CN113151453A - 一种卵巢早衰诊断生物标志物及其应用 - Google Patents

一种卵巢早衰诊断生物标志物及其应用 Download PDF

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CN113151453A CN202110602274.8A CN202110602274A CN113151453A CN 113151453 A CN113151453 A CN 113151453A CN 202110602274 A CN202110602274 A CN 202110602274A CN 113151453 A CN113151453 A CN 113151453A
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Abstract

本发明公开了一种卵巢衰老功能诊断生物标志物及其在原发性卵巢功能不全诊断和预后中的应用。本发明分别从组织样本(人卵巢)、细胞样本(人临床颗粒细胞)和动物样本(小鼠卵巢)进行实验，均获得一致的结果：m6A和METTL14表达水平随卵巢功能衰老增加。本研究表明，METTL14可以作为卵巢功能衰老生物标志物，为卵巢功能衰老的诊断、预后及诊断提供理论基础。

Description

一种卵巢早衰诊断生物标志物及其应用
技术领域
本发明属于卵巢功能诊断技术领域，具体涉及一种卵巢早衰诊断生物标志物及其在原发性卵巢功能不全诊断和预后中的应用。
背景技术
原发性卵巢功能不全(Primaryovarianinsufficiency，POI)，是一种妇科内分泌疾病，主要表现为40岁前促性腺激素异常增高和雌激素减低，发病率为3.7％。当前，随着中国二胎政策放开及女性受孕年龄的延迟，高龄生育女性数量逐渐增多，有生育需求女性中POI患者比例也相应增加。POI可能由遗传因素、放化疗手术相关医源性因素、代谢因素、线粒体功能紊乱、免疫因素和环境因素等造成，进而导致卵子数量和质量下降，但仍有75％以上POI患者原因不明。POI不仅导致女性生育力下降、妊娠不良结局增多、生殖系统疾病发生，也诱发多种心血管、骨科、乳腺疾病，严重危害女性身心健康和家庭幸福。
通常POI患者在出现闭经及围绝经期症状的晚期阶段即POF才能被识别，此时卵巢功能恢复的希望渺茫，识别POF的意义十分有限，如能在卵巢功能衰竭前发现卵巢损伤并给予合理的管理可延缓甚至逆转卵巢损伤，减轻POF患者的远期并发症，因此，早期识别并及时诊断POI在临床工作中显得尤为重要。
目前，对POI的诊断主要从临床表现、实验室检查、超声检查及病理组织活检进行。实验室检查主要包括检测血清促卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH和抗苗勒管激素AMH等。有研究表明，只有当卵巢功能损害达到一定程度时才会出现血清FSH水平的明显改变，所以，检测FSH并不能筛查出极早期的卵巢功能减退。当卵巢功能受损时，LH的表现远不如FSH敏感，往往要在FSH水平发生改变几年后才发生改变。AMH是近年来新兴的一项检测指标，是目前外周血中可检测到的最早的卵泡产生的物质，其水平随年龄增加而显著降低，且与窦状卵泡数(AFC)具有强烈相关性，可更直接、真实地反映原始卵泡储备情况。NICE(英国)指南建议，将AMH<(0.1～0.35)ng/mL作为预测生殖能力受损的界值，而AMH>8pmol/L可排除POI，但特异性较低。此外，还可通过超声检查判断卵巢功能储备，AFC是指卵泡早期经阴道超声检测的直径为2～5mm的窦状卵泡数，AFC再发育就会成为成熟卵泡，其可精确地反映卵巢剩余卵泡数。卵巢体积反映卵巢状态，在FSH上升前即有所改变。监测卵巢血流动力学指标，也可了解卵巢功能储备情况。卵巢活检是确诊POI的“金标准”，但受取材位置的影响，诊断POF的意义有限；同时，具有一定危险性，且术后有粘连和感染的可能，患者不易接受，不主张采用卵巢活检对POI进行病因诊断和病情评估。因此，早期识别及诊断POI目前仍然存在较大困难。
因此，急需一种能够准确诊断卵巢功能衰老的生物标志物，能够为卵巢功能衰老的诊断、预后及诊断提供理论基础。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题，研究发现，不同年龄组女性卵巢中m6A位点分布及基因数均存在较大差异，m6A和METTL14表达水平随卵巢功能衰老增加。因此，METTL14作为潜在的卵巢功能衰老的生物标志物，可为卵巢功能衰老的诊断、预后及诊断提供理论基础。
第一方面，本发明提供了用于检测METTL14转录水平的物质在以下任一中的应用，
(A)诊断或辅助诊断卵巢早衰；
(B)诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全；
(C)比较待测卵巢组织功能衰老状况；
(D)制备用于诊断或辅助诊断卵巢早衰的产品；
(F)制备用于诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全的产品；
(G)制备用于比较待测卵巢组织功能衰老状况的产品。
进一步地，所述检测METTL14转录水平的物质为如下1)或2)：
1)转录测序所需试剂及仪器；
2)扩增所述METTL14的引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒。
进一步地，所述扩增METTL14的引物对由SEQIDNO.1所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQIDNO.2所示的单链DNA分子或其衍生物组成；所述单链DNA分子的衍生物为将所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的单链DNA分子。
第二方面，本发明提供了一种比较待测卵巢组织功能衰老状况的方法，用于非疾病诊断和治疗目的，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)直接测序；
