CN114959041A - 抑制结直肠癌增殖转移的新靶标与诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制结直肠癌增殖转移的新肿瘤标志物及新靶标发现与其应用。本发明公开了LINC00955的用途：作为抑制结直肠癌增殖转移的靶标、诊断标志物。本发明还同时公开了LINC00955表达促进剂在制备抑制结直肠癌增殖、转移的药物中的应用。

Description

抑制结直肠癌增殖转移的新靶标与诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抑制结直肠癌增殖转移的新肿瘤标志物及新靶标发现与其应用，更具体涉及LINC00955作为抑制结直肠癌增殖转移研究的新肿瘤标志物及新靶标与其应用。

背景技术

通过国际癌症研究机构(International Agency for Research on cancer)发布的2020年全球癌症发病率和死亡率估算数据，提供了全球癌症的最新情况。据估计，2020年全球新增癌症病例达1930万例，癌症死亡人数近1000万例。结直肠癌估计有196万新病例(10.0％)，仅低于乳腺癌和肺癌，位居第三位。大肠癌是癌症死亡的第二大原因，估计有94万人死亡(9.4％)，仅次于肺癌(18％)。近些年来，我国结直肠癌的发病率和死亡率也处于上升趋势。2015年我国结直肠癌发病率为0.282‰，死亡率为0.1361‰，分别居于恶性肿瘤的第三位和第五位。结直肠癌早期症状并不明显，患者住院时已是晚期，错过最佳治疗时间。即便患者在疾病早期进行治疗，仍有约30％的病人会出现疾病的复发转移不断恶化的情况，研究表明，结直肠癌的转移是造成结直肠癌患者死亡的最主要原因。因此寻找更加准确特异的诊断标志物及有效抑制肿瘤转移治疗靶标，提高结直肠癌患者的诊断与治疗效果，是我们目前临床实践中需要迫切解决的问题。

在非编码RNA发现之前，人们一直认为生物在分子层面上的生物学行为是由蛋白质与蛋白质的相互作用实现的。而后来的研究发现，人类基因组中编码基因只占人基因组的3％。而75％的基因组序列能够被转录成RNA，其中近74％的转录产物为非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)，起初人们认为这些转录产物都是基因表达的转录“噪声”，本身并不具备任何生物学功能。但是，随着研究的深入，近些年来越来越多的研究发现非编码RNA在生命过程中扮演者极为重要的角色，其中作为非编码RNA中最为广泛与重要的成员之一的lncRNA几乎参与调控了包括肿瘤在内的所有的生命过程。但是包括结直肠癌在内，还有众多的具有重要作用但是功能未知的LncRNA分子未被研究报道，因此新lncRNA分子靶标的鉴定及其机制的阐明，有助于全面了解lncRNA的生物学功能，也有助于促进新的高效诊治结直肠癌的标志物、分子靶标的发现及药物的研发应用。

目前LINC00955相关功能尚不清楚。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抑制结直肠癌增殖转移的新靶标与诊断标志物及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供LINC00955的用途：作为抑制结直肠癌增殖转移的靶标、诊断标志物。

本发明还同时提供了LINC00955表达促进剂在制备抑制结直肠癌增殖、转移的药物中的应用。

作为本发明的应用的改进：抑制结直肠癌细胞体内增殖、抑制结直肠癌细胞体内转移。

作为本发明的应用的进一步改进：LINC00955表达促进剂为LINC00955的过表达质粒。

本发明还同时提供了一种预防或/和治疗结直肠癌的组合物，组合物包含：

(1)LINC00955的表达促进剂；

(2)药剂学上能够接受的载体。

作为本发明的预防或/和治疗结直肠癌的组合物的改进：LINC00955表达促进剂为LINC00955的过表达质粒。

本发明还同时提供了一种检测LINC00955表达的试剂：LINC00955表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，

