CN115109716B - 一种泡菜发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泡菜发酵剂及其制备方法和应用，该发酵剂含有的菌种组合包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、醋杆菌(Acetobacter sp.)，菌种经液体逐级放大培养，然后经浓缩冻干制得。本发明泡菜发酵剂用于制备泡菜，能减少泡菜发酵中酵母菌污染，提高泡菜产品的风味，缩短泡菜发酵时间，使用方便，发酵效果好。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种泡菜发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
泡菜是以各种新鲜蔬菜为原料，经过以乳酸菌为主的微生物协同发酵而成的一种传统发酵食品，具有制作简单、风味独特等优点。目前，泡菜的生产有两种方式。一种是采用传统的自然发酵方式，即将蔬菜用一定浓度的盐水腌制预处理后，依靠蔬菜上携带的微生物进行自然发酵，这种方式制备的泡菜风味丰富，但生产过程可控性较差，常常因腐败菌的存在引起安全问题。特别是制备过程中经常会污染在酸性环境下生长的酵母菌，由于酵母菌大量生长繁殖而造成泡菜发酵过程中或储存过程中出现白色团状菌膜，俗称“生花”，导致泡菜品质变差，甚至不能食用。采用人工接种直投式乳酸菌发酵剂制作泡菜是一种新型泡菜生产方法。纯种微生物发酵剂接种蔬菜可以快速启动发酵，缩短发酵周期，减少杂菌污染，提高泡菜的安全性。然而，泡菜的风味是多种微生物共同代谢产生，采用单一的菌种制备泡菜会造成泡菜口感不够丰满，缺乏传统发酵泡菜固有的风味和滋味，因此泡菜发酵剂需要采用复合发酵剂。人工接种泡菜工业化生产的关键在于直投式发酵剂的制备。目前的发酵剂多以复合菌种复配而成，菌种种类和其他成分各有不同。但这些发酵剂所用的菌主要是以产乳酸的菌为主，包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌类等同型乳酸发酵和异型乳酸发酵菌，其发酵产物中基本都为乳酸，泡菜口感单一，风味不及传统泡菜。
发明内容
本发明为解决泡菜生产过程中存在酵母菌等真菌污染、发酵产品风味单一的问题，本发明提出了一种新的复合泡菜发酵剂，能够显著降低酵母菌污染，提高发酵产品的风味。针对酵母菌污染，本发明泡菜发酵剂中添加费氏丙酸杆菌，以抑制酵母菌等腐败菌的生长。本发明泡菜发酵剂中添加醋杆菌，利用醋酐菌进行好氧发酵，减少泡菜发酵系统中存在的氧气，促进厌氧乳酸菌和丙酸杆菌的增殖，抑制好氧腐败菌生长。针对发酵产品风味单一的问题，本发明泡菜发酵剂中添加乳杆菌、丙酸杆菌和醋杆菌，这些菌在代谢中产生乳酸、乙酸、丙酸、乙醇等多种有机酸和风味物质，使泡菜口感更丰满，增加泡菜风味。
为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种泡菜发酵剂，所述泡菜发酵剂为复合菌剂，其包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、醋杆菌(Acetobacter sp.)。
在一些具体实施方案中，所述泡菜发酵剂主要由前述各菌剂组成。
优选地，所述植物乳杆菌，为植物乳杆菌CICC 22201；所述发酵乳杆菌，为发酵乳杆菌CICC 21800；所述费氏丙酸杆菌，为费氏丙酸杆菌谢氏亚种Propionibacteriumfreudenreichii subsp.shermanii CICC 10284；所述醋杆菌，为醋杆菌Acetobactersp.CICC20441。上述菌株可在中国工业微生物菌种保藏管理中心购买http://www.china- cicc.org。
所述泡菜发酵剂中的各组成，包括但不限于固态的菌粉和液态的菌剂。
优选地，所述菌粉，活菌数比为植物乳杆菌：发酵乳杆菌：费氏丙酸杆菌：醋杆菌＝10-30:10-30:5:1。
更优选地，各菌粉/菌剂含有的活菌数之比例为植物乳杆菌：发酵乳杆菌：费氏丙酸杆菌：醋杆菌＝15:20:5:1。