(A2)用权利要求2或3所述的试剂或试剂盒对待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平进行测定：
若所述待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平高于其他所述待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平，则所述待测卵巢组织相对衰老；
若所述待测待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平低于其他所述待测待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平，则所述待测卵巢组织相对不衰老。
第三方面，本发明提供了具有如下(A)-(G)中至少一种功能的物质，用于检测METTL14转录水平的物质，
(A)诊断或辅助诊断卵巢早衰；
(B)诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全；
(C)比较待测卵巢组织功能衰老状况；
(D)制备用于诊断或辅助诊断卵巢早衰的产品；
(F)制备用于诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全的产品；
(G)制备用于比较待测卵巢组织功能衰老状况的产品。
第四方面，本发明提供了本发明第二方面所述的方法及第三方面所述的物质在筛选具有如下性状中至少一种的卵巢组织中的应用：
(a)卵巢功能相对衰老；
(b)卵巢功能相对不衰老；
(c)原发性卵巢功能相对不全。
第五方面，本发明提供了一种用于诊断或辅助诊断卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全的系统，包括：
(A1)用于检测METTL14的转录水平的物质；
(A2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(A1)检测得到的待测者的样本中METTL14的转录水平值；
所述数据比较模块用于将待测者的样本中METTL14的转录水平值与对照数值进行比较；所述对照数值为未患有卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全的患者的METTL14的转录水平值；
所述结论输出模块用于按照如下标准输出结论：如果待测者的样本中METTL14的转录水平值大于对照数值，则待测者为卵巢功能衰老或候选为卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全患者。
与现有技术相比，本发明从组织样本(人卵巢)，细胞样本(人临床颗粒细胞)和动物样本(小鼠卵巢)均获得一致的结果：m6A和METTL14表达水平随卵巢功能衰老增加。因此，METTL14可作为生物标志物检测卵巢功能衰老，为卵巢功能衰老提供预测、预后及诊断理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍
图1为胎儿期、青年期、中年期、绝经前期及绝经期测序结果进行聚类分析。
图2为RNA-m6A水平随人卵巢功能衰老增加；图2A.Young(20-30岁，n＝4)、Middle(31-40岁，n＝4)和Old(41-50岁无绝经，n＝4)三组人卵巢切片HE染色，红框为放大部分，标尺为200μm；图2B.Young、Middle和Old三组人卵巢METTL14抗体免疫组织化学染色；图2C.Young、Middle和Old组小鼠不同年龄小鼠卵巢切片HE染色后组织化学评分结果。
图3为不同年龄小鼠卵巢衰老表型分析。图3A.Young(12-14周，n＝6)、Middle(28-32周，n＝6)和Old(56-65周，n＝6)组小鼠卵巢大体观；图3B.Young、Middle和Old组小鼠卵巢重量统计，*P<0.05；图3C.Young、Middle和Old组卵巢重量与体重比统计，*P<0.05；图3D.Young、Middle和Old组小鼠不同年龄小鼠卵巢切片HE染色，红框为放大部分，标尺为200μm；图3E.Young、Middle和Old组小鼠不同年龄小鼠卵巢初级卵泡以及次级卵泡数量统计，*P<0.05；图3F.DotBlot检测Young、Middle和Old组小鼠卵巢m6A表达；图3G.WesternBlot检测Young、Middle和Old组小鼠卵巢中METT14蛋白表达，*P<0.05。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
1.1样本的收集
人中孕期胎儿(无疾病个人因素孕22-24周引产样本3例)、青年期(20-30岁2例)、中年期(31-40岁2例)、绝经前期(41-50岁无绝经2例)和绝经期(55-60岁确定绝经2例)卵巢。
1.2组织总RNA的提取
利用Trizol法提取细胞的总RNA，利用Qubit测定RNA浓度，将提取的RNA置于-80℃冰箱中保存待用。
1.3MeRIP-seq:
1.3.1统一取卵巢组织10μg总RNA，在37℃下，DNase(Ambion，AM2238)处理30min后，用2.5μL的0.5MEDTA(Sigma，03690)终止。
1.3.2利用10XFragmentbuffer(Thermo,AM8740)在70℃下处理5min后，用10Xstopbuffer在冰上终止2min。用Glycogen(5mg/ml，Thermo，AM9510)在-80℃沉降过夜。
1.3.3将30μLprotein-A(Thermo，10002D)，30μLprotein-G(Ther mo，10004D)和m6A抗体(SYSY，202003)在4℃摇床上过夜结合。
1.3.4纯化后的RNA与antibody-beads在4℃摇床上结合2h，利用不同浓度的IPbuffer洗涤6次，利用Elutionbuffer在4℃震荡仪上将m6A-RN A洗脱下来，并进行纯化。
