CN1528891A - 苏云金芽孢杆菌工程菌g033a及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种构建广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌工程菌的方法，得到了一株对鞘翅目和鳞翅目害虫具有高毒力的工程菌，同时，为了增加工程菌的环境安全性，构建了一种环境安全的Bt－E.coli穿梭表达载体和相应的突变体。

Description

苏云金芽孢杆菌工程菌G033A及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌工程菌及其制备方法；本发明还涉及构建对环境安全的Bt-E.coli穿梭表达载体和相应的突变体。本发明还涉及野生型苏云金芽孢杆菌菌株G03的应用。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。在形成芽孢的同时，能产生由一种或几种杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体(parasporalcrystal)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
迄今为止已有人从不同的Bt菌株中克隆了268种杀虫晶体蛋白基因，根据杀虫晶体蛋白氨基酸的同源性，可将他们分为42大类，分属127种模式基因(http：//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中，cry1类基因的表达产物对鳞翅目昆虫有特异的杀虫活性，其蛋白分子量为130～140kD，用胰蛋白酶处理可生成60kD的毒性核心片段(Whiteley，H.R.And Schnepf，H.E.，The molecular biology of parasporalcrystal body formation in B.thuringiensis，Annu.Rev.Microbiol.，1986，40：549)，其中Cry1Ca蛋白对甜菜夜蛾具高毒力，Cry1Ac蛋白对棉铃虫具高毒力。cry3A对鞘翅目昆虫具有特异毒性，该基因编码65kD的蛋白，可不依赖芽孢形成晶体，在昆虫中肠液的作用下，被降解为55kD的毒性多肽(Krieg A，Huger A M，Langenbruch G A，et al.1983 Bacillusthuringiensis var.tenebrionis：ein neuer gegenuber larven von Coleopteren wirksamer pathotyp.Z.Ang.Entomol.，96：500-508)。
国内外已有人利用生物工程的方法，构建了一些苏云金芽孢杆菌工程菌。如美国Ecogen公司首次利用质粒结合转移等细胞工程手段构建了含有cry3B和cry1Ca基因、对鳞翅目和鞘翅目害虫有活性的Bt工程菌(Sick，A.et al.1990.Nucleotide sequence of acoleopteran-active toxin from a new isolate of B.t.subsp.Tolworth.Nucl.Acids Res.18；Entwistle，P.F.，1993.An Environmental Biopesticide：Theory and Practice.Wiley ChichesterPress.U.K.125-146.)。美国Mycogen(Frank.H.Gaermer.et al.Bacillus thuringiensis isolate.US Patent，NO.4910016.Mar.20，1990.)公司和Sandoz(Dimitri-Karamata.et al.Insecticidalhybrid bacteria from B.t.subsp.kustaki and B.t.subsp.tenebrionis.US Patent NO.4797279.Jan10，1989.)公司用上述同样的方法研制出MT104和B-18013，分别用于粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和马铃薯甲虫的防治。
