CN113773965A - 一种牛筋草生防菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛筋草生防菌，采集牛筋草自然发病的植株，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织分离、培养和纯化得到多种菌株，通过柯赫氏法则验证其中的致病菌，最终获得了一种对牛筋草有强致病力的病原真菌(NJC‑16)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO.M2020688。本发明的牛筋草炭疽菌专一性强，致病力较为迅速，接种3天后能形成明显的叶部病斑，随着病斑的扩展，达到有效防控牛筋草的目的。该菌对玉米、小麦、水稻安全，专一性强，有进一步开发的潜力。
Description
技术领域
本发明属于杂草生物防治技术领域，特别涉及一种对牛筋草具有侵染和防治能力的生防真菌(Colletotrichum eleusines)。
背景技术
牛筋草是农田的一种恶性杂草，分布于中国南北各省区及全世界温带和热带地区，主要危害玉米、棉花、大豆等粮食作物，及蔬菜、果树等经济作物。该草适应性极强、生长速度快、繁殖力强、耐践踏、竞争优势强，严重的影响了其他作物的生长，并对农业生态系统的功能和结构构成严重威胁。
目前，使用化学除草剂是牛筋草主要的防除措施，然而随着化学除草剂的大量使用，导致牛筋草抗药性以及环境污染问题日益加重，牛筋草的高效安全防除面临着严峻挑战。因此，开发微生物除草剂或利用自然界生物中具有生物活性的代谢产物开发新的生物源除草剂成为高效防除牛筋草，进而替代现有化学除草剂的有效途径之一。综上，为解决上述问题，我们提供一种牛筋草生防菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种对牛筋草有强致病作用与生防作用的除草真菌。根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为牛筋草炭疽菌(Colletotrichum eleusines),通过试验测定，确定了它生长、产孢和侵染致病的最适条件，并分析了该菌的寄主专化性及其生物安全性。
牛筋草强致病菌株的分离纯化：采集牛筋草自然发病的植株，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织分离、培养和纯化得到多种菌株，通过柯赫氏法则验证其中的致病菌，最终获得了一种对牛筋草有强致病力的病原真菌(NJC-16)。
本发明的牛筋草炭疽菌菌株(NJC-16)已于2020年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO.M2020688。
菌株的形态特征(图1)鉴定：NJC-16菌株在PDA培养基上菌落呈圆形，边缘规则，绒状，25℃培养条件下7天生长速度为5.9cm，菌落初期白色，后期为黑色(图1A)；在PSA培养基上菌落圆形，边缘规则，呈绒状，25℃培养条件下7天生长速度为6.1cm，菌落初期白色，后期为黑色，气生菌丝较多(图1B)。菌丝有隔，透明，0.6-5.0μm，有脂滴。
分生孢子(图1C)无色，单孢，长椭圆状或镰刀状，大小为2.8-4.6μm×7.3-11.8μm，分生孢子内含脂滴。附着胞(图1D)圆形或长圆形，卵球形或倒卵球形或棒状，边缘光滑，少有叶瓣状附着胞，大小为4.3-6.0μm×6.7-11.6μm，初步通过形态学鉴定菌株NJC-16为子囊菌亚门腔孢纲黑盘孢目禾生炭疽菌复合种下的牛筋草炭疽菌。
病原菌的分子鉴定：采用CTAB法提取病原菌株的基因组DNA。采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增该病原菌的目的基因序列，得到554bp大小的片段，将此片段在GenBank中进行BLAST比对，发现该菌株与牛筋草炭疽菌的同源性最高，为99.62％。通过构建系统发育树发现，菌株NJC-16序列与牛筋草炭疽菌的遗传距离最近，聚在一起，如图2所示，结合形态学特征及分子鉴定结果，确定NJC-16为牛筋草炭疽菌(Colletotrichum eleusines)。
菌株的最佳培养条件：该真菌菌落生长和产生分生孢子的最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)(图3)，最适生长温度为25℃，生长最适pH为7，不同光照条件对病原菌生长无显著差异，在供试碳(氮)源中病原菌对淀粉和酵母粉的利用效果最好(图4)。
