CN115125175B - 一种杀螨菌株的发酵方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效杀螨菌株的发酵方法，包括以下步骤：S1:取保藏编号为CGMCC No.24996，名称为bacillus velezensis的菌株；S2:取该菌种划线于培养基固体平板上进行活化，培养后，挑取单菌落；S3:将挑取的单菌落接种于摇瓶培养基中培养后转接入小试发酵罐；S4:小试发酵罐后转接5T发酵罐；S5:发酵罐培养后下罐；S6:得发酵液。本发明发酵液稀释后作为活性成分杀螨，杀螨效果好。
Description
技术领域
本发明涉及农业领域，特别涉及一种杀螨菌株的发酵方法、发酵液及除螨剂。
背景技术
当前农业有害生物防治中，植食性螨类是世界公认的最难防的有害生物类群之一，其主要类别为叶螨，俗称红蜘蛛，属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，真螨目(Acariformes)，叶螨总科(Tetranychoidea)。叶螨是一种世界性害螨，因其个体小、世代短、发育周期短、繁殖快、适应性强、突变率高，极易产生抗药性，防治极为困难，造成农作物螨害愈演愈烈的“小虫成大灾”局势，使农业生产遭受极大损失，影响到农业增产和农民增收，成为目前农业生产上一个重要的亟待解决的大问题。
化学防治依然是我国园艺作物生产中治理螨害的主要对策，但是杀螨剂的滥用和误用极易导致叶螨抗药性的产生，极大降低了化学农药的田间防治效果。2008年统计显示叶螨对目前药剂中的92中活性成分产生了抗药性，包括神经毒素类杀虫剂如有机憐酸酯类和拟除虫菊酯类，选择性杀螨剂如线粒体电子传递抑制剂和有机锡类等。叶螨抗药性情况比其它田间害虫如小菜蛾、蚜虫等要严重许多，因而有科学人员将叶螨视为最耐药的物种。其中二斑叶螨(Tetranychus Urticae Koch)无论是在温室蔬菜上还是露天的果树上，其抗药性要明显高于其它螨类。如二斑叶螨对阿维菌素、三氯杀螨醇和克螨特等的抗性倍数是其他螨类的10倍以上。二斑叶螨的全基因组DNA研究发现，其体内的解毒基因是其它动物的3倍之多，含有一个抗药性基因家族的39个基因，而昆虫和脊椎动物只有14个。因此，开展以生物防治为主要手段的防治策略是实现可持续控制的重要途径。
在害螨的各种防治手段中，生物防治一直是一个研究的重点和热点，在害螨防治策略中扮演重要角色。目前在害螨天敌、植物源农药和叶螨病原菌等方面的生防研究均取得了一些进展和成果。叶螨的天敌种类繁多，植绥螨和食螨瓢虫是研究和应用较多的两种，尤其是植绥螨在许多国家已工厂化大规模生产。荷兰有60％的温室用智利小植绥螨防治黄瓜上的二斑叶螨，而英国、芬兰、瑞典和丹麦已超过70％。福建省农业科学院植物保护所初步建立了我国第一个捕食螨大量繁殖基地，在全国推广应用面积达13.3万公顷。但天敌利用因存在不易建立优势种群、维持天敌种群的费用昂贵，不能和化学防治一起综合防治等缺点而在其应用和发展上受到限制。植物性农药有效成分安全、低毒，大多是一类具有杀螨活性的植物次生代谢物质，已经报道进行过杀螨活性测定的植物接近200余种，但由于活性低活性成分不明确，具有开发利用价值的寥寥无几。
节肢动物体内广泛分布着各种胞质遗传的细胞内共生菌，分为初生共生菌(primary symbiont)和次生共生菌(secondary symbiont)。初生共生菌是宿主生存必需的，与寄主协同进化，广泛分布于寄主的组织细胞内，主要通过母系垂直传播，同时还能进行水平传播。次生共生菌不是寄主存活所必需的，对寄主可能有益也可能有害，有害者可称为叶螨病原菌。叶螨病原菌与叶螨之间经过漫长的进化过程，在它们之间形成了相互依存和制约的关系。如何利用该病原菌及其生物活性物质，已成为近年来发达国家许多实验室的主攻方向。
叶螨在自然界中的病原菌相对较少，目前记录最主要的是沃尔巴克氏体(Wolbachia)，最初发现于尖音库蚊(Culexpipiens)卵巢中，能够感染昆虫、螨等多种节肢动物。这类细菌能够引发寄主生殖异常行为，如胞质不亲和、孤雌生殖、杀雄和雌性化等现象。具有相似活性的菌株还有Candidatus cardinium，简称Cardinium，是从匀鞭蚜小蜂属(Encarsia)寄生蜂中发现的，能够引起叶螨雌性化，诱导孤雌生殖，诱导胞质不亲和，影响宿主适合度和改变寄主的产卵行为。蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii Zimm)可用于防治蚜虫、粉虱和螨。顶孢霉菌株(Acremonium hansfordii)从自然感病的桃蚜(Myzuspersicae Sulzer)幼虫分离获得的，对菜青虫、桃蚜和二斑叶螨有侵染作用，寄主感染顶孢霉后，消耗了其体内蛋白质，破坏了合成蛋白质的组织和器官使体内解毒酶和保护酶失去平衡。叶螨病原菌的研究案例和利用相对较少，但是利用叶螨病原菌进行“以菌治螨”，可以安全有效调节虫口密度，在生防中起着重要的作用，应是生物防治工作的重要组成部分。
