CN102037142A - 诊断慢性心脏同种异体移植物排斥的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用基因组表达图谱、蛋白质组表达图谱或基因组和蛋白质组表达图谱的组合来诊断心脏同种异体移植物的慢性排斥的方法。

Description

诊断慢性心脏同种异体移植物排斥的方法
本申请要求2008年4月10日提交的美国临时申请61/071,056和2009年3月3日提交的US 61/157,166的优先权利益，它们二者通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及使用基因组表达图谱、蛋白质组表达图谱或基因组和蛋白质组表达图谱的组合诊断心脏同种异体移植物的慢性排斥的方法。
背景技术
移植被视作具有末期生命器官衰竭的患者的主要疗法。尽管诸如环孢菌素和他罗利姆等免疫抑制剂的可用性已经提高了同种异体移植物受体存活和健康，但尽可能早地和尽可能精确地鉴别同种异体移植物的排斥和有效地监视和调节免疫抑制药物的剂量，对于同种异体移植物受体的持续存活仍然非常重要。
通常将同种异体移植物的排斥描述为受体对供体组织表达的非自身抗原的免疫应答的结果。急性排斥可能发生在移植后数天或数周内，而慢性排斥可能是更慢的过程，发生在移植后数月或数年后。
目前，侵入性活组织检查，例如心内膜心肌、肝核心和肾细针抽吸活组织检查，被广泛视作监督和诊断同种异体移植物排斥的黄金标准，但是侵入性操作具有它们自身的风险(例如Mehra MR，等人Curr.Opin.Cardiol.2002 Mar；17(2)：131-136.)。由于取样误差和观察人员之间的差异性，活组织检查结果也可能产生再现性和判读问题，尽管可利用国际指南例如Banff纲要(用于分级肝同种异体移植物排斥)(Ormonde 等人1999.Liver Transplantation 5：261-268)或修订的ISHLT移植级别(Stewart等人2005。J Heart Lung Transplant，2005；24：1710-20)。尽管已经开发了侵入性更低的(成像)技术，例如用于监视慢性心脏排斥的血管造影术和IVUS，这些替代方案也容易具有与活组织检查有关的那些类似的局限性。
心脏同种异体移植物血管病(CAV)的发展被广泛地视作心脏移植受体的长期生存的一个关键限制因素和同种异体移植物的慢性排斥(CR)的一个指示。现在，最常用的检测CAV的标准是冠状血管造影术，这是侵入性的且相对不灵敏的操作。CAV的典型特征是沿着心脏同种异体移植物中受侵袭的冠状血管的长度的血管损伤和同心纤维性内膜增生/血管损害。由于CAV被视作活过移植后第一年的患者的主要死因，早期检测已经变得日益重要。但是，CAV的早期诊断经常是一项困难的任务，这部分地由于缺少缺血的临床症状(由心脏去神经支配导致)。目前，将冠状血管造影术用作CAV的标准诊断。血管内超声(IVUS)是一种相对更灵敏的技术，虽然没有广泛用于移植中心，但是是诊断CAV的另一个工具(综述见Schmauss等人，2008.Circulation117：2131-2141)。生命期望也受到慢性排斥作用的影响——心脏受体的长期(即10年)存活率大致是50％，很大程度上受到心脏同种异体移植物血管病(CAV)的发展(随着慢性排斥(CR)的表达)的限制。
可以将通过活组织检查测得的急性同种异体移植物排斥的严重性分级，以提供标准化的参照标准。国际心肺移植分级学会(International Society for Heart and Lung Transplantation scale，ISHLT)为心脏移植受试者提供了分级活组织检查样品的方法(表1)。
表1：用于组织病理学活组织检查分析的急性心脏移植排斥的国际心肺移植学会分级
Figure BPA00001257880100031
同种异体移植物排斥的指标可以包括增强的和集中的免疫应答，这由下述的一种或多种指示：局部的或全身的炎症、组织损伤、免疫细胞的同种异体移植物浸润、组织-和血液-衍生的蛋白的改变的组成和浓度、同种异体移植物组织的差别化氧合、水肿、内皮的增厚、增加的胶原含量、改变的心肌内血流量、感染、同种异体移植物和/或周围组织的坏死等。
同种异体移植物排斥可以描述为“急性的”或“慢性的”。急性排斥通常视作在受试者接受同种异体移植物的约6个月内的组织或器官同种异体移植物排斥。急性排斥的特征在于对供体组织的细胞和体液损伤，导致快速的移植物功能障碍和组织或器官的衰竭。慢性排斥通常视作在6个月后的组织或器官同种异体移植物排斥，且可能是接受同种异体移植物后几年。慢性排斥的特征在于由同种免疫应答触发的渐进性组织再造，且可能导致在动脉内逐渐形成新生内膜，促成闭塞性血管病、实质纤维化，和最终的移植物衰竭和损失。通常，在临床上通过IUVS(血管内超声)、血管造影术和/或超声心动描记术进行评估或诊断，且在必要时可以进一步包括活组织检查(参见，例如，Tsutsui等人2001Circulation 104：653-7；Kobashigawa等人2005.J.American College of Cardiology 45：1532-7；Tuzcu等人2005.J American College of cardiology 45：1538-42)。根据排斥的性质和严重性，在正在发生或疑似发生同种异体移植物排斥(慢性的或急性的)的受试者中观察到的指示或临床变量可能存在重叠。
