CN110643613A

CN110643613A - 一种靶向沉默小菜蛾gnbp2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用

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Publication number: CN110643613A
Application number: CN201910854266.5A
Authority: CN
Inventors: 许小霞; 金丰良; 洪莹莹; 鞠雯燕; 曾路; 张雨欣; 花艳艳; 曹苗苗
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-09-10
Also published as: CN110643613B

Abstract

本发明公开了一种靶向沉默小菜蛾GNBP2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用。具体地，小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利首次发现害虫免疫系统为靶标体系中的阴性菌结合蛋白GNBP2基因，能够有效降低革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2和下游抗菌肽基因的表达，大大提高小菜蛾对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的敏感性，进一步提高了其死亡率。本发明为人畜安全的免疫抑制剂的开发奠定理论基础，并为害虫的生物防治提供新的理论，最终为我国绿色农业生产和可持续发展提供害虫控制的新策略和新途径。

Description

一种靶向沉默小菜蛾GNBP2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种靶向沉默小菜蛾GNBP2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用。

背景技术

昆虫种类繁多、形态各异，属于无脊椎动物中的节肢动物，是地球上数量最多的动物群体，在所有生物种类(包括细菌、真菌、病毒)中占了超过50％，它们的踪迹几乎遍布世界的每一个角落。具有高度的适应能力和有效防御机制。

昆虫免疫系统不同于哺乳动物，没有B和T淋巴细胞系统，因而不具有高等动物的高度专一的获得性免疫系统。但是，昆虫具有对非特异因子产生免疫应答的高效先天免疫系统。研究表明，昆虫的免疫应答主要体现在三个方面：体液免疫产生抗菌肽、细胞免疫吞噬或包埋外源微生物以及酚氧化酶反应在伤口或外源物周围堆集黑色素。

体液免疫产生的抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABPs)在昆虫先天免疫防御系统中起着重要的作用。抗菌肽是一类普遍存在的防御性蛋白质，具有分子量小，理化性能稳定和广谱抗菌等特点，是在昆虫受到外界刺激或创伤时在体内特定组织快速合成，分泌到血淋巴中对侵染病原微生物进行抑制的小分子多肽。昆虫接受外界免疫应答合成抗菌肽，主要是通过模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRS)识别入侵微生物产生的病原相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs)，激活Toll和Imd信号途径，通过NF-кB样转录因子调控抗菌肽基因的表达。

任何免疫应答反应启动的开关按钮是昆虫对入侵外源物质或异物的识别作用。昆虫存在一套完善的系统可以清楚的识别“自己”与“非己”成分。昆虫免疫开关依赖于模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)对病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或微生物相关分子模式(microbe-associatedmolecular patterns，MAMPs)的识别与结合，从而激活相关的免疫信号通路。PAMPs或MAMPs包括微生物的核酸、蛋白、脂类、脂蛋白，通常位于病原体生存所必需的保守结构中，是特异性激活先天性免疫通路的配体。

昆虫的模式识别受体主要包括肽聚糖识别蛋白(Petidoglycan recognitionproteins，PGRPs)、革兰氏阴性菌结合蛋白(Gram negative binding proteins，GNBPs)、β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein，βGRP)、C型凝集素(C-typelectins,CTL)、清道夫受体(scavenger receptor)、血淋巴类免疫球蛋白(hemolin)和硫脂蛋白(thioester-containing proteins,TEPs)。模式识别蛋白对“异己”识别后，机体便会启动自身的免疫机制，将“危险信号”放大。细胞内信号转导后，激活昆虫体内Toll、Imd、和STAT途径，将“危险信号”向下游传递。

目前缺乏一种通过沉默革兰氏阴性菌结合蛋白达到对昆虫的防控的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种靶向沉默小菜蛾GNBP2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2。

本发明的第二个目的是提供一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2。

本发明的第三个目的是提供所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、或所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一作为害虫防治靶点的应用。

本发明的第四个目的是提供所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、或所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的dsRNA。

