CN102505009A - 一种桔黄假单胞菌菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物和农用促生菌剂，公开了一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，步骤包括：(1)将桔黄假单胞菌JD37菌种接种入液体培养基中，培养24～28小时，冷冻离心得菌体，与灭菌的助剂溶液悬浮，混合均匀，得到悬浮菌液；(2)将悬浮菌液与灭菌的载体混合。通过上述方法所制得的桔黄假单胞菌菌剂用于制备微生物肥料，菌体释放能力高，使用方便，可降低植株发病率，促进作物生长。制备方法简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物和化学领域，公开了一种农用促生菌剂，具体地说是一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法。
背景技术
我国是农业大国，通过使用化肥以提高农作物的产量，长期和大量施用化肥会造成水体富营养化、土壤物理性质恶化，危害食品安全、甚至人类生命健康。
微生物肥料菌剂是由一种或数种有益活体微生物制备而成的肥料，借助其代谢过程或代谢产物，以改善植物生长条件，尤其是营养环境，达到促进植株生长的作用。微生物肥料菌剂是一种保护生态环境、提高农作物产量和品质的好方法。假单胞菌是一种植物根际促生菌(Plant Growth-promoting Rhizobacteria，PGPR)，能够通过多种方式促进植物生长，包括：抑制植物病原菌、分泌吲哚乙酸(IAA)、产生铁载体等直接或间接的作用促生作用。
现有阶段发现桔黄假单胞菌对多种植物致病菌有抑制作用(RosasBS等，Phyton-Revista Internacionalde Botanica Experimental，2001，67：203-209)；Rosas和Rovera等人(Carlier E，Rovera M等World J Microbiol Biotechnol，2008，24：2653-2658)研究发现，桔黄假单胞菌SR1通过产生铁载体、拮抗蛋白、氢氰酸(HCN)、植物激素类似物等来抑制植物病原菌、促进植物的生长。Feklistova和Maksimova(Feklistova IN等，Bulletin of BSU，chemistry，biology，Geography，2005，2：29-31)发现，桔黄假单胞菌还能合成吩嗪类物质(phenazines)起到生物防治的作用。
现有研究发现一株桔黄假单胞菌JD37(菌种保藏号CGMCCNo.1.10967)对多种植物致病菌有抑制作用，并且能够通过直接或者间接促生作用促进玉米、小麦和番茄植株的生长。所以发明一种对人畜无毒、生态环境友好、能促进植物生长的桔黄假单胞菌菌剂对于保护环境、促进植物生长和农业发展有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是：提供一种既能对植物有促生作用，提高植株产量，又对环境无污染，同时制备简单、使用方便的桔黄假单胞菌菌剂的制备方法。
本发明的技术方案为，一种桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将桔黄假单胞菌JD37菌株接种入液体培养基中，25～30℃下培养24～28小时；离心沉淀取桔黄假单胞菌JD37菌体，与灭菌的0.05wt％～0.2wt％助剂溶液悬浮，混合均匀，得到悬浮菌液；
液体培养基为KB培养基；
离心条件为-8～0℃，优选-4℃，6000～10000rpm离心8～15分钟；
助剂优选为羧甲基纤维素钠；助剂溶液浓度优选为0.1wt％；
获得菌体的液体培养基与助剂溶液体积比为200～300∶1，即：平均每200～300毫升菌液离心后得到的桔黄假单胞菌JD37菌体，与1毫升助剂溶液混合制备悬浮菌液。
(2)将悬浮菌液与灭菌的载体混合，载体与悬浮菌液的体积质量比为3～6g/ml，优选为5g/ml。载体可选用滑石粉或硅藻土，优选为滑石粉。
通过上述方法制备的桔黄假单胞菌JD37菌剂可用作微生物肥料，菌体释放能力高，可防治植物病害，促进作物生长。