引物序列为:F(上游引物):5′-CGTCGCCAACGCCCCTAGGAC-3′

R(下游引物):5′-CACCCGGAAGTCTCATGTGGA-3′。

本发明的目的在于表明LINC00955可以应用为结直肠癌的诊断标志物以及治疗靶标。

本发明所采取的技术方案如下：通过生物信息学技术手段，下载TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中的结肠癌(TCGA-COAD)的exon-Seq V2测序数据和临床数据对转录组数据进行深度挖掘，本发明发现，在TCGA中41对配对的临床组织样本中，相较于癌旁正常组织，LINC00955基因在癌组织中表达水平表达显著下调。本发明进一步采用实验室收集的150对临床组织样本通过RT-QPCR技术进行验证，发现在150对临床组织样本中，相较于癌旁正常组织，LINC00955基因在癌组织中表达水平同样显著下调，与TCGA数据库一致。将150对临床样本按照stage分期标准进行分期并分组，Q-PCR检测发现，Ⅲ+Ⅳ期(已有结直肠癌淋巴结转移与远端转移的中晚期)病人组织中LINC00955的表达水平显著低于Ⅰ+Ⅱ期(未发生癌转移早期)病人。同时对22对配对的原发灶癌旁正常组织、原发灶癌组织与肝转移癌组织的病人组织进行Q-PCR检测发现，LINC00955表达水平在原发灶癌旁正常组织、原发灶癌组织与肝转移癌组织中依序下调。同时，相较于正常结肠上皮细胞CCD-18Co，CCD-841与HCoEpiC细胞，LINC00955在HCT116等癌细胞系中表达显著下调。

进一步通过生物信息学技术手段，对TCGA数据库中的CRC患者按照LINC00955基因高、低表达进行分组，发现LINC00955高表达的患者预后要明显好于LINC00955低表达的患者。

本发明通过构建过表达载体并建立HCT116细胞和RKO细胞稳转细胞株后，通过ATP活力测定实验和soft agar实验发现，LINC00955的下调显著促进了HCT116细胞和RKO细胞的增殖。

本发明采取皮下注射的方式建立裸鼠异位移植瘤模型，观察HCT116细胞在裸鼠皮下的生长情况。研究发现，LINC00955显著抑制了结直肠癌细胞HCT116细胞的体内增殖能力。

本发明通过Transwell实验，体外研究发现，LINC00955的下调显著促进了HCT116细胞和RKO细胞的迁移与侵袭能力。

采取尾静脉注射的方式建立裸鼠肺转移模型，观察HCT116细胞与RKO细胞在裸鼠体内肺转移情况。研究发现，LINC00955显著抑制了结直肠癌细胞HCT116与RKO细胞的体内转移能力。采取脾脏注射的方式建立裸鼠肝转移模型，观察HCT116细胞与RKO细胞在裸鼠体内肝转移情况。研究发现，LINC00955显著抑制了结直肠癌细胞HCT116与RKO细胞的体内转移能力。

本发明有益效果如下：通过生物信息学手段对TCGA数据库进行分析，并通过Q-PCR等实验技术发现，相较于癌旁正常组织在癌组织中LINC00955在转录水平呈显著下调趋势，LINC00955在晚期病人中相较于早期病人表达水平显著降低，在转移组织中相较于原发灶组织表达同样显著降低，并且LINC00955基因的表达高低与病人预后显著相关，表明LINC00955可以作为结直肠癌增殖、转移诊断标志物，并成为病人的预后指标之一。同时，本发明进一步以结直肠癌HCT116、RKO细胞为模型，过表达LINC00955可显著抑制结直肠癌细胞HCT116、RKO的体内外增殖、转移能力，表明LINC00955可以作为结直肠癌增殖、转移的潜在的治疗靶标。即，本发明有望为结直肠癌增殖、转移提供全新的诊断标志物和治疗靶标。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为LINC00955在结直肠癌组织中表达下调；

