所述复合菌剂包含枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，甲基营养型芽孢杆菌，植物乳杆菌，多粘类芽孢杆菌中的任意一种或多种，还包含一种新型几丁质酶CHI‑S11。所述几丁质酶CHI‑S11的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的复合菌剂可广泛应用于枯萎病、茎基腐病、白粉病、炭疽病等常见植物病害的防治，其中几丁质酶CHI‑S11的添加能明显提高复合菌剂的综合防治效果，为植物病害的微生物防治提供了新的思路，具有较好的大田推广潜力。

Description

一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用，属于农业病害防治领域。

背景技术

微生物和农业的关系十分密切，素有“微生物大本营”之称的土壤中，微生物扮演着质循环的主要角色，有着不可替代的作用。它们分解动植物的残体废物而将其转化为腐殖质，促进土壤良好结构的形成。许多土壤微生物可固定空气中的氮素和转化各类有机物，不断为植物提供可有效利用的碳、氮、磷、钾等各类营养元素。自然界还广泛存在昆虫的病原微生物和植物病菌的拮抗微生物，它们可用于植物病虫害的防治而部分替代化学农药。

生物防治是继化学防治之后的又一重要防治方法。生物防治不仅能够很好的避免化学防治带来的农药残留、环境污染和耐药性问题，还具有作用时间长，维持土壤良好微生态的作用。目前生物防治的主要力量是微生物。对植物病原菌、害虫或杂草具有抑制或杀灭作用的微生物也常被称为生防菌。常用的生防微生物包括细菌、真菌、病毒等几个大类。用作微生物农药的细菌主要有芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属等，已有很多具有优异生防性能的细菌菌株被分离出来，在很早以前就有利用放射农杆菌K84防治植物冠瘿病的成功案例。更有许多芽孢杆菌被制作成商品制剂，例如，AgraQuest公司利用短小芽孢杆菌QST2808生产了活菌制剂SONATA，它能有效控制链格孢属及葡萄孢属等真菌引起的植物疾病；还有利用解淀粉芽孢杆菌QST713菌株制备的菌剂Serenade Opti，以及 Novozymes公司的产品Taegro(含枯草芽孢杆菌，用于防治由镰刀菌属和丝核菌属引起的根腐病和枯萎病)。陈志谊等利用枯草芽孢杆菌B-916开发了生物农药“纹曲宁”用于防治水稻纹枯病及伪黑穗病等。

近些年研究发现，除了生防菌外，酶制剂也在生物防治中扮演着重要的角色，其中研究最多的就是几丁质酶。几丁质酶作为真菌细胞壁降解酶类的重要成员，是研究丝状真菌和寄主植物相互作用的模式蛋白之一，具有良好的生防潜能。大部分产几丁质酶的真菌可以直接或者间接抵御多种病原真菌对植物的侵染，体外表达的真菌源几丁质酶对真菌的生长也有抑制作用，且都具有较为广泛的抑菌谱，生防功效良好。研究显示，用对多种植物病原真菌有显著抑制作用的链霉菌 S01菌株外源表达的几丁质酶处理病原菌，病原菌菌丝产生了扭曲变形，细胞质聚集、外溢的异常现象。经过基因工程改造的重组几丁质酶也具有良好的生防潜能，可有效抑制灰霉、根霉、毛霉和拟茎点霉的孢子萌发。因此，筛选稳定性好、抑菌能力强的新型几丁质酶也是生物防治领域的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用。所述复合菌剂可广泛应用于枯萎病、茎基腐病、白粉病、炭疽病等常见植物病害的防治。

本发明一方面提供了一种复合菌剂，包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)中的任意一种或多种。

所述的复合菌剂还包含几丁质酶。

进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌VB1264，保藏号为 CCTCC NO：M2019451，CN 110724648B，购买来源：山东蔚蓝生物科技有限公司；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌VB1700，保藏号为CCTCC NO： M2019441，见CN 110734875B，购买来源：山东蔚蓝生物科技有限公司；所述甲基营养型芽孢杆菌为甲基营养型芽孢杆菌VB1263，保藏号为CCTCC NO： M2019439，见CN 110734872B，购买来源：山东蔚蓝生物科技有限公司。