传统的泡菜制作依靠蔬菜自身携带的微生物进行发酵，生产可控性差，常因腐败菌如酵母菌污染而造成食品安全问题。采用人工接种直投式乳酸菌发酵剂制作泡菜可以快速启动发酵，缩短发酵周期，减少杂菌污染，提高泡菜的安全性。但目前已有的复合发酵剂所用的菌主要是以产乳酸的菌为主，包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌等同型乳酸发酵和异型乳酸发酵菌，其发酵产物中基本都为乳酸，泡菜口感单一，风味不及传统泡菜。
本发明提出的复合发酵剂包括植物乳杆菌、发酵乳杆菌、费氏丙酸杆菌、醋杆菌等四大类菌。针对酵母菌污染，本发明泡菜发酵剂中的费氏丙酸杆菌能产生丙酸及细菌素，可以抑制酵母菌等腐败菌的生长。费氏丙酸杆菌是一种厌氧革兰氏阳性菌，与乳杆菌共存，能把乳杆菌产生的乳酸转化为丙酸，丙酸是一种很好的真菌抑制剂，可有效抑制酵母菌等真菌的生长，而不需要外源添加抗真菌剂。本发明泡菜发酵剂中的醋杆菌进行好氧发酵，能迅速减少泡菜发酵体系中存在的氧气，抑制好氧腐败菌生长，有助于厌氧的丙酸杆菌和乳杆菌的增殖。
针对发酵产品风味单一的问题，本发明泡菜发酵剂中各菌株代谢产物多样，植物乳杆菌进行同型乳酸发酵产生乳酸，发酵乳杆菌进行异型乳酸发酵产生乳酸和乙醇，丙酸杆菌代谢产生丙酸和琥珀酸，醋杆菌代谢产乙酸等，所产有机酸种类丰富多样，琥珀酸赋予酸菜有特殊的鲜味，发酵产生的酸和醇反应形成具有特殊香味的酯类成分。该泡菜发酵剂有益生作用，费氏丙酸杆菌具有耐胃酸、耐胆盐的能力，具有刺激双歧杆菌生长，调节免疫系统作用，并且生长代谢时产生VB12、叶酸等对人体有益的物质。植物乳杆菌和发酵乳杆菌均是益生菌。
因此，本发明实质性的创新技术在于提出了一种新的复合泡菜发酵剂，这一发明为解决泡菜生产过程中存在酵母菌污染、发酵产品风味单一等的问题。应用本发明的复合泡菜发酵剂生产的泡菜色泽亮、汤汁清澈、风味柔和丰满、酸鲜适中、泡菜质地脆，泡菜中酵母菌大大降低，解决了目前常用的泡菜发酵剂生产的泡菜口感单一，风味不及传统泡菜的问题。进一步应用本发明的复合泡菜发酵剂来生产泡菜，解决了传统自然发酵过程中由于酵母菌大量生长繁殖而造成泡菜发酵过程中或储存过程中出现白色团状菌膜导致泡菜品质变差、甚至不能食用的问题。应用本发明发酵剂，泡菜中的酵母菌数量大幅度降低，泡菜的安全性得到了保证。
本发明还提供了一种所述泡菜发酵剂的制备方法，将所述泡菜发酵剂含有的菌种经液体逐级放大培养，然后经浓缩冻干制得。所述制备方法包括以下步骤：
(1)植物乳杆菌和发酵乳杆菌用MRS液体培养基增殖培养，接种量为2％，30-37℃培养8-20h；丙酸杆菌用SLB培养基增殖培养，接种量为4％，28-34℃培养48-72h；醋杆菌用GY液体培养基增殖培养，接种量为2％，28-34℃培养24-48h。
其中，所述的MRS液体培养基，其组成为：牛肉膏10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，吐温801g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸二胺2g/L，K2HPO42g/L，MnSO410g/LMgSO4，10g/L，CH3COONa 10g/L。
其中，所述的SLB液体培养基，其组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，乳酸钠10g/L，K2HPO41g/L。
其中，所述的GY液体培养基，其组成为：酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，无水乙醇30g/L。
(2)将上述各菌株的培养液用0.2μm微滤膜过滤浓缩，分别得到植物乳杆菌、发酵乳杆菌、丙酸杆菌和醋杆菌的浓缩液；
(3)将植物乳杆菌、发酵乳杆菌、丙酸杆菌和醋杆菌浓缩液按10-30:10-30:5:1比例混合，得到混合菌液，即为液态泡菜发酵剂；
(4)按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，加入步骤(3)制备的菌液中，混合均匀，然后冷冻干燥，获得固态泡菜发酵剂。
进一步地，所述步骤(4)中所述冷冻保护液中含3％(w/v)卡拉胶寡糖、3％(w/v)褐藻胶寡糖和4％(w/v)菊粉多糖。
