CN101144066A - 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 - Google Patents
伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101144066A CN101144066A CNA2007100162788A CN200710016278A CN101144066A CN 101144066 A CN101144066 A CN 101144066A CN A2007100162788 A CNA2007100162788 A CN A2007100162788A CN 200710016278 A CN200710016278 A CN 200710016278A CN 101144066 A CN101144066 A CN 101144066A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- burkholderia
- multifunctional engineering
- chitinase
- strain
- engineering strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明涉及伯克氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418－Chil13，菌种保藏号CGMCC No.2079。伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法是利用越南伯克氏菌CGMCC No.1212，通过Tn5转座，将来自枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因通过自杀性质粒整合到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体上，使多功能微生物在具有解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，增强和扩大伯克氏菌的抗病能力和抑菌范围，实现防病和促生、定殖等的多重功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法。
背景技术
使用化学杀菌剂是目前防治农作物病害的主要手段，频繁使用促成了植物病原菌抗药性的产生和发展，不仅不能有效地控制病害，而且增加了环境污染。以生防菌为基础的微生物杀菌剂和肥料虽然目前在整个世界植物保护市场中所占的分量不到0.1％，但已受到各行业的重视，成为当前世界农业研究的热点与重点。生防细菌伯克霍尔德氏菌(保藏号CGMCCNo.1212)分离自白俄罗斯明斯克市的大麦根际土壤中，经研究该菌株具有根际定殖能力，解磷、解钾、固氮及促进植物生长作用，是一株多功能生防菌株，对植物根结线虫具有一定的防治效果。该生防菌在对病原真菌的生防效果上稳定性较差，因此要对这株多功能菌株进行改良以进一步提高其生防活性和适应能力，这是植物病害生物防治研究领域的一个重要方面，得到了广泛的重视。通过改良获得的工程菌较传统的生防菌优势明显，如杀菌谱更宽、毒力提高、抗紫外线、田间药效长、虫病兼治、生物防治效率高等。这类改良后的产品较传统的生物杀菌剂将具有更高的生防效率和更强的市场竞争力。目前对生防菌的改良技术主要包括诱变、原生质体融合和基因工程技术等几个方面。
诱变育种是通过人工方法处理微生物，使之发生突变，运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。诱变主要包括化学诱变和物理诱变。阿哈吗用哈茨木霉通过亚硝基胍诱变得到了苯菌灵抗性菌株，其中两株的纤维素酶产生能力明显高于野生型菌株，其根际定殖能力显著改善，参见阿哈吗，哈茨木霉突变株的竞争腐生能力和纤维素水解能力研究，植物病理学报，1987(Ahamad，Competitive saprophytic abilityand cellulolytic activity of rhizosphere-competent mutants of Trichodermaharzianum.Phytopathology.1987)。紫外线诱变相对于化学诱变来说是一种比较简便而又可靠的方法。杨合同等人通过对绿色木霉菌的紫外线诱变处理，根据不同的筛选标记，得到了两个突变株LR和LRR，LR寄生能力强，产孢量大，分枝多，并且可以在低温条件下正常生长；LRR则对多菌灵表现出一定的抗性。棉花病害防治试验表明，两个突变株对立枯病，枯萎病和黄萎病的表现不同。对于立枯病的防治，LRR的效果比野生型菌株LTR-2略有提高，而LR的防治效果完全丧失；对于枯萎病和黄萎病，LR防治效果明显提高，而LRR的提高幅度相对较小，参见杨合同，绿色木霉LTR-2菌株的紫外线诱变改良，中国生物防治，2004。可见，虽然紫外线诱变可以得到优良的突变株，但对于不同的病害来说，筛选标记不能雷同，以防止防病效果的丧失，如同LR对立枯病的情况一样。因此，如何在突变体中选择优良菌株，确定合适的筛选标记是非常重要的。
原生质体融合亦称细胞融合，是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞，使一个细胞的遗传物质包括细胞核DNA和核外基因都进入另一个细胞。其整个过程包括：遗传标记筛选，原生质体的制备、融合与再生，融合子的鉴定。该技术没有细胞壁的阻碍，不需要有已知的遗传系统，融合后两新株的整套基因组相互接触，使优良性状通过融合再组合到一个新菌种中。杨合同等人利用产孢量大，对苯菌灵有抗性，对潮霉素B敏感的哈茨木霉T9和产孢量少，对潮霉素B有抗性，对苯菌灵敏感的康宁木霉Tk7a为亲本，进行原生质体融合，筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子，参见杨合同，原生质体融合技术改良植病生防木霉菌株，中国生物防治，2005。
基因工程的发展，给植物病害生防菌的培育开辟了新的途径。基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等，是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。因此比其他育种方法更有目的性和方向性，可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是当前最先进的育种技术。
通过基因工程手段将目的基因导入到受体细胞中，是目前增强微生物拮抗活性的有效途径。思密证明几丁质酶基因chiA在荧光假单胞菌A7279高效表达后分泌几丁质酶可有效避免立枯丝核菌对棉花幼苗的危害。参见思密，通过Tn7转座降几丁质酶编码基因整合到荧光假单胞杆菌中以防治土壤病原菌，基因，1994(Simi K.et al.The chitinase encodingTn7-based chiA gene endows Pseudomonas fluorescens with the capacity to controlplant pathogens in soil.Gene，1994)。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法。
本发明提供一株伯克氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-Chi113，申请人已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2007年6月11日，保藏编号：CGMCC No.2079。
本发明利用的原始菌株是在白俄罗斯明斯克市的大麦根际土壤中获得一株越南伯克氏菌CGMCC No.1212，具有解磷、解钾、固氮、促进植物生长和根际定殖能力，是一株多功能菌株。本发明应用基因工程手段，通过Tn5转座，将来自枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因通过自杀性质粒整合到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体上，使多功能微生物在具有解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，增强和扩大伯克氏菌的抗病能力和抑菌范围，实现防病和促生、定殖等的多重功能。