图1中：

A为通过生物信息学手段分析TCGA数据库中LINC00955在结直肠癌相较于癌旁组织中转录水平的表达情况；

B为LINC00955在150对临床样本中转录水平表达情况；

C为LINC00955在不同分期病人癌组织中的表达情况；

D为LINC00955在配对的原发灶癌旁正常组织、原发灶癌组织与肝转移癌组织中的表达情况；

E为LINC00955在正常结肠上皮细胞CCD-18Co，CCD-841与HCoEpiC细胞，以及在结直肠癌细胞系中表达情况。

图2为LINC00955在癌组织中的表达高低与病人预后的关系。

图3为LINC00955可显著抑制结直肠癌细胞HCT116与RKO的体外增殖能力；

图3中，

A、B为在HCT116与RKO细胞中过表达LINC00955后通过Q-PCR鉴定过表达效率；

C、D通过ATP实验，实验验证LINC00955对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响；

E-H通过soft agar实验，实验验证LINC00955对结直肠癌细胞体外增殖能力的影响。

图4为本发明采取皮下注射的方式建立裸鼠异位移植瘤模型，观察HCT116细胞在裸鼠皮下的生长情况；

图4中，

A、B为采取皮下注射的方式建立了裸鼠异位移植瘤模型，观察过表达LINC00955后HCT116细胞相较于对照细胞在裸鼠皮下的生长情况；

C为所得瘤体称重；

D为瘤体生长曲线统计。

图5为LINC00955可显著抑制结直肠癌细胞HCT116与RKO的体外迁移与侵袭能力；

图5中，

A～D为通过Transwell实验验证LINC00955对结直肠癌细胞HCT116与RKO体外迁移与侵袭能力的影响。

图6为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，观察过表达LINC00955后HCT116细胞相较于对照细胞在裸鼠肺中转移情况；

图6中，

A为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，造模成功后观察过表达LINC00955后HCT116细胞相较于对照细胞在裸鼠肺中转移情况，裸鼠肺转移灶计数；

B为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，造模成功后对裸鼠肺组织进行正反面拍照；

C为采取尾静脉注射的方式建立了裸鼠肺转移模型，造模成功后裸鼠肺转移灶计数统计图。

图7为采取脾脏注射的方式建立了裸鼠肝转移模型，观察过表达LINC00955后HCT116细胞相较于对照细胞在裸鼠肝中转移情况；

图7中：

A为采取脾脏注射的方式建立了裸鼠肝转移模型，造模成功后对裸鼠肝组织进行拍照；

B为采取脾脏注射的方式建立了裸鼠肝转移模型，造模成功后对裸鼠肝组织进行HE染色。

具体实施方式

下面通过本发明的具体实施方式并结合说明书附图，进一步明确本发明的具体内容。

实施例1

通过生物信息学手段分析TCGA数据库中LINC00955在结直肠癌相较于癌旁组织中转录水平表达相对下调(图1A)。Q-PCR检测在150对临床样本中转录水平的表达情况(图1B)；检测LINC00955在不同分期的结直肠癌组织中的表达差异情况(图1C)；检测LINC00955在结直肠正常组织、原发灶癌组织与转移灶癌组织中的表达情况(图1D)；Q-PCR检测在结直肠癌细胞中转录水平的表达情况(图1E)；

下载TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中的结肠癌(TCGA-COAD)的exon-Seq V2测序数据和临床数据。

1)首先对数据中低量表达的基因进行剔除(过滤raw count 80％以上为0的基因)。筛选有癌旁配对组织的样本作为对象，进行差异分析。分别使用R包edgeR(Version：3.4，http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)对数据进行预处理，将raw count标化为log-CPM值，进行线性建模，并且使用由voom函数计算的精度权重来调节平均方差关系。使用limma包提供的线性回归和经验贝叶斯方法，分别对数据Tumor VS Normal进行差异表达分析。所有基因经过得到相应的P.Value值，使用Benjamini&Hochberg方法进行多重检验校正，得到校正后p值即adj.P.Value。本研究中LncRNA差异表达阈值均为adj.P.Value<0.05且|log2FC|>2。