本发明的第六个目的是提供一种重组表达载体。

本发明的第七个目的是提供一种重组菌。

本发明的第八个目的是提供权利要求5所述dsRNA、权利要求6所述重组表达载体或权利要求8所述重组菌在防控害虫中的应用。

本发明的第九个目的是提供一种防控小菜蛾的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

发明人利用农业重要害虫小菜蛾作为研究对象，利用实验室深度测序获得小菜蛾GNBP2的unigene，并利用3’-RACE和5’RACE技术获得了GNBP2的全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，经序列分析发现小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2的功能区序列如SEQ ID NO：4所示，其对应的GNBP2基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白(GNBP2)基因是一种模式识别受体，能高效识别病原物并激活调控抗菌肽表达的免疫信号通路，利用实时荧光载体检测小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2基因的时空表达模式，发现这个模式别蛋白在中肠体内高表达。将小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2功能区序列定向连接到表达载体L4440，用IPTG体外诱导GNBP2的dsRNA表达后，收集菌体(1:250)，按4g饲料加1ml菌体的比例混匀，饲喂小菜蛾后于6h、12h、18h、24h、36h和48h解剖小菜蛾收集中肠，以正常健康饲养的小菜蛾为对照，利用实时荧光定量PCR检测GNBP2基因的干扰效果；实时荧光定量PCR结果表明，小菜蛾通过添食重组菌体，不仅能降低革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2和下游抗菌肽基因包括Cecropin1、Cecropin2、Cecropin3、Defensin、Moricin和Gloverin的表达，还大大提高小菜蛾对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的敏感性，进一步提高了小菜蛾死亡率，与对照相比，小菜蛾在革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2的RNAi后感染革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌、革兰氏阳性菌和真菌，小菜蛾死亡率分别提高了60％，50％，40％。

因此，本发明要求保护以下内容：

一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一作为害虫防治靶点的应用。

所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、或所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

优选地，所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

优选地，述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步本发明要求保护一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的dsRNA，，其中一条链为所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段。

一种重组表达载体，通过靶向所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，和/或抑制所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的表达。

本发明并不限制该重组表达载体的类型，目前常用的RNAi载体，或CRISPR载体均可。

优选地，所述重组载体为RNAi载体，所述重组表达载体含有所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，或所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP3或其片段的反向互补序列。

更优选地，所述重组载体为表达载体L4440，含有所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段。

更优选地，所述重组载体为表达载体L4440，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段。

优选地，通过表达所述dsRNA靶向所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2。

一种重组菌，携带有所述的重组表达载体。

优选地，所述重组菌为HT115(DE3)。

更优选地，所述重组菌为携带有含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段的重组表达载体L4440的重组菌HT115(DE3)。

所述dsRNA、所述重组表达载体或所述重组菌在防控害虫中的应用。

一种防控小菜蛾的方法，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，和/或抑制所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的表达。

优选地，利用所述重组表达载体沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，和/或抑制所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的表达。

更优选地，通过表达所述dsRNA靶向所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，沉默所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2。

更优选地，所述dsRNA其中一条链核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

最优选，携带有含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段的重组表达载体L4440的重组菌HT115(DE3)在IPTG诱导表达后，离心得到菌体，重悬菌体，与饲料混合，进行饲喂。

优选地，IPTG诱导表达的条件为浓度为0.8～1.2mM，诱导表达3～5h。

更优选地，IPTG诱导表达的条件为浓度为1mM，诱导表达4h。

优选地，200到300倍重悬菌体。

更优选地，250倍重悬菌体。

优选地，重悬菌体与饲料的用量为3～5:1(g：mL)。

更优选地，重悬菌体与饲料的用量为4:1(g：mL)。

最优选，携带有含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段的重组表达载体L4440的重组菌HT115(DE3)在浓度为1mM的IPTG诱导表达4h后，离心得到菌体，250倍重悬菌体，重悬菌体与饲料的用量为4:1(g：mL)混合，进行饲喂。