目前世界上防治鳞翅目和鞘翅目害虫所使用的Bt制剂杀虫谱较窄、品种单一、害虫易于产生抗性。且现有技术的工程菌带来的转基因生物的安全问题较为突出。因此除了应解决Bt制剂杀虫谱较窄的问题，构建对环境安全的载体，以及由此获得的转基因微生物逐渐成为人们的研究重点。1989年Ross等提出将来自Lactococcus Lactis subsp.lactis的胸苷酸合酶基因(thy)作为遗传标记代替抗生素标记(Ross，P，F.O′Gara，and S.Condon.1990.Thymilate synthase gene from Lactococcus lactis as a genetic marker：an alternativeto antibiotic resistance genes.Appl.Environ.Microbiol.56：2164-2169)。1998年杨宏杰(于群，2001，假单孢菌、苏云金芽孢杆菌胸苷酸合酶缺陷型突变株的筛选和安全穿梭载体的构建。中国农业大学硕士研究生论文。)对thy基因作为遗传标记的可行性进行了测定，不论以thy基因、amp基因、thy基因和amp基因同时作为筛选标记，均出现相似的有效性，第一个在大肠杆菌和肺炎克氏菌中建立了以胸苷酸合酶为中心的遗传操作系统。利用胸苷酸合酶基因(thy)作为遗传筛选标记，具有较高的生物安全性和遗传稳定性，这在农业、食品业和生物制药等行业中有非常重要的实用价值。
发明内容：
本发明的目的之一是拓宽苏云金芽孢杆菌工程菌制剂(即Bt产品)的杀虫谱，延缓害虫对其产生的抗药性。
目的之二是构建环境安全的表达载体、筛选相应的突变菌株来增强转基因工程菌的生物安全性。
目的之三是探讨不同类型的cry基因的表达产物杀虫活性，找出有效的杀虫蛋白和基因组合，以用于开发新型杀虫剂。
技术方案
1.构建不含红霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因的Bt-E.coli穿梭表达载体pSTK，该载体含有卡那霉素抗性基因和胸苷酸合酶基因。
该载体对环境安全。
2.将cry3Aa7基因插入到上述表达载体pSTK中，得到含有cry3Aa7基因的重组表达载体pSTK-3A。
该载体含有对鞘翅目害虫高毒力的cry3Aa7基因，且对环境安全。
3.将上述重组表达载体pSTK-3A导入对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株G03中，得到苏云金芽孢杆菌工程菌G033A。
因菌株G03对鳞翅目害虫有较高毒力。因此所得到的工程菌G033A对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫同时具有毒力并且对环境安全。
此外，本发明确定了G03菌株含有cry1Ca、cry1Ac、cry1Aa和cry2Ab四种基因。本发明发现G03菌株杀虫晶体蛋白对鳞翅目具有较高的毒力。因此，以上基因的组合及其所表达的蛋白质的组合都可用于制备新型的杀虫剂。
因此，本发明还包括使用所描述的野生型菌株G03、使用本发明所描述的cry1Ac、cry1C等的基因组合以及cry3Aa7基因与cry1Ac、cry1C等基因组合。
以下详述本发明：
1  G03中杀虫晶体蛋白基因的鉴定以及杀虫活性测定
利用cry基因的CAPS鉴定体系，鉴定了菌株G03的cry基因型。确定G03菌株含有cry1Ca、cry1Ac、cry1Aa和cry2Ab四种基因(图1)。
2  G03的杀虫活性测定
提取G03菌株杀虫晶体蛋白，测定对几种害虫的活性，发现其对棉铃虫、甜菜夜蛾具有较高的毒力。(表1、2)
3  PCR扩增胸苷酸合酶基因(thy)全长基因
根据胸苷酸合酶基因(thy)基因的序列，设计一对引物扩增其全长基因片段，并在引物中加入酶切位点。引物序列如SEQ ID NO：1。
以含有全长胸苷酸合酶基因的质粒pUCM1为模板，组合上游和下游引物进行PCR扩增，得到全长的胸苷酸合酶基因片段(1.1kb)。
4  苏云金芽孢杆菌胸苷酸合酶基因缺失突变株的筛选
利用氨基碟呤、胸腺嘧啶作为诱变剂，从经过氨基碟呤和胸腺嘧啶处理的苏云金芽孢杆菌中筛选到不能在基础培养基上生长、只能在补加20ug/mL的胸腺嘧啶核苷的培养基上生长的即为胸苷酸合酶缺陷型突变株。
5  卡那霉素抗性基因(Kmr)
载体质粒pDG780上含有全长的卡那霉素抗性基因，用Cla1酶切质粒pDG780，得到1.4kb全长的卡那霉素抗性基因(Kmr)。
6  Bt-E.coli穿梭表达载体的构建
用胸苷酸合酶基因(thy)和卡那霉素抗性基因分别替代载体pSXY422b上的红霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，得到重组质粒pSTK(图2、3、10、11)。
7  Bt电击感受态的制备
为了提高Bt的转化效率，制备Bt的电击转化感受态细胞(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.1989.Molecular cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbour Lab.，Cold Spring Harbour，NY)，采用电击转化的方法转化Bt受体菌细胞，以获得更多的含有外源基因的转化子。