已经尝试减少每位患者的活组织检查和侵入性监督技术的数目，但是通常不会成功，部分地由于难以精确找到排斥开始或发展的部位，也由于在没有进行实际活组织检查的情况下难以评估组织。已经研究了非侵入性监督技术，且可以提供同种异体移植物排斥的适当阴性预测，但是在临床场合可能具有更少的实践实用性(Mehra等人，同上)。
在慢性同种异体移植物排斥的领域内，引用了众多标志物，且在某些情况下可能呈现明显冲突的结果。文献中的这种冲突，与基因组的复杂性(估计上限是30,000个转录单位)、人体中细胞类型(估计上限是200)、器官和组织和表达的蛋白或多肽(估计上限是80,000)的复杂性一起，使可能用于诊断器官排斥的核酸序列、基因、蛋白、代谢物或其组合的数目是惊人的。个体之间的差异会产生额外的障碍，以及血浆中蛋白浓度的动态范围(介于10-6至103μg/mL，许多蛋白以非常低的浓度存在)和极大量的少数最丰富的血浆蛋白(占总蛋白质量的～99％)。
PCT公开WO2006/083986、WO2006/122407、US公开2008/0153092、2006/0141493、US7026121和US7235358披露了使用生物标志物的集合(蛋白质组或基因组)诊断或检测从癌症到器官移植的不同疾病状态的方法。
Borozdenkova等人2004(J.Proteome Research 3：282-288)公开称，αB-晶状体蛋白和原肌球蛋白在一组心脏移植受试者中升高。
Roussoulieres等人，2005(Circulation 111：2636-44)公开了CHD5在人心脏移植小鼠模型的急性排斥中的牵涉。
Ishihara，2008(J.Mol Cell Cardiology 45：S33)公开称，ADIPOQ可能在心脏移植中起作用，且Nakano(Transplant Immunology 2007 17：130-136)提出，ADIPOQ的上调可能是克服肝移植受试者的排斥所必需的。
Hedman等人，2007(Pediatr Transplantation 11：481-490)公开称，高APOB/APOA1比与儿科心脏同种异体移植物受体中的血管造影可检测的血管病有关，且低HDL-C可以预测接受普伐他汀治疗的这些患者中移植血管病的发作。
已经在急性肾同种异体移植物排斥中观察到IGFBP3、MST1、CDH5的水平的改变(Fukuda等人，1998 Growth Horm IGF Res 8：481-6；Sarwal等人，2003.New England J.Med 349：125-138；Roussoulieres等人，2007 J.Biomed Biotechnol.doi：10.1155/2007/41705)。
Matsui等人，2003(Physiol Genomics 15：199-208)公开了在鼠心脏移植模型中阻断共刺激信号后耐受同种异体移植物的基因表达图谱。
Fildes等人2008(Transplant Immunology 19：1-11)的综述讨论了细胞类型在肺移植后的免疫过程中的作用，并公开称，AICL(CLEC2B)与NK细胞蛋白的相互作用可能在急性和慢性排斥中起作用。
已经为不同癌症的诊断和监视提出多平台(蛋白组学，基因组学)的整合，但是，在该领域鉴别出蛋白和mRNA表达之间的不一致性(Chen等人，2002.Mol Cell Proteomics 1：304-313；Nishizuka等人，2003 Cancer Research 63：5243-5250)。以前的研究已经报道了基因组和蛋白质组数据之间的低度相关(Gygi SP等人1999.Mol Cell Biol.19：1720-1730；Huber等人，2004 Mol Cell Proteomics 3：43-55)。
迫切需要侵入性更低的、可重复的且更有力的(更不易产生取样和判读误差)评估或诊断同种异体移植物排斥(包括慢性排斥)的方法。
发明内容
本发明涉及使用基因组表达图谱、蛋白质组表达图谱或基因组和蛋白质组表达图谱的组合诊断心脏同种异体移植物的慢性排斥的方法。
本发明涉及使用基因组或蛋白质组表达图谱诊断心脏同种异体移植物的排斥(包括慢性排斥)的方法。
根据本发明的一个方面，提供了诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的方法，该方法包含：a)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱，所述基因组标志物选自CHPT1、RPS26、GBP3、KLRCl/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5；b)将一种或超过一种基因组标志物的表达图谱与无排斥者图谱进行对比；和c)测定一种或超过一种基因组标志物的表达水平是否相对于无排斥者图谱升高或降低，其中一种或超过一种基因组标志物的升高或降低是受试者的排斥状态的指示。