一种防控害虫的制剂，含有所述重组菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本专利首次发现害虫免疫系统为靶标体系中的阴性菌结合蛋白GNBP2基因，能够有效降低革兰氏阴性菌结合蛋白GNBP2和下游抗菌肽基因的表达，还大大提高小菜蛾对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的敏感性，进一步提高了小菜蛾死亡率。本发明为人畜安全的免疫抑制剂的开发奠定理论基础，并为害虫的生物防治提供新的理论，最终为我国绿色农业生产和可持续发展提供害虫控制的新策略和新途径。

附图说明

图1为GNBP2基因的全长cDNA序列及其推导的氨基酸序列。

图2为GNBP2在小菜蛾体内的时空表达模式；Egg：卵；1st：一龄幼虫；2nd：二龄幼虫；3rd：三龄幼虫，4th：4龄幼虫；Prepupa：预蛹；He：血细胞；Fb：脂肪体；Mg：中肠；Ep：表皮；Hd：头部；Mt：马氏管，Pupa：蛹；Adult：成虫。图中小写字母代表不同龄期间差异显著水平(P＜0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05)，相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

图3为不同细菌侵染小菜蛾后中肠中GNBP2的表达情况；CK：未处理的不同时间点的4龄幼虫；A、B.thuringiensis：苏云金芽孢杆菌；B、S.aureus：金黄色葡萄球菌；C、S.marcescens：粘质沙雷氏菌；D：E.coli：大肠杆菌；以RPS13为内参基因，误差线代表±SE(n＝3)，单星代表处理与对照间差异显著(P＜0.05)；双星带表差异极显著(P＜0.01)。

图4为真菌孢子侵染小菜蛾后中肠不同时间段的PxGNBP2的表达情况；Tween80：0.05％Tween80缓冲液；I.fumosorosea：玫烟色棒束孢；B.bassiana：白僵菌；RPS13作为内参基因，双星代表处理与对照组差异极显著(P＜0.01)，单星代表处理与对照间差异显著(P＜0.05)。

图5为L4440-GNBP2干扰载体的凝胶电泳检测；M：DNA分子量标记DL2000；1，2：L4440；3：L4440-PxGNBP2。

图6为RNAi后小菜蛾中肠PxGNBP2基因的表达情况；CK：未作任何处理；RPS13作为内参基因，误差线代表±SE(n＝3)，双星号代表处理组与对照组差异极显著(P＜0.01)。

图7为RNAi后小菜蛾中肠抗菌肽基因的表达情况；RPS13作为内参基因,误差线代表±SE(n＝3)双星号代表处理组与对照组差异极显著(P＜0.01)，单星号代表处理组与对照组差异显著(P＜0.05)。

图8为RNAi后小菜蛾的死亡率，误差线代表±SE(n＝3)。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

表1本发明实施例中使用过的引物：

实施例1小菜蛾革兰氏阴性菌结合蛋白基因GNBP2 cDNA序列的克隆

一、实验方法

1、GNBP2基因的Unigene扩增

根据实验室测定的小菜蛾中肠转录组数据库。以小菜蛾总RNA为模板，反转录获得第一条cDNA；以Unigene序列设计引物(GNBP2F和GNBP2R)，PCR扩增Unigene序列，产物与pMD18-T载体连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选正确的划线单菌落，接种到含有抗生素LB液体培养基，质粒抽提试剂盒抽提质粒后进行PstI和EcoR I双酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送广州艾基生物技术有限公司测序。测序结果用DNAMAN软件对比，用在线生物学网站http://www.ncbi.nlm.nih.GOv/blast进行序列分析，得到Unigene扩增结果，判断为GNBP2的部分序列。

2、GNBP2基因的全长的扩增

利用上一步获得序列，扩增GNBP2基因的全长。

根据RACE试剂盒，制备模板5’RACE cDNA和3’RACE cDNA，并以分别测序正确的GNBP2的部分序列设计5’和3’RACE引物(3’RACE引物为3′GNBP2F1和3′GNBP2F2，3’RACE引物为5′GNBP2R1和5′GNBP2R2)，与通用引物配对，进行扩增，分别获得5’和3’RACE PCR产物，并将PCR产物进行T克隆，用DNAstar软件将上一步PCR产物及5’和3’RACE产物进行拼接，并用特异性引物进行序列测序分析，并用PCR重新扩增cDNA全长，最终获得GNBP2基因全长cDNA序列。