本发明进一步提出了所述复合泡菜发酵剂在制备泡菜中的应用。
本发明还提出了所述泡菜发酵剂的使用方法。在一具体实施方案中，将所述泡菜发酵剂以添加量为0.5-1.0g/kg蔬菜原料活化后加入到待发酵原料中进行发酵3-30天生产泡菜。
具体地，将本发明所述泡菜发酵剂用于制备泡菜，包括如下步骤：
(1)蔬菜的预处理：将蔬菜清洗干净，沥干水分。然后将蔬菜置于2-8％食盐水中腌制10-15小时，取出；
(2)泡菜发酵剂的活化：取所述泡菜发酵剂(即复合菌剂)添加到水中，于28-34℃混匀活化30分钟，复合泡菜发酵剂的用量为蔬菜量的0.5-1.0g/kg，所用水量为蔬菜量的1倍。
(3)厌氧发酵：将活化后的复合泡菜发酵剂均匀喷洒在蔬菜中，蔬菜层层压实放入发酵缸中，菜要浸没于水中，于15-40℃发酵3-30天即可。优选为发酵7天。
所述步骤(1)中的蔬菜为新鲜的白菜、卷心菜、萝卜、豇豆等。
为增加泡菜风味，泡菜制作中还可包含其它调味材料，如姜、蒜、辣椒、紫苏等。
所述步骤(1)中发酵剂中的活菌数在1010CFU/g或1010CFU/ml以上。
本发明中，为更好地实现泡菜制作效果，在活化发酵剂时，可以添加蔗糖、葡萄糖、植物蛋白水解液、玉米浆、乙醇等生长促进因子中的一种或多种，可以缩短发酵时间，增加产品的风味。这些生长促进因子有助于发酵剂菌种在蔬菜中迅速启动发酵，快速增殖，缩短发酵周期，同时抑制蔬菜及发酵体系中腐败菌生长，提高产品的安全性。乙醇的存在促进醋酸菌的增殖，糖类的存在为发酵剂中细菌的迅速增殖和产酸提供碳源，植物蛋白水解液和玉米浆为发酵剂中细菌的生长提供氮源和生长因子，促进其快速增殖。
现有泡菜发酵剂制作时，是采用先制备单一的菌粉，然后把菌粉混合，因菌粉颗粒细小，这种方法制备的菌剂很难混合均匀，具体使用时易造成发酵批次不稳定。有些发酵剂制作时把不同的菌混合培养，然后制成菌剂，这种培养方法很难控制不同菌株合适的比例，可能造成菌剂中有些菌数量偏多，有些菌数量偏少。本发明的菌剂采用分别培养单一的菌株，使每种菌株的活菌数可控，然后把浓缩菌液混合，在液体状态下很容易混合均匀，最后再添加冷冻保护剂冻干。
现有泡菜发酵剂的制作多采用离心浓缩技术，离心时的剪切力对菌体损伤大，离心后菌体的回收率低。本发明的泡菜发酵剂采用微滤法浓缩技术，操作条件温和，对菌体活性的影响小。在制备泡菜发酵剂时，本发明采用卡拉胶寡糖、褐藻胶寡糖和菊粉多糖作为冻干保护剂。卡拉胶寡糖和褐藻胶寡糖属于小分子寡糖，其携带较多的羟基基团可取代水分子与细胞膜磷脂中的磷酸基团或蛋白质极性基团形成氢键，从而保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，进而在冷冻干燥过程中达到保护菌体作用。菊粉多糖属大分子多糖，在冷冻干燥时可使溶液呈过冷状态，降低了溶液结冰的速度，可在特定低温下，降低细胞外溶质(电解质)的浓度，避免在冻干过程中由于盐类浓缩，使细胞脱水而导致细菌发生渗透压性休克、细胞壁和细胞膜的塌陷、蛋白质变性等不良后果。同时，大分子多糖可以以“包裹”的形式对菌体施加保护，能促进卡拉胶寡糖和褐藻胶寡糖这两种小分子寡糖进一步发挥作用。因此本发明采用卡拉胶寡糖和褐藻胶寡糖两种小分子寡糖和菊粉多糖大分子多糖保护剂配合使用，可以在冷冻干燥过程中对菌体起到一个更好的保护作用。
本发明有益效果包括但不限于以下：
本发明所提供的泡菜发酵剂为复合菌剂，其中的醋杆菌为好氧菌，在泡菜发酵初期迅速消耗泡菜体系中的氧气，为后期厌氧的乳杆菌和丙酸杆菌的生长创造条件。醋酸菌的生长也迅速降低发酵体系的pH，抑制不耐酸微生物的增殖。
本发明中，丙酸杆菌生长代谢产生的丙酸可以较好抑制霉菌、酵母及一些革兰氏阴性菌的生长，防止泡菜出现生花现象，强化了泡菜的安全，延长货架期。
本发明中，复合菌剂中，醋杆菌代谢产生乙酸，发酵乳杆菌进行异型乳酸发酵产生乳酸和乙醇，植物乳杆菌进行同型乳酸发酵产生乳酸，丙酸杆菌转化乳酸产生丙酸、琥珀酸、VB12，四种微生物代谢产生的乳酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇等有机酸和醇类，使泡菜的口感更加丰满，避免纯种微生物发酵制备泡菜口感单一、风味单薄的缺陷。