菌株的接种侵染条件：病原菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在106个/mL数量级或更高，接种后保湿和黑暗培养24h，并在整个侵染期保持温度在25-28℃，湿度在80％以上。
菌株的致病性：牛筋草炭疽菌对牛筋草有良好的致病作用和生长抑制作用。在室内接种分生孢子悬浮液的牛筋草植株在喷雾接种3d后产生水渍状病斑，后逐渐扩大并形成黑褐色轮纹状病斑，接种7d后植株萎蔫死亡。
菌株的专化性：在合适的条件下，将菌株NJC-16分生孢子液(106个/mL)分别接种三叶期的牛筋草、稗草、马唐、千金子、大巢菜、反枝苋等杂草植株。室内生防实验结果表明，菌株NJC-16孢子悬浮液对牛筋草生防效果最佳，接菌21d后牛筋草发病率为83.2％，致死率达89.7％，鲜重抑制率达73.2％；对马唐、千金子和反枝苋的生防效果较差，鲜重抑制率仅为5.8％，5.2％，9.4％；稗虽然发病，但是却不致死；接种大巢菜21d后在大巢菜叶片上可见菌落，但致死率以及鲜重抑制率均不高(图5)，说明该牛筋草炭疽菌菌株是牛筋草的专性致病菌。
菌株的生物安全：在合适的条件下，将菌株NJC-16分生孢子液(106个/mL)分别接种三叶期的玉米、小麦及水稻植株，室内作物安全性试验结果表明，在喷雾菌株NJC-16孢子液7d后，玉米(鄂玉24)、小麦(郑麦9023)和水稻(晚籼98)叶片均没有明显病斑；21d后，玉米、小麦和水稻等作物鲜重没有明显的抑制，表现为安全(图6)。说明该菌株若用于研制牛筋草生防除草剂，可保证生境中其他植物的安全。
附图说明
图1为本发明生防菌NJC-16的形态特征图；
图2为本发明基于ITS序列采用NJ法构建菌株NJC-16及其相关菌株的系统发育树图；
图3为本发明NJC-16在不同培养基上的生长速率及产孢量统计图；
图4为本发明不同碳、氮源对NJC-16菌丝生长的影响统计图；
图5为本发明NJC-16菌株孢子液对不同杂草生防防效的比较统计图；
图6为本发明NJC-16菌株孢子液对不同作物的安全性比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1：除草真菌的分离纯化与鉴定
1.牛筋草病原菌分离、纯化：选取病叶样品，采用常规组织分离法分离病原菌，用清水洗净病叶并剪取4mm×4mm的病健交界处组织，用75％乙醇处理30s，0.1％升汞消毒1-2min，无菌水冲洗3遍，接种在PDA培养基上，25℃下培养5d，将获得的菌株通过单孢纯化后保存在PDA斜面及滤纸片上，分别置于4℃及-20℃冰箱保存备用。
2.牛筋草病原菌的致病性鉴定：采用菌丝块离体接种及分生孢子液活体接种进行，菌丝块接种：从三叶期健康牛筋草植株上选取大小一致的无病害叶片20片，70％酒精1min进行表面消毒，打取直径为5mm的菌丝块，接种至牛筋草健康叶片上；以接种PDA培养基作为对照，置于30cm×50cm的瓷盘内25℃保湿培养，接种2d后移去菌丝块，观察发病情况；分生孢子悬浮液活体接种：收集牛筋草炭疽菌的分生孢子，将分生孢子配成浓度为1×106个/mL的分生孢子悬浮液。牛筋草植株种于10cm的花盆中，每盆10-15株，将配制好的分生孢子悬浮液(含0.05％的吐温80)每盆10mL均匀喷洒到三叶期的健康牛筋草植株上，以含0.05％的吐温80的无菌水作对照，28℃、黑暗保湿培养2d后，16h/8h光/暗培养，观察发病情况；根据柯赫氏法则，对发病叶片进行再分离、培养，在显微镜下观察分离得到的菌株是否为原接种菌株。
3.牛筋草病原菌分类地位鉴定：病原菌形态学鉴定：将病原菌接种到PDA、PSA培养平板上，25℃黑暗培养，观察菌落形态、颜色、分生孢子及附着胞的特征等，对病原菌进行初步鉴定；病原菌的分子鉴定：采用CTAB法提取病原菌株的基因组DNA。采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增该病原菌的目的基因序列，所得到的核苷酸序列与GenBank中序列进行BLAST比对分析，使用MEGA 7.0软件将供试菌株的ITS序列与BLAST上同源性高的菌株序列进行比对，采用邻近法(neighbor-joining，NJ)进行聚类分析，构建系统发育树。
实施例2：牛筋草炭疽菌生物学特性
1.培养基对菌株生长及产孢的影响：将病原菌接种到PDA、PSA、OTA、OMA、CA、MBA培养平板上，25℃黑暗培养，观察菌落形态、颜色、分生孢子及附着胞的特征。