8  大肠杆菌电击感受态的制备
为了提高大肠杆菌SCS110的转化效率，制备SCS110的电击转化感受态细胞(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.1989.Molecular cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbour Lab.，Cold spring Harbour，NY)，采用电击转化的方法转化SCS110受体细胞，以去除外源基因中甲基化的影响，同时获得更多的含有外源基因的转化子。
9  胸苷酸合酶基因及卡那霉素基因在Bt中活性的检测
将重组质粒pSTK通过电击转化技术分别导入胸苷酸合酶基因缺失突变株UV17thy-和Bt无晶体突变株HD73cry-中，然后分别用不含任何抗生素的1/2LB培养基和含有卡那霉素的1/2LB平板进行筛选，得到转化子。表明胸苷酸合酶基因及卡那霉素基因可以在Bt中正常表达。
10  PCR扩增cry3Aa7全长基因
根据cry3Aa7基因的序列设计一对引物扩增其全长基因片段，并在引物中加入酶切位点。引物序列如SEQ ID NO：2。
以含有全长cry3Aa7基因的质粒pHY512为模板，组合上游和下游引物进行PCR扩增，得到全长的cry3Aa7基因片段(1.9kb)。
11  cry3A基因的Bt表达载体的构建
将PCR扩增得到全长的cry3Aa7基因。PCR产物用BamHI和SalI酶切后，插入到载体pSTK中，得到重组质粒pSTK-3A(图4、12)。
12  含cry3A基因的Bt工程菌G033A的构建及检测
通过电击转化技术将重组质粒导入野生菌株G03中，获得含有cry3A7基因的重组工程菌G033A，采用PCR技术以及SDS-PAGE对外源基因及其表达进行检测(图5、6、7)，并在光学显微镜下观察其晶体形态(图8)。比较了G03和G033A菌株的生长曲线，发现表达载体pSTK-3A导入野生菌株G03中，对它们的生长速率无不良影响(图9)。
13  工程菌的遗传稳定性
采用连续培养法(丁之诠，1997，杀虫遗传工程荧光假单孢菌的构建及生物学特性研究。中国农业大学博士研究生论文。)测定工程菌的遗传稳定性，证明工程菌中含有外源cry3Aa7基因的质粒可以稳定遗传(表3)。
14  工程菌杀虫活性研究
将工程菌G033A、出发菌株G03进行牛肉膏蛋白胨培养基摇瓶培养，然后将菌体经过低温干燥制成粉剂。检测粉剂中活孢子的数量为107/mg，SDS-PAGE电泳检测粉剂中晶体蛋白的含量为G03中130kD的蛋白为11.2％，G033A中130kD和65kD的蛋白分别为10.58％、11.34％。将粉剂稀释成不同的浓度，在室内来测定工程菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾以及鞘翅目害虫榆蓝叶甲的活性(表4、5、6、7)。
附图说明
图1.菌株G03中cry基因的鉴定
1：λDNA/Ecol30I Marker(19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925，421bp)2：G03/K5un2、K3un2  3：G03/K5un3、K3un3  4：G03/K5un2、K3un2  5：pUC57/Sau3AI+TaqI Marker(1444，961，736，585，481，258，159，105bp)6：cry1-3’/XbaI+PstI  7.cry1-5’/PstI+EcoRI  8.cry2/MvaI+MspI
图2.pSXYTHY质粒及酶切分析图谱
1：λDNA/Eco130I Marker  2：thy gene  3：pSXY422b/MunI载体大片段  4：pSXYTHY/PstI5：pSXYTHY/M11、M12  6：pSXYTHY
图3.pSTK质粒及酶切分析图谱
1：λDNA/Eco130I Marker  2：pSXYTHY/Eam1105+PpuMI双酶切后回收载体片段  3：KmR基因片段  4：pSTK/BamHI  5：pSTK/EcoRV  6：pSTK  7：pSXYTHY
图4.pSTK-3A质粒及酶切分析图谱
1：pSTK  2：λDNA/Eco130I Marker  3：pSTK/BamHI+SalI  4：cry3Aa7基因片段  5：pSTK-3A/BamHI+SalI  6：pSTK-3A/SC3A  5、SC3A3  7：pSTK-3A
图5.G033A中cry3Aa7基因的PCR鉴定