桔黄假单胞菌JD37菌剂通过降低植株发病率，达到促进作物生长的效果。桔黄假单胞菌菌剂作为活体微生物肥料的应用价值在于：
(1)桔黄假单胞菌菌剂的菌体释放能力高。
(2)能通过直接或间接的促生方式，促进作物生长。
对作用施用桔黄假单胞菌活体微生物肥料，并在整个生长过程中多次施用，可以显著促进植株根的生长，进而促进整株作物的生长。
(3)抑制植物病原真菌：通过离体叶片实验，桔黄假单胞菌活体微生物肥料能够显著抑制植物病原菌，增强植株抵抗植物病原的能力，起到预防和防治植物病原菌的效果。无毒、无副作用，人畜安全。
(4)农药开发成本低：桔黄假单胞菌活体微生物菌剂的活性成分是桔黄假单胞菌，该菌具有易培养、易收集、对人体及动植物无害的特点，加工促生菌剂选用的载体及助剂材料价格低廉，制备工艺简单易行。
(5)菌剂的使用方法操作简单：桔黄假单胞菌菌剂为干粉状，使用前按一定比例加水稀释，采用浇灌和喷晒的方式施用均可。
附图说明
图1为桔黄假单胞菌JD37菌剂释放菌体在番茄根际土壤和根内的定殖实验结果。
具体实施方式
实施例1
(1)制备液体培养基：蛋白胨20g、甘油10mL、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O 1.5g、去离子水1L，混合静置并灭菌；
(2)在超净工作台中用移液枪将5毫升桔黄假单胞菌JD37菌悬液接种入500毫升液体培养基中，放入恒温摇床，28℃下转速200转/分钟，振荡培养28小时；
(3)将振荡培养后的菌悬液转入灭菌的离心瓶，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机，-4℃离心10分钟，沉淀制得JD37菌体；
(4)配制质量分数为0.1％的羧甲基纤维素钠溶液，在121℃灭菌20分钟备用；将滑石粉置入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟，烘干，分别灭菌三次。
(5)将步骤(3)制得的菌体加入灭菌的0.1％羧甲基纤维素钠溶液2毫升，混合均匀；倒入装有10克滑石粉的玻璃广口瓶中，用无菌玻璃棒搅拌；在超净工作台中晾干，桔黄假单胞菌JD37菌剂制成，可作为干粉状活体JD37微生物肥料。
(6)将步骤(5)制得的桔黄假单胞菌JD37菌剂装入一只封口塑料袋，抽真空，密封、室温保存。
取10克桔黄假单胞菌JD37菌剂，放入10公斤水中，搅拌均匀；番茄种子播种后浇灌，出苗后喷洒。
实施例2
(1)制备液体培养基：
蛋白胨50g、甘油25mL、K2HPO4 3.75g、MgSO4·7H2O 3.75g、去离子水2500ml，混合静置并灭菌；
(2)在超净工作台中用移液枪将25毫升桔黄假单胞菌JD37菌悬液接种入2500毫升液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养28小时；
(3)将振荡培养后的菌悬液转入灭菌的离心瓶，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机，-4℃离心10分钟，沉淀制得JD37菌体；
(4)配制质量分数为0.1％的羧甲基纤维素钠溶液，在121℃灭菌20分钟备用；将滑石粉置入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟，烘干，分别灭菌三次。
(5)将步骤(3)制得的菌体加入灭菌的0.1％羧甲基纤维素钠溶液10毫升，混合均匀；倒入装有50克滑石粉的玻璃广口瓶中，用搅拌器搅拌；在无菌环境晾干，桔黄假单胞菌JD37菌剂制成，可作为干粉状活体JD37微生物肥料。
(6)将步骤(5)制得的JD37菌剂装入封口塑料袋，每袋10克，抽真空，密封、室温保存。
取2袋菌剂，放入20公斤水中，搅拌均匀；番茄幼苗期灌溉。
实施例3
(1)制备液体培养基：
蛋白胨20g、甘油10mL、K2HPO4 1.5g、MgSO4·7H2O 1.5g、去离子水1L，混合静置并灭菌；
(2)在超净工作台中用移液枪将3毫升桔黄假单胞菌JD37菌悬液接种入300毫升液体培养基中，放入恒温摇床，转速200转/分钟，振荡培养28小时；