在当前害虫普遍产生耐药性以及注重害虫综合治理的持续性和无公害性的前提下，着力开发这些微生物资源，筛选具有高致病力的菌株，减少了化学农药的用量为现在先进农业的发展方向。
发明内容
基于上述问题，本发明提供一种杀螨菌株的发酵方法，该杀螨菌株的发酵方法制备的发酵液稀释后作为活性成分杀螨，杀螨效果好。
一种杀螨菌株的发酵方法，包括以下步骤：
S1:取保藏编号为CGMCC No.24996，名称为bacillus velezensis菌株的菌种；
S2:菌种划线于琼脂培养基固体平板上进行活化，培养2天后，挑取单菌落；
S3:将挑取的单菌落接种摇瓶培养基中培养16h后转接入小试发酵罐；
S4:小试发酵罐培养16h后转接入发酵罐；
S5:在发酵罐培养后下罐；
S6:得发酵液。
该bacillus velezensis菌株命名为LMFSSMJ-1，LMFSSMJ-1的菌体形态特征为：革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，两端钝圆，单个、成对或成串出现，有芽孢，芽孢椭圆形或圆形，中端至次端生，能运动，鞭毛周生；该菌在营养琼脂培养基上单菌落成圆形，边缘不整齐，有明显褶皱，直径2～3mm，微隆起，颜色呈白色，不透明。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S1中，菌种取出前，保存在-80℃超低温冰箱。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S2中，培养基为琼脂培养基，培养时间为2天。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S3中，装液量为100ml，摇瓶为挡板三角瓶，培养温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为16h。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S4中，装液量为30L，接种量为1％，转速为300rpm，温度为30℃，pH为7，通气流量为1vvm。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S5中，发酵罐培养条件为：温度30～35℃，pH 6～8，通气量110～120m3/h，罐压0.035～0.045MPa，转速200-300rpm。
在本申请的一个或多个的具体实施方式中，所述S5中，发酵罐为5T发酵罐。
基于上述的发酵方法，本申请还提供一种发酵。
一种发酵液，所述发酵液由上述的杀螨菌株的发酵方法制备而成。
基于上述的发酵液，本申请还提供一种杀螨剂。
一种杀螨剂，该杀螨剂包含作为活性成分的发酵液，该发酵液为上述的发酵液。
发明原理及有益效果：
本申请发酵方法通过bacillus velezensis与发酵条件的配合，制备的发酵液作为杀螨剂活性成分，在室内生测实验中，杀螨率达96％。
生物保藏说明
保藏菌分类命名拉丁学名为bacillus velezensis,于2022年05月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：1000101)，保藏编号为CGMCC No.24996。
具体实施方式
下面将对本发明作进一步说明。
实施例1
从眉山市青神县的柑橘叶片上分离得到原始菌株(该原始菌株保藏编号为CGMCCNo.24996，名称为bacillus velezensis(贝莱斯芽孢杆菌))。
保藏编号为CGMCC No.24996，名称为bacillus velezensis(贝莱斯芽孢杆菌)的菌株命名为LMFSSMJ-1，LMFSSMJ-1的菌体形态特征为：革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，两端钝圆，单个、成对或成串出现，有芽孢，芽孢椭圆形或圆形，中端至次端生，能运动，鞭毛周生。该菌在营养琼脂培养基上单菌落成圆形，边缘不整齐，有明显褶皱，直径2～3mm，微隆起，颜色呈白色，不透明。
实施例2-9
S1:取出在-80℃超低温冰箱中保存的实施例1的保藏编号为CGMCCNo.24996，名称为bacillus velezensis菌株的菌种。
S2:划线于NA固体培养基平板上进行活化，培养2天后，挑取单菌落。