二、实验结果

最终获得GNBP2基因全长cDNA序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)序列见图1。在线网站对小菜蛾PxGNBP2基因进行ORF的确定和氨基酸翻译，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2和图1所示。小菜蛾GNBP2基因全长为1673bp，ORF为1473bp，编码491个氨基酸，5’非编码区(UTR)为40bp，3’非编码区(UTR)为161bp，测蛋白分子质量为55kDa。

实施例2小菜蛾GNBP2基因的时空表达模式

一、实验方法

选取健康的不同发育历期小菜蛾样品，包括卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、预蛹、蛹和成虫的样品，冰上解剖4龄第一天小菜蛾，收集头部、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、表皮6个组织样品，抽提总RNA和cDNA第一链的合成。以小菜蛾GNBP2全长cDNA序列为基础和RPS13基因序列，分别设计一对荧光定量PCR引物(引物分别为：GNBP2-qRT-F和GNBP2-qRT-R，RPS13-qRT-F和RPS13-qRT-R)，进行实时荧光定量PCR检测。

二、实验结果

结果如图2所示，小菜蛾GNBP2基因在小菜蛾各个龄期都有表达，在小菜蛾4龄表达量最高；利用qRT-PCR对4龄第一天的6个组织进行检测。结果表明GNBP2基因在中肠中的表达量最高。

实施例3小菜蛾GNBP2对不同微生物的敏感性检测

一、实验方法

将实验室保存的大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的甘油菌分别接种到新鲜的不含任何抗性的LB培养基中，37℃，240rpm过夜培养种子菌，将种子菌1:100接种到新鲜的不含任何抗性的LB培养基中，37℃，240rpm，OD₆₀₀＝0.8，12000g离心10min收集菌体，菌体用PBS洗两次，用血球计数器计数母液菌体浓度，再用PBS稀释至1.0×10⁸CFU/mL备用。

将实验室保存白僵菌(B.bassiana)和玫烟色棒束孢(I.fumosorosea)转接到PDA平板，然后置于25℃培养箱(12L:12D)中培养7天。待产孢后，在平板上加入20mL 0.05％吐温-80溶液，用接种环轻刮平板上的孢子，将配置的溶液倒入烧杯，磁力搅拌器搅拌30min。待孢子完全分散后,用双层医用纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液。用血球计数器计数母液孢子浓度，用0.05％的吐温-80溶液配成1.0×10⁸CFU/mL的孢子悬浮液，备用。

小菜蛾细菌饲喂方法，收集培养好四种菌的菌体与饲料拌匀，菌体与饲料的比例为1：4，饲喂4龄第一天小菜蛾幼虫，分别在饲喂后6、12、18、24、36和48h取样，每个时间点取6头幼虫，在冰上解剖获得中肠，荧光定量PCR检测GNBP2基因在小菜蛾中肠内的表达情况，结果如图3。

小菜蛾真菌，采用浸渍法，将培养好的真菌，分别在真菌处理小菜蛾后收集并解剖中肠，即将白僵菌(B.bassiana)和玫烟色棒束孢(I.fumosorosea)侵染小菜蛾80头，用0.05％吐温-80(Tween-80)侵染小菜蛾作为对照。分别在真菌处理小菜蛾后的12、24、36、48、60和72h收集小菜蛾并解剖中肠，每个时间点收集6头幼虫。在冰上解剖获得中肠，荧光定量PCR检测GNBP2基因在小菜蛾中肠内的表达情况(GNBP2-qRT-F和GNBP2-qRT-R)，结果如图4。

二、实验结果

结果如图3所示，苏云金芽孢杆菌处理后，PxGNBP2表达量在6h达量达到最高；金黄色葡萄球菌能诱导PxGNBP2在小菜蛾中肠6、36、48h表达量升高，与对照组差异性极显著(p<0.01)；粘质沙雷氏菌处理后，PxGNBP2在12h时的表达量显著高于其他时间段，与未处理对照组表达量比差异极显著(p<0.01)；大肠杆菌处理后，PxGNBP2的表达量在6h时达到高峰，与对照组差异极显著(p<0.01)。