上述枯草芽孢杆菌的具体菌株不做限定，凡具有几丁质酶活性的枯草芽孢杆菌均可。例如，保藏编号为CGMCC No.0912，CGMCC No.0372或CGMCC No.0954等枯草芽孢杆菌株均可。
本发明所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，包括下列步骤：
1)重组质粒pUT-Chi113的构建
根据几丁质酶基因序列设计引物Chi113NotIup和Chi113NotIdo，利用PCR技术扩增几丁质酶基因，利用NotI分别酶切几丁质酶基因和质粒pUT-Kml，再将酶切后的几丁质酶基因和质粒pUT-Kml连接，转入大肠杆菌，得到重组质粒pUT-Chi113；
2)三亲杂交
采用三亲杂交方法，在助手质粒pRK600的存在下，将步骤1)得到的重组质粒pUT-Chi113转入越南伯克氏菌CGMCC1212中，得到76个单菌株。
3)筛选
通过PCR扩增和电泳技术、Southern杂交和几丁质酶活性检测对步骤2)的76个单菌株进行筛选，获得1个几丁质酶酶活性最高的单菌株，即为伯克氏菌多功能工程菌CGMCCNo.2079。
以上所说的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079的筛选主要采用以下三个步骤进行：
(1)PCR扩增和电泳技术
利用JCHI113-F和JCHI113-R通过PCR扩增和电泳技术对步骤2)中的76个单菌株进行突变子筛选，得到31个单菌株；
(2)Southern杂交
对上述步骤(1)得到的31个单菌株在同等条件下分别进行Southern杂交，所用的DNA探针是几丁质酶基因序列中674bp到1673bp这一片段。经检测这31个单菌株中有27个单菌株的几丁质酶基因是单拷贝插入到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体中，保留该27个单菌株备用。
(3)几丁质酶活性检测
通过几丁质酶活性检测对上述步骤(2)得到的27个单菌株进行进一步的筛选。将上述27个单菌株同时接种到几丁质平板上，通过透明圈筛选菌株，参见图4，得到8个单菌株在几丁质平板上的透明圈比较明显，将这8个单菌株接种到几丁质的液体培养基中，摇床培养48小时后，利用721分光光度计通过透光率测定几丁质酶酶活性，获得1个几丁质酶酶活性最高(酶活性为1.84466)单菌株，即为本发明的目标产物伯克氏菌多功能工程菌株CGMCCNo.2079。
酶活单位定义：每小时水解几丁质产生1μmol还原糖所需的酶蛋白量。
上述步骤1)的引物Chi113NotIup和Chi113NotIdo优选序列如下：
Chi113NotIup：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG-3’
Chi113NotIdo：5’-CGGCGGCCGCTTATTTGCAATCACCAATT-3’
上述步骤1)中所用的质粒pUT-Kml由马塔构建，参见马塔，1990，用于革兰氏阴性菌外源基因染色体整合的含有非抗选择标记的转座载体的构建，细菌学报(Marta Herrero etal，Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning andstable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative Bacteria，Journal of Bacteriology，1990)，该质粒的特性在于：
(1)该质粒上含有卡那霉素抗性编码基因；
(2)该质粒具有Tn5转座子；
(3)该质粒Tn5转座序列中含有一个NotI酶切位点，用于携带外源基因，该酶切位点序列如下：GCGGCCGC。
上述步骤1)中所说的大肠杆菌是含有λ-pir的大肠杆菌，具体选自E.coli DH5α(λ-pir)，E.coli SM10(λ-pir)，E.coli S17-1(λ-pir)或E.coli MV1190(λ-pir)等。
上述步骤2)中所用的引物JCHI113-R和JCHI113-F，优选序列如下：
JCHI113-R：5’-TCTGCGATGTTTGCTCCG-3’
JCHI113-F：5’-TTGGCGGATGGTCTTGGT-3’
上述步骤2)中所采用的三亲杂交方法为现有技术，具体参见周洪友，荧光假单胞菌2P24抗生素2，4-二乙酰基间苯三酚生物合成的基因调控研究，中国农业大学博士学位论文。
上述步骤2)中的pUT-Kml包含Tn5，Tn5作为转座子可以交错切开靶DNA，转座子两端连接到靶DNA的凸出单链上，最后填补空缺完成转座，这样就使几丁质酶基因整合到伯克氏菌CGMCC1212染色体上。
本发明重组的伯克氏菌多功能工程菌株(CGMCC No.2079)的生物学特性研究：
(1)对得到的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079进行稳定性测定
(2)对得到的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079进行解磷、解钾和固氮能力的检测，参见图5。
(3)对得到的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079进行生长曲线测定，参见图6。
(4)越南伯克氏菌CGMCC1212及其得到的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079在小麦根部的定殖能力检测，参见图7。
本发明越南伯克氏菌CGMCC1212同伯克氏菌多功能工程菌CGMCC2079的应用：
对越南伯克氏菌CGMCC1212及其得到的伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079平板拮抗能力能力检测，参见图8。
本发明的伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC No.2079用于各种植物病害的防治，包括本发明中涉及到的各种植物病原菌。所述的植物病原菌如立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis var.tritici)，植物根结线虫。因此，伯克氏菌多功能工程菌株可作为主要有效成分用于微生物肥料的制备。
本发明的优点是：针对目前化学杀菌剂带来的环境污染严重等问题，应用基因工程手段，通过Tn5转座，将几丁质酶编码基因整合到越南伯克氏菌CGMCC1212染色体上，使多功能微生物在具有解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，增强和扩大伯克氏菌的抗病能力和抑菌范围，实现防病和促生、定殖等的多重功能。通过利用自杀性载体pUT-Kml，构建新的工程菌株，在解磷、解钾、固氮，促进植物生长和根际定殖能力的基础上，提高了该菌的生防功效。平板拮抗实验中，伯克氏菌工程菌CGMCC No.2079同越南伯克氏菌CGMCC No.1212相比，对所有的病原菌抑菌能力均有所提高，尤其对麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)的抑菌能力，本发明伯克氏菌多功能工程菌CGMCCNo.2079抑菌百分数提高了20％以上。
本实验室将来自芽孢杆菌的几丁质酶基因通过自杀性质粒整合到越南伯克氏菌CGMCC No.1212的染色体DNA上，获得了稳定高效的伯克氏菌多功能工程菌CGMCCNo.2079。对生防菌的遗传改良是获得优良生防菌的有效途径，尤其是基因工程技术的出现可以有目的的对生防菌进行改造，使生防菌获得兼治多种病害的功能。但由于不少生防菌结构复杂，遗传操作比较困难，有关改良技术还需要进一步的研究。
附图说明
图1是电泳照片，以JCHI113-F和JCHI113-R为引物的PCR扩增用于检测重组质粒pUT-Chi113，产物大小1kb。
图2是电泳照片，以JCHI113-F和JCHI113-R为引物的PCR扩增用于检测几丁质酶基因是否整合到越南伯克氏菌CGMCC No.1212的基因组DNA上，产物大小1kb。
图3是Southern杂交照片，以几丁质酶基因序列中674bp到1673bp片段作为DNA探针，对步骤3)中的第(1)步得到的31个单菌落进行Southern杂交。经检测这31个单菌株中有27个单菌株的几丁质酶基因是单拷贝插入到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体中，图3是部分单菌株的Southern杂交照片。