2.温度对菌株NJC-16的影响：打取直径为6mm的菌丝块，接至PDA平板中央，分别在5、10、15、20、25、30、35℃的恒温条件下培养，观察菌丝生长情况，5d后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理5次重复。
3.光照对菌株NJC-16的影响：将直径为6mm的病原菌菌丝块接至PDA平板中央，将平板分别置于连续光照、12h光暗交替、连续黑暗的人工气候培养箱，25℃恒温培养，5d后用十字交叉法测量菌落直径，每处理5次重复。
4.pH对菌株NJC-16的影响：打取直径为6mm的菌丝块，接至PDA平板中央，分别在pH4、5、6、7、8、9、10，25℃恒温条件下培养，观察菌丝生长情况，5d后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理5次重复。
5.碳源和氮源对菌株NJC-16生长的影响：以查氏(Czapek)培养基为基础培养基，用等质量碳元素的葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、半乳糖、山梨醇、麦芽糖、柠檬酸钠、果糖、乳糖替代蔗糖，以不加碳源的查氏培养液作为对照；用等质量氮元素的酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠代替KNO3，以不加氮源的查氏培养液作为对照。打取直径为6mm的菌丝块接至含不同碳(氮)源的PDA平板上，25℃条件下培养5d后用十字交叉法测量菌落直径，每处理5次重复。
实施例3：菌株NJC-16的致病力测定
将菌株NJC-16接种于PDB培养基，25℃、220r/min摇培7d，收集孢子并配制成浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液(含0.05％的吐温80)。将10mL孢子悬浮液每盆喷施于3叶期稗、马唐和反枝苋等杂草植株，28℃、黑暗保湿培养2d后，16h/8h光/暗培养。以喷施0.05％的吐温80的植株为对照，7d后观察植株的发病情况。每个处理3次重复。
实施例4：菌株NJC-16的生物安全测定
将浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液(含0.05％的吐温80)喷施2-3叶期玉米、小麦和水稻植株，28℃、黑暗保湿培养2d后，16h/8h光/暗培养。以喷施0.05％的吐温80的植株为对照。接种7d后，观察供试玉米、小麦和水稻的发病情况。21d后收集作物地上部分，统计鲜重抑制率。鲜重抑制率(fresh weight inhibition rate,FWIR)的计算公式：FWIR(％)＝(对照平均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重×100。
Claims (4)
1.一种牛筋草生防菌，其在特征在于：采集牛筋草自然发病的植株，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织分离、培养和纯化得到多种菌株，通过柯赫氏法则验证其中的致病菌，最终获得了一种对牛筋草有强致病力的病原真菌(NJC-16)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO.M2020688。
2.一种牛筋草生防菌，其在特征在于：病原菌的分子鉴定采用CTAB法提取病原菌株的基因组DNA。
3.一种牛筋草生防菌，其在特征在于：最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA) 。
4.一种牛筋草生防菌，其在特征在于：病原菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在106个/mL数量级或更高。
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| CN115433682A (zh) * | 2022-07-07 | 2022-12-06 | 湖北省农业科学院植保土肥研究所 | 一种稗草生防菌b-48及其应用方法 |
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| CN115433682B (zh) * | 2022-07-07 | 2024-02-09 | 湖北省农业科学院植保土肥研究所 | 一种稗草生防菌b-48及其应用方法 |
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