结果如图4所示，玫烟色棒束孢基本都是诱导Px GNBP2的表达。白僵菌侵染后，12h至36h，小菜蛾PxGNBP2基因的表达被显著诱导表达，与对照组的差异极显著(p<0.01)。以上说明真菌可以诱导小菜蛾的表达。

实施例3小菜蛾RNA干扰载体的构建

一、片段扩增

以含有GNBP2基因片段的cDNA为模板，设计一对带有酶切位点的特异性引物(L-GNBP2F和L-GNBP2R)对GNBP2蛋白的功能区(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)扩增，利用高保真酶KOD PLU在25μL体系中进行扩增。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，回收PCR产物，用Xho I和Bgl II进行双酶切，回收酶切产物，放-20℃备用。

二、表达载体L4440酶切

将保存的L4440空质粒的甘油菌接种于5mL的LB液体培养基中，放置于37℃，240rpm/min的摇床中过夜培养种子菌。将过夜培养的种子菌按1:100的比例分别接种于4mL含有Amp(100mg/L)和Tet(100mg/mL)双抗性的新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.6左右后提取质粒，质粒用Xho I和Bgl II进行双酶切切胶纯化回收。

三、酶切产物的连接

将GNBP2基因酶切回收产物与L4440酶切回收产物进行连接，反应体系如下：酶切后L44480质粒，3μL；GNBP2表达片段，14μL；T4 DNA Ligase，1μL；T4 DNA Ligase Buffer，2μL；16℃生化培养箱中过夜连接。

四、转化大肠杆菌

将连接产物L4440-GNBP2转化到表达菌株HT115(DE3)感受态细胞，摇菌，抽提质粒。用Xho I和Bgl II进行双酶切鉴定，将酶切产物送广州艾基生物技术有限公司测序，将测序正确的菌体保存甘油菌，-80℃保存备用。

实施例4原核表达小菜蛾L4440-GNBP2-dsRNA的表达及检测

一、实验方法

将带有L4440-PxGNBP2表达质粒的重组菌株HT115(DE3)，接种于含有Amp+(100mg/L)和Tet+(100mg/mL)双抗性的LB液体培养基中，37℃、240rpm/min摇菌6h，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达4h。

将菌体离心12000rpm/min离心1min，收集菌体入液氮，研磨，研磨完全后，加入1000μL RNAiso Plus，以L4440空载体对照作为对照，同样进行RNA抽提，DNA凝胶电泳检测，

二、实验结果

结果如图5所示，在500bp左右有一条特异性的条带，说明PxGNBP2的dsRNA在HT115(DE3)菌株中或的表达。

实施例5饲喂小菜蛾后检测GNBP2基因在小菜蛾中肠中的表达量

一、实验方法

1、饲喂小菜蛾

将带有L4440-GNBP2的HT115，进行培养，IPTG诱导后，收集菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：250。将制备好的菌体，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，每组处理100头小菜蛾，饲喂空载作为阴性对照，以健康的小菜蛾为空白对照。

2、小菜蛾中肠GNBP2基因的相对表达量

将带有L4440-GNBP2的HT115，进行培养，IPTG诱导后，收集菌体，进行抽提总RNA，凝胶电泳进行检测，结果如图5。将重组细菌HT115，摇菌，诱导，收集菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：250。浓缩菌体后，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌匀饲料，然后将拌有菌的饲料放在饲喂盒中，每组处理100头小菜蛾，并同时饲喂转空载(L4440)的HT115菌体作为阴性对照，以健康的小菜蛾为空白对照。在小菜蛾饲喂后，不同时间点(6h、12h、18h、24h、36h、48h)，每次6头虫取中肠，进行实时荧光定量PCR检测检测。