所述复合菌剂中活菌量不低于10⁸CFU/mL。

所述复合菌剂中几丁质酶的质量百分比不低于1％。

所述复合菌剂的使用方法是沟施或随水冲施。

所述复合菌剂的使用量是1-3kg/亩。

本发明一方面提供了上述复合菌剂在防治植物病害中的应用。

进一步地，所述植物病害为茎基腐病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一种。进一步地，所述植物为草莓、黄瓜、茄子、西红柿、辣椒中的任意一种。

本发明还提供了一种新型几丁质酶CHI-S11，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种工程菌，其携带有重组表达几丁质酶CHI-S11基因的表达载体。

所述几丁质酶CHI-S11的最适反应温度为35℃，最适反应pH为6.5，具有温度和pH稳定的特性，在温度范围22-46℃以及pH范围5.5-7.5的条件下反应 30min，仍可保持50％以上的活性，有利于适应田间多变的外界条件。

所述几丁质酶CHI-S11对尖孢镰刀菌具有明显的抑制作用，可单独，也可与其他具有生防效果的微生物复配用于防治常见植物病害。

本发明还提供了所述几丁质酶CHI-S11在制备生物防治制剂中的应用。

有益效果：

1、本发明提供的几丁质酶CHI-S11是一种结构与功能新颖的几丁质酶，其氨基酸序列与已有性质报道的几丁质酶序列相似度仅为64.73％。该酶的最适反应温度为35℃，最适反应pH为6.5，在温度范围22-46℃以及pH范围5.5-7.5 的条件下，皆可保持50％以上的活性。

2、本发明提供的几丁质酶CHI-S11对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用，在较低浓度(1μg/ml)的情况下仍然具有较好的抑菌效果，抑菌带宽度可达15mm。

3、本发明提供的几丁质酶CHI-S11可单独作为防治西红柿枯萎病、草莓炭疽病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防制剂，防治效率达到 65.3％-80.7％％，还可与其他微生物菌剂组合，用于常见植物病害的防治。

4、本发明提供的复合菌剂是由几丁质酶CHI-S11与选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、多粘类芽孢杆菌中的具有生防效果的微生物复配得到的，可用于多种植物病害的防治。其中，复合菌剂对草莓炭疽病和西红柿枯萎病的防治效率分别高达95.3％和98.1％，对茎基腐病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、灰霉病、褐斑病和果腐病等常见植物病害的防治效率均超过75％。复合菌剂中几丁质酶 CHI-S11的添加能显著提高微生物的防治效率，取得了意料不到的技术效果。

附图说明

图1为本发明几丁质酶CHI-S11的蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品； 1，纯化所得几丁质酶)；

图2为本发明几丁质酶CHI-S11的温度和pH适应性分析(A，几丁质酶的最适反应温度；B，几丁质酶的最适反应pH；

图3为本发明几丁质酶CHI-S11对尖孢镰刀菌的抑制效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。本发明所选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。

实施例1几丁质酶CHI-S11的序列分析及重组表达

本发明从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SP-S11中克隆得到一个几丁质酶基因，命名为CHI-S11，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸如SEQ IDNO.1所示。

利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，CHI-S11的氨基酸序列包含有多糖水解酶GH18家族的几丁质酶保守区和几丁质结合结构域(ChiC-BD)，与来源于枯草芽孢杆菌Ap113的几丁质酶Chi113(AccessionABG57262.1)序列相似性最高，为64.73％。因此，本发明所述几丁质酶CHI-S11归属于多糖水解酶(GH18)家族。

将CHI-S11的序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：PCHIS11-F：

5’-CTAGCCATGGTAAACACGGTTTTGCTAAACA-3’(Nco I)；

反向引物：SEQ ID NO.4：PCHIS11-R：

5’-CGCCTCGAGTTTCGCAATCGCCAGCAGTTTC-3’(Xho I)。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA 聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国 Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL 氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至 LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CHI-S11。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CHI-S11，保存在-80℃备用。