1：λDNA/Eco130I Marker  2、3：G033A/SC3A5、SC3A3  4：CK+(pHY512/SC3A5、SC3A3)  5：CK-(G03/SC3A5、SC3A3)
图6.G033A中cry3Aa7基因产物的SDS-PAGE检测
1：Protein Marker(212，119，99，66，40kD)  2：G3A  3：G03  4：Bt22
图7.不同时间G033A中cry3A基因的表达情况
1：Protein Marker  2：36hrs  3：38hrs  4：40hrs  5：42hrs  6：44hrs
图8.光学显微镜下G033A中的方形晶体和菱形晶体
1：Bt22中方形晶体  2：G033中方形晶体和菱形晶体  3：G03中菱形晶体
图9.G03和G033A的生长曲线比较
图10.载体质粒pSXYTHY构建的物理图谱
图11.载体质粒pSTK构建的物理图谱
图12.重组质粒pSTK-3A及工程菌的构建技术路线
具体实施方式
以下是本发明的实施例，这些实施例只对本发明举例说明。在实施例中，尽管详细描述了不同基因的组合，但本发明的基因组合并不限于对Bt菌株进行转化和用于生产对上述害虫有抗性的Bt工程菌。
实际上，可使用本发明所描述的野生型菌株G03，使用本发明所描述的cry1Ac、cry1C等的基因组合以及cry3Aa7基因与cry1Ac/cry1C等基因组合。此外，使用本发明构建的广宿主载体pSTK，以本领域的普通技术人员所掌握的任何一种方法导入任何微生物、植物或其组织、细胞中，以及由此所获得具有任何抗虫活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代，均包括在本发明之内。
实施例1  G03中杀虫晶体蛋白基因的鉴定以及杀虫活性测定
利用cry基因的CAPS鉴定体系(Kuo W-S，Chak K-F，1996.Identification of novelcry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment lengthpolymorphism of the PCR-amplified DNA.Appl.Environ Microbiol.，62(4)：1369-1377；宋福平等，苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立，中国农业科学，1998，31(3)，13-18。)，鉴定了菌株G03的cry基因型。使用Kun2引物对和Kun3引物对分别扩增出1.6kb的cry1基因3’端和1.4kb的cry1基因5’端特征带，表明G03含cry1类基因；用Sun2引物对扩增出1.2kb的cry2基因特征带，表明内含cry2基因。PCR-RFLP分析结果表明cry1基因有cry1Ac、cry1Aa和cry1Ca；cry2基因为cry2Ab(http：//www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。因此确定G03菌株含有cry1Ca、cry1Ac、cry1Aa和cry2Ab四种基因。酶切分析表明电泳分析结果见图1，引物序列见SEQ ID NO：3。
实施例2  G03的杀虫活性测定
提取G03菌株杀虫晶体蛋白，SDS-PAGE定量分析后，以不同的浓度梯度拌入置于培养皿中的人工饲料中，每个培养皿接入初孵幼虫20头虫，室温下培养。对甜菜夜蛾，每24小时统计一次活虫数，直至120小时；对棉铃虫，同样每24小时统计一次，不同的是由于棉铃虫有同类互残的现象，所以一般在3龄后便不再统计。表1为G03蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性；表2为对棉铃虫的杀虫活性。蛋白的初始浓度为2.0μg/μl。室内生物活性测定表明该菌株对棉铃虫、甜菜夜蛾高毒力，其对于棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为0.113μg/g、2.62859μg/g。
                   表1  G03蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性
  样品     浓度   重复   总虫数   存活数  死亡率 校正死亡率   LC50
 G03蛋白   200μg/g     3     60     0   100％   100％ 2.62859ug/g
  同上   20μg/g     3     60     22   63.3％   59.97％
  同上   2μg/g     3     60     28   53.3％   49.06％