图4是几丁质平板照片，对步骤3)中的第(2)步得到的27个单菌株接种到几丁质平板上，通过透明圈筛选菌株，图中8个单菌株的透明圈比较明显，具有几丁质酶活性。
图5是平板照片，越南伯克氏菌CGMCC No.1212及伯克氏菌多功能工程菌CGMCCNo.2079的解磷、解钾、固氮能力平板检测。
图6是越南伯克氏菌CGMCC No.1212及伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079的生长曲线图。
图7越南伯克氏菌CGMCC1212及本发明伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在小麦根尖的定殖数量，其中，A图是越南伯克氏菌CGMCC1212及本发明伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在自然土中在小麦根尖的定殖数量关系图；B图是越南伯克氏菌CGMCC1212及本发明伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在灭菌土中在小麦根尖的定殖数量关系图。
图8是平板照片，越南伯克氏菌CGMCC1212及本发明伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079对棉花枯萎病菌的抑菌作用。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例1：伯克氏菌多功能工程菌株的构建
本实施例中所用的几丁质酶基因序列如下，参见文献黄玉杰等，芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆、序列分析及其在伯克氏菌B418中的表达，2006，中国生物防治。
1 TGCTCCCGGCCGCCATGGTGGCCGCGGGAATTCGATTCCACATACGGTTTGAAGAGGCGTATGAAAACCAAAAATGTAAGC
82 GTTTTCCCCTTGTTGTCTTCAGTGTCATCAGCTGCTATGTCAGGACAAGGTGAATATAAACCTATTGAAAAGGGGGTGAAC
163 AAAATAGAGTTTCATTGATGAACAGCCAAAAAAATTGATGAAAAGGAGATGAAAAAAGTGTTTTCAAACAAAAAGTTTCTC
M K K V F S N K K F L
244 GTTTTTTCTTTCATTTTTGCGATGATTTTAAGTCTGTCTTTTTTTAATGGGGAAAGTGCACAAGCCAGTTCTGACAAAAGT
V F S F I F A M I L S L S F F N G E S A Q A S S D K S
325 TATAAAATCATCGGCTACTATCCGTCCTGGGGCGCTTATGGAAGGGATTTTCAAGTATGGGATATGGATGCTTCTAAAGTC
Y K I I G Y Y P S W G A Y G R D F Q V W D M D A S K V
406 AGCCATATTAATTATGCATTTGCTGATATTTGCTGGGAGGGGAGGCATGGAAACCCTGATCCGACAGGCCCGAATCCCCAG
S H I N Y A F A D I C W E G R H G N P D P T G P N P O
487 ACATGGTCTTGCCAGGATGAAAACGGAGTGATTGATGTTCCAAATGGATCAATCGTTATGGGGGACCCATGGATCGATGTG
T W S C O D E N G V I D V P N G S I V M G D P W I D V
568 CAAAAGTCAAATGCCGGAGATACTTGGGATGAGCCGATTCGGGGCAACTTTAAACAACTATTGAAGCTGAAAAAGAACCAT
Q K S N A G O T W D E P I R G N F K Q L L K L K K N H
649 CCTCATTTGAAAACATTCATATCAGTTGGCGGATGGTCTTGGTCAAATCGCTTTTCAGATGTTGCGGCAGATCCTGCGGCA
P H L K T F I S V G O W S W S N R F S D V A A D P A A
730 AGAGAGAATTTTGCTGCTTCAGCAGTAAATTTTTTAAGAAAATATGGGTTTGATGGGGTCGACCTTGACTGGGAATACCCG
R E N F A A S A V N F L R K Y G F D G V D L D W E Y P
811 GTTAGTGGAGGGCTGCCGGGAAACAGCACCCGTCCGGAGGATAAGAGAAACTACACGCTACTCTTGCAGGATGTGCGAGAA
V S G G L P G N S T R P E D K R N Y T L L L Q D V R E
892 AAGCTTGACGCCGCAGAAGCGAAGGATGGCAAGAAATACTTGCTGACGATCGCCTCCGGCGCCAGTCCTGAATATGTAAGC
K L D A A E A K D G K K Y L L T I A S G A S P E Y V S
973 AACACTGAATTAGATAAGATTGCTGAAACCGTTGATTGGATTAACATTATGACCTATGACTTTAATGGCGGATGGCAAAGT
N T E L D K I A E T V D W I N I M T Y D F N G G W Q S
1054 ATAAGCGCTCATAATGCCCCATTATTCTATGATCCAAAAGCGAAAGAAGCCGGCGTTCCAAACGCTGAGACATTTAACATT
I S A H N A P L F Y D P K A K E A G V P N A E T F N I
1135 GAAAGCACCGTGAAGCGCTACAAGGAAGCCGGTGTCAAAGCGGACAAATTAGTGCTTGGCACACCGTTCTATGGCAGAGGC
E S T V K R Y K E A G V K A D K L V L G T P F Y G R G
1216 TGGAGCAATTGTGAGCCTGCAGACAACGGAGAATATCAAAAATGCGGACCGGCTAAAGAAGGGACGTGGGAAAAGGGGGTA
W S N C E p A D N G E Y Q K C G P A K E G T W E K G V
1297 TTTGATTTTTCAGATCTTGAAAAGAACTACATCAATAAAAACGGATATAAAAGATATTGGAATGATCGAGCAAAAGTGCCG
F D F S D L E K N Y I N K N G Y K R Y W N D R A K V P
1378 TTTTTGTATAATGCGGAGAATGGAAACTTCATTACCTACGATGATGAAGAATCATATGGATACAAAACCGATTTAATTCAA
F L y N A E N G N F I T Y D D E E S Y G Y K T D L I Q
1459 TCAAACGGATTAAGCGGGGCTATGTTTTGGGATTTCAGCGGTGATTCAAATCAGACTTTGCTCAACAAATTAGCAGCCGAT
S N G L S G A M F W D F S G D S N Q T L L N K L A A D
1540 TTAGGGTTCGCTCCGGGTGAGGGTAATCCAGAGCCGCCTTCATCTGCACCGGGTAATTTGCGTGTGACCGAAAAAACCGCA
L G F A p G E G N P E P P S S A P G N L R V T E K T A
1621 ACCAGTATCAGTCTGGCGTGGGATGCACCGAGCGACGGAGCAAACATCGCAGAGTATGTGCTGTCATATGAAGGCGGGGCC
T S I S L A W D A P S D G A N I A E Y V L S Y E G G A