实施例2几丁质酶CHI-S11的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-CHI-S11在100mL的LB液体培养基中(50 μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导20h。几丁质活性测定方法为：100μL酶液加入900μL 0.3％几丁质底物(20mM醋酸-醋酸钠，pH＝6.5)，在35℃下反应10min，加入750μL的DNS试剂，沸水中反应 10min进行显色，在OD₅₂₀下检测其吸光度。酶活力定义为1U为每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中几丁质酶CHI-S11的酶活力可达 158.3U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5mL/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到91.4％。纯化所得壳聚糖酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得几丁质酶CHI-S11的分子量为67kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得几丁质酶CHI-S11的蛋白纯度达到96％以上。

实施例3温度和pH对几丁质酶CHI-S11的影响

将实施例2中纯化所得几丁质酶CHI-S11在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-70℃)下反应30min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下CHI-S11 的相对酶活力。如图2A所示，几丁质酶CHI-S11的最适反应温度为35℃。

将实施例2中纯化所得几丁质酶CHI-S11与用不同的缓冲液体系配成不同 PH的几丁质底物反应，使用的缓冲液分别为乙酸钠缓冲液(50mM，pH5.0-6.0)，磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.0-8.0)和Tris-HCl缓冲液(50mM，pH6.0-7.0)。在最适温度反应30min，检测活性，酶活性最高值为100％。如图2B所示，几丁质酶CHI-S11的最适反应pH为6.5。

同时，本发明所得几丁质酶CHI-S11具有良好的温度和pH稳定性，在温度范围22-46℃以及pH范围5.5-7.5的条件下，最低皆可保持50％以上的活性。

实施例4几丁质酶CHI-S11的抑菌效果测定

将实施例2中纯化所得的几丁质酶CHI-S11进行梯度稀释，制备成供试生防酶液备用(100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml)。制备PDA培养基：马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加蒸馏水煮烂(煮沸30min，到可被玻璃棒戳破的程度)，用八层纱布过滤，加热，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，加入 15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，稍冷却后再补足水分至 1000mL，分装试管或者锥形瓶，封口膜封口，115℃灭菌20min，冷却后贮存备用。将病原菌尖孢镰刀菌在PDA培养基上培养5天后备用。在营养琼脂培养基的中央接种尖孢镰刀菌菌饼，在菌饼两侧距离培养皿中心2.5cm处分别滴加上述供试生防酶液，然后30℃培养箱中培养72h后，取出测量抑菌带的宽度，以此来判断抑菌效果。多菌灵为阳性对照，浓度为1μg/ml。结果如图3所示，本发明所得几丁质酶CHI-S11对尖孢镰刀菌具有浓度依赖的抑制作用。其中，在较低浓度(1μg/ml)的情况下仍然具有较好的抑菌效果，抑菌带宽度可达15mm。

所述几丁质酶CHI-S11可单独作为防治西红柿枯萎病、草莓炭疽病、甜瓜死棵病、姜烂脖子病等植物病害的生防制剂，防治效率普遍达到65.3％-80.7％。所述几丁质酶CHI-S11还可与其他微生物菌剂组合，用于常见植物病害的防治。

实施例5复合菌剂在草莓炭疽病防治中的应用

1、实验地点：

青岛市城阳区上马街道草莓种植基地。

2、草莓炭疽病防治实验：

选取10m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内有10垄草莓，约800±20 株。共设置15个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3 个实验区进行实验。

(1)空白组：清水浇施草莓根部；

(2)对照处理组：按1kg/亩的用量将解淀粉芽孢杆菌VB1264菌粉(活菌量10亿/g)随水浇施于草莓根部，间隔7天用一次，连续使用三次；

(3)复合菌剂处理组：按1kg/亩的用量将解淀粉芽孢杆菌VB1264菌粉(活菌量10亿/g)与几丁质酶CHI-S11混匀后，随水浇施于草莓根部，间隔7天用一次，连续使用三次。其中：