  同上   0.2μg/g     3     60     41   31.6％   25.38％
  CK   无菌水     3     60     55   8.33％   0
表2  G03蛋白对棉铃虫的杀虫活性
  样品     浓度  重复   总虫数   存活数   死亡率  校正死亡率     LC50
G03蛋白 100ug/g 3 60 0 100％ 100％ 0.113ug/g
  10μg/g   3     60     12   80％     80％
  1μg/g   3     60     20   66.7％     66.7％
  0.1μg/g   3     60     27   55.0％     55.0％
  0.01μg/g   3     60     44   26.7％     26.7％
   CK    无菌水   3     60     60   0     0
实施例3  PCR扩增胸苷酸合酶基因(thy)全长基因
根据胸苷酸合酶基因基因的序列，设计了扩增其全长基因的一对引物，上游引物M11，下游引物M12，并同时在引物中加入EcoRI酶切位点。引物序列如SEQ ID NO：1。以含有全长胸苷酸合酶基因的质粒pUCM1为模板(杨宏杰，北京大学硕士研究生学位论文，1998)，组合上游引物和下游引物M11、M12，进行PCR扩增，得到胸苷酸合酶基因全长片段(1.1kb)。PCR反应体系如下：PCR10倍缓冲液10uL，20mmol/L MgCl2 12uL，10mmol/LdNTP 2uL，10umol/L上、下游引物各2uL，DNA模板0.1-2ng，2U/uL pfu酶0.5uL，用超纯水补至100uL，混匀离心，加入50uL石蜡油。PCR条件为：94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸3min，32个循环；72℃延伸10min。(宋福平等，苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立，中国农业科学，1998，31(3)，13-18。)
实施例4  胸苷酸合酶基因缺失突变株的筛选
野生菌在培养基上划线培养，取一单菌落于3mL液体培养基中振荡培养过夜后再以1％接种于补加200ug/mL氨基碟呤和200ug/mL的胸腺嘧啶核苷的液体培养基中30℃振荡培养4天；然后稀释涂布于补加20ug/mL的胸腺嘧啶核苷的平板上，30小时后挑取较大的斑，分别接种于没有补加20ug/mL的胸腺嘧啶核苷的基础培养基和补加20ug/mL的胸腺嘧啶核苷的基础培养基上。不能在基础培养基上生长而只能在补加20ug/mL的胸腺嘧啶核苷的基础培养基上生长的菌即为胸苷酸合酶基因缺陷型突变株。
实施例5  卡那霉素抗性基因(Kmr)
载体质粒pDG780上含有全长的卡那霉素抗性基因(Guerout-Fleury AM，Shazand K，Frandsen N，Stragier P.Antibiotic-resistance cassettes for Bacillus subtilis.Gene.1995 Dec 29；167(1-2)：335-6.)，用ClaI酶切质粒pDG780，得到1.4kb全长的卡那霉素抗性基因(Kmr)。
实施例6  Bt-E.coli穿梭的构建
将PCR扩增得到的胸苷酸合酶基因用EcoRI酶切后插入到质粒pSXY422b上红霉素抗性基因中MunI酶切位点(宋福平，东北农业大学博士学位论文，2001)，得到载体质粒pSXYTHY，构建流程见图9。酶切和PCR鉴定结果见图2。转化大肠杆菌胸苷酸合酶基因缺失突变株DH5αthy-，得到重组子，表明该基因可以在大肠杆菌中正常表达。将酶切质粒pDG780得到的全长卡那霉素抗性基因补平后插入到pSXYTHY上氨苄青霉素抗性基因中Eam1105I和PpuMI酶切位点(补平)之间，得到重组质粒pSTK，构建流程见图10。图3为pSTK的酶切分析图谱。转化大肠杆菌JM110，用卡那霉素进行筛选，得到转化子，表明卡那霉素基因可以在大肠杆菌中正常表达。
实施例7  大肠杆菌SCS110电感受态的制备
挑取单菌落于5ml LB震荡37℃培养过夜。按1％接种量接种于100ml LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2hrs(OD600＝0.5)。4℃，4000rpm离心6min。弃上清，加入预冷的超纯水冲洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞。4℃，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入10％甘油1-2ml重新悬浮细胞，分装，-70℃保存备用。