3、小菜蛾RNAi后下游抗菌肽基因的表达

为了进一步检测RNA干扰效果，将小菜蛾饲喂重组菌株HT115后，18h后进一步用三种微生物感染小菜蛾，以健康小菜蛾为对照：粘质沙雷氏菌(S.marcescens)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，并在饲喂后6h、12h、18h、24h、36h和48h收集样品，解剖小菜蛾获取中肠；真菌采用浸渍法，将1.0×10⁸CFU/mL白僵菌(B.bassiana)侵染浸渍重组菌株HT115后18h小菜蛾，并在浸渍后6h、12h、18h、24h、36h和48h收集样品，解剖小菜蛾获取中肠。利用实时荧光定量PCR检测小菜蛾抗菌肽基因Defensin、Moricin、Cecropin1、Lysozyme1、Gloverin、Lysozyme2、Cecropin2和Cecropin3基因进行q RT-PCR检测，检测引物见表1，同时统计每组小菜蛾的死亡率。

Cecropin1的引物为PxCep1-qF和PxCep1-qR；Cecropin2的引物为PxCep2-qF和PxCep2-qR；Cecropin3的引物为PxCep3-qF和PxCep3-qR；Lysozyme1的引物为PxLys1-qF和PxLys1-qR；Lysozyme2的引物为PxLys2-qF和PxLys2-qR；Defensin的引物为PxDef-qF和PxDef-qR；Moricin的引物为PxMor-qF和PxMor-qR；Gloverin的引物为PxGlo-qF和PxGlo-qR。

二、实验结果

结果如图6所示，在小菜蛾中肠中的PxGNBP2基因在6h、12h、18h和24h时表达量显著降低，跟对照组的差异显著(P<0.01)。

结果如图7所示，在小菜蛾中肠中，抗菌肽基因Defensin、Moricin、Gloverin、Cecropin1、Cecropin2和Cecropin3的表达量相对于对照显著下降，而Lysozyme1和Lysozyme2的表达量上调。

结果如图8所示，将小菜蛾饲喂重组菌株HT115后，感染了粘质沙雷氏菌、苏云金芽孢杆菌和白僵菌的小菜蛾死亡率明显下降。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种靶向沉默小菜蛾GNBP2基因的重组细菌及在害虫防治中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1672