(3)将振荡培养后的菌悬液转入灭菌的离心瓶，置入转速为8000转/分钟的冷冻离心机，-4℃离心10分钟，沉淀制得JD37菌体；
(4)配制质量分数为0.1％的羧甲基纤维素钠溶液，在121℃灭菌20分钟备用；将硅藻土置入高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟，烘干，分别灭菌三次。
(5)将步骤(3)制得的菌体加入灭菌的0.1％羧甲基纤维素钠溶液5毫升，混合均匀；倒入装有10克硅藻土的玻璃广口瓶中，用搅拌器搅拌；在无菌环境晾干，桔黄假单胞菌JD37菌剂制成，可作为干粉状活体JD37微生物肥料。
(6)将步骤(5)制得的桔黄假单胞菌JD37菌剂装入一只封口塑料袋，抽真空，密封、室温保存。
取10克桔黄假单胞菌JD37菌剂，放入4公斤水中，搅拌均匀；番茄种子播种后浇灌，出苗后喷洒。
实施例4菌体释放能力测定
JD37微生物肥料的保存能力测定：菌剂制备一周后，用分析天平(0.0001g)称取各1g实施例2和3所制备的干粉状活体JD37菌剂，分别加入装有100ml无菌水三角瓶中，摇床振荡1h后，立即采用平板稀释涂布的方法，计算两种菌剂中的JD37菌体含量。实验三次重复。结果如表1所示。
“菌剂1”表示用滑石粉为载体制备的菌剂；“菌剂2”表示用硅藻土为载体制备的菌剂。实验结果表明：实施例2以滑石粉为载体的菌剂中有效菌体释放能力比实施例3硅藻土为载体的菌剂高2.5倍(表1)。此数据表明，以滑石粉作为载体更适合于桔黄假单胞菌JD37菌剂的制备，载体材料滑石粉能够为桔黄假单胞菌JD37菌体提供了适合的附着位点并且有良好的释放作用。
表1菌剂释放JD37数量
实施例5菌剂对番茄植株促生能力测定
实施例1产品对番茄植株促生能力测定程序如下：
(1)实验对象：番茄种子：上海903号种子，购于上海忆涵种苗贸易有限公司。种植土：上海师范大学植物园。番茄灰霉病菌由国家南方农药创制中心(上海)提供。
(2)菌剂的使用处理方法：用分析天平(0.0001g)称取一定质量实施例1所制备的干粉状活体JD37肥料，加入清水中，配制成107CFU/ml的稀释液(约1000倍)。
试验方法：
(1)JD37菌剂释放的JD37菌体在番茄植株根际土壤及番茄根内的定殖情况：挑选健康的番茄种子，表面消毒后室温催芽，播种于装有无菌土的黑色育苗盆中，2粒/槽，5槽/组，每个处理3次重复，置于25℃无菌光照培养箱中14h光照培养，10h黑暗培养，播种1天后浇灌稀释倍数为1000倍的JD37菌剂(107cfu/ml)，培养期间用无菌水浇灌保持土壤湿润，分别于出苗后第1、7、14、21、28天取样，用以下两种方法评价JD37菌剂释放的JD37菌体在根际土壤和根部的定殖数量。
根际土壤：小心取出幼苗，轻轻抖落根表土制备土壤稀释液，取10-5、10-6、和10-7稀释度的土壤悬液涂布在含有氨苄霉素和氯霉素的KB平板上，28℃培养，3-5天后计菌落数，试验3次重复。番茄根部：洗去根上土，加2％NaCl0消毒3min，再用无菌水冲洗，称重。将经过处理的根剪成0.5mm的小段于研钵中研磨成浆状，静止15min，稀释涂布抗性平板，28℃培养2-3天后计菌落数，试验3次重复。
从图1定实殖实验结果可以得知结论，浇灌1000倍的桔黄假单胞菌菌剂稀释液所释放的活体微生物JD37菌体不仅能够在番茄根际土壤中稳定定殖(107CFU/g土壤)，而且能够在番茄根内中稳定定殖(106CFU/g根内组织)。JD37菌剂就是通过释放的JD37菌体能够稳定在植物根际土壤及植物根内定殖来达到促进作物生长的作用。
(2)温室促生实验：在温室里，挑选健康的番茄种子，催芽，播种于36格育苗盘中(28cm*28cm)，每格2粒番茄种子，设置6格为一组，每个处理组6次重复，放置在温室中培养。实验组1为JD37菌株微生物肥料；实验组2为培养28小时的JD37发酵液；实验组3为对照组清水。播种后第一天分别浇灌稀释倍数为1000倍(107CFU/ml)的JD37菌剂和稀释到107cfu/ml的JD37发酵液，对照组浇灌清水。分别于出苗后的第一天和第15天再次浇灌。出苗后30天采集植株样本，测定植株生长指标，包括：植株的株高、根长、鲜重、干重。结果如表2.