实施例8  Bt电击感受态的制备
挑取单菌落于5ml LB震荡30℃培养过夜。按1％接种量接种于100ml BH液体培养基中，37℃，230rpm培养3-4hr(OD600＝2.0)。4℃，9000rpm离心6min。弃上清，加入预冷的超纯水洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞，4℃，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入40％PEG重悬细胞，分装，-70℃保存备用。
实施例9  胸苷酸合酶基因及卡那霉素抗性基因表达的检测
用重组质粒pSTK电击转化大肠杆菌SCS110，去甲基化。从中提取质粒分别转化Bt无晶体突变株HD73 cry-和胸苷酸合酶基因缺失突变株UV17 thy-，然后分别用含有卡那霉素的1/2LB平板和普通的1/2LB培养基进行筛选，得到转化子。从转化子中提取重组质粒，分别回转大肠杆菌JM110和胸苷酸合酶基因缺失突变株DH5α thy-，用含有卡那霉素的1/2LB平板和普通的1/2LB培养基筛选，得到转化子，重新提取质粒，进行酶切检测，证明所提取的质粒中含有卡那霉素抗性基因和胸苷酸合酶基因。表明卡那霉素抗性基因和胸苷酸合酶基因可以在Bt中正常表达。
实施例10  PCR扩增cry3Aa7全长基因
根据cry3Aa7基因的序列，设计了扩增全长cry3Aa7基因的一对引物，上游引物SC3A5，下游引物SC3A3，并在上游引物加进BamHI切点，下游引物引物加进SalI切点，序列如SEQ ID NO：2。
以含有cry3Aa7全长基因的质粒pHY512为模板(张杰，中国农业科学院博士学位论文，2000)，用SC3A5/SC3A3为引物PCR扩增得到cry3Aa7全长基因片段(1.9kb)，PCR反应体系如下：PCR10倍缓冲液10uL，20mmol/LMgCl2 12uL，10mmol/LdNTP 2uL，10umol/L上、下游引物各2uL，DNA模板0.1-2ng，2U/uLpfu酶0.5uL，用超纯水补至100uL，混匀离心，加入50uL石蜡油。PCR条件为：94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸3min，32个循环；72℃延伸10min。
实施例11  cry3A基因的Bt表达载体的构建
将PCR扩增得到的cry3A基因产物用BamH1和Sal1酶切后，插入到载体pSTK的BamH1和Sal1酶切位点之间。重组质粒命名为pSTK-3A。图12为pSTK-3A的构建流程图。图4为pSTK-3A的酶切分析及PCR鉴定电泳结果，
实施例12  cry3A基因在Bt中的表达及检测
用含有cry3A基因的重组质粒转化大肠杆菌SCS110，用卡那霉素进行筛选，得到转化子，从中提取重组质粒，然后电击转化Bt自然菌株G03，利用卡那霉素抗性筛选转化子，得到工程菌G033A，图5为它的PCR鉴定结果，证明表达载体转化成功。获得工程菌G033A在1/2LB平板上30℃培养30个小时后，在光学显微镜下观察晶体。G033A可以观察到比较明显的菱形晶体和方形晶体。图8为光学显微镜下观察晶体的结果。比较了G03和G033A菌株的生长曲线，发现表达载体pSTK-3A导入野生菌株G03中，对它们的生长速率无影响。图9为它们的生长曲线。
在牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃培养G033A，在40小时后，取样进行SDS-PAGE电泳，检测cry3A基因的表达情况。结果表明，cry3A基因可以正常表达，并形成65kD左右的蛋白带(图6)。分别于第32、36、38、40、42、44小时取样，离心收集沉淀，SDS-PAGE分析不同时间内cry3Aa7基因的表达情况。结果表明，cry3Aa7基因可以在出发菌株中稳定表达65kDa的蛋白(图7)。
实施例13  工程菌的遗传稳定性
采用连续培养法(丁之诠，1997，杀虫遗传工程荧光假单孢菌的构建及生物学特性研究。中国农业大学博士研究生论文。)测定工程菌的遗传稳定性，将待测菌株接种在含有抗生素的LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，以1％的接种量转接至无抗生素的LB液体培养基中，30℃连续振荡培养，于24、36、48、60、72hrs取样，按菌浓度稀释107-109倍，并分别取100ul稀释液涂布于没有选择压的LB平板上，30℃培养30-40hrs，待长出单菌落后，任意挑取100个单菌落转移至有选择压的平板上，30℃培养30-40hrs，统计有选择压的平板上的菌落数，以下式计算抗性菌落百分数：