1702 GTATCGGTCAAGGATACATCGGCGACAATCGGGCAATTAAAGCCGAATACGACATACTCATTTACAGTATCTGCAAAGGAT
V S V K D T S A T I G Q L K P N T T Y S F T V S A K D
1783 GCGGACGGAAAGCTCCATACCGGGCCAACGATAGAAGCAACAACAAACTCTGATCAAACATGTGGGTATAACGAATGGAAA
A D G K L H T G P T I E A T T N S D Q T C G Y N E W K
1864 GATACAGCCGTCTACACAGGCGGAGACCGAGTCGTCTTTAACGGCAAAGTGTATGAAGCGAAATGGTGGACGAAAGGAGAG
D T A V Y T G G D R V V F N G K V Y E A K W W T K G E
1945 CAGCCGGATCAGGCTGGTGAGTCGGGTGTATGGAAATTAATTGGTGATTGCAAATAAATCAGTTTGATAGAAAACGATAAA
Q P D O A G E S G V W K L I G D C K*
2026 GAGAGAGTGGGCTCCCCATCTCTCTTTATGAGAAAGGAGTATGAATGAAGTGAAAAGAACCGCTTTATTTACTTTGTCATC
2107 GATGCTGCTCCTGTCACTTTTGACCCCGTTCCACAACATTTCCGCAGAGTCGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCA
2188 GGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGAGACTA
1)重组质粒pUT-Chi113的构建
根据几丁质酶基因序列设计引物：
Chill3Notlup：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG-3’
Chi113NotIdo：5’-CGGCGGCCGCTTATTTGCAATCACCAATT-3’
在该基因两端分别引入NotI酶切位点。以pMSDChi113为模板，进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性5min，其次94℃变性1min，39℃退火1.5min，72℃延伸2min，共10个循环，然后94℃变性1min，41℃退火1.5min，72℃延伸2min，共25个循环，最后72℃延伸10min。
利用NotI单酶切几丁质酶基因和质粒pUT-Km1，其中质粒pUT-Km1上含有转座子Tn5，并连接，转入E.coli DH5α(λ-pir)，设计引物JCHI113-F和JCHI113-R进行PCR扩增检测。
JCHI113-R：5’-TCTGCGATGTTTGCTCCG-3’
JCHI113-F：5’-TTGGCGGATGGTCTTGGT-3’
PCR反应条件94℃预变性5min，其次94℃变性1min，50℃退火1.5min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
通过PCR扩增检测得到的阳性克隆子，提取质粒，得到重组质粒pUT-Chi113。以该重组质粒为模板进行PCR扩增检测，结果参见图1，检测的PCR产物大小为1kb。
2)三亲杂交
将重组质粒pUT-Chi113转化到E.coli DH5α(λ-pir)感受态细胞中，用其作为供体菌，以菌株CGMCC1212作受体菌，采用三亲杂交方法，使几丁质酶基因整合到野生菌CGMCC1212染色体上。即将过夜培养的供体菌悬液、受体菌悬液、助手菌悬液以1∶1∶1(体积比)于1.5ml离心管中混合，收集菌体，无菌水冲洗一次，再次收集菌体悬浮于100μl的无菌水中，将菌液点接于伯克氏菌平板上，28℃培养6-8h后，用无菌水收集菌体，稀释后涂于含Kan和Amp的CGMCC1212平板上，28℃培养48h，得到76个单菌株。
3)伯克氏菌多功能工程菌CGMCC No.2079的筛选
主要采用以下三个步骤进行伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC No.2079的筛选：
(1)PCR扩增和电泳技术
利用JCHI113-F和JCHI113-R通过PCR扩增和电泳技术对步骤2)中的76个单菌株进行突变子筛选，PCR反应条件参见实施例1中以JCHI113-F和JCHI113-R为引物的PCR反应条件。经PCR扩增和电泳技术检测得到31个单菌株，结果见图2。
(2)Southern杂交
通过Southern杂交对(1)中的31个单菌种进行验证，方法如下：
A、步骤3)中(1)得到的31个菌株基因组的提取及酶切
(a)培养50ml细菌培养物至饱和状态，取15ml的培养物12000g离心5min；
(b)沉淀物加入5670μl TE，用吸管反复吹打使之重悬。加入300μl 10％SDS和30μl20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育2.5-3h；
(c)加入1000μl 5M NaCl，充分混匀，再加入800μl CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育30-60min(从这一步开始可以除去多糖及其它污染的大分子)；
(d)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，12000g离心20min，将上清液转入一个新管中，如难移出上清，先用牙签除去界面物质，重复2次；
(e)加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合(缓慢上下颠倒3min)，置于4℃冰箱中保持10min，用一细弯玻棒将絮状沉淀沟出，转入一5ml的离心管中；
(f)用3ml的70％乙醇中洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次，各12000g离心2min，弃上清，超净工作台上风干(勿使沉淀完全干燥，否则极其难溶)；
(g)加入100-200μl TE缓冲液，4℃过夜溶解DNA；
(h)加10mg/ml RNase至终浓度为50ug/mL，37℃温育1h；
(i)加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提1次，上清液再用氯仿/异戊醇抽提1次；
(j)向上清中加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，倒置混合；
(k)离心后轻轻弃去上清，DNA沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，稍干后溶于适量TE buffer中，置于4℃冰箱保存(可于-20℃长期保存)。
选择EcoRI对上述提到的基因组进行完全酶切，电泳检查，酶切完全后制备凝胶。
B、毛细管洗脱法转膜
(1)将凝胶用水冲洗3次，每次5min；
(2)20×SSC浸泡凝胶30min左右，其间轻轻摇动；
(3)在磁盘内放入支持物，支持物上放置玻璃板，上面放上滤纸作为纸桥，滤纸要有部分铺在磁盘内。磁盘内倒入20×SSC，液面略低于平台表面，当滤纸浸透后，用玻璃棒赶走所有气泡；
(4)将凝胶用刀片切去无用的一角，作为操作过程中凝胶方位的标记；
(5)剪一张尼龙膜，长度应分别比凝胶大0.5cm左右；
(6)将尼龙膜用20×SSC浸泡至少5min，并剪去一角，使其与凝胶的切角相对应；
(7)将凝胶翻转置于平台上滤纸的中央，滤纸与凝胶的切角相对应；
(8)用封口膜围绕凝胶周边，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中；
(9)在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重合，尼龙膜与凝胶之间不能有气泡；
(10)2×SSC溶液浸湿两张与凝胶大小相同的滤纸，放置在尼龙膜的上方，并赶走气泡；
(11)叠一层略小于滤纸的纸巾，放置在滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一重物压实；
(12)当纸巾浸湿后，应及时更换新的纸巾，持续12-18h；