根据本发明的另一个方面，提供了用于诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的试剂盒，所述试剂盒包含用于下述一种或超过一种的特异性和定量检测的试剂：CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2或IFIT5，以及关于使用这些试剂的说明书，和任选地，分析得到的数据的方法。试剂盒可以另外包含一种或多种寡核苷酸，用于与一种或多种基因或转录物进行选择性杂交，所述基因或转录物编码CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2或IFIT5中的一些或一部分。可用于组合试剂盒的结果和其它测定法的结果以提供无排斥截止指示或受试者排斥状态的诊断对照的说明书或其它信息，也可以提供在试剂盒中。
根据本发明的另一个方面，CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4和IFIT5可以相对于对照降低，且OSBP2可以相对于对照升高。
根据本发明的另一个方面，所述方法另外包含，得到一个或多个临床变量的值，并将一个或多个临床变量与对照进行对比。
根据本发明的另一个方面，所述对照是自体对照。
根据本发明的另一个方面，所述方法可以进一步包含，测定在表6中列出的一种或多种标志物的表达图谱。
根据本发明的另一个方面，所述对照是无排斥的同种异体移植物受体受试者或非同种异体移植物受体受试者。
根据本发明的另一个方面，通过检测与一种或超过一种标志物相对应的RNA序列，可以测定一种或超过一种基因组标志物的表达图谱。
根据本发明的另一个方面，可以通过PCR测定一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱。
根据本发明的另一个方面，可以通过杂交测定一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱。
根据本发明的另一个方面，所述杂交可以是与寡核苷酸杂交。
根据本发明的另一个方面，所述生物样品是血液样品。
根据本发明的另一个方面，提供了一种方法，其中：a)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种蛋白质组标志物的蛋白质组表达图谱，所述一种或超过一种蛋白质组标志物选自由IGFBP3、MST1、CDH5、C1QB、CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽；b)将一种或超过一种蛋白质组标志物的表达图谱与无排斥者图谱进行对比；和c)测定一种或超过一种蛋白组标志物的表达水平是否相对于无排斥者图谱升高或降低，其中一种或超过一种蛋白质组标志物的水平的升高或降低是受试者的排斥状态的指示。
根据本发明的另一个方面，提供了诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的试剂盒，所述试剂盒包含用于一种或超过一种多肽的特异性和定量检测的试剂，所述多肽由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9、IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码，以及关于使用这些试剂的说明书，和分析得到的数据的方法。可用于组合试剂盒的结果和其它测定法的结果以提供无排斥截止指标或受试者排斥状态的诊断对照的说明书或其它信息，也可以提供在试剂盒中。
根据本发明的另一个方面，由IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的多肽的水平可以相对于对照降低，由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽的水平可以相对于对照升高。
根据本发明的另一个方面，所述方法另外包含，得到一个或多个临床变量的值，并将一个或多个临床变量与对照进行对比。
根据本发明的另一个方面，所述对照是自体对照。
根据本发明的另一个方面，所述无排斥者图谱从无排斥的同种异体移植物受体受试者或非同种异体移植物受体受试者得到。
根据本发明的另一个方面，所述蛋白质组表达图谱可以通过免疫测定法来测定。
根据本发明的另一个方面，所述蛋白质组表达图谱可以通过ELISA来测定。
根据本发明的另一个方面，所述蛋白质组表达图谱可以通过质谱法来测定。
根据本发明的另一个方面，所述蛋白质组表达图谱可以通过同位素或同重元素标记方法来测定。
因此，本发明的某些方面的一个优点是，提供了诊断慢性同种异体移植物排斥的方法，无需被移植的组织或器官的活组织检查。
本发明也涉及使用基因组表达和蛋白质组表达图谱诊断心脏同种异体移植物的慢性排斥的方法。根据本发明的另一个方面，提供了诊断受试者的同种异体移植物排斥的方法，该方法包含：a)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种标志物的基因组表达图谱，所述标志物选自基因组标志物OSBP2、CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1、ZCCHC2、242907、CLEC2B、PDK4和IFIT5；b)测定生物样品中的蛋白质组标志物的蛋白质组表达图谱，所述蛋白质组标志物选自由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9、IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的多肽；c)将基因组和蛋白质组表达图谱与对照图谱相对比；和d)测定一种或超过一种标志物的基因组或蛋白质组表达水平是否相对于对照图谱升高或降低，其中一种或超过一种标志物的升高或降低是排斥状态的指示。