S3:将挑取的单菌落接种于摇瓶培养基中，在温度为30℃，200rpm的摇床中培养16h，按1％的接种量转接入50L小试发酵罐中。
S4:种子液培养，在50L小试发酵罐中培养16h，接入5T发酵罐中。
S5：发酵培养，在罐压0.04Mpa，装液量为3T，接种量为1％，转速为250rpm的条件下进行发酵培养，培养72h后下罐。发酵条件见表1。
S6：得发酵液。
本实施例中，
琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml；
摇瓶培养基成分为：蛋白胨2％，葡萄糖2.5％，磷酸二氢钾0.1，碳酸钙0.02％，七水硫酸镁0.005％，硫酸锰0.002％，氯化钠0.002％，余量为水。
小试培养基成分为：酵母粉2wt％，大豆蛋白粉1.5wt％，糖蜜2wt％，赤霉素膜残液0.5wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，碳酸钙0.3wt％，七水硫酸镁0.15wt％，氯化钠0.03wt％，泡敌0.07wt％，余量为水。
发酵罐培养基成分为：酵母粉2wt％，大豆蛋白粉1.5wt％，糖蜜2wt％，赤霉素膜残液0.5wt％，磷酸二氢钾0.2wt％，碳酸钙0.3wt％，七水硫酸镁0.15wt％，氯化钠0.03wt％，泡敌0.07wt％，余量为水。其中，赤霉素膜残液通过以下步骤制备：
①根据CN113957115A(一种高产赤霉酸的发酵方法)实施例3的发酵方法制取赤霉素发酵液。
②将①的赤霉素发酵液经管式膜过滤，得清液和膜残液，其中清液用于后续提取生产GA3，膜残液即表1中的赤霉素膜残液。赤霉素膜残液为黄色粘稠液，其主要成分是水、微生物菌丝体、未代谢利用完的培养基、无机盐和少量赤霉素残留，干物质含量在10％左右，富含粗蛋白、多种氨基酸、核酸、脂类、大量元素和微量元素等。
表1
对比实施例1
本实施例中，除下面的发酵罐培养条件与实施例2-9不同外，其余均相同。
发酵罐培养条件为：温度27℃，pH为7，流量80m3/h，罐压0.05MPa，培养72h后下罐。
对比实施例2
本实施例中，除下面的发酵罐培养条件与实施例2-9不同外，其余均相同。
发酵罐培养条件为：温度36℃，pH为7，流量130m3/h，罐压0.05MPa，培养72h后下罐。
实施例21
参照农药室内生物测定试验准则，采用玻片浸渍法。
分别取实施例2-13、对比实施例1的发酵液，并各自稀释至100倍、200倍，每个浓度设置三个平行，同时设置清水对照。
将双面胶带剪成2-3cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每片粘3行，每行粘10头。然后放入温度26℃，相对湿度80％左右的生化培养箱中放置4h后，用显微镜观察，剔除死亡或不活泼个体。
将带螨玻片的一端浸入稀释后的发酵液或对照清水中，轻轻晃动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。
重置于上述生化培养箱中，24h后检查结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。结果如下表3
计算防效：死亡率＝(死亡虫数/处理总虫数)*100％，校正死亡率＝(处理死亡率-空白对照死亡率)/(1-空白对照死亡率)*100％。若对照死亡率＜5％，不需要校正，若对照死亡率在5％-20％，需要校正。若对照死亡率＞20％，试验无效。
表2
| 实施例 | 稀释100倍防效 | 稀释200倍防效 |
| 实施例2 | 77.43％ | 64.29％ |
| 实施例3 | 84.43％ | 72.96％ |
| 实施例4 | 92.59％ | 81.48％ |
| 实施例5 | 96.42％ | 85.71％ |
| 实施例6 | 85.19％ | 73.08％ |
| 实施例7 | 88.89％ | 75％ |
| 实施例8 | 89.28％ | 74.07％ |
| 实施例9 | 92.85％ | 82.14％ |
| 对比实施例1 | 48.15％ | 37.03％ |
| 对比实施例2 | 55.19％ | 43.07％ |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种杀螨菌株的发酵方法，包括以下步骤：
S1:取保藏编号为CGMCC No.24996，名称为贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）菌株的菌种；
S2:菌种划线于琼脂培养基固体平板上进行活化，培养2天后，挑取单菌落；
S3:将挑取的单菌落接种摇瓶培养基中培养16h后转接入小试发酵罐；