2)组织样本

临床组织样本与温州医科大学附属第一医院提供，样本采集与利用已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会的伦理批准，严格按照相关制度与流程进行采集与利用。采集到样本后，一部分组织采取液氮速冻的方式保存于液氮罐中，一部分组织立即用4％的PFA固定24h-48h，具体处理流程如下：

a.组织脱水：组织经4％PFA固定后，流水过夜冲洗组织，除去残余的PFA固定液。之后按照30％酒精1h→50％酒精1h→70％酒精4℃过夜→80％酒精1h→90％酒精1h→95％酒精1h→100％酒精Ⅰ1h→100％酒精Ⅱ1h的顺序将组织梯度脱水(Ⅰ与Ⅱ代表玻璃瓶编号，酒精试剂无差异)。

b.组织透明：组织经梯度脱水后，将组织置入50％无水乙醇与50％二甲苯的混合液玻璃缸中5min，之后将组织转入二甲苯Ⅰ中5min，之后再转入二甲苯Ⅱ中5min(Ⅰ与Ⅱ代表玻璃瓶编号，二甲苯试剂无差异)。

c.组织浸蜡：组织透明后，将组织浸入软蜡中1h，之后浸入硬蜡中1h。

d.组织包埋：将组织从塑料包埋盒中取出，放入金属包埋盒中，将塑料包埋盒掩于其上，滴加适量的硬蜡，使硬蜡充分包裹塑料包埋盒，待硬蜡微凝固后将蜡块继续转入冰盒中，使蜡块与金属包埋盒脱离，取出蜡块，常温或4℃长期保存。

3)组织总RNA提取

a.从超低温冰箱中取出结直肠癌临床样本，每个样本取样约50mg于EP管中，加入700μl的Qiazol混匀，组织需要剪碎并用组织破碎仪充分破碎。

b.加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s，冰上静置5min。提前预冷离心机至4℃。4℃离心,12000g，15min。

c.用200μl的去酶枪头吸取上清，移至新的EP管中，约400μl。加入等体积的400μl异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10min。4℃离心,12000g，10min，弃去上清。

d.用DEPC水配制75％酒精，向上述沉淀中加入1ml配置好的75％酒精，吹打沉淀，4℃离心，12000g，5min，弃去上清，重复此步骤。

e.弃去上清后空离5min，用去酶小枪头吸取残留上清，留底部白色沉淀。开盖晾干，待底部白色沉淀透明后加入去酶水。4℃溶解2h，测定RNA浓度。

4)RT-QPCR

依照上述步骤提取并测定完成RNA浓度后，使用购买于Invitrogen公司的SuperScript^TM IV逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂说明书逆转录反应体系及步骤如下：

按照说明书将各组分加入到PCR管中，振荡混匀，之后将其置于PCR仪，设置PCR仪第一步反应程序：65℃，5min。反应完成后，冰上静置大于1min，按照如下体系将各组分混匀并加入到第一步反应所得产物中，进行第二步PCR反应。

按照说明书将各组分加入到PCR管中，振荡混匀，后将其置于PCR仪，设置PCR仪第二步反应程序：50-55℃10min，80℃10min。得到cDNA后，封口膜密封-80℃保存或完成下一步实验后再进行保存处理。将所需细胞获得cDNA后，利用Qiagen所购试剂盒进行PCR，PCR反应体系如下(4℃操作)：

按照以上反应体系将各组分充分混匀，加入384孔板中，每个样本设置3个复孔，离心1000g，1min，使各组分混匀并沉于孔底，置于Q6荧光定量PCR仪中进行检测。PCR反应条件为预变性：95℃，30s，变性：95℃，5秒，退火：58℃，30秒，延伸：72℃，30秒，共设置40cycles。

PCR Forward Primer(上游引物):5′-CGTCGCCAACGCCCCTAGGAC-3′；

PCR Reverse Primer(下游引物):5′-CACCCGGAAGTCTCATGTGGA-3′。

所得结果为：LINC00955在结直肠癌组织中表达相对下调且与结直肠癌转移相关；根据该结果，可得知：LINC00955可以作为结直肠癌的诊断标志物。

实施例2

LINC00955高表达的患者预后要明显好于LINC00955低表达的患者

整理预后相关临床信息，包括总生存时间、总生存状态。将LncRNA分别按照肿瘤组的表达水平将样本分为两组：高表达和低表达，并进行log-rank统计检验，设定p<0.05为统计学显著性阈值。分析LINC00955与患者预后的关系并绘制K-M生存曲线。所得结果见图(图2)；所得结果为：LINC00955表达越高，患者的无病生存期与总生存期越长；因此可得知：LINC00955可以作为结直肠癌的预后标志物。