处理组1：几丁质酶CHI-S11用量为5g/亩；

处理组2：几丁质酶CHI-S11用量为10g/亩；

处理组3：几丁质酶CHI-S11用量为20g/亩。

在草莓结果期统计草莓炭疽病发病株数，计算复合菌剂对草莓炭疽病的防治效率，具体结果见表1。

发病率＝发病草莓株数/草莓总株数×100％。

防治效率％＝(空白对照组发病率-处理组发病率)/空白对照组发病率×100％。

表1复合菌剂对草莓炭疽病的防治效果

分组	平均发病率	平均防治效率
			空白组	65.5％	-
对照处理组	21.2％	67.6％
			复合菌剂处理组1	20.7％	68.4％
复合菌剂处理组2	8.4％	87.2％
			复合菌剂处理组3	1.8％	95.3％

从表1的数据可知，与空白组相比，在苗期施用解淀粉芽孢杆菌VB1264菌粉的各处理组草莓炭疽病发病率明显降低。而与单一施用解淀粉芽孢杆菌VB1264的对照处理组相比，复合施用几丁质酶CHI-S11的处理组1-3草莓的发病率也有不同程度的降低，尤其是施用量达到10g/亩以上时，对炭疽病的防治效率得到极显著提高。从而说明，本发明提供的几丁质酶CHI-S11与解淀粉芽孢杆菌VB1264复配使用能显著提高对草莓炭疽病的防治效果，取得了意料不到的技术效果。

实施例6复合菌剂在西红柿枯萎病防治中的应用

1、实验地点：

青岛市城阳区夏庄西红柿种植大棚，西红柿重茬地块，枯萎病多发。

2、西红柿枯萎病防治实验

选取20m×8m的区域作为一个实验区，每个实验区内有10垄西红柿，约 350±10株。共设置15个实验区，每个实验区之间设立保护行。每个处理组随机选择3个实验区进行实验。

(1)空白对照组：清水冲施；

(2)对照处理组：在西红柿移栽后，将枯草芽孢杆菌VB1700菌粉(活菌量 10亿/g)和甲基营养型芽孢杆菌VB1263菌粉(活菌量10亿/g)分别按1kg/亩的用量混匀后，随水浇施于西红柿根部，间隔10天用一次，连续使用三次；开花初期再采用相同用量加施一次；

(3)复合菌剂处理组：在西红柿移栽后，将枯草芽孢杆菌VB1700菌粉(活菌量10亿/g)和甲基营养型芽孢杆菌VB1263菌粉(活菌量10亿/g)分别按1kg/ 亩的用量与几丁质酶CHI-S11混匀后，随水浇施于西红柿根部，间隔10天用一次，连续使用三次，开花初期再采用相同用量加施一次。其中：

处理组1：几丁质酶CHI-S11用量为10g/亩；

处理组2：几丁质酶CHI-S11用量为20g/亩；

处理组3：几丁质酶CHI-S11用量为40g/亩。

在西红柿结果期，统计各组西红柿枯萎病发病株数，计算发病率以及各组对西红柿枯萎病的防治效率，具体结果见表2。

发病率＝发病株数/总株数×100％。

表2复合菌剂对西红柿枯萎病的防治效果

从表2的数据可知，与空白组相比，各处理组西红柿枯萎病发病率明显降低。与对照处理组相比，复合施用几丁质酶CHI-S11的处理组1-3西红柿的发病率明显降低，防治效率最高达98.1％。从而说明，本发明提供的几丁质酶CHI-S11与枯草芽孢杆菌VB1700和甲基营养型芽孢杆菌VB1263复合菌剂复配使用能显著提高对西红柿枯萎病的防治效果，取得了意料不到的技术效果。

此外，本发明所述几丁质酶CHI-S11还可与地衣芽孢杆菌，植物乳杆菌，多粘类芽孢杆菌等多种具有生防效果的微生物复配用于茎基腐病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、灰霉病、褐斑病和果腐病等常见植物病害的防治，防治效率超过75％。