实验结果表明：桔黄假单胞菌JD37活体菌剂对番茄幼苗有明显的促生作用，如表2，其中“1”表示浇灌桔黄假单胞菌JD37菌悬液(107CFU/ml)；“2”表示1000倍的桔黄假单胞菌JD37菌剂稀释液；“CK”表示对照组，即浇灌清水。通过测定幼苗的根长、株高、鲜重、干重四项指标表明浇灌1000倍的桔黄假单胞菌JD37菌剂稀释液(107CFU/ml)和JD37菌悬液(107CFU/ml)对番茄幼苗都有明显的促生作用，菌剂稀释液与菌悬液之间对番茄的促生效果没有显著差异性，二者与对照组形成显著差异，表明菌剂释放的活体微生物活性稳定。
表2JD37菌剂对番茄幼苗的促生作用
(3)离体叶片实验：选取部位相同、大小一致的健康番茄植株叶片，用清水洗净后，用0.3％的次氯酸钠溶液对叶片表面进行消毒，将叶片放在1000倍的JD37菌剂稀释液中浸泡10分钟；将叶片置于铺有无菌湿润滤纸的培皿中，放在25℃，湿度为90％的培养箱中培养，每3片叶子为一个处理，每个处理三次重复，3天后用打孔器取番茄灰霉菌菌饼(直径为5mm)，将有菌丝的一面贴于叶片表面，观察叶片的患病情况，对照组用无菌水代替稀释1000倍的JD37菌剂稀释液。
通过离体叶片实验表明：植物根际促生菌桔黄假单胞菌JD37促生菌剂能显著降低病情指数，与对照组相比，防治效果高达55％以上。结果如表3，其中“1”表示用稀释1000倍的菌剂稀释液(107CFU/ml)处理，再接种灰霉病菌；“2”表示用培养28小时的JD37菌悬液(107CFU/ml)处理，再接种灰霉病菌；“CK”表示对照组，即用无菌水处理后再接种灰霉病菌。桔黄假单胞菌JD37菌剂通过降低植株发病率，达到促进作物生长的效果。
表3离体叶片实验
综上所述，桔黄假单胞菌JD37菌剂通过降低植株发病率，达到促进作物生长的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将桔黄假单胞菌JD37菌株接种入液体培养基中，25～30℃下培养24～28小时；
离心后取桔黄假单胞菌JD37菌体，与灭菌的0.05wt％～0.2wt％助剂溶液悬浮，混合均匀，得到悬浮菌液；
获得菌体的菌液与助剂溶液体积比为200～300∶1；
(2)将悬浮菌液与灭菌的载体混合，载体与步骤(1)所述助剂溶液的用量比为3～6g/ml。
2.权利要求1所述一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述助剂为羧甲基纤维素钠，所述载体为滑石粉。
3.权利要求1所述一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述液体培养基为KB培养基。
4.权利要求1所述一种植物根际促生菌桔黄假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述桔黄假单胞菌JD37培养条件为28℃下培养28小时。
5.一种桔黄假单胞菌菌剂，其特征在于，通过权利要求1～4任一项所述的方法制备。
6.权利要求5所述桔黄假单胞菌菌剂用于制备微生物肥料。
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