实施例3

LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力

1)、选用HCT116细胞与RKO细胞，并采用pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-LINC00955质粒在HCT116与RKO细胞中过表达LINC00955，建立稳定转染细胞HCT116-LINC00955，RKO-LINC00955及其对照HCT116-Vector，RKO-Vector，Q-PCR实验验证过表达效率，如图3A,3B所示。

说明：pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-LINC00955质粒为LINC00955过表达质粒，可购自湖南丰晖生物公司。

2)、采用ATP实验检测肿瘤细胞HCT116-LINC00955、RKO-LINC00955相较于对照HCT116-Vector、RKO-Vector细胞生长活力变化，如图3C、D所示。

具体步骤如下：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至96孔板中。细胞贴壁后从培养箱取出相应细胞，显微镜下观察状态。从-20℃取出ATP检测试剂，室温溶解。甩去96孔板中的旧培养基，每孔加25μl的PBS，再加入每孔25μl的ATP检测试剂，避光操作。避光，振荡器上震荡3min，室温静置10min。将96孔板中的西细胞裂解产物转移至避光板，每孔加40μl。上机检测。

所得结果为：过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力。

3)、采用软琼脂克隆形成(soft agar)实验评价肿瘤细胞HCT116-LINC00955、RKO-LINC00955相较于对照HCT116-Vector、RKO-Vector细胞锚定非依赖的恶性增殖能力，如图3E、F、G、H所示。

具体步骤如下：按照每孔取1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml配制的培养基(即：medium)于15ml离心管中，轻轻吹打混匀后加入6孔板的孔中，避免吹打出气泡，铺板要平而均匀，避免产生气泡。静置至少2h后，按照如下体系铺上层胶：

1.25％琼脂糖凝胶 0.264ml

2×细胞培养基 0.736ml

细胞数 1×10⁴

先将1.25％的琼脂糖凝胶与2×细胞培养基混匀后放入42℃水浴锅中预热，然后用0.25％胰酶消化处于对数生长期的细胞，用培养基吹打成为单细胞悬液，计数后取相应悬液体积的细胞加入相应细胞数至1.25％的琼脂糖凝胶与2×细胞培养基中，铺板。静置1-2小时后，用封口膜密封6孔板，之后放入37℃5％二氧化碳细胞培养箱中继续培养，7天左右开始观察克隆生长状态，待到克隆生长至合适大小时，采用显微镜5倍镜拍照并计数，计算细胞集落数形成率。

所得结果为：过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体外增殖能力；因此可得知：LINC00955可以作为抑制结直肠癌增殖的新治疗靶标。

实施例4

过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力

1)动物饲养

BALB/C-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15±0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。

2)皮下注射

0.25％胰酶消化处于对数生长期的HCT116-Vector细胞和HCT116-LINC00955细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用PBS重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去PBS，加入1ml PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后充池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠皮下注射100μl细胞悬液，其中包含300万细胞量。裸鼠皮下注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，均匀注射于小鼠右背部皮下位置，每组注射5只裸鼠。

3)测定拍照

1周左右PBS被裸鼠充分吸收，肿瘤细胞初步成瘤，此时用游标卡尺测肿瘤大小计算肿瘤体积(肿瘤体积V＝0.52×(a×b²)，如图4D所示；待裸鼠接种肿瘤细胞生长4周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出瘤体，拍照并将瘤体称重。

所得结果为：过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体内增殖能力；因此进一步表明LINC00955可以作为抑制结直肠癌增殖的新治疗靶标。

实施例5

LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体外迁移与侵袭能力

采用Transwell实验，将HCT116-LINC00955，RKO-LINC00955以及对照细胞用0.1％对应的培养基重悬细胞之后种于上室中，下室采用全培培养，24h后采用3.7％甲醛固定5min，100％甲醇渗透20min，吉姆萨染色液进行避光染色15min并拍照，并对迁移和侵袭的细胞数定量分析，如图5A-5D所示，其差异具有统计学意义。