序列表

<110> 山东蔚蓝绿源生物科技有限公司

<120> 一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 605

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Ser Lys Thr Val Phe Ser Asn Lys Lys Phe Leu Val Phe Ser

1 5 10 15

Phe Ile Phe Ala Met Ile Leu Ser Leu Ser Phe Phe Asn Gly Glu Ser

20 25 30

Ala Gln Ala Tyr Ala Lys Ser Tyr Lys Ile Ile Gly Tyr Pro Tyr Ser

35 40 45

Trp Gly Ala Tyr Gly Arg Asp Phe Gln Val Trp Asp Met Asp Ala Ser

50 55 60

Lys Val Ser His Ile Tyr Ala Phe Ala Asp Ile Cys Trp Glu Gly Arg

65 70 75 80

His Gly Asn Pro Asn Ala Ala Cys Arg Thr Arg Asn Arg Arg Pro Gly

85 90 95

Ala Ala Arg Met Lys Thr Ala Tyr Leu Met Cys Arg Thr Ala Ala Leu

100 105 110

Lys Trp Ala Ile Arg Gly Leu Cys Ser Arg Lys Ala Thr Arg Ala Ile

115 120 125

Pro Gly Met Asn Arg Phe Ala Ala Thr Leu Asn Ser Cys Tyr Asn Ser

130 135 140

Lys Lys Thr Ile Arg Ile Tyr Lys Pro Leu Leu Ala Trp Ala Ala Gly

145 150 155 160

Ala Gly Ala Thr Ala Leu Ala Ser Val Ala Ala Asp Pro Ala Ala Arg

165 170 175

Glu Asn Phe Ala Ala Ser Ala Val Asn Phe Leu Arg Lys Tyr Gly Phe

180 185 190

Asp Gly Val Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ser Gly Gly Leu Pro

195 200 205

Gly Asn Ser Thr Arg Pro Glu Asp Lys Arg Asn Tyr Thr Leu Leu Leu

210 215 220

Gln Asp Val Arg Glu Lys Leu Asp Ala Ala Glu Ala Lys Asp Gly Lys

225 230 235 240

Lys Tyr Leu Leu Thr Ile Ala Ser Gly Ala Ser Pro Glu Tyr Val Ser

245 250 255

Asn Thr Glu Leu Asp Lys Ile Ala Glu Thr Val Asp Trp Ile Asn Ile

260 265 270

Met Thr Tyr Asp Phe Asn Gly Gly Trp Gln Arg Leu Ala Arg Ile Thr

275 280 285

Arg Arg Cys Phe Met Ile Arg Lys Arg Lys Lys Pro Leu Thr Leu Lys

290 295 300

Ala Pro Lys Thr Leu Lys Ala Asn Ala Ile Lys Lys Arg Ala Cys Lys

305 310 315 320

Arg Ile Asn Trp Cys Trp Ala Pro Arg Phe Met Ala Ala Ala Gly Ala

325 330 335

Thr Ala Asn Arg Arg Ile Thr Ala Asn Ile Arg Asn Ala Ala Arg Arg

340 345 350

Lys Lys Ala Pro Gly Lys Lys Ala Cys Leu Ile Leu Ala Asn Ser Arg

355 360 365

Ile Arg Arg Arg Glu Ser Ser Asp Leu Glu Lys Asn Tyr Ile Asn Lys

370 375 380

Asn Gly Tyr Lys Arg Tyr Trp Asn Asp Arg Ala Lys Val Pro Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Ala Glu Asn Gly Asn Phe Ile Thr Tyr Asp Asp Glu Glu Ser