(13)转膜结束后，揭去上方的纸巾和滤纸，翻转凝胶和尼龙膜，以凝胶的一面朝上，放在一张滤纸上，用笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置；
(14)将凝胶从尼龙膜上剥离弃去，用6×SSC溶液在室温下浸泡尼龙膜5min，除去膜上的琼脂糖碎片；
(15)取出尼龙膜，待溶液滴尽后放在纸巾上，在室温晾干30min以上；
(16)将晾干的尼龙膜放在两张滤纸的中间，80℃烘烤30min-2h。烘烤好的尼龙膜可以立即用于杂交，也可以用锡箔纸包好后室温保存。
C、探针的制备和标记
以几丁质酶基因序列中674bp到1673bp的片段作为DNA探针。以DIG HIGH PRIMELABELING MIX(Roche)标示DNA探针
(1)以蒸馏水稀释10ng-3μg的DNA探针至终体积16μl；
(2)将DNA煮沸10min以变性，迅速置于冰上(或液氮)防止DNA重新粘合；
(3)加入4μl DIG HIGH PRIME LABELING MIX，快速混合，轻敲后离心；
(4)37℃反应一夜；
(5)加入2μl 0.2M EDTA(pH8)以终止反应并以加热65℃ 10min以除活性；
(6)使用前将探子煮沸10-20min；
(7)使用过的探子可于杂交缓冲液(hybridization buffer)中储存于-20℃，并重复使用。
D、杂交
(a)杂交膜浸湿于6×SSC 2min，同时预热预杂交液和杂交炉至杂交温度；
(b)杂交膜封于杂交袋中，按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液，预杂交至少1h；
(c)双链DNA探针提前100℃变性，10min后迅速水浴。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度；
(d)弃预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，置入杂交炉滚动；
(e)杂交膜处理顺序：
2×洗液 2×15min
0.5×洗液 2×15min
1×缓冲液 1×3min
1×封阻液 1×60min
抗体液 1×60mn
1×缓冲洗液 2×15min
1×检测液 1×5min
(f)将膜浸于显色液中，室温避光静置30min，进行显色。
经检测实施例1中3)中第(1)步得到的31个单菌株中有27个单菌株的几丁质酶基因是单拷贝插入到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体中。结果见图3，得到的DNA杂交带各一条，表明工程菌株的外源几丁质酶编码基因为单一拷贝。
(3)几丁质酶活性检测
将步骤3)中的(2)Southern杂交后获得的27个单菌株同时接种到几丁质平板上，28℃培养3-5天后，通过透明圈检测筛选到8个单菌株具有几丁质酶活性，参见图4。将这8个单菌株接种到几丁质的液体培养基中，摇床培养48h后，利用721分光光度计通过透光率测定检测几丁质酶的酶活性。
采用比浊法测定几丁质酶活性，参见文献杨合同等，木霉菌平板抗菌几丁质酶和β-1，3—葡聚糖酶活性与病害防治效果[J].山东科学，2003，16(2)：1-6
A)0.5ml的样品几丁质酶液和0.5ml几丁质明胶(1％湿几丁质明胶溶于50mmol/L磷酸钾缓冲液)混合，25℃温育24h
B)以100℃灭活15min的样品几丁质液作对照，重复步骤A)
C)将培育好的混合物用5ml蒸馏水稀释，在510nm测透光率，以胶体几丁质悬液透光率增加来计算酶活。重复三次取平均值。规定透光率增加10％的酶量为1个酶活单位(U)。
酶活性(U)＝10×(处理液透光率-对照液透光率)/对照液透光率
注：10代表由透光率增加10％酶活力单位增加1U的换算系数。
结果见表1，由表1可以看到菌株37酶活性较高，为1.84466。综合上述筛选过程，最终将菌株37在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，即得到伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC No.2079。
表1：经几丁质平板检测后8个单菌株的酶活性检测
| 菌株 | 酶活性 | 菌株 | 酶活性 |
| 37 | 1.84466 | 38 | 0.638298 |
| 39 | 1.22449 | 40 | 0.4 |
| 35 | 0.927835 | 12 | 0.555556 |
| 41 | 0.851064 | 33 | 1.636364 |
实施例2：伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079的生物学特性
(1)伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079稳定性测定
将伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079接种到不含任何抗生素的固体CGMCC1212培养基上，转接15代后，在含Kan的伯克氏菌培养基上划线，检测伯克氏菌多功能工程菌CGMCC2079的生长情况。同时将伯克氏菌多功能工程菌CGMCC2079接种到不含抗生素的液体培养基中，转接15代后，将菌液稀释到一定的倍数，涂到不含抗生素的固体培养基中，将长出的菌落转接到含抗生素的固体培养基上，检测菌株生长情况。结果在不加抗生素的固体和液体培养的菌株，均能在含抗生素的平板上生长，说明外源基因整合到染色体上具有遗传的稳定性。
(2)伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079解磷、解钾、固氮能力检测分别利用以下培养基进行伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079有关固氮、解磷、解钾能力的测定。
Ashby培养基：NaH2PO4 0.2g；CaCO3 5g；MgSO4·7H2O 0.2g；甘露醇10g；NaCl 0.2g；CaSO4·2H2O 0.1g；琼脂18g；蒸馏水1000ml。
无机磷培养基：葡萄糖10g；(NH4)2SO4 0.5g；NaCl 0.2g；KCl 0.3g；MgSO4·7H2O 0.3g；FeSO4·7H2O 0.03g；MnSO4·4H2O 0.03g；Ca3(PO4)2 10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml。
硅酸盐细菌分离培养基(Aleksandrov培养基)：蔗糖5g；MgSO4·7H2O 0.5g；FeCl3 0.005g；Na2HPO4 2g；钾长石1g(土壤矿物1g)；CaCO3 1g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；pH7.5。
将伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079及越南伯克氏菌CGMCC1212分别接种到以上三种培养基上，28℃培养7天后，检测菌株的生长情况及透明圈产生情况。结果见图5。由图中可见伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在上述培养基上的生长情况均好于越南伯克氏菌株CGMCC1212，尤其是伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079的生长情况，在固氮培养基上长势明显强于越南伯克氏菌株CGMCC1212。伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在解磷培养基上的透明圈明显强于越南伯克氏菌CGMCC1212。
(3)伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079生长曲线的测定
将28℃液体培养的伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079稀释到A600＝0.2，以1∶100(体积比)的比例接种于100ml的伯克氏菌液体培养基中，28℃，150r/min培养，每隔2h测定各菌株在A600的吸光值。结果显示(图6)，伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079染色体上增加了几丁质酶基因的拷贝，其生长曲线与伯克氏菌CGMCC1212相比，具有明显的差异，表明增加了几丁质酶基因的拷贝影响到其菌株本身的生长。由图中可以看出，伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079的生长速度快于伯克氏菌CGMCC1212，在38h后进入静止生长期。说明几丁质酶基因整合到伯克氏菌CGMCC1212染色体中，改变了它的生长速度。