1.3.5利用SMARTerStrandedTotalRNA-SeqKitv2-PicoInputMammalianComponents(Takara，634419)对纯化后的m6A-RNA及totalRN A的input进行建库。
1.4MeRIP-seq分析
胎儿期、青年期、中年期、绝经前期及绝经期测序结果进行聚类分析、m6a-peak紧密度分析及RNA-m6a位点数的区域分布分析。如图1中所示，m6A甲基化聚类分析显示各组卵巢存在较好的组内一致性；m6A峰紧密度分析显示m6A位点主要集中在3UTR区；分析各组间m6A位点区域分布时发现青年组和中年组在3’UTR的比例分别是15.5％和24.5％，存在较大差异；进一步以各组共有的基因进行分析，中年组和青年组之间基因数差异比其他各两组间差异更大；以共有基因mRNA及其m6A水平共同分析，中年组和青年组间相关性高于中年组和老年组。
实施例2
2.1样本收集
自然衰老小鼠，青年组(12-14周)、中年组(28-32周)，老年组(56-65周)卵巢。
2.2组织总RNA的提取
利用Trizol法提取细胞的总RNA，利用Qubit测定RNA浓度，将提取的RNA置于-80℃冰箱中保存待用。
2.3MeRIP-seq
方法同实施例1。
2.4DotBlot
2.4.1统一总RNA的上样量(500ng和1μg)，每个2μl上样与硝酸纤维膜上；
2.4.2在紫外交联仪器上UV254nm，2min；
2.4.3用buffer洗5分钟后用脱脂牛奶孵育1小时；
2.4.4使用m6A(SYSY，202003)抗体1：250稀释后4℃孵育过夜；
2.4.5第二天洗脱孵育二抗后，曝光拍摄。
2.5WesternBlot
2.5.1取100mg组织，按照100mg/1mL加入RIPA裂解液；
2.5.2研磨仪研磨组织后裂解30min；
2.5.3离心，取上清液，BCA法测定蛋白浓度；
2.5.4取相同质量蛋白质，加入5XLoadingBuffer，水补足至相同体积；
2.5.5煮蛋白：100℃5min；
2.5.5电泳、转膜、曝光
2.6结果分析
如图2所示，相较于青年组，甲基转移酶METTL14蛋白水平在老年组上升，具有统计学差异，m6A水平也具有上升趋势。同时，MeRIP-seq结果显示从青年期到中年期，METTL14表达水平上升，中年期到绝经前期下降，绝经前期到绝经期再次上升。
实施例3
3.1过表达载体构建
3.1.1在NCBI上获得人METTL14的序列，将METTL14的cDNA克隆到pCDNA3.1(+)-mCherry载体上；
3.1.2以cDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理并纯化回收；
cDNA的PCR引物如下:
METLL14-F:5’-TTGGTACCGAGCTCGGATCCATGGATAGCCGCTT GCAGG-3’(SEQIDNO.1)；
METTL14-R:5’-GCTGGATATCTGCAGAATTCTTATCGAGGTGGAA AGCCACC-3’(SEQIDNO.2)
3.1.3胶回收载体后与片段连接并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序；
3.1.4符合METTL14的菌液加入有氨苄霉素的LB液摇菌后使用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取；
3.1.5使用Fugene的转染试剂以DNA：试剂1：2比例转染，36-48小时后收样实验。
3.2CCK8法检测细胞增殖
3.2.1将转染METTL14的细胞消化后转代，以密度为1.0×104/mL的颗粒细胞接种于直径96孔培养皿中；
3.2.2连续培养4天，每天在相同时间点100μl培养液中加入10ulCC K8试剂，培养箱孵育3小时后酶标仪检测CCK8的OD值；
3.2.3连续4天检测后统计每天的OD值。
3.3β-半乳糖苷酶检测细胞衰老
3.3.1预处理的细胞，按3.0×105/mL的密度，接种于六孔板。
3.3.2第二天进行细胞敲降或过表达METTL14和EGR1，待细胞生长48h后，吸去上清。
3.3.3用PBS洗涤1次加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min。
3.3.4吸除PBS，每孔加入930μl工作液C，10μl工作液A、10μl工作液B和50μlX-Gal。37℃孵育过夜(非培养箱锡纸包裹)。
3.3.5普通光学显微镜下观察并计数，被染成深蓝色的细胞即为衰老阳性细胞，用ImageJ统计阳性衰老细胞占比。
3.4细胞内总RNA提取
方法同实施例1。
3.5细胞内蛋白质提取
方法同实施例2。
3.6WesternBlot
方法同实施例2。
3.7DotBlot
方法同实施例2。
3.8结果分析
如图3所示，m6A水平增加，细胞的增殖能力减弱，细胞衰老加剧。
综上，从组织样本(人卵巢)，细胞样本(人临床颗粒细胞)和动物样本(小鼠卵巢)均获得一致的结果：m6A和METTL14表达水平随卵巢功能衰老增加。故发明人认为METTL14可作为生物标志物检测卵巢功能衰老，为卵巢功能衰老提供诊断、预后及诊断理论基础。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
序列表
<110> 苏州市立医院
<120> 一种卵巢早衰诊断生物标志物及其应用
<130> 2021
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ttggtaccga gctcggatcc atggatagcc gcttgcagg 39
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gctggatatc tgcagaattc ttatcgaggt ggaaagccac c 41