根据本发明的另一个方面，提供了使用基因组和蛋白质组标志物的组合集合测定受试者的慢性同种异体移植物排斥状态的方法，所述方法包含：a)测定来自受试者的生物样品中的CHPT1、GBP3、242907_at和CLEC2B基因组标志物的基因组表达图谱；b)测定生物样品中的蛋白质组标志物的蛋白质组表达图谱，所述蛋白质组标志物选自由CFHR2、CPN1、GC和C1QB编码的多肽；c)将基因组和蛋白质组表达图谱与对照图谱进行对比；和d)测定基因组和蛋白质组标志物的基因组或蛋白质组表达水平是否相对于对照图谱升高或降低，其中基因组标志物CLDC2B、CHPT1、242907_at、GB3的增加和由CFHR2、CPN1和GC编码的多肽的增加和由C1QB编码的多肽的降低是受试者的慢性排斥状态的指示。
根据本发明的另一个方面，所述方法另外包含，得到一个或多个临床变量的值，并将一个或多个临床变量与对照进行对比。
根据本发明的另一个方面，所述对照是无排斥的同种异体移植物受体受试者或非同种异体移植物受体受试者。
根据本发明的另一个方面，提供了用于评估、预测或诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的试剂盒，所述试剂盒包含用于一种或超过一种基因组标志物OSBP2、CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1、ZCCHC2、242907、CLEC2B、PDK4和IFIT5和包含由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9、IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的多肽的蛋白质组标志物的特异性和定量检测的试剂，以及关于使用这些试剂的说明书，和任选地分析得到的数据的方法。可用于组合试剂盒的结果和其它测定法的结果以提供无排斥截止指标或受试者排斥状态的诊断对照的说明书或其它信息，也可以提供在试剂盒中。
因此，本发明的某些方面的一个优点是，提供了诊断慢性同种异体移植物排斥的方法，无需被移植的组织或器官的活组织检查。
本发明概要不一定描述了本发明的所有特征。本领域普通技术人员在阅读本发明的具体实施方案的以下描述后，会明白本发明的其它方面、特征和优点。
附图说明
从下面的描述更容易明白本发明的这些和其它特征，在描述中参考了附图，其中：
图1.10个基因的生物标志物集合用于区分慢性排斥(n＝7)(实心菱形)和稳定的受试者(n＝6)(实心圆形)。用于该生物标志物集合的基因的列表包括：胆碱磷酸转移酶1、核糖体蛋白S26、鸟苷酸结合蛋白3、杀伤细胞凝集素样受体亚家族C、成员1、锌指、含有2的CCHC结构域、242907_at、C-型凝集素结构域家族2、成员B、丙酮酸脱氢酶激酶、同工酶4、氧化固醇结合蛋白2、干扰素诱导的含有tetratricopeptide重复序列5的蛋白。
图2.使用LDA将图1中鉴别的生物标志物集合应用于31个样品，以评价该集合的分类值。83％的通过上述方法鉴别出的具有慢性排斥的受试者(实线)被正确分类。91％的稳定受试者(点画线)被正确分类。
图3显示了提议的生物标志物NKG2C、NKGWa、PDK4和CHPT1之间的关系。
图4显示了基于106个探针集合(与106个基因相对应)的热图(heatmap)，FDR＜10％。
图5显示了基于14个差别表达的蛋白组的热图(p-值＜0.05)。沿着热图的右侧列出了蛋白组代码。慢性样品(灰色条)-最左侧的7个柱(1-7)；稳定样品(黑色条)-最右侧的6个柱(8-13)。
图6显示了基于使用基因组、蛋白质组和组合的生物标志物集合对12个实验队列样品分类的结果的Striplot。已经将所有3个分类器(对于基因组、蛋白质组和组合的分类器分别是‘HP4’、‘H4’和‘组合的”)的线性判别(LD)变量的值重新定中心位，以将分类截止线校正为0。显示了训练集合中的CR(空心星形)和S(实心星形)样品的LD变量值的中心(或分类器‘评分’)。实心圆形和实心正方形分别对应着实验队列中的每个S和CR样品的LD变量/分类器评分。
图7A-T显示了在表6中列出的可用于诊断慢性心脏同种异体移植物排斥的核酸标志物的靶序列(SEQ ID NO：1-10，37-46)。
图8A-R显示了在表8中列出的可用于诊断慢性心脏同种异体移植物排斥的蛋白质组标志物的氨基酸序列(SEQ ID NO：11-12，14-17，21-23，25，27-28和31-36)。
图9显示了根据本发明的某些实施方案在iTRAQ测定中鉴别出的示例性的肽。该列表另外包括它们的指定的蛋白组代码和SEQ ID NO：47-421。
具体实施方式
在下面的描述中，广义地使用许多术语，提供下面的定义，以便于理解本发明的不同方面。实例在说明书中的使用(包括术语的实例)，仅用于解释目的，且无意限制本文中本发明的实施方案的范围和含义。数值范围包括界定该范围的数字在内。在说明书中，词语“包含(comprising)”作为开放式术语使用，基本上等同于短语“包括、但不限于”，且词语“包含(comprises)”具有对应的含义。
本发明提供了诊断已经接受组织或器官同种异体移植物、尤其是心脏同种异体移植物的受试者的排斥的方法。