Figure A20031010019700131
实验结果表明，在无抗性的培养基中培养72小时后工程菌的遗传稳定性仍可达到100％(表3)。
                表3.G033A中pSTK-3A质粒的遗传稳定性
时间(hrs) 24  36  48  60  72
遗传稳定性(％) 100  100  100  98  100
实施例14  工程菌杀虫活性研究
将工程菌G033A、出发菌株G03以及对照菌株Bt22进行牛肉膏蛋白胨培养基摇瓶培养，然后将培养液液进行离心，收集菌体，菌体经过低温干燥制成粉剂。检测粉剂中活孢子的数量为107/mg，SDS-PAGE电泳检测粉剂中晶体蛋白的含量为G03中130kD的蛋白为11.2％，G033A中130kD和65kD的蛋白分别为10.58％、11.34％。将粉剂稀释成不同的浓度，在室内来测定工程菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾以及鞘翅目害虫榆蓝叶甲的活性。小菜蛾、榆蓝叶甲：采用浸叶法测定工程菌的活性，96hrs调查结果；棉铃虫、甜菜夜蛾：采用人工饲料饲喂法，7天调查结果。结果表明工程菌G033A不仅对鳞翅目害虫棉铃虫、甜菜夜蛾和小菜蛾具有很高的毒力，同时与出发菌株G03相比，增加了对鞘翅目害虫榆蓝叶甲的毒性(表4、5、6、7)。由表4，5，6可以看出工程菌株G033A对棉铃虫、甜菜夜蛾和小菜蛾的LC50分别为41.52ug/ml、20.07ug/ml、8.13ug/ml，与出发菌株相比，差异不明显；但是工程菌株G033A增加了对鞘翅目害虫的毒性，G033A对榆蓝叶甲的LC50为3.097mg/ml。
                表4.G033A在室内对甜菜夜蛾的杀虫活性测定结果
    处理                G03               G033A
 浓度(mg/ml)    校正死亡率   LC50(mg/ml)    校正死亡率   LC50(mg/ml)
    0.2     95.77465 0.02418     87.32394 0.02007
    0.1     83.09859     85.21127
    0.05     76.76056     76.76056
    0.02     47.18309     53.52112
    0.01     17.90744     26.05633
表5.G033A在室内对小菜蛾的杀虫活性测定结果
    处理                    G03                   G033A
 浓度(mg/ml)   死亡率  校正死亡率   LC50(mg/ml) 死亡率   校正死亡率   LC50(mg/ml)
    0.33   1   1 0.00634 1   1 0.00813
    0.033   0.95   0.947368 0.925   0.921053
    0.0165   0.883333   0.877193 0.916667   0.912281
    0.00825   0.825   0.815789 0.583333   0.561404
    0.0033   0.116667   0.070175 0.033333   0
            表6.G033A在室内对棉铃虫的杀虫活性测定结果
    处理              G03                G033A
  浓度(mg/ml)   校正死亡率(％)   LC50(mg/ml) 校正死亡率(％)     LC50(mg/ml)
    0.667   97.91667 0.05308   95.83333 0.04152
    0.333   93.75   91.66667
    0.167   83.33333   77.08333
    0.083   64.58333   68.75
    0.0417   41.66667   50
           表7.G033A在室内对榆蓝叶甲的杀虫活性测定结果
    处理                G03              G033A
浓度(mg/ml) 校正死亡率(％)   LC50(mg/ml) 校正死亡率(％)     LC50(mg/ml)
    10     10 980.932     100 3.097
    5     7     90
    3     3     40
    1.5     0     6.7
    0.75     0     3.3