Claims (9)

1.用于检测METTL14转录水平的物质在以下任一中的应用，
(A)诊断或辅助诊断卵巢早衰；
(B)诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全；
(C)比较待测卵巢组织功能衰老状况；
(D)制备用于诊断或辅助诊断卵巢早衰的产品；
(F)制备用于诊断或辅助诊断原发性卵巢功能不全的产品；
(G)制备用于比较待测卵巢组织功能衰老状况的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测METTL14转录水平的物质为如下1)或2)：
1)转录测序所需试剂及仪器；
2)扩增所述METTL14的引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增METTL14的引物对由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子或其衍生物组成；所述单链DNA分子的衍生物为将所述单链DNA分子经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的单链DNA分子。
4.一种比较待测卵巢组织功能衰老状况的方法，其特征在于，用于非疾病诊断和治疗目的，包括如下步骤(A1)或(A2)：
(A1)对所述METTL14直接测序；
(A2)用权利要求2或3所述的试剂或试剂盒对待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平进行测定：
若所述待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平高于其他所述待测待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平，则所述待测卵巢组织相对衰老；
若所述待测待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平低于其他所述待测待测卵巢组织中所述METTL14的转录水平，则所述待测卵巢组织相对不衰老。
5.权利要求4所述的方法或权利要求1-3任一所述的物质在筛选具有如下性状中至少一种的卵巢组织中的应用：
(a)卵巢功能相对衰老；
(b)卵巢功能相对不衰老；
(c)原发性卵巢功能相对不全。
6.一种用于诊断或辅助诊断卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全的系统，包括：
(A1)用于检测METTL14的转录水平的物质；
(A2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块。
7.根据权利要求6所示的系统，其特征在于，所述数据输入模块用于输入(A1)检测得到的待测者的样本中METTL14的转录水平值。
8.根据权利要求6所示的系统，其特征在于，所述数据比较模块用于将待测者的样本中METTL14的转录水平值与对照数值进行比较；所述对照数值为未患有卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全的患者的METTL14的转录水平值。
9.根据权利要求6所示的系统，其特征在于，所述结论输出模块用于按照如下标准输出结论：如果待测者的样本中METTL14的转录水平值大于对照数值，则待测者为卵巢功能衰老或候选为卵巢功能衰老或原发性卵巢功能不全患者。
CN202110602274.8A 2021-05-31 2021-05-31 一种卵巢早衰诊断生物标志物及其应用 Pending CN113151453A (zh)

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