本发明提供了与受试者中同种异体移植物排斥的评估、预测或诊断有关的基因组、核酸、蛋白质组表达图谱或基因组和蛋白质组表达图谱的组合。尽管基因组或蛋白质组表达图谱中的几个元件可能单个地是现有技术已知的，但基因组或蛋白质组标志物的特定集合的改变的表达水平(与对照相比升高或降低)的特定组合，包含可用于评估、预测或诊断受试者的同种异体移植物排斥的新颖组合。
同种异体移植物是在相同物种的2个遗传上不同的受试者之间移植的器官或组织。接受同种异体移植物的受试者是“受体”，而提供同种异体移植物的受试者是“供体”。组织或器官同种异体移植物可以替代性地称作“移植物(transplant)”、“移植物(graft)”、“同种异体移植物”、“供体组织”或“供体器官”或类似的术语。不同物种的2个受试者之间的移植物是异种移植物。
受试者可能呈现文献中熟知的许多症状或临床变量，但是它们自身都不能预测或诊断同种异体移植物排斥。除了同种异体移植物的活组织检查以外，众多临床变量可以用于评估具有或疑似具有同种异体移植物排斥的受试者。从这些临床变量得到的信息然后由临床医师、医师、兽医师或临床场合的其它从业人员用于确定是否发生排斥和它的进展速度的尝试中，以允许修改受试者的免疫抑制药物疗法。在表2中描述了临床变量的实例。
临床变量(任选地伴有活组织检查)尽管目前是临床医师在主流医疗实践中可利用的唯一实用工具，但是并非总能清楚地区分CR(慢性排斥者)和NR(无排斥者，稳定的或对照)受试者。尽管极端的受试者可以正确地被归类为CR或NR，但大量的受试者落入中间范围，且他们的状态不明。这没有否认临床变量在评估同种异体移植物排斥中的价值，但是相反地指出当在没有其它方法的情况下使用时它们的局限性。
表2：可能用于评估同种异体移植物排斥的临床变量
Figure BPA00001257880100121
  细胞毒性峰值水平   全部
  细胞毒性峰值日期   全部
  冲洗溶液   全部   在移植中使用的冲洗溶液类型
  冷却时间1   全部
  冷却时间2   全部
  重新温热时间1   全部
  重新温热时间2   全部
  HTLV 1   全部
  HTLV 2   全部
  HCV RNA   全部
  24小时尿   全部   24小时尿排出量
  收缩压   全部   血压读数
  舒张压   全部   血压读数
  24小时尿   全部   24小时尿
  钠   全部   血检验
  钾   全部   血检验
  氯化物   全部   血检验
  总CO2   全部   血检验
  白蛋白   全部   血检验
  蛋白   全部   血检验
  钙   全部   血检验
  无机磷酸盐   全部   血检验
  镁   全部   血检验
  尿酸   全部   血检验
  葡萄糖   全部   血检验
  血红蛋白AlC   全部   血检验
  CPK   全部   血检验
  副甲状腺激素   全部   血检验
  高半胱氨酸   全部   血检验
  尿蛋白   全部   尿检验
  肌酸酐   全部   血检验
  BUN   全部   血检验
  血红蛋白   全部   血检验
  血小板计数   全部   血检验
  白细胞计数   全部   血检验
  凝血酶原时间   全部   血检验
  部分凝血激酶时间   全部   血检验
  INR   全部   血检验
  γGT   全部   血检验
  AST   全部   血检验
  碱性磷酸酶   全部   血检验
  淀粉酶   全部   血检验
  总胆红素   全部   血检验
  直接胆红素   全部   血检验
  LDH   全部   血检验
  ALT   全部   血检验
  甘油三酯   全部   血检验
  胆固醇   全部   血检验
  HDL胆固醇   全部   血检验
  LDL胆固醇   全部   血检验
  FEV1   全部   肺功能检查
  FVC   全部   肺功能检查
  总铁蛋白   全部   血检验
  TIBC   全部   血检验
  转铁蛋白饱和的   全部   血检验
  铁蛋白   全部   血检验
  血管造影术   心脏   心功能试验
  血管内超声   心脏   心功能试验
  多巴酚丁胺负荷超声心动图   心脏   心功能试验
  环孢菌素WB   全部   免疫抑制水平
  环孢菌素2hr   全部   免疫抑制水平
  他罗利姆WB   全部   免疫抑制水平
  西罗莫司WB   全部   免疫抑制日总剂量
  甲泼尼龙的水溶性酯   全部   免疫抑制日总剂量
  泼尼松   全部   免疫抑制日总剂量
  泼尼松ALT   全部   免疫抑制日总剂量
  他罗利姆   全部   免疫抑制日总剂量
  环孢菌素   全部   免疫抑制日总剂量
  依木兰   全部   免疫抑制日总剂量
  麦考酚酸莫酯   全部   免疫抑制日总剂量
  西罗莫司   全部   免疫抑制日总剂量
  OKT3   全部   免疫抑制日总剂量
  ATG   全部   免疫抑制日总剂量
  ALG   全部   免疫抑制日总剂量
  巴利昔单抗   全部   免疫抑制日总剂量
  达珠单抗   全部   免疫抑制日总剂量
Figure BPA00001257880100151
