CN104073542A

CN104073542A - 一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法

Info

Publication number: CN104073542A
Application number: CN201410284977.0A
Authority: CN
Inventors: 朱余玲
Original assignee: University of Shaoxing
Current assignee: University of Shaoxing
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: CN104073542B

Abstract

本发明提供了一种复合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法，将进行脱淀粉处理的黄姜原料粉碎，得到黄姜残渣；以黄姜残渣为唯一碳源配制发酵培养基；加入里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉组合菌进行发酵；将发酵产物过滤后烘干，用有机溶剂提取并得到结晶；即得到薯蓣皂素。本发明提供的制备方法处理简单，污染少，并且可有效提高微生物发酵效率，产物的率高。

Description

一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种薯蓣皂素的生产方法，特别涉及一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法。

背景技术

薯蓣皂素，是合成甾体激素药物的重要中间体，广泛应用于消炎镇痛，脑血管，避孕药物的合成中。素有激素之母的美誉。世界上60%的甾体激素类药物都是以薯蓣皂素为原料进行生产的，对其需求量非常大。中国是薯蓣皂素生产和出口的大国，主要是从薯蓣属植物（盾叶薯蓣和穿龙薯蓣）中提取皂素的。其中盾叶薯蓣（俗名黄姜）是我国的特有品种，种植面积大，薯蓣皂素的含量高。

薯蓣皂素一般以薯蓣皂苷的形式存在于植物根茎中，既在薯蓣皂素配基的C-3和C-26位连接不同的糖基形成的。水解这两个位置的糖基即可得到薯蓣皂素。工业中一般利用强酸（H₂SO₄或HCl）在高温高压的条件下水解黄姜根茎获得薯蓣皂素，该过程称为酸水解。酸水解产生大量高COD，高盐，高色度的强酸性废水，非常难处理，严重污染当地环境。

与酸水解相比，生物催化反应条件温和，专一性强，是一种环境友好的方法。利用微生物或酶水解黄姜制备属于皂素已有报道。但是现有技术中酶水解成本较高，不适宜工业化生产，而微生物水解可以解决成本问题，但是效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供低成本，效率高的微生物法生产薯蓣皂素的方法，以克服现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法，所述方法采用里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉组合发酵黄姜得到薯蓣皂素。其中里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉均购买于中国农业微生物菌种保藏中心，其中里氏木霉ACCC30597，绿色木霉 ACCC30048 和烟曲霉ACCC30556。

所述方法的具体步骤包括：

a．菌种的驯化：首先采用低浓度的黄姜乙醇提取物分别对前述三种菌种进行驯化培养，循环驯化多次后取薯蓣皂素含量最高的霉菌孢子再次转接至高浓度的黄姜乙醇提取物驯化培养液中继续驯化，最后将菌种保存在50%的黄姜乙醇提取物中。

其中黄姜乙醇提取物为90%乙醇提取物，即为总皂苷。

b．黄姜的预处理：黄姜原料洗净后烘干、粉碎、过筛，然后进行脱淀粉处理，再次粉碎过筛后，得到黄姜残渣；

c．菌种活化培养：从驯化后的菌种分别挑取孢子接种于活化培养基中，循环活化，活化后进行种子培养；

d．组合发酵：首先接种步骤c中得到绿色木霉，发酵一段时间后接种步骤c中得到的里氏木霉，继续发酵一段时间后，接种步骤c中得到的烟曲霉发酵一段时间，得到发酵产物；

e．产物处理：将发酵产物过滤后烘干，用有机溶剂提取，结晶干燥后得到产物。

进一步，所述步骤a中的菌种驯化的具体方法为：将里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉分别接种于无机盐培养基中，第一次驯化时，向培养基中加入1%黄姜乙醇提取物（即总皂苷浓度），30 oC水浴振荡培养7 d；循环驯化3次后，选择薯蓣皂素含量最高摇瓶中的霉菌孢子转接至5%黄姜乙醇提取物（总皂苷浓度）驯化培养液中；依前述方法驯化10%和15%浓度，最后保存于50%黄姜乙醇提取物（总皂苷浓度）中。

进一步，所述无机盐培养基为NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄ 0.1%；FeSO₄0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H2O 0.05%； pH 值6.6。