附：本发明所涉及的DNA序列
SEQ ID NO：1(用于扩增全长的胸苷酸合酶基因序列)
M11：5-G GAATTCGCTAGCTGTCTCAGGTTTGTTCCT-3
M12：5-G GAATTCGCTAGCCGTTGCAGGACGTTGC-3
SEQ ID NO：2(用于扩增全长的cry3A基因片段)
SC3A5：5`-CGC GGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`
SC3A3：5`-ACGC GTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`
SEQ ID NO：3
Kun2(用于扩增出1.6kb的cry1基因3’端特征带)
Forward 5’-AGGACCAGGATTTACAGGAGG-3’
Reverse 5’-GCTGTGACACGAAGGATATAGCCAC-3’
Kun3(用于扩增出1.4kb的cry1基因5’端特征带)
Forward 5’-CAATGCGTACCTTACAATTGTTTAAGTAAT-3’
Reverse 5’-CCTCCTGTAAATCCTGGTCCT-3’
Sun2(用于扩增出1.2kb的cry2基因特征带)
Forward 5’-GGAAGAACTACTATTTGTGATGC-3’
Reverse 5’-AATAGTTTGAATTACCGCGAGC-3’
注：划线部分为酶切位点，其中GAATTC为EcoR1的酶切位点，GGATCC为BamH1的酶切位点，GTCGAC为Sal1的酶切位点。

Claims (10)

1.一种对环境安全的Bt-E.coli穿梭表达载体pSTK，其特征是不含红霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，并含有卡那霉素抗性基因和胸苷酸合酶基因。
2.权利要求1所述载体pSTK的制备方法，包括以下步骤：
1)以含有胸苷酸合酶基因的质粒pUCM1为模板，进行PCR扩增，得到全长的胸苷酸合酶基因片段；
2)用限制性内切酶Cla1酶切质粒pDG780，得到全长的卡那霉素基因片段；
3)将上述两个基因分别替换载体pSXY422b中的红霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，得到重组质粒pSTK。
3.一种重组表达载体pSTK-3A，其特征是含有权利要求1所述的表达载体pSTK和cry3Aa7基因。
4.权利要求3所述载体pSTK-3A的制备方法，包括以下步骤：
1)以序列为SEQ ID NO：2的DNA为引物，用含有cry3Aa7基因的质粒pHY512为模板，进行PCR扩增，得到全长的cry3Aa7基因片段；
2)将上述基因片段插入到权利要求1所述的表达载体pSTK中，得到含有cry3Aa7基因的重组表达载体pSTK-3A。
5.一种对鞘翅目和鳞翅目害虫高毒力的工程菌G033A，其特征是含有权利要求3所述的重组表达载体pSTK-3A和野生苏云金芽孢杆菌菌株G03；且菌株G03中含有cry1Ca、cry1Ac、cry1Aa和cry2Ab四种基因。
6.权利要求5所述工程菌G033A的制备方法，将权利要求4所述的重组表达载体pSTK-3A导入野生菌株G03中得到。
7.用cry1Ca、cry1Ac、cry1Aa和cry2Ab四种基因中任意二种或多种基因的组合，或任意二种或多种基因所编码的蛋白的组合制备杀虫剂的用途。
8.权利要求7所述的制备杀虫剂用途，优选用cry1Ca、cry1Ac基因的组合，或此二种基因所编码的蛋白的组合。
9.用cry3Aa7与cry1Ac及cry1Ca基因的组合，或此三种基因所编码的蛋白的组合制备杀虫剂的用途。
10.用苏云金芽孢杆菌野生菌株G03制备杀虫剂的用途。
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Assignor: INSTITUTE OF PLANT PROTECTION CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: Baciallus thuringiensis engineering bacterium Go33A and preparing method thereof

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License type: Exclusive License

Open date: 20040915

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