<212> DNA

<213> Plutella xylostella

<400> 1

acatggggag tgctcaaacc tccttacaga gcacgcgtaa tggctggatt aaaaactatt 60

ttcgtgttgt ctctggtcgc gatctgccat ggacaagcta gagggccgca gtactccgtg 120

cctcccgcca agcttgaggc cattgccccc accggctggt taaaagtcac tctgccagac 180

gacggcttct ccctattcgc cttccatggc aagctcaacg aggagatgga tggcctcgaa 240

gccggccact gggcgcggga catcaccaag ccgaaggacg gagtgtggac cttcagagac 300

agggctgccc ggctgaaggt cggagacaag gtgtacttct ggacctttgt tattaaggat 360

ggactggggt atcgacagga tgatggggag tggactgtca cagagttcgt agacgagcaa 420

ggcaaccctc aggagccagg accacaagca tccacctcaa gcccgacaca acgacccacg 480

ccagccccca ccagaccccc taccaagaag ccagacccac cgtgcaaacc ctcagagacc 540

gtggtacagg gggtcacgtc agtttgcaag ggcgctctgg tattcaatga ggagtttgac 600

aagtccaatg tgaaagattt ggacaactgg agccctgaag tcaagtttcc tgaggagcct 660

gactatccct tcaacctgta caccacaacc aagaccctga cactcgagga cggagatcta 720

aacatcaacc ctctactact ggagaaccag taccacgaaa gatggtttat gaggagctgg 780

acttaaccaa cacatgcact ggacaagtag gcaccaccga gtgccagcgc aaagccatcg 840

gagcaaacat actgcctccc gtcatgaccg gcaaagtaac aactaaacat aaattcaact 900

tcaaatacgg aagagttgaa gtccgagcga aattaccagc tggaaattgg ctacttccag 960

aaataaacct ggaacctcga gacaacatct acggtgtcaa ccggtacgcc tcagggctca 1020

tgcgggtcgc cttcgtccga gggaacccta gtttctccaa gaagctcagt gcggggccgg 1080

tgctgtctga tgcggaaccc ttcaggtctg ccctcttgaa ggagaagatc ggcatcgaca 1140

actggaacaa gggctaccac aattacacga tgatttggaa gcctgacggc gtctccatgc 1200

aagtggacgg tctgcccttc ggcaccgtgt ctccaggcga ggggttctac cacgcggggc 1260

gggagcacgc cgtgccacac gcctcgctgt ggcacaaggg gtcggtgatg gcacccttgg 1320

atgaactgtt ttacatcagc ctcggagtcc gagtgggggg agtccacgat ttcccggaca 1380

gcaaggacaa gccctggaag aaccggggca acaaggccgt cttcaacttc tgggaggcca 1440

aagacgcctg gttttccacc tggtatgaca gcagcatgaa agtagactac gtcagagttt 1500

acgctctgta aattgactga agaaaaatac acaaatgaga tttaatataa tgattttaat 1560

gtatttttta attgaggaga ctgtgattta atttaataaa taagttttat accaagctag 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagta ctctgcgttg ataccactgc tt 1672

<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> Plutella xylostella

<400> 2

Met Ala Gly Ile Lys Thr Ile Phe Val Leu Ser Leu Val Ala Leu Cys

1 5 10 15

His Gly Gln Ala Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Val Pro Pro Ala Lys Leu

20 25 30

Glu Ala Ile Ala Pro Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Leu Pro Asp Asp