在本领域考虑到同种异体移植物排斥预测、诊断和评估的多因素性质，排除了甚至满足同种异体移植物排斥的预测、诊断或评估需求之一的单一生物标志物的可能性。包含多个标志物的策略可以考虑该多因素性质。或者，可以与侵入性更低的临床变量(例如不需要活组织检查)组合地评估多个标志物，以适应受试者中同种异体移植物排斥的预测、诊断和/或评估。
不管用于预测、诊断和评估同种异体移植物排斥的方法，越早越好——从保持器官或组织功能和预防更多全身性有害效应的观点看。不能“治愈”同种异体移植物排斥，只能使受试者维持在适当地免疫抑制的状态，或在某些情况下，如果排斥已经过快发展或太严重而难以用免疫抑制药干预治疗进行矫正，则更换器官。
将多个数学的和/或统计分析的方法应用于蛋白或多肽数据集、代谢物浓度数据集或核酸表达数据集，可以指示重要的标志物的不同子集，导致关于哪种方法是“最好”或“更精确”的不确定性。不论数学，根本的生物学在数据集中是相同的。通过将多个数学的和/或统计的方法应用于微阵列数据集，并评估对于共同标志物各自的统计上显著的子集，可以减少不确定性，且可以鉴别标志物的临床上有关的核心组。
“标志物”、“生物学标志物”或“生物标志物”可以互换地使用，泛指生物样品中可检测的(和在某些情况下可定量的)分子或化合物。在移植同种异体移植物之后，受试者中的标志物可能下调(降低)、上调(升高)或实际上不变。标志物可以包括：核酸(DNA或RNA)、基因或转录物或转录物的一部分或片段，它们称作“基因组”标志物(或者称作“核酸标志物”)；多肽、肽、蛋白或它们的前体或同种型或其片段或部分，它们称作“蛋白质组”标志物；或选定的分子、它们的前体、中间体或分解产物(例如脂肪酸、氨基酸、糖、激素或其片段或亚基)(“代谢物标志物”或“代谢组标志物”)。蛋白质组标志物可以是由基因编码的多肽。在某些用法中，这些术语可以是指特定蛋白、肽、核酸或多核苷酸或代谢物的水平或数量(以绝对术语或相对于另一样品或标准值表示)，或受试者的生物样品中2种蛋白、多核苷酸、肽或代谢物的水平之间的比例。可以将水平表示为：浓度，例如微克/毫升；在特定光波长的比色强度，例如0.0是透明，且1.0是不透明，其中实验样品相应地排列，并接受基于特定波长的光的透射或吸收的数字评分；或与用于定量标志物的其它方式有关，例如本领域已知的。在某些实例中，可以将比例表示为无单位的值。“标志物”也可以是指比例或减去基线值以后的净值。标志物也可以表示为“变化倍数”，有或没有方向性指标(升高或降低/上或下)。标志物的表达的升高或降低也可以称作“下调”或“上调”或响应于刺激、生理事件或受试者病症的升高或降低的类似指标。标志物可以存在于第一种生物样品中，且在第二种生物样品中不存在；或者，标志物可以存在于二者中，二者之间存在统计上显著的差异。生物样品中标志物的存在与否或相对水平的表示，可以取决于用于定量或评估该标志物的检测法的性质，并且这样的表示方式是本领域技术人员熟悉的。
当排斥同种异体移植物的受试者中的表达水平显著不同于受试者或从无排斥受试者采取的样品的表达水平时，可以将标志物描述为差别化表达的。与正常或对照样品的表达水平相比，差别化表达的标志物可以过表达或低表达。
“图谱”是一种或多种标志物和它们的存在与否、相对水平或丰度(相对于一种或多种对照)的集合。例如，代谢物图谱是代谢标志物的存在与否、相对水平或丰度的数据集。蛋白质组图谱是蛋白质组标志物的存在与否、相对水平或丰度的数据集。基因组或核酸图谱是表达的核酸(例如转录物、mRNA、EST等)的存在与否、相对水平或丰度的数据集。图谱可以替代性地称作表达图谱。
通过本领域已知的几种测量基因产物或转录物的存在和/或相对丰度的方法中的任一种，可以测定生物样品中的标志物的升高或降低或定量。可以将标志物的水平测定为绝对值，或相对于基线值，和相对于截止指标(例如无排斥截止指标)的受试者标志物水平。或者，可以相对于对照，测定一种或几种标志物的相对丰度。对照可以是临床上正常的受试者(例如尚未接受同种异体移植物的受试者)，或可以是以前尚未表现出排斥的同种异体移植物受体。
在某些实施方案中，对照可以是自体对照，例如在接受同种异体移植物移植之前从该受试者得到的样品或图谱。在某些实施方案中，可以将在一个或多个时间点(移植之前、之后，或之前和之后)得到的图谱与以前从相同受试者得到的一种或超过一种图谱进行对比。通过随着时间从相同受试者重复采取相同的生物样品，可以提供组成图谱，它会解释随着时间的标志物水平或表达。也可以从受试者得到连续的样品，并得到各自的图谱，以随着时间跟踪一种或多种标志物的升高或降低的进程，例如，可以在移植之前采取一种或多种起始样品，每周、每2周、每月、每2个月或以其它合适的间隔采取后续样品，并与以前采取的样品的图谱进行对比。也可以在施用药物(例如免疫抑制药)疗程之前、过程中和之后，采取样品。
可以用于检测和/或定量特定标志物或标志物集合的技术、方法、工具、算法、试剂和测定法的其它必要方面是各种各样的。重要的不是用于检测标志物或标志物集合的具体方法如此之多，而是检测哪种标志物。如在文献中所反映的，巨大的变动是可能的。一旦鉴别出要检测或定量的标志物或标志物集合，只要提供适当的试剂，几种技术中的任一种都可以很好地适用。当提供了要鉴别的标志物集合时，本领域技术人员能选择适当的测定法(例如，基于PCR的或基于微阵列的测定法(对于核酸标志物)，ELISA、蛋白或抗体微阵列或类似的免疫测定法，或在某些实例中，使用基于iTRAQ、iCAT或SELDI蛋白质组质谱的方法)来执行本文公开的方法。