(4)越南伯克氏菌CGMCC1212及伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在小麦根部定殖小麦种子表面用70％乙醇消毒后28℃催芽，种子露白后用2×108cfu/ml利福平标记的越南伯克氏菌CGMCC1212与利福平和卡那霉素标记的伯克氏菌多功能工程菌菌液浸种，分别播种在灭菌土和自然土中。20天后取根尖(根尖以上2cm)，加入灭菌水，混匀后系列稀释。涂板统计菌落数。
结果如图7所示。不管在灭菌土中还是在自然土中，伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079在小麦根尖部分的定殖能力均比越南伯克氏菌CGMCC1212的定殖能力有所提高，尤其是在自然土中，说明将几丁质酶基因整合到越南伯克氏菌CGMCC1212染色体中并得到表达，有利于生防菌提高其自然环境中的竞争定殖能力。
实施例3：伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079平板拮抗试验
病原菌：立枯丝核病菌(Rhizoctoniasolani)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)
各种供试病原菌在PDA培养基上培养三天后，用灭菌打孔器取带菌丝的圆盘型培养基块，将圆盘型带有病原菌的培养基块放在PDA平板的中央，将越南伯克氏菌CGMCC1212及伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079分别点接在距中央2厘米的周围，28℃下培养5-8天后记录抑菌带的宽度。
以各种病原菌为拮抗对象，检测越南伯克氏菌CGMCC1212及伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079拮抗能力。从表2中可以看出伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079相对于越南伯克氏菌CGMCC1212的拮抗能力都有所增强，尤其对Bipolaris sorokiniana，伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079的抑菌百分数是33.33％，与越南伯克氏菌CGMCC1212相比较，抑菌率增长了25.64％。图8是对Fusarium oxysporum的抑菌效果图。说明几丁质酶基因在伯克氏菌多功能工程菌CGMCC2079对病原菌拮抗起主要作用。最终获得伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079。
表2：越南伯克氏菌CGMCC1212及伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC2079
对病原菌的拮抗能力
| 病原菌(Pathogen) | CK(cm) | 抑菌带宽度(cm) | 抑菌率(％) | ΔCGMCC2079％ | ||
| CGMCC1212 | CGMCC2079 | CGMCC1212％ | CGMCC2079 | |||
| 立枯丝核病菌Rhizoctonia solani | 4.3 | 0.3 | 0.8 | 6.98 | 18.60 | 11.63 |
| 尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum | 4.25 | 04 | 0.9 | 9.41 | 21.18 | 11.76 |
| 禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis | 4.1 | 0.5 | 1.2 | 12.20 | 29.27 | 17.07 |
| 麦根腐离蠕孢菌Bipolaris sorokiniana | 3.9 | 0.3 | 1.3 | 7.69 | 33.33 | 25.64 |
| 大丽轮枝菌Verticillium dahliae | 3.85 | 0.8 | 1.1 | 20.78 | 28.57 | 7.79 |
| 小麦全蚀病菌Gaeumannomycesgraminis var.tritici | 3.25 | 0.2 | 0.9 | 6.15 | 27.69 | 21.54 |
注：CK为未接生防菌处的病原菌扩展半径；CGMCC1212％、CGMCC2079％分别是是抑菌宽度占CK扩展半径的百分数；ΔCGMCC2079％是CGMCC2079％与CGMCC1212％的差值；表中数据为三次重复的平均值。
Claims (10)
1.伯克氏菌多功能工程菌株(Burkholderia vietnamiensis)P418-Chi113，菌种保藏号CGMCC No.2079。
2.如权利要求1所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，包括下列步骤：
1)重组质粒pUT-Chi113的构建
根据几丁质酶基因序列设计引物Chi113NotIup和Chi113NotIdo，利用PCR技术扩增几丁质酶基因，利用NotI分别酶切几丁质酶基因和质粒pUT-Km1，再将酶切后的几丁质酶基因和质粒pUT-Km1连接，转入大肠杆菌，得到重组质粒pUT-Chi113；
2)三亲杂交
采用三亲杂交方法，在助手质粒pRK600的存在下，将步骤1)得到的重组质粒pUT-Chi113转入越南伯克氏菌CGMCC1212中，得到76个单菌株。
3)筛选
通过PCR扩增和电泳技术，Southern杂交，几丁质酶活性检测对步骤2)的76个单菌株进行筛选，获得1个几丁质酶酶活性最高的单菌株，即为伯克氏菌多功能工程菌CGMCCNo.2079。
3.如权利要求2所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于步骤3)的筛选具体采用以下三个步骤：
(1)PCR扩增和电泳技术
利用JCHI113-F和JCHI113-R通过PCR扩增和电泳技术对步骤2)中的76个单菌株进行突变子筛选，得到31个单菌株；
(2)Southern杂交
对上述步骤(1)得到的31个单菌株在同等条件下分别进行Southern杂交，所用的DNA探针是几丁质酶基因序列中674bp到1673bp这一片段。经检测这31个单菌株中有27个单菌株的几丁质酶基因是单拷贝插入到越南伯克氏菌CGMCC1212的染色体中，保留该27个单菌株备用。
(3)几丁质酶活性检测
通过几丁质酶活性检测对上述步骤(2)得到的27个单菌株进行进一步的筛选。将上述27个单菌株同时接种到几丁质平板上，通过透明圈筛选菌株，得到8个单菌株在几丁质平板上的透明圈比较明显，将这8个单菌株接种到几丁质的液体培养基中，摇床培养48小时后，利用721分光光度计通过透光率测定几丁质酶酶活性，获得1个几丁质酶酶活性最高(酶活性为1.84466)单菌株，即为本发明的目标产物伯克氏菌多功能工程菌株CGMCC No.2079。
4.如权利要求2所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于步骤1)的引物Chi113NotIup和Chi113NotIdo优选序列如下：
Chi113NotIup：5’-CGGCGGCCGCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG-3’
Chi113NotIdo：5’-CGGCGGCCGCTTATTTGCAATCACCAATT-3’。
5.如权利要求2所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于步骤1)中所说的大肠杆菌是含有λ-pir的大肠杆菌。
6.如权利要求6所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于所述的含有λ-pir的大肠杆菌选自E.coli DH5α(λ-pir)，E.coli SM10(λ-pir)，E.coli S17-1(λ-pir)或E.coliMV1190(λ-pir)。