丙酸杆菌发酵产生的丙酸，是一种常见的真菌抑制剂，可应用于食品和饲料行业。本专利所用丙酸杆菌作为一种生物抑菌剂，直接作为泡菜发酵剂的组成之一，丙酸杆菌在生长代谢过程中，不仅会产生丙酸，具有抑菌作用，而且会产生其他复杂多样的抑菌物质，抑菌包括酵母菌在内的泡菜杂菌，避免泡菜生产过程中的“生花”现象。因，本发明首次提出把费氏丙酸杆菌加入到泡菜发酵剂中，是一种技术的创新。
醋杆菌代谢产生醋酸，醋酸也是一种常见的食品防腐剂。本发明所用醋杆菌作为一种生物抑菌剂，直接作为泡菜发酵剂的组成之一，醋杆菌在生长代谢过程中，不仅会产生醋酸，具有抑菌作用，也会产生其他复杂多样的抑菌物质，醋杆菌进行好氧发酵，减少泡菜发酵过程中存在的氧气，还会进一步抑制好氧腐败菌生长。因此，添加醋杆菌可以抑菌包括酵母菌在内的泡菜杂菌，避免泡菜生产过程中的“生花”现象。因，本发明首次提出把醋杆菌加入到泡菜发酵剂中，是一种技术的创新。
本发明的泡菜发酵剂是根据不同的菌株的协同互作而形成的复合菌剂。不同菌株互相提供有利于其他菌株生长的环境和营养，形成一个互作体系。醋酐菌是一种好氧菌，在发酵前期迅速增殖，消耗掉体系中的氧气，形成有利于乳杆菌和丙酸杆菌的增殖的厌氧环境。植物乳杆菌和发酵乳杆菌属于耐氧菌，有氧和无氧条件下均可生长，在无氧条件下增殖更快，该类菌的增殖在泡菜发酵中持续较长时间。丙酸杆菌属于厌氧菌，在体系中没有氧气的情况下增殖较快，而且丙酸杆菌生长时把乳杆菌产生的乳酸转化为丙酸等有机酸，所以乳杆菌产生的乳酸为丙酸杆菌提供生长原料，乳酸被利用也解除了其对乳杆菌生长的反馈抑制。所以本发明菌剂中的不同菌株协同作用，完成泡菜发酵制作。
附图说明
图1为本发明实施例7中的发酵泡菜pH值变化的示意图。
图2为本发明实施例7中的发酵泡菜过程中酵母菌数量变化的示意图。
图3为本发明实施例9中的发酵泡菜pH值变化的示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1泡菜发酵剂的制备
(1)取冷冻保存的植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌种1ml，分别接种到装有50mlMRS液体培养基的锥形瓶中，在30℃活化培养20h。将得到的培养液以2％的比例接种到2L的MRS液体培养基中，30℃搅拌培养18h，然后以2％的比例接种到100L发酵罐中，30℃培养14h，得到植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌液，活菌数分别为0.9×109cfu/ml和1.2×109cfu/ml；
(2)取冷冻保存的丙酸杆菌4ml，接种到装有100ml SLB液体培养基的三角瓶中，在32℃培养72h，得到的培养液以4％的比例接种到2.5L SLB液体培养基中，32℃培养60h，然后以4％的比例接种到体积为50L的SLB液体培养基中，于32℃培养48h得到菌液，活菌数为1.4×109cfu/ml；
(3)取冷冻保存的醋杆菌1ml，接种到50ml GY液体培养基中，在30℃培养36h，将得到的培养液以2％的比例接种2LGY液体培养基，32℃培养30h，然后以2％的比例接种100LGY液体培养基，32℃培养24h，得到菌液，活菌数为2.8×109cfu/ml；
(4)将上述培养液用0.2μm滤膜过滤浓缩，得到浓缩菌液；
(5)取30份植物乳杆菌浓缩液、30份发酵乳杆菌浓缩液、5份丙酸杆菌浓缩液和1份醋杆菌浓缩液混匀；
(6)按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，与步骤(5)中制备的菌液混合，冷冻干燥，制得泡菜发酵剂。其中冷冻保护液中含3％(w/v)卡拉胶寡糖、3％(w/v)褐藻胶寡糖和4％(w/v)菊粉多糖。
实施例2泡菜发酵剂的制备
(1)分别取冷冻保存的植物乳杆菌和发酵乳杆菌1ml，分别接种到装有50mlMRS液体培养基的锥形瓶中，在37℃活化培养12h。将得到的培养液以2％的比例接种到2L的MRS液体培养基中，37℃搅拌培养10h，然后以2％的比例接种到100L发酵罐中，37℃培养8h，得到植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌液，活菌数分别为1.6×109cfu/ml和2.1×109cfu/ml。