本发明提供了与受试者中同种异体移植物排斥的评估、预测或诊断有关的核酸表达图谱和蛋白质组表达图谱。尽管基因组或蛋白质组表达图谱中的几个元件可能单个地是现有技术已知的，基因组或蛋白质组标志物的特定集合的改变的表达水平(与对照相比升高或降低)的特定组合，包含可用于评估、预测或诊断受试者的同种异体移植物排斥的新颖组合。
例如，通过许多方法或测定法中的任一种，可以完成核酸的检测或测定，和在某些情况下定量，所述方法或测定法采用本领域已知的重组DNA技术，包括但不限于，序列特异性的杂交、聚合酶链式反应(PCR)、RT-PCR、微阵列等。这样的测定法可以包括序列特异性的杂交、引物延伸或侵入切割。此外，存在许多用于分析/检测每类反应的产物的方法(例如，荧光、发光、质量测量、电泳等)。此外，反应可以发生于溶液中或在固体载体(例如载玻片、芯片、珠子等)上。
设计和选择用于微阵列或生物芯片中的探针的方法，或选择或设计用于基于PCR的测定中的引物的方法，是本领域已知的。一旦鉴别出一种或多种标志物，并测定了核酸的序列，例如，通过查询包含这样的序列的数据库，或通过具有提供的适当序列(例如，本文提供的序列表)，本领域技术人员能够使用这些信息来选择适当的探针或引物并执行选定的测定。
阐述本领域技术人员已知的重组DNA技术的一般原理的标准参考文献包括，例如：Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York(1998和增刊至2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York(1989)；Kaufman等人编，Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine，CRC Press，Boca Raton(1995)；McPherson，编，Directed Mutagenesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford(1991)。
通过本领域已知的多种方法，可以特异性地鉴别和/或定量蛋白、蛋白复合物或蛋白质组标志物，且可以单独地或组合地使用。基于免疫学的或抗体的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白印迹、免疫荧光、微阵列、一些色谱技术(即免疫亲和色谱法)、流式细胞术、免疫沉淀等。这些方法是基于一种或多种抗体对特定表位或表位组合的特异性，所述表位与目标蛋白或蛋白复合物有关。非免疫学方法包括基于蛋白或蛋白复合物自身的物理特征的方法。这些方法的实例包括电泳、一些色谱技术(例如高效液相色谱法(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、亲和色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法等)、质谱法、测序、蛋白酶消化等。这些方法是基于质量、电荷、疏水性或亲水性，其源自蛋白或蛋白复合物的氨基酸补体和氨基酸的具体序列。采用质谱法的方法的实例包括，在例如PCT公开WO 2004/019000、WO 2000/00208、US 6670194中所述的那些。可以组合免疫学和非免疫学方法来鉴别或表征蛋白或蛋白复合物。此外，存在许多用于分析/检测每类反应的产物的方法(例如，荧光、发光、质量测量、电泳等)。此外，反应可以发生于溶液中或在固体载体(例如载玻片、芯片、珠子等)上。
生产用于蛋白或抗体阵列或其它基于免疫学的测定法中的抗体的方法是本领域已知的。一旦鉴别出一种或多种标志物并鉴别了蛋白或多肽的氨基酸序列，无论是通过查询数据库，还是通过具有提供的适当序列(例如，本文提供的序列表)，本领域技术人员能够使用这些信息来制备一种或多种适当的抗体并执行选定的测定。
关于针对生物标志物的单克隆抗体的制备，可以使用通过培养中的连续细胞系生产抗体分子的任意技术。这样的技术包括、但不限于，最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)开发的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术(Gustafsson等人，1991，Hum.Antibodies Hybridomas 2：26-32)、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today 4：72)和生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等人，1985，见：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。可以使用人抗体，且可以通过使用人杂交瘤获得(Cote等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)或通过用EBV病毒体外转化人B细胞来获得(Cole等人，1985，见：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，页77-96)。可以使用为生产“嵌合抗体”开发的技术(Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Neuberger等人，1984，Nature 312：604-608；Takeda等人，1985，Nature 314：452-454)，其中将对生物标志物特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接到一起；这样的抗体是在本发明的范围内。可以改进关于单链抗体的生产所述的技术(美国专利4,946,778)，以生产生物标志物特异性的抗体。本发明的另一个实施方案利用关于Fab表达文库的构建所述的技术(Huse等人，1989，Science 246：1275-1281)，以允许快速且容易地鉴别对生物标志物蛋白具有希望的特异性的单克隆Fab片段。通过已知的方法(例如，美国专利号5,225,539)可以将非人抗体“人源化”。