7.如权利要求2所述的伯克氏菌多功能工程菌株的构建方法，其特征在于步骤2)中所用的引物JCHI113-R和JCHI113-F序列如下：
JCHI113-R：5’-TCTGCGATGTTTGCTCCG-3’
JCHI113-F：5’-TTGGCGGATGGTCTTGGT-3’。
8.权利要求1所述的伯克氏菌多功能工程菌株的用途，其特征在于用于植物病原菌的防治。
9.如权利要求8所述的伯克氏菌多功能工程菌株的用途，其特征在于所述植物病原菌是立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)，植物根结线虫。
10.权利要求1所述的伯克氏菌多功能工程菌株用于微生物肥料的制备。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100162788A CN101144066B (zh) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100162788A CN101144066B (zh) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101144066A true CN101144066A (zh) | 2008-03-19 |
| CN101144066B CN101144066B (zh) | 2011-07-13 |
Family
ID=39206802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007100162788A Expired - Fee Related CN101144066B (zh) | 2007-08-21 | 2007-08-21 | 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101144066B (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102071163A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-05-25 | 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 | 一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法 |
| CN101942401B (zh) * | 2009-12-31 | 2012-08-22 | 江南大学 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
| RU2474614C1 (ru) * | 2011-09-23 | 2013-02-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ β-ЛАКТАМАЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ |
| CN103911311A (zh) * | 2013-07-15 | 2014-07-09 | 河南工业大学 | 一种高效解磷细菌及其生产的菌剂 |
| CN104911122A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-09-16 | 华南农业大学 | 一株久留里伯克霍尔德菌及其应用 |
| CN108018305A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-11 | 华南农业大学 | 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 |
| CN108251328A (zh) * | 2017-12-16 | 2018-07-06 | 山东省科学院生态研究所 | 一种防治蔬菜南方根结线虫病的微生物菌剂及其应用 |
| CN108265015A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-07-10 | 华中农业大学 | 一种多功能解钾菌及其应用 |
| CN109486794A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-19 | 江南大学 | 一种酶活提高的甲壳素酶突变体 |
| CN109810966A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-28 | 南京工业大学 | 一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用 |
| CN111235083A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-05 | 西南大学 | 表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用 |
| CN112359049A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用 |
| CN114058546A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-02-18 | 山东蔚蓝绿源生物科技有限公司 | 一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100999718B (zh) * | 2006-07-06 | 2011-06-15 | 湖南师范大学 | 几丁质酶基因重组的苏云金杆菌工程菌 |
-
2007
- 2007-08-21 CN CN2007100162788A patent/CN101144066B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942401B (zh) * | 2009-12-31 | 2012-08-22 | 江南大学 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
| CN102071163A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-05-25 | 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 | 一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法 |
| CN102071163B (zh) * | 2010-11-29 | 2012-10-24 | 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 | 一株降解毒死蜱的多功能工程菌株及其构建方法 |
| RU2474614C1 (ru) * | 2011-09-23 | 2013-02-10 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ГЕНОВ β-ЛАКТАМАЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ |
| CN103911311A (zh) * | 2013-07-15 | 2014-07-09 | 河南工业大学 | 一种高效解磷细菌及其生产的菌剂 |
| CN103911311B (zh) * | 2013-07-15 | 2016-04-27 | 河南工业大学 | 一种高效解磷细菌及其生产的菌剂 |
| CN104911122A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-09-16 | 华南农业大学 | 一株久留里伯克霍尔德菌及其应用 |
| CN104911122B (zh) * | 2015-04-13 | 2017-12-26 | 华南农业大学 | 一株久留里伯克霍尔德菌及其应用 |
| CN108018305B (zh) * | 2017-12-01 | 2020-08-07 | 华南农业大学 | 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 |