S4:小试发酵罐培养16h后转接入发酵罐；
S5:在发酵罐培养后下罐；
S6:得发酵液。
2.根据权利要求1所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S1中，菌种取出前，保存在-80℃超低温冰箱。
3.根据权利要求1-2任一所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S2中，培养基为琼脂培养基，培养时间为2天。
4.根据权利要求1-2任一所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S3中，装液量为100ml，摇瓶为挡板三角瓶，培养温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为16h。
5.根据权利要求1-2任一所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S4中，装液量为30L，接种量为1%，转速为300rpm，温度为30℃，pH为7，通气流量为1vvm。
6.根据权利要求1-2任一所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S5中，发酵罐培养条件为：温度30~35℃，pH 6~8，通气量110~120m³/h，罐压0.035~0.045MPa，转速200-300rpm；发酵培养基包括酵母粉2wt%，大豆蛋白粉1.5wt%，糖蜜2wt%，赤霉素膜残液0.5wt%，磷酸二氢钾0.2wt%，碳酸钙0.3wt%，七水硫酸镁0.15wt%，氯化钠0.03wt%，泡敌0.07wt%，余量为水；
所述赤霉素膜残液通过以下方法制备：
①制取赤霉素发酵液；
②将①的赤霉素发酵液经膜过滤，得清液和赤霉素膜残液。
7.根据权利要求3所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S5中，发酵罐培养条件为：温度30~35℃，pH 6~8，通气量110~120m³/h，罐压0.035~0.045MPa，转速200-300rpm；发酵培养基包括酵母粉2wt%，大豆蛋白粉1.5wt%，糖蜜2wt%，赤霉素膜残液0.5wt%，磷酸二氢钾0.2wt%，碳酸钙0.3wt%，七水硫酸镁0.15wt%，氯化钠0.03wt%，泡敌0.07wt%，余量为水；
所述赤霉素膜残液通过以下方法制备：
①制取赤霉素发酵液；
②将①的赤霉素发酵液经膜过滤，得清液和赤霉素膜残液。
8.根据权利要求4所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S5中，发酵罐培养条件为：温度30~35℃，pH 6~8，通气量110~120m³/h，罐压0.035~0.045MPa，转速200-300rpm；发酵培养基包括酵母粉2wt%，大豆蛋白粉1.5wt%，糖蜜2wt%，赤霉素膜残液0.5wt%，磷酸二氢钾0.2wt%，碳酸钙0.3wt%，七水硫酸镁0.15wt%，氯化钠0.03wt%，泡敌0.07wt%，余量为水；
所述赤霉素膜残液通过以下方法制备：
①制取赤霉素发酵液；
②将①的赤霉素发酵液经膜过滤，得清液和赤霉素膜残液。
9.根据权利要求5所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S5中，发酵罐培养条件为：温度30~35℃，pH 6~8，通气量110~120m³/h，罐压0.035~0.045MPa，转速200-300rpm；发酵培养基包括酵母粉2wt%，大豆蛋白粉1.5wt%，糖蜜2wt%，赤霉素膜残液0.5wt%，磷酸二氢钾0.2wt%，碳酸钙0.3wt%，七水硫酸镁0.15wt%，氯化钠0.03wt%，泡敌0.07wt%，余量为水；
所述赤霉素膜残液通过以下方法制备：
①制取赤霉素发酵液；
②将①的赤霉素发酵液经膜过滤，得清液和赤霉素膜残液。
10.根据权利要求1-2任一所述的杀螨菌株的发酵方法，其特征在于，所述S5中，发酵罐为5T发酵罐。
11.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液由权利要求1-10任一所述的杀螨菌株的发酵方法制备而成。
12.一种杀螨剂，该杀螨剂包含作为活性成分的发酵液，其特征在于，该发酵液为权利要求11所述的发酵液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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