进一步，所述菌种驯化后的保藏培养基为黄姜乙醇提取物（总皂苷浓度）50%；NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄ 0.1%；FeSO₄0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H2O 0.05%； pH值 6.6。

进一步，步骤b中黄姜的预处理两次过筛均为60目筛。

进一步，步骤c中菌种活化培养基为黄姜乙醇提取物（总皂苷浓度）5%；NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH 值6.6。

进一步，步骤c中菌种的种子培养基为PDA培养基。

进一步，步骤d中组合发酵的发酵培养基为黄姜残渣25-30%，Tween 80 1-1.2%，蛋白胨2.5-3%，K₂HPO₄0.2-0.3%，pH 5.5-6；置于超声发生器中，25-50KHz超声15min；超声后的培养基121 °C 灭菌30min。

进一步，步骤d中组合发酵的发酵条件为：固体浅盘发酵室，相对湿度75-80%，温度30-35°C，通无菌空气200 mL/min。首先接种里氏木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种绿色木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种烟曲霉搅拌均匀发酵5天。

进一步，，所述固态浅盘发酵室外设有空气压缩泵，室外空气从空气压缩泵出来后，通过0.45μm滤膜过滤后，进入水浴锅，从水浴锅出来后变成无菌空气，通过通气管进入发酵室，然后分别通过穿孔通气管进入每个固态发酵架中。

进一步，所述发酵室的出气口采用4层纱布过滤。

进一步，步骤d中各菌种的接种浓度为：里氏木霉的接种浓度为10⁶-10⁷个孢子/g，所述绿色木霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g。所述烟曲霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g，其中g为黄姜残渣重量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用组合微生物发酵替代单一微生物发酵，解决了单一微生物发酵皂素得率低的问题。绿色木霉主要分泌纤维素酶，将皂苷从纤维素的包裹中释放出来，里氏木霉主要分泌糖苷酶，水解皂苷糖链末端的葡萄糖和鼠李糖。烟曲霉主要分泌皂苷水解酶，水解皂苷C-3位的葡萄糖基生成皂素。三种菌按顺序添加，协同作用，共同发酵可以显著提高皂素得率。

进一步，本发明利用固态发酵替代传统的液态发酵，解决了液态发酵用水量大，生产效率低的问题，同时使用浅盘固态发酵，成本低，操作简单，便于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中一种固态浅盘发酵室的结构示意图。

图2是图1中一个固态发酵架的结构示意图。

1 紫外灯管，2 湿度控制器，3 空调，4 固态发酵架，5 空气压缩泵，6 穿孔通气管，7固态发酵浅盘，8 0.45um滤膜，9水浴锅，10 4层纱布，11 出气口，12 搅拌耙。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1

一种组合微生物固态发酵法生产黄姜中薯蓣皂素的方法，具体步骤如下：

黄姜的预处理步骤：1kg黄姜洗净，60°C烘干，粉碎，过60目筛。置于10L反应釜中，加入6L水。100 oC水浴煮沸1 h。冷却后加入20g淀粉酶（2000IU/g） 70 oC，pH 6.5液化1 h，再加入30 g糖化酶（10000 IU/g），60 oC，pH 4糖化6 h。冷却，板压过滤，60°C烘干，粉碎，过60目筛，得到268g黄姜残渣。

固态发酵培养基：200g黄姜残渣， Tween 80 12g，蛋白胨30g，K₂HPO₄ 3g， pH 6. 去离子水 800mL，置于超声发生器中，25-50KHz超声15min。置于固体发酵浅盘中，盖上四层纱布盖，121 °C 灭菌30min。灭完菌的固态发酵浅盘，置于固态浅盘发酵器中，控制相对湿度75-80%，温度30-35°C，通无菌空气200 mL/min。

其中图1为本发明实施例1中一种固态浅盘发酵室的结构示意图，图2是图1中一个固态发酵架的结构示意图。结合图1和图2可知，固态发酵室的顶部设有紫外灯1，用于室内灭菌。室内底部两侧边分别设有温度控制器2，配合空调3，用于控制室内温度。室内并排放置多个固态发酵架4，每个发酵架4上设有多层固体发酵浅盘7，发酵架4的两侧和每层固态发酵浅盘7上均设置有穿孔通气管6，用于无菌空气的输送，发酵架4上还设有搅拌耙12，用于固体发酵过程中的搅拌。其中在固体发酵室外部设有空气压缩泵5，从空气压缩泵5出来的压缩空气首先通过0.45μm的滤膜8，然后通过水浴锅9，得到无菌空气，输送至穿孔通气管6中，用于固态发酵。为了保证室内空气的无菌，出气口11处设置了4层纱布10对空气进行过滤。