35 40 45

Gly Phe Ser Leu Phe Ala Phe His Gly Lys Leu Asn Glu Glu Met Asp

50 55 60

Gly Leu Glu Ala Gly His Trp Ala Arg Asp Ile Thr Lys Pro Lys Asp

65 70 75 80

Gly Val Trp Thr Phe Arg Asp Arg Ala Ala Arg Leu Lys Val Gly Asp

85 90 95

Lys Val Tyr Phe Trp Thr Phe Val Ile Lys Asp Gly Leu Gly Tyr Arg

100 105 110

Gln Asp Asp Gly Glu Trp Thr Val Thr Glu Phe Val Asp Glu Gln Gly

115 120 125

Asn Pro Gln Glu Pro Gly Pro Gln Ala Ser Thr Ser Gly Pro Thr Gln

130 135 140

Arg Pro Thr Pro Ala Pro Ala Arg Pro Pro Thr Lys Lys Pro Asp Pro

145 150 155 160

Pro Cys Lys Pro Ser Glu Thr Val Val Gln Gly Val Thr Ser Val Cys

165 170 175

Lys Gly Ala Leu Val Phe Asn Glu Glu Phe Asp Lys Ser Asn Val Lys

180 185 190

Asp Leu Asp Asn Trp Ser Pro Glu Val Lys Phe Pro Glu Glu Pro Asp

195 200 205

Tyr Pro Phe Asn Leu Tyr Thr Thr Thr Lys Thr Leu Thr Leu Glu Asp

210 215 220

Gly Asp Leu Asn Ile Asn Pro Leu Leu Leu Glu Asn Gln Tyr His Glu

225 230 235 240

Gly Met Val Tyr Glu Glu Leu Asp Leu Thr Asn Thr Cys Thr Gly Gln

245 250 255

Val Gly Thr Thr Glu Cys Gln Arg Lys Ala Ile Gly Ala Asn Ile Leu

260 265 270

Pro Pro Val Met Thr Gly Lys Val Thr Thr Lys His Lys Phe Asn Phe

275 280 285

Lys Tyr Gly Arg Val Glu Val Arg Ala Lys Leu Pro Ala Gly Asn Trp

290 295 300

Leu Leu Pro Glu Ile Asn Leu Glu Pro Arg Asp Tyr Ile Tyr Gly Val

305 310 315 320

Asn Arg Tyr Ala Ser Gly Leu Met Arg Val Ala Phe Val Arg Gly Asn

325 330 335

Pro Ser Phe Ser Lys Lys Leu Ser Ala Gly Pro Val Leu Ser Asp Ala

340 345 350

Glu Pro Phe Arg Ser Ala Leu Leu Lys Glu Lys Ile Gly Ile Asp Asn

355 360 365

Trp Asn Lys Gly Tyr His Asn Tyr Thr Leu Ile Trp Lys Pro Asp Gly

370 375 380

Val Ser Met Gln Val Asp Gly Leu Pro Phe Gly Thr Val Ser Pro Gly

385 390 395 400

Glu Gly Phe Tyr His Ala Gly Arg Glu His Ala Val Pro His Ala Ser

405 410 415

Leu Trp His Lys Gly Ser Val Met Ala Pro Leu Asp Glu Leu Phe Tyr

420 425 430

Ile Ser Leu Gly Val Arg Val Gly Gly Val His Asp Phe Pro Asp Ser

435 440 445

Lys Asp Lys Pro Trp Lys Asn Arg Gly Asn Lys Ala Val Tyr Asn Phe

450 455 460

Trp Glu Ala Lys Asp Thr Trp Phe Ser Thr Trp Tyr Asp Ser Ser Met

465 470 475 480

Lys Val Asp Tyr Val Lys Val Tyr Ala Leu

485 490

<210> 3

<211> 438

<212> DNA

<213> Plutella xylostella

<400> 3

cgagacaaca tctacggtgt caaccggtac gcctcagggc tcatgcgggt cgccttcgtc 60

cgagggaacc ctagtttctc caagaagctc agtgccgggc cggtgctgtc cgatgcggaa 120

cccttcaggt cggccctctt gaaggagaag atcggcatcg acaactggaa taagggctac 180

cacaactaca cgctgatttg gaagcctgac ggcgtctcca tgcaagtaga cggtctgccc 240

ttcggcaccg tgtctccagg cgaggggttc taccacgcgg ggcgcgagca cgccgtgcca 300

cacgcctcgc tgtggcacaa ggggtccgtg atggcaccct tggatgaact gttttacatt 360

agcctcggag tccgcgtagg tggtgtccat gatttcccgg acagcaagga caagccctgg 420

aagaaccggg gcaacaag 438

<210> 4

<211> 146

<212> PRT

<213> Plutella xylostella

<400> 4

Arg Asp Asn Ile Tyr Gly Val Asn Arg Tyr Ala Ser Gly Leu Met Arg

1 5 10 15

Val Ala Phe Val Arg Gly Asn Pro Ser Phe Ser Lys Lys Leu Ser Ala

20 25 30

Gly Pro Val Leu Ser Asp Ala Glu Pro Phe Arg Ser Ala Leu Leu Lys

35 40 45

Glu Lys Ile Gly Ile Asp Asn Trp Asn Lys Gly Tyr His Asn Tyr Thr

50 55 60

Leu Ile Trp Lys Pro Asp Gly Val Ser Met Gln Val Asp Gly Leu Pro

65 70 75 80

Phe Gly Thr Val Ser Pro Gly Glu Gly Phe Tyr His Ala Gly Arg Glu

85 90 95

His Ala Val Pro His Ala Ser Leu Trp His Lys Gly Ser Val Met Ala

100 105 110

Pro Leu Asp Glu Leu Phe Tyr Ile Ser Leu Gly Val Arg Val Gly Gly

115 120 125

Val His Asp Phe Pro Asp Ser Lys Asp Lys Pro Trp Lys Asn Arg Gly

130 135 140

Asn Lys

145

Claims

1.一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、或权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一作为害虫防治靶点的应用。

4.权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2、权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段、权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2、或权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的片段任一的抑制剂在制备杀虫剂中的应用。

5.一种小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的dsRNA，其特征在于，其中一条链为权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2的片段。

6.一种重组表达载体，其特征在于，通过靶向权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，沉默权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，和/或抑制权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的表达。

7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，通过表达权利要求5所述dsRNA靶向权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2或其片段，沉默权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2。

8.一种重组菌，其特征在于，携带有权利要求7所述的重组表达载体。

9.权利要求5所述dsRNA、权利要求6所述重组表达载体或权利要求8所述重组菌在防控害虫中的应用。

10.一种防控小菜蛾的方法，其特征在于，沉默权利要求1所述小菜蛾模式识别受体蛋白基因GNBP2，和/或抑制权利要求2所述小菜蛾模式识别受体蛋白GNBP2的表达。