(2)取冷冻保存的丙酸杆菌4ml，接种到装有100ml SLB液体培养基的三角瓶中，在28℃培养72h，得到的培养液以4％的比例接种到2.5L SLB液体培养基中，28℃培养70h，然后以4％的比例接种到体积为50L的SLB液体培养基中，于28℃培养64h得到菌液，活菌数分别为0.6×109cfu/ml。
(3)取冷冻保存的醋杆菌1ml，接种到50ml醋杆菌液体培养基中，在34℃培养30h，将得到的培养液以2％的比例接种2L醋杆菌液体培养基，34℃培养28h，然后以2％的比例接种100L的醋杆菌液体培养基，34℃培养24h，得到菌液，活菌数分别为0.8×109cfu/ml。
(4)将上述培养液用0.2μm滤膜过滤浓缩，得到浓缩液。
(5)取10份植物乳杆菌浓缩液、10份发酵乳杆菌浓缩液、5份丙酸杆菌浓缩液和1份醋杆菌浓缩液混匀。
(6)按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，与步骤(5)中制备的菌液混合，冷冻干燥，制得泡菜发酵剂。其中冷冻保护液中含3％(w/v)卡拉胶寡糖、3％(w/v)褐藻胶寡糖和4％(w/v)菊粉多糖。
实施例3泡菜发酵剂的制备
(1)分别取冷冻保存的植物乳杆菌和发酵乳杆菌1ml，分别接种到装有50mlMRS液体培养基的锥形瓶中，在35℃活化培养18h。将得到的培养液以2％的比例接种到2L的MRS液体培养基中，35℃搅拌培养16h，然后以2％的比例接种到100L发酵罐中，35℃培养14h，得到植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌液，活菌数分别为1.5×109cfu/ml和1.8×109cfu/ml。
(2)取冷冻保存的丙酸杆菌4ml，接种到装有100ml SLB液体培养基的三角瓶中，在34℃培养48h，得到的培养液以4％的比例接种到2.5L SLB液体培养基中，34℃培养40h，然后以4％的比例接种到体积为50L的SLB液体培养基中，于34℃培养36h得到菌液，活菌数为1.1×109cfu/ml。
(3)取冷冻保存的醋杆菌1ml，接种到50ml醋杆菌液体培养基中，在28℃培养48h，将得到的培养液以2％的比例接种2L醋杆菌液体培养基，28℃培养40h，然后以2％的比例接种100L的醋杆菌液体培养基，28℃培养36h，得到菌液，活菌数分别为0.8×109cfu/ml。
(4)将上述培养液用0.2μm滤膜过滤浓缩，得到浓缩液；
(5)取15份植物乳杆菌浓缩液、20份发酵乳杆菌浓缩液、5份丙酸杆菌浓缩液和1份醋杆菌浓缩液混匀，
(6)按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，与步骤(5)中制备的菌液混合，冷冻干燥，制得泡菜发酵剂。所述冷冻保护液中含3％(w/v)卡拉胶寡糖、3％(w/v)褐藻胶寡糖和4％(w/v)菊粉多糖。
实施例4利用不同的冻干保护剂制备泡菜发酵剂
步骤(1)到步骤(5)采用和本发明实施例3完全相同的操作。
步骤(6)按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，与步骤(5)中制备的菌液混合，冷冻干燥，制得泡菜发酵剂。其中冻干保护剂为卡拉胶寡糖，制备冻干泡菜发酵剂进行琼脂平板活菌计数，植物乳杆菌和发酵乳杆菌利用MRS培养基琼脂平板，丙酸杆菌利用SLB培养基琼脂平板，醋杆菌利用GY培养基琼脂平板，进行菌落计数，植物乳杆菌存活率为80.5％，发酵乳杆菌存活率为83.6％，费氏丙酸杆菌存活率为76.2％，醋杆菌存活率为85.1％。
采用和步骤(6)相同的方法进行冷冻干燥，其中冻干保护剂为褐藻胶寡糖，冻干泡菜菌发酵剂进行琼脂平板活菌计数，植物乳杆菌存活率为78.8％，发酵乳杆菌存活率为84.2％，费氏丙酸杆菌存活率为82.3％，醋杆菌存活率为80.8％。
采用和步骤(6)相同的方法进行冷冻干燥，其中冻干保护剂为菊粉多糖，冻干泡菜菌发酵剂进行琼脂平板活菌计数，植物乳杆菌存活率为68.2％，发酵乳杆菌存活率为74.9％，费氏丙酸杆菌存活率为62.5％，醋杆菌存活率为70.3％。