菌种保藏培养基：总皂苷50%；NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH 6.6 121 oC灭菌30 min。

菌种活化培养基：总皂苷5%；NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH 6.6，采用500mL摇瓶，装液量50mL。 121 oC灭菌30 min。

菌种种子培养基：PDA培养基，采用500mL摇瓶，装液量100mL。

种子的活化：从菌种保藏平板上挑取霉菌孢子接种于活化培养基中，30 oC，150rpm震荡培养2天后再静止培养五天。循环活化3次。

种子的培养：取1ml活化后的霉菌孢子，接种于活化培养基中，30 oC，150rpm震荡培养2天后再静止培养五天。

发酵过程首先接种绿色木霉（10⁷-10⁸个孢子/g），搅拌均匀，发酵1天后接种里氏木霉10⁶-10⁷个孢子/g，搅拌均匀，发酵1天后接种烟曲霉（10⁷-10⁸个孢子/g）搅拌均匀发酵5天。其中g为黄姜残渣重量。

所获的产物板压过滤，60 oC烘干。

发酵产物120#汽油索氏提取，结晶干燥后得产物，24.7g，其纯度为98%，既薯蓣皂素得率为2.42%。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种组合微生物固态发酵法生产薯蓣皂素的方法，其特征在于，所述方法采用里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉组合发酵黄姜得到薯蓣皂素，具体步骤包括：

a．菌种的驯化：首先采用低浓度的黄姜乙醇提取物分别对前述三种菌种进行驯化培养，循环驯化多次后取薯蓣皂素含量最高的霉菌孢子再次转接至高浓度的黄姜乙醇提取物驯化培养液中继续驯化，最后将菌种保存在50%的黄姜乙醇提取物中；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中的菌种驯化的具体方法为：将里氏木霉，绿色木霉和烟曲霉分别接种于无机盐培养基中，第一次驯化时，向培养基中加入1%黄姜乙醇提取物，30 oC水浴振荡培养7 d；循环驯化3次后，选择薯蓣皂素含量最高摇瓶中的霉菌孢子转接至5%黄姜乙醇提取物驯化培养液中；依前述方法驯化10%和15%浓度，最后保存于50%黄姜乙醇提取物中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无机盐培养基为NaNO₃0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH 值6.6。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种驯化后的保藏培养基为黄姜乙醇提取物50%；NaNO3 0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH值 6.6。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中菌种活化培养基为黄姜乙醇提取物5%；NaNO₃ 0.3%；K₂HPO₄0.1%；FeSO₄ 0.001%；KCl 0.05%；MgSO₄·7H₂O 0.05%； pH 值6.6。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中组合发酵的发酵培养基为黄姜残渣25-30%，Tween 80 1-1.2%，蛋白胨2.5-3%，K₂HPO₄0.2-0.3%，pH 5.5-6；置于超声发生器中，25-50KHz超声15min；超声后的培养基121 °C 灭菌30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中组合发酵的发酵条件为：固体浅盘发酵室，相对湿度80-90%，温度30-35°C，通无菌风1-1.5vvm；首先接种里氏木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种绿色木霉，搅拌均匀，发酵1天后接种烟曲霉搅拌均匀发酵5天。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固态浅盘发酵室外设有空气压缩泵，室外空气从空气压缩泵出来后，通过0.45μm滤膜过滤后，进入水浴锅，从水浴锅出来后变成无菌空气，通过通气管进入发酵室，然后分别通过穿孔通气管进入每个固态发酵架中。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵室的出气口采用4层纱布过滤。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中各菌种的接种浓度为：里氏木霉的接种浓度为10⁶-10⁷个孢子/g，所述绿色木霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g；所述烟曲霉的接种浓度为10⁷-10⁸个孢子/g，其中g为黄姜残渣重量。