405 410 415

Tyr Gly Tyr Lys Thr Asp Leu Ile Gln Ser Asn Gly Leu Ser Gly Ala

420 425 430

Met Phe Trp Asp Phe Ser Gly Asp Ser Asn Gln Thr Leu Leu Asn Lys

435 440 445

Leu Ala Ala Asp Leu Gly Phe Ala Pro Gly Glu Gly Asn Pro Tyr Pro

450 455 460

Pro Ser Ser Ala Pro Gly Asn Leu Arg Val Thr Glu Lys Thr Ala Thr

465 470 475 480

Ser Ile Ser Leu Ala Trp Asp Ala Pro Ser Asp Gly Ala Asn Ile Ala

485 490 495

Glu Tyr Val Leu Ser Tyr Glu Gly Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ile Gly

500 505 510

Gln Leu Lys Pro Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Thr Val Ser Ala Lys Asp

515 520 525

Ala Asp Gly Lys Gly Ala Val Ser Val Leu His Thr Gly Pro Thr Ile

530 535 540

Glu Ala Thr Thr Thr Ala Ile Arg Pro Ala Ala Ile Thr Asn Gly Lys

545 550 555 560

Ile Pro Arg Cys Ile Pro Ala Ala Ile Ala Trp Cys Leu Thr Ala Lys

565 570 575

Cys Asn Glu Ala Lys Trp Trp Thr Lys Gly Glu Gln Pro Asp Gln Ala

580 585 590

Gly Glu Ser Gly Val Trp Lys Leu Leu Ala Ile Ala Lys

595 600 605

<210> 2

<211> 1815

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtttagca aaaccgtgtt tagcaacaaa aaatttctgg tgtttagctt tatttttgcg 60

atgattctga gcctgagctt ttttaacggc gaaagcgcgc aggcgtatgc gaaaagctat 120

aaaattattg gctatccgta tagctggggc gcgtatggcc gcgattttca ggtgtgggat 180

atggatgcga gcaaagtgag ccatatttat gcgtttgcgg atatttgctg ggaaggccgc 240

catggcaacc cgaacgcggc gtgccgcacc cgcaaccgcc gcccgggcgc ggcgcgcatg 300

aaaaccgcgt atctgatgtg ccgcaccgcg gcgctgaaat gggcgattcg cggcctgtgc 360

agccgcaaag cgacccgcgc gattccgggc atgaaccgct ttgcggcgac cctgaacagc 420

tgctataaca gcaaaaaaac cattcgcatt tataaaccgc tgctggcgtg ggcggcgggc 480

gcgggcgcga ccgcgctggc gagcgtggcg gcggatccgg cggcgcgcga aaactttgcg 540

gcgagcgcgg tgaactttct gcgcaaatat ggctttgatg gcgtggatct ggattgggaa 600

tatccggtga gcggcggcct gccgggcaac agcacccgcc cggaagataa acgcaactat 660

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aaatatctgc tgaccattgc gagcggcgcg agcccggaat atgtgagcaa caccgaactg 780

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ctgaccctga aagcgccgaa aaccctgaaa gcgaacgcga ttaaaaaacg cgcgtgcaaa 960

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cgcattaccg cgaacattcg caacgcggcg cgccgcaaaa aagcgccggg caaaaaagcg 1080

tgcctgattc tggcgaacag ccgcattcgc cgccgcgaaa gcagcgatct ggaaaaaaac 1140

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<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagccatgg taaacacggt tttgctaaac a 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcctcgagt ttcgcaatcg ccagcagttt c 31

Claims

1.一种复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、植物乳杆菌、多粘类芽孢杆菌中的任意一种或多种。

2.如权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述的复合菌剂还包含几丁质酶。

3.如权利要求2所述的复合菌剂，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，优选，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中活菌量不低于10⁸CFU/g。

5.如权利要求3或4所述的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中几丁质酶的质量百分比不低于1％。

6.权利要求1-5任一所述的复合菌剂在植物病害防治中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为茎基腐病、炭疽病、纹枯病、弯孢病、根腐病、白绢病、白粉病、疮痂病、灰霉病、枯萎病、褐斑病和果腐病中的任意一种。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为草莓、黄瓜、茄子、西红柿、辣椒中的任意一种。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述复合菌剂的使用方法是沟施或随水冲施。

10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述复合菌剂的使用量是1-3kg/亩。