采用和步骤(6)相同的方法进行冷冻干燥，其中冻干保护剂为卡拉胶寡糖、褐藻胶寡糖和菊粉多糖。冻干泡菜菌发酵剂进行琼脂平板活菌计数，植物乳杆菌存活率为92.2％，发酵乳杆菌存活率为91.6％，费氏丙酸杆菌存活率为92.4％，醋杆菌存活率为90.5％。
采用和步骤(6)相同的方法进行冷冻干燥，其中不添加冻干保护剂。冻干泡菜菌发酵剂进行琼脂平板活菌计数，植物乳杆菌存活率为51.9％，发酵乳杆菌存活率为62.2％，费氏丙酸杆菌存活率为56.3％，醋杆菌存活率为60.1％。
实施例5利用不同的浓缩方法制备泡菜发酵剂
步骤(1)和本发明实施例3完全相同的操作。
(2)将上述培养液采用两种方法进行浓缩，一种方法为：将菌液按比例混匀，然后8000r/min离心10min，弃上清液，得到细胞沉淀，按发酵液体积的10％配制冷冻保护液，加入到细胞沉淀中，混匀后冷冻干燥，得到泡菜发酵剂。
一种方法操作和本发明实施例3相同，制备泡菜发酵剂。分别测定两种发酵剂细胞的收率及成活率，结果如表1所示。
表1本发明实施例5菌液浓缩方式比较
实施例6利用本发明实施例3制备的发酵剂制备泡菜的方法
(1)蔬菜的预处理：取新鲜的卷心菜10kg，去掉外边的老叶和烂叶，用清水清洗卷心菜，沥干水分。将卷心菜置于10kg的6％的食盐水中，腌制12h；
(2)泡菜发酵剂的活化：量取10KG清水，加入实施例3所制备的泡菜发酵剂，投入量为0.5g/kg卷心菜，于28-34℃混匀活化30分钟；
(3)厌氧发酵：将活化后的复合发酵剂均匀喷洒在卷心菜中，将卷心菜压实，菜要浸没于水中，于30℃发酵7天。
实施例7泡菜发酵剂应用，以及感官评价、pH值、有机酸、酵母菌数量等测评
以卷心菜为原料，分为三组，第一组是用本发明实施例3制备的泡菜发酵剂制备泡菜(本发明泡菜发酵剂组)，第二组是用市售的泡菜发酵剂制备泡菜(市售发酵剂组)，第三组是泡菜制备时，不接种菌，只利用蔬菜自身携带的微生物进行的自然发酵制备泡菜(自然发酵组)。对三组方法制备的泡菜进行评价。感官评定：请10名经过培训的人员进行评价，指标包括色泽、香气、酸度、脆度、口感。评价分值见表2。泡菜产品感官评价结果见表3。泡菜的有机酸分析见表4。
表2泡菜产品感官评分标准
| 项目 | 好 | 较好 | 一般 | 差 |
| 色泽20分 | 汤汁清澈15-20分 | 汤汁较暗10-15分 | 汤汁较浑浊5-10分 | 汤汁浑浊<5分 |
| 气味20分 | 香气浓郁15-20分 | 香气较好10-15分 | 香味一般5-10分 | 没有香味<5分 |
| 滋味30分 | 酸鲜适中25-30分 | 酸鲜较好20-25分 | 较酸15-20分 | 过酸或异味<15分 |
| 质地30分 | 脆、有咀嚼感25-30 | 较脆20-25分 | 不够脆15-20分 | 不脆、咀嚼感差<15分 |
表3本发明实施例7制作的泡菜的感官评价
| 指标 | 自然发酵 | 市售发酵剂 | 本发明泡菜发酵剂 |
| 色泽 | 汤汁较清澈(14分) | 汤汁清澈(16分) | 汤汁清澈(16分) |
| 气味 | 香气浓郁(18分) | 香气较好(14分) | 香气浓郁(18分) |
| 滋味 | 酸鲜适中(26分) | 酸鲜较好(21分) | 酸鲜适中(26分) |
| 质地 | 较脆有咀嚼感(24分) | 较脆(24分) | 很脆，有咀嚼感(26分) |
| 总分 | 82 | 75 | 86 |
表4本发明实施例7制作的泡菜有机酸分析
| 有机酸(g/kg) | 自然发酵 | 市售发酵剂 | 本发明泡菜发酵剂 |
| 乳酸 | 5.21±0.12 | 6.53±0.09 | 6.82±0.13 |
| 乙酸 | 1.29±0.03 | 1.98±0.02 | 2.14±0.06 |
| 柠檬酸 | 0.1±0.01 | 0.09±0.03 | 0.04±0.01 |
| 苹果酸 | 0.72±0.01 | 0.59±0.01 | 0.76±0.02 |
| 琥珀酸 | 0.31±0.02 | 0.32±0.01 | 0.78±0.01 |
| 草酸 | 0.72±0.01 | 0.64±0.01 | 0.42±0.01 |
| 丙酸 | 0 | 0.02±0.01 | 1.22±0.01 |
| 合计 | 8.35 | 10.17 | 12.02 |
实验结果可见，利用本发明泡菜发酵剂发酵制备的泡菜感官评价分数最高，为86分。其次是自然发酵组的泡菜，感官评价分数为75分。市售发酵剂组的泡菜感官评价分数最低，为75分。
pH计测定泡菜制品pH值的变化如图1所示。与自然发酵组相比，通过本发明泡菜发酵剂、市售发酵剂接种的泡菜发酵启动快，pH下降快，且本发明泡菜发酵剂组的pH下降速度还更快于市售发酵剂泡菜pH下降速度。
用HPLC法分析泡菜有机酸组成，结果见表4。泡菜中有机酸均以乳酸为主，使用了本发明泡菜发酵剂制备的泡菜中，有机酸组成多样，除乳酸外，还含有较高的乙酸、丙酸、琥珀酸等，显著高于用市售发酵剂制备的泡菜、利用自然发酵制备的泡菜。
进一步分析泡菜发酵过程中酵母菌数量的变化(图2)。采用本发明泡菜发酵剂制备的泡菜很好地抑制了酵母菌的增殖，到第7天几乎为0。而市售发酵剂制备的泡菜、用自然发酵制备的泡菜到第7天时酵母菌数量分别为1.78×102cfu/ml、4.68×102cfu/ml。
实施例8利用本发明实施例2制备的发酵剂制备泡菜的方法
(1)蔬菜的预处理：取新鲜的白菜10kg，去掉外边的老叶和烂叶，用清水清洗白菜，沥干水分。将白菜置于10kg的4％的食盐水中，腌制8h；
(2)泡菜发酵剂的活化：量取10KG清水，加入实施例2所制备的泡菜发酵剂，投入量为1.0g/kg白菜，于28-34℃混匀活化30分钟；
(3)厌氧发酵：将活化后的复合发酵剂均匀喷洒在卷心菜中，将卷心菜压实，菜要浸没于水中，于30℃发酵7天。
实施例9泡菜发酵剂的制备与应用
(1)分别取冷冻保存的植物乳杆菌和发酵乳杆菌1ml，分别接种到装有50mlMRS液体培养基的锥形瓶中，在36℃活化培养14h。将得到的培养液以2％的比例接种到2L的MRS液体培养基中，36℃搅拌培养12h，然后以2％的比例接种到100L发酵罐中，36℃培养10h，得到植物乳杆菌和发酵乳杆菌菌液，活菌数分别为1.9×109cfu/ml和1.8×109cfu/ml。
(2)取冷冻保存的丙酸杆菌4ml，接种到装有100ml SLB液体培养基的三角瓶中，在30℃培养60h，得到的培养液以4％的比例接种到2.5L SLB液体培养基中，30℃培养54h，然后以4％的比例接种到体积为50L的SLB液体培养基中，于30℃培养48h得到菌液，活菌数为1.9×109cfu/ml。
(3)取冷冻保存的醋杆菌1ml，接种到50ml醋杆菌液体培养基中，在32℃培养36h，将得到的培养液以2％的比例接种2L醋杆菌液体培养基，32℃培养32h，然后以2％的比例接种100L的醋杆菌液体培养基，32℃培养32h，得到菌液，活菌数分别为1.3×109cfu/ml。
(4)将上述培养液用0.2um滤膜过滤浓缩，得到浓缩液。
(5)取15份植物乳杆菌浓缩液、15份发酵乳杆菌浓缩液、5份丙酸杆菌浓缩液和1份醋杆菌浓缩液混匀。取发酵液体积的10％配制冷冻保护液，与菌液混合，冷冻干燥，制得泡菜发酵剂A。
采用和步骤(5)相同的方法步骤制备泡菜发酵剂，菌的组成为：15份植物乳杆菌、15份发酵乳杆菌和1份醋杆菌，制得泡菜发酵剂B。
采用和步骤(5)相同的方法步骤制备泡菜发酵剂，菌的组成为：15份植物乳杆菌、15份发酵乳杆菌和5份丙酸杆菌，制得泡菜发酵剂C。
采用和步骤(5)相同的方法步骤制备泡菜发酵剂，菌的组成为：15份植物乳杆菌和15份发酵乳杆菌，制得泡菜发酵剂D。
(6)将上述泡菜发酵剂按本发明实施例8的方法制备泡菜，分析泡菜发酵时pH变化，酵母菌污染情况、泡菜口感及有机酸含量。四种发酵剂发酵过程pH值变化见图3。发酵剂A和发酵剂B发酵3天后pH已降低小于3.6，泡菜发酵成熟；发酵剂C和发酵剂D发酵5天后pH<3.6，发酵成熟。不同发酵剂制备的泡菜生花情况及发酵效果见表5，发酵剂A和发酵剂C制备的泡菜没有生花现象，泡菜中酵母菌数量非常少；而发酵剂B和发酵剂D制备的泡菜有生花情况，生花现象发生时，检测到泡菜中酵母菌数量可达105cfu/ml，泡菜的气味和口感较差。以发酵剂A制备的泡菜气味和脆度最好。四种发酵剂制备的泡菜有机酸含量见表6，发酵剂A制备的泡菜有机酸含量多样，各种有机酸含量较高，发酵剂B和D制备的泡菜乳酸含量高，但发酵剂B制备的泡菜琥珀酸及丙酸含量低，发酵剂D制备的泡菜乙酸、丙酸及琥珀酸含量低。发酵剂C制备的泡菜乳酸和乙酸含量略低。
表5本发明实施例9制作的泡菜生花及性状
表6本发明实施例9制作的泡菜有机酸分析
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (7)
1. 一种泡菜发酵剂，其特征在于，其包括植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum、费氏丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii和醋杆菌Acetobacter sp；其活菌数比为植物乳杆菌：发酵乳杆菌：费氏丙酸杆菌：醋杆菌=10-30:10-30:5:1；
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CICC22201；
所述发酵乳杆菌为发酵乳杆菌CICC21800；
所述费氏丙酸杆菌为费氏丙酸杆菌谢氏亚种Propionibacterium freudenreichiisubsp. shermanii CICC10284；
所述醋杆菌为醋杆菌CICC20441。
2.一种如权利要求1所述的泡菜发酵剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）植物乳杆菌和发酵乳杆菌用MRS液体培养基增殖培养，接种量为2%，30-37℃培养8-20h；费氏丙酸杆菌用SLB培养基增殖培养，接种量为4%，28-34℃培养48-72h；醋杆菌用GY液体培养基增殖培养，接种量为2%，28-34℃培养24-48h；
（2）将上述各菌株的培养液用0.2μm微滤膜过滤浓缩，分别得到植物乳杆菌、发酵乳杆菌、丙酸杆菌和醋杆菌的浓缩液；
（3）将所述步骤（2）得到的植物乳杆菌、发酵乳杆菌、丙酸杆菌和醋杆菌浓缩液按10-30:10-30:5:1比例混合，得到混合菌液；
（4）按发酵液体积的10%配制冷冻保护液，加入步骤（3）制备的菌液中，混合均匀，然后冷冻干燥，获得泡菜发酵剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述MRS液体培养基，其组成为：牛肉膏10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，吐温80 1g/L，蛋白胨10g/L，柠檬酸二胺2g/L，K2HPO4 2g/L，MnSO4 10g/L MgSO4 10g/L, CH3COONa 10g/L；
所述SLB液体培养基，其组成为：蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，乳酸钠10g/L，K2HPO4 1g/L；
所述GY液体培养基，其组成为：酵母膏10g/L，葡萄糖10g/L，无水乙醇30g/L。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤（4）中所述冷冻保护液中含3%w/v卡拉胶寡糖、3%w/v褐藻胶寡糖和4%w/v菊粉多糖。
5.如权利要求1所述泡菜发酵剂在制备泡菜中的应用，其特征在于，将所述泡菜发酵剂以添加量为0.5-1.0g/kg蔬菜原料活化后加入到待发酵原料中进行发酵3-30天生产泡菜。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将泡菜发酵剂以添加量为0.5-1.0g/kg蔬菜原料活化后加入到待发酵原料中进行发酵7天生产泡菜。
7.如权利要求1所述泡菜发酵剂的使用方法，其特征在于，将所述泡菜发酵剂以添加量为0.5-1.0g/kg蔬菜原料活化后加入到待发酵原料中进行发酵3-30天生产泡菜。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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