实施例6

过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力

1)动物饲养

BALB/C-nu雌性裸鼠，周龄为3-4周，体重15±0.5克，实验动物由江苏集萃药康生物科技有限公司购入，并饲养于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域。所进行动物实验的开展已通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准且实验过程符合伦理委员会的动物伦理要求。

2)尾静脉注射

0.25％胰酶消化处于对数生长期的HCT116-Vector细胞、HCT116-LINC00955细胞、RKO-Vector细胞、RKO-LINC00955细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用PBS重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去PBS，加入1ml PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后冲池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠尾静脉注射100μl细胞悬液，其中包含200万细胞量。裸鼠尾静脉注射部位用75％酒精擦拭消毒处理，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100ul细胞悬液，缓慢尾静脉注射，每组注射5只裸鼠。

3)测定拍照

待裸鼠接种肿瘤细胞生长8周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠肺组织，统计转移灶数目(图6A，6C)，拍照(图6B)并固定包埋肺组织。

所得结果为：过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力；因此可得知：进一步表明LINC00955可以作为抑制结直肠癌转移的新治疗靶标。

实施例7

1)脾脏注射

0.25％胰酶消化处于对数生长期的HCT116-Vector细胞、HCT116-LINC00955细胞、RKO-Vector细胞、RKO-LINC00955细胞；用培养基终止消化，将所有培养皿的细胞收集至50ml离心管中，1500rpm离心5min，之后弃去上清培养基，用PBS重悬细胞洗一次，再次1500rpm离心5min后弃去PBS，加入1ml PBS重悬，按照一定比例稀释细胞后冲池计数，计算所需细胞量。每只裸鼠脾脏注射100μl细胞悬液，其中包含300万细胞量。裸鼠以100μl-300μl 0.3％戊巴比妥钠/10g的标准进行腹腔注射麻醉，手术部位用75％酒精擦拭消毒处理，剖开腹腔定位脾脏后，接种前将细胞充分混匀，用1ml无菌胰岛素注射器吸取100μl细胞悬液，缓慢脾脏注射，每组注射6只裸鼠。

2)测定拍照

待裸鼠接种肿瘤细胞生长8周左右时，用0.5％戊巴比妥钠麻醉裸鼠后处死，解剖取出裸鼠肝组织，进行拍照展示(图7A)并固定包埋肝组织进行HE染色(图7B)。

所得结果为：过表达LINC00955显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力；因此可得知：进一步表明LINC00955可以作为抑制结直肠癌转移的新治疗靶标。

肝脏和肺脏是临床结直肠癌患者远处转移的常见器官，LINC00955对于结直肠癌细胞的肝脏和肺脏转移能力的抑制作用，能够强有力表明LINC00955可以显著抑制结直肠癌细胞的体内转移能力，并可以作为抑制结直肠癌转移的新治疗靶标。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 瓯江实验室

温州医科大学

<120> 抑制结直肠癌增殖转移的新靶标与诊断标志物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtcgccaac gcccctagga c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacccggaag tctcatgtgg a 21

Claims (7)

1.LINC00955的用途，其特征是：作为抑制结直肠癌增殖转移的靶标、诊断标志物。

2.LINC00955表达促进剂在制备抑制结直肠癌增殖、转移的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：抑制结直肠癌细胞体内增殖、抑制结直肠癌细胞体内转移。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述LINC00955表达促进剂为LINC00955的过表达质粒。

5.一种预防或/和治疗结直肠癌的组合物，其特征在于，组合物包含：

(1)LINC00955的表达促进剂；

(2)药剂学上能够接受的载体。

6.根据权利要求5所述的预防或/和治疗结直肠癌的组合物，其特征在于：所述LINC00955表达促进剂为LINC00955的过表达质粒。

7.一种检测LINC00955表达的试剂，其特征在于：所述LINC00955表达的试剂包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含一对特异性引物，

引物序列为:F:5′-CGTCGCCAACGCCCCTAGGAC-3′

R:5′-CACCCGGAAGTCTCATGTGGA-3′。

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