| CN108018305A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-05-11 | 华南农业大学 | 一种利用香蕉穿孔线虫伴生细菌介导的香蕉穿孔线虫防治方法 |
| CN108251328A (zh) * | 2017-12-16 | 2018-07-06 | 山东省科学院生态研究所 | 一种防治蔬菜南方根结线虫病的微生物菌剂及其应用 |
| CN108265015A (zh) * | 2018-01-09 | 2018-07-10 | 华中农业大学 | 一种多功能解钾菌及其应用 |
| CN108265015B (zh) * | 2018-01-09 | 2021-04-06 | 华中农业大学 | 一种多功能解钾菌及其应用 |
| CN109486794A (zh) * | 2018-12-06 | 2019-03-19 | 江南大学 | 一种酶活提高的甲壳素酶突变体 |
| CN109486794B (zh) * | 2018-12-06 | 2020-06-09 | 江南大学 | 一种酶活提高的甲壳素酶突变体 |
| CN109810966A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-05-28 | 南京工业大学 | 一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用 |
| CN111235083A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-05 | 西南大学 | 表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用 |
| CN111235083B (zh) * | 2020-02-21 | 2021-11-05 | 西南大学 | 表达几丁质酶编码基因的荧光假单胞菌生防重组工程菌及其构建方法和应用 |
| CN112359049A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用 |
| CN112359049B (zh) * | 2020-12-10 | 2022-01-28 | 昆明理工大学 | 一种岷江百合几丁质酶基因LrCHI2及其应用 |
| CN114058546A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-02-18 | 山东蔚蓝绿源生物科技有限公司 | 一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用 |
| CN114058546B (zh) * | 2021-11-25 | 2022-08-05 | 山东蔚蓝绿源生物科技有限公司 | 一种用于防治植物病害的复合菌剂及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101144066B (zh) | 2011-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101144066B (zh) | 伯克氏菌多功能工程菌株及其构建方法 | |
| Montealegre et al. | Selection of bioantagonistic bacteria to be used in biological control of Rhizoctonia solani in tomato | |
| Singh et al. | Biological control of Fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria | |
| De Cal et al. | Biological control of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici | |
| Idris et al. | Screening rhizobacteria for biological control of Fusarium root and crown rot of sorghum in Ethiopia | |
| CN107254427A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌菌株jn5及其应用 | |
| CN104946567B (zh) | 一株深褐芽孢杆菌及其应用 | |
| Wang et al. | Production of antifungal compounds by Pseudomonas aeruginosa K-187 using shrimp and crab shell powder as a carbon source | |
| CN106754557A (zh) | 枯草芽孢杆菌ybm‑4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用 | |
| CN101993836A (zh) | 枯草芽孢杆菌菌株yb-81、菌剂及其制备方法和应用 | |
| Maachia et al. | Biological control of the grapevine diseases ‘grey mold’and ‘powdery mildew’by Bacillus B27 and B29 strains | |
| CN107099467A (zh) | 一株铜绿假单胞菌xcs007及其在防治烟草黑胫病中的应用 | |
| CN101250495A (zh) | 一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用 | |
| CN104877926B (zh) | 一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用 | |
| Radovanović et al. | Biocontrol and plant stimulating potential of novel strain Bacillus sp. PPM3 isolated from marine sediment | |
| Hu et al. | A new mycoparasite, Aspergillus sp. ASP-4, parasitizes the sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum | |
| CN101812412A (zh) | 蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用 | |
| CN103060208A (zh) | 高效表达β-1,4-葡聚糖酶编码基因的木霉工程菌株及其应用 | |
| CN101182469A (zh) | 一株对多菌灵具有高抗活性的黑曲霉菌株及其应用 | |
| CN108795827B (zh) | 一种巨大芽孢杆菌bm22及其水分散粒剂和应用 | |
| CN106591154A (zh) | 一株有效防治黄瓜枯萎病的青霉菌 | |
| CN104342393A (zh) | 甲基营养型芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用 | |
| CN106905423A (zh) | 大丽轮枝菌的致病基因、蛋白及其应用 | |
| CN103555615B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其用途 | |
| Araujo et al. | Survival of genetically modified Pseudomonas fluorescens introduced into subtropical soil microcosms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110713 Termination date: 20160821 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |