CN114601761A

CN114601761A - 一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法及其用途

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Publication number: CN114601761A
Application number: CN202210056193.7A
Authority: CN
Inventors: 周秋娜; 吕凤; 金荣熙; 尹锺赫; 金延埈
Original assignee: Chengdu Xiaoambition Network Technology Co ltd; Cosmax China Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Chengdu Xiaoambition Network Technology Co ltd; Cosmax China Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2022-01-18
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明属于化妆品技术领域，公开了一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法及其用途。本发明所述方法包括：S1，取新鲜采摘的茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，过筛，得抹茶粉，加入纯水均匀分散，灭菌后得发酵基质；S2，将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，摇床培养，得种子培养液；S3，将种子培养液以1‑5％接种量加入到抹茶发酵基质中，发酵，得初始发酵液；S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种修护肌肤屏障的植物发酵液。本发明使用含有抹茶粉的发酵基质，以乳酸菌为发酵菌株进行发酵，所得发酵液可从三个维度协同增效，给予皮肤屏障全方位的预防和修复，可作为功效原料加入到化妆品中。

Description

一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体是涉及一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法及其用途。

背景技术

“中国敏感性皮肤诊疗指南”对敏感性皮肤的定义为：特指在生理或病理条件下发生的一种高反应状态，主要发生在面部，表现为受到物理、化学、精神等因素刺激时皮肤容易出现灼热、刺痛、瘙痒及紧绷感等主观症状，伴随红斑、鳞屑、毛细血管扩张等客观体征。通俗来讲，敏感肌就是皮肤在外界刺激下产生的各种皮肤不耐受的反应，如温度变化、环境变化，引发泛红、起皮、紧绷等各种不舒适的症状。敏感肌分为先天性和后天性2种，先天性敏感肌大多为遗传，特征为皮肤天生较薄、红血丝明显，容易受到外部环境变化的影响；后天性敏感肌大多是因为后天的一些刺激、不当的护肤行为所致，如紫外线照射产生的活性氧造成表皮细胞过氧化，过度清洁造成角质层结构破坏等。

抹茶，古时称作末茶，起源于中国，是唐代首创的一种茶艺形式，1191年，传入日本后，形成日本特有的茶道文化。抹茶含有2-5％的咖啡碱、18-36％的茶多酚、1-2％的茶氨酸以及茶蛋白、茶多糖等具有保健功能的活性成分，具有抗焦虑、抗辐射、抗氧化、消炎杀菌等作用。随着绿色、天然潮流的兴起，抹茶作为一种食品添加剂被广泛应用于各种食品，如抹茶蛋糕、抹茶冰激凌等，但在化妆品市场中多用于概念宣传，造成了极大的浪费。然而，对化妆品的功效宣称开始严格管控，单纯的概念添加不符合法规要求，也已不能满足消费者的诉求，配方中添加具有实际功效原料是大势所趋。而敏感肌的化妆品市场庞大，开发具有修护肌肤屏障的原料显得尤为重要。因此，将抹茶开发成具有实际功效的化妆品原料具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法及其用途。本发明的方法使用含有抹茶粉的发酵基质，以乳酸菌为发酵菌株进行发酵，所得发酵液可从三个维度协同增效，给予皮肤屏障全方位的预防和修复，可作为功效原料加入到化妆品中。

为达到本发明的目的，本发明修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法包括以下步骤：

S1，取新鲜采摘的茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，过筛，得抹茶粉，加入纯水均匀分散，灭菌后得发酵基质；

S2，将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，摇床培养，得种子培养液；

S3，将种子培养液以1-5％接种量加入到抹茶发酵基质中，发酵，得初始发酵液；

S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种修护肌肤屏障的植物发酵液。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S1中茶叶选择抽新芽后覆盖栽培，遮光率90％以上的茶叶。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S1中球磨机的料球比为1:3-9，转速为150-300r/min，球磨时间为30-120min。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S1中所得抹茶粉的粒径为1000-1500目。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S1中加入纯水使得料液比为1:10-20。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S2中乳酸菌接种量为0.5-5％，摇床转速为100-200rpm，培养温度为35-45℃，培养时间为24-72h。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S3中发酵的温度为35-45℃，发酵时间为48-96h。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述S4中破壁处理是利用高压均质机进行，温度70-90℃，压力400-600bar，破壁4-6min，间隙4-6min，反复3-5次。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述灭菌为121℃下灭菌20-60min。

另一方面，本发明提供了一种前述方法所得修护肌肤屏障的植物发酵液的用途，所述用途为将发酵液用于修护肌肤屏障的化妆品中。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述化妆品包括但不限于水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜等。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述植物发酵液在化妆品中的质量百分比为0.1-10％。

与现有技术相比，本发明于含有抹茶粉的发酵基质中以乳酸菌为发酵菌株进行发酵，所得发酵液具有三个维度的功效：1)通过促进神经酰胺和天然保湿因子的生成，强化皮肤屏障功能；2)通过清除体内多余自由基，抑制外界刺激对皮肤屏障的氧化损伤；3)通过抑制炎症因子1L-1α、1L-6的表达，抑制炎症对皮肤屏障造成损伤。本发明所得修护肌肤屏障的植物发酵液从这三个维度协同增效，可以给予皮肤屏障全方位的预防和修复。

附图说明

图1是本发明效果例1中神经酰胺的促进作用测试结果；

图2是本发明效果例2中丝聚蛋白基因表达的促进作用测试结果；

图3是本发明效果例3中抗氧化DPPH清除率(％)测评试验结果；

图4是本发明效果例4中炎症因子含量变化图；

图5是本发明效果例5中皮肤含水量测量结果；

图6是本发明效果例5中经皮水份流失Tewl值测量结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。

此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种修护肌肤屏障的植物发酵液采用以下工艺制备：

S1，采摘抽新芽后覆盖栽培(遮光率90％以上)的新鲜茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，料球比为1:6，转速为240r/min，时间为60min，过筛，得粒径为1200目的抹茶粉，加入料液比为1:10的纯水均匀分散，121℃下灭菌20min，得发酵基质；

S2，将乳酸菌以2％的接种量接种于MRS液体培养基中，摇床培养，温度为38℃，转速为180rpm，培养时间为48h，得种子培养液；

S3，将种子培养液以5％接种量加入到抹茶发酵基质中，发酵，温度为40℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为72h，得初始发酵液；

S4，初始发酵液121℃下灭菌30min，利用高压均质机进行破壁处理，温度80℃，压力500bar，破壁5min，间隙5min，反复4次，过滤，收集滤液，即得一种修护肌肤屏障的植物发酵液。

对比例1

一种修护肌肤屏障的植物发酵液采用以下工艺制备：

S1，采摘抽新芽后没有覆盖栽培的新鲜茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，料球比为1:6，转速为240r/min，时间为60min，过筛，得粒径为1200目的绿茶粉，加入料液比为1:10的纯水均匀分散，121℃下灭菌20min，得发酵基质；

S2，将乳酸菌以2％的接种量，接种于MRS液体培养基中，摇床培养，温度为38℃，转速为180rpm，培养时间为48h，得种子培养液；

S3，将种子培养液以5％接种量加入到绿茶发酵基质中，发酵，温度为40℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为72h，得初始发酵液；

对比例2

一种修护肌肤屏障的植物发酵液采用以下工艺制备：

S1，采摘抽新芽后覆盖栽培(遮光率90％以上)的新鲜茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，料球比为1:9，转速为240r/min，时间为60min，过筛，得粒径为1500目的抹茶粉，加入料液比为1:10的纯水均匀分散，121℃下灭菌20min，得初始混悬液；

S2，利用高压均质机对初始混悬液进行破壁处理，温度90℃，压力600bar，破壁5min，间隙5min，反复5次，过滤，收集滤液，即得一种修护肌肤屏障的植物发酵液。

对比例3

一种修护肌肤屏障的植物发酵液采用以下工艺制备：

S1，采摘抽新芽后没有覆盖栽培的新鲜茶叶，蒸青、干燥，利用球磨机进行粉碎，料球比为1:9，转速为240r/min，时间为60min，过筛，得粒径为1500目的绿茶粉，加入料液比为1:10的纯水均匀分散，121℃下灭菌20min，得初始混悬液；

效果例1

促进神经酰胺合成试验

神经酰胺(CERs)是维持角质层功能的重要脂质，也是评价皮肤屏障功能的参数之一。

正常人皮肤的HEKa细胞，用含有1％HKGS(人角质形成细胞生长添加剂)的Epilife^TM培养基(含PSA液：青霉素、链霉素和两性霉素B)，在37℃，5％CO₂培养箱中常规培养，待细胞生长至80％融合状态时，用Trypsin/EDTA消化(胰蛋白酶)，以约2.5*10³个/cm²的密度传代至25cm²培养瓶中，每3-5d传代1次。

取对数生长期细胞常规消化，调整HEKa细胞浓度为5*10⁴个/ml、取100μl接种于96孔板，生长近融合状态，将96孔板中换入Epilife^TM培养基，继续培养24h，然后每孔中加入100μl质量分数0.2％待测样品(稀释溶剂为Epilife^TM培养基)。设立阴性对照组(细胞和培养基组)，每个样品设立5个复孔，置孵箱中作用24h，分别收集不同组合物作用于HEKa细胞的上清液，用于ELISA测定。

由图1可知：实施例1所得发酵液对神经酰胺合成的促进作用明显高于其他对比例，顺序依次为实施例1＞对比例1＞对比例2＞对比例3。

效果例2

天然保湿因子是由表皮中的丝聚蛋白Filaggrin(FLG)分解形成，主要包括氨基酸、吡咯烷酮羧酸、乳酸、尿素等低分子量物质，在角质层内与水结合而维持皮肤屏障功能。

采用实时荧光定量PCR法检测组合物对靶标基因表达量的调节，阴性对照(细胞不加药，NT)，阳性对照(透明质酸0.01％，HA)，相同质量百分比(0.2％)的实施例1、对比例1、对比例2、对比例3所得发酵液。HaCaT细胞以3*105/孔接种至6孔板上，培养24h，细胞贴壁生长。将待测样品配制成1X，共2个浓度的梯度稀释剂量点，每孔2ml加入细胞板，于37℃5％CO₂恒温培养箱继续孵育24h之后，收集细胞，应用PureLink mini RNA抽提试剂盒对细胞总RNA进行提取，核酸浓度定量，每管200-800ng RNA作为模板，Taqman一步法反应(逆转录+Real Time-PCR)进行实时定量荧光PCR检测各个基因的相对表达量(20μl体系)。

计算公式：Fold change＝2^-ΔΔCT；-ΔΔCT＝[(CT靶标基因–CT内参基因)treatedsample-(CT靶标基因–CT内参基因)untreated sample]。此试验中，靶标基因为FLG，内参基因为GAPDH。

由图2可知：实施例1所得发酵液对丝聚蛋白基因表达的促进作用明显高于其他对比例，顺序依次为实施例1＞HA＞对比例1＞对比例2＞对比例3。

效果例3

抗氧化测评试验

DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的无水乙醇溶液呈紫色，加入自由基清除剂时，自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，可评价清除自由基的能力。

分别取0.2％实施例1、对比例1、对比例2、对比例3所得发酵液以及0.1％VC(阳性对照)适当稀释，用移液器取40μl，再加入160μl的DPPH乙醇溶液(200μg/ml)。混匀后于室温避光条件下反应30min，再于517nm处测吸光度A，每组设置3组平行实验计算平均值，计算方法如下：

清除率％＝[1-(A₁-A₂)/A₀×100

式中：A₀为未加入试样的DPPH溶液的吸光度；

A₁为加入试样后的DPPH溶液反应后的吸光度；

A₂为DPPH溶液与各试样混合后反应前的吸光度。

由图3可知：实施例1所得发酵液的DPPH清除率明显高于其他对比例，对比例3(未发酵的绿茶粉)DPPH清除率略高于对比例2(未发酵的抹茶粉)。

效果例4

IL-1α，IL-6为细胞炎症因子，在皮肤受到紫外线、污染物等刺激时会产生，进一步激活花生四烯酸级联反应，生成前列腺素(PGE2)，PGE2作用于末梢神经与血管，产生刺痛、发红等肌肤炎症反应。

采用ELISA法进行检测。其中以没做任何处理的HaCat细胞作为空白组，以脂多糖(LPS)诱导的HaCat细胞作为模型组。用1μg/ml LPS刺激HaCat细胞后，分别将0.2％的实施例1、对比例1、对比例2、对比例3所得发酵液，以每孔100μl加入96孔板，于37℃、5％的CO₂恒温培养箱培养72h，每个实验组3个复孔。收集细胞培养上清，通过ELISA检测试剂盒进行抗炎功效评价，结果取平均值，以空白组检测的含量为参考量，即为100％。

效果例5

筛选健康志愿者30名，年龄在30-45岁。使用实施例1所得发酵液质量占比2％的乳液，每天早晚各1次，连续使用4周，使用Corneometer测量皮肤含水量、经皮失水值，结果如图5和图6所示。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S1中茶叶选择抽新芽后覆盖栽培，遮光率90％以上的茶叶。

3.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S1中球磨机的料球比为1:3-9，转速为150-300r/min，球磨时间为30-120min。

4.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S1中所得抹茶粉的粒径为1000-1500目。

5.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S1中加入纯水使得料液比为1:10-20。

6.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S2中乳酸菌接种量为0.5-5％，摇床转速为100-200rpm，培养温度为35-45℃，培养时间为24-72h。

7.根据权利要求1所述的修护肌肤屏障的植物发酵液的制备方法，其特征在于，所述S3中发酵的温度为35-45℃，发酵时间为48-96h；优选地，所述S4中破壁处理是利用高压均质机进行，温度70-90℃，压力400-600bar，破壁4-6min，间隙4-6min，反复3-5次；优选地，所述灭菌为121℃下灭菌20-60min。

8.权利权利要求1-7任一项所述修护肌肤屏障的植物发酵液的用途，其特征在于，所述用途为将所述植物发酵液用于修护肌肤屏障的化妆品中。

9.根据权利要求8所述修护肌肤屏障的植物发酵液的用途，其特征在于，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜或面膜。

10.根据权利要求8所述修护肌肤屏障的植物发酵液的用途，其特征在于，所述植物发酵液在化妆品中的质量百分比为0.1-10％。