通过本领域已知的技术，可以产生含有生物标志物的独特型的抗体片段。例如，这样的片段包括、但不限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段；可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥产生的Fab′片段；可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段；和Fv片段。合成的抗体，例如，通过化学合成产生的抗体，可用于本发明中。
本文所述的和相关领域的技术人员已知的标准参考文献描述了免疫学和非免疫学技术、它们对于特定样品类型、抗体、蛋白或分析的适应性。阐述本领域技术人员已知的免疫学一般原理和采用免疫学方法的测定的标准参考文献包括，例如：Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1999)；Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York；Coligan等人编.Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York，NY(1992-2006)；和Roitt等人.，Immunology，第3版，Mosby-Year Book Europe Limited，London(1993)。
阐述本领域技术人员已知的肽合成技术的一般原理和方法的标准参考文献包括，例如：Chan等人.，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2005；Peptide and Protein Drug Analysis，Reid，R.，Marcel Dekker编，Inc.，2000；Epitope Mapping，Westwood等人编，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000；Sambrook等人.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY 2001；和Ausubel等人.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons，NY，1994)。
受试者的排斥状态可以描述为“慢性排斥者”(CR)或“无排斥者”(NR)或“稳定的”(S)，且可以通过将标志物的浓度与无排斥者截止指标的浓度进行对比来确定。“无排斥者截止指标”是数值或评分，当超过它或在它之外时，将受试者归类为具有CR排斥状态。无排斥者截止指标可以替代性地称作“对照值”、“对照指标”或简称为“对照”。无排斥者截止指标可以是对照受试者群体中的单个标志物的浓度，且可以为测量的每种标志物单独考虑；或者，元排斥者截止指标可以是标志物浓度的组合，并与为诊断提供的受试者样品中的标志物浓度的组合进行对比。对照受试者群体可以是正常的或健康的对照群体，或可以是尚未或不会排斥同种异体移植物的同种异体移植物受体群体。对照可以是单个受试者，且对于某些实施方案，可以是自体对照。对照或对照组可以是恒定的，例如由静态值表示，或可以是累积的，因为用于获得它的样品群体可能随部位或时间不同而变化，并结合额外的数据点。例如，中央数据储存库，例如集中的健康护理信息系统，可以接收和储存在不同地方(医院，临床实验室等)得到的数据，并提供该累积数据集，在单个医院、社区诊所用于本发明的方法，由终端用户(即单个医学从业人员，医务所或中心等)获取。
无排斥者截止指标可以替代性地称作“对照值”、“对照指标”或简称为“对照”。在某些实施方案中，截止指标可以进一步表征为代谢物截止指标(对于受试者的代谢物图谱)、基因组截止指标(对于受试者的基因组表达图谱)、蛋白质组截止指标(对于受试者的蛋白质组图谱)等。
“生物样品”泛指来自受试者的体液或组织或器官样品。例如，生物样品可以是体液，例如血液、血浆、淋巴液、血清、尿或唾液。可以消化、提取组织或器官样品(例如非液体组织样品)，或另外转化成液体形式——这样的组织或器官的实例包括培养的细胞、血细胞、皮肤、肝、心脏、肾、胰腺、胰岛、骨髓、血液、血管、心脏瓣膜、肺、肠(intestine)、肠(bowel)、脾、膀胱、阴茎、脸、手、骨、肌肉、脂肪、角膜等。可以在任意一次收集多个生物样品。可以在任意时间从受试者采取一种或多种生物样品，包括在同种异体移植物移植之前，在移植时或在移植后的任意时间。生物样品可以包含单链或双链形式的核酸，例如脱氧核糖核酸或核糖核酸或其组合。当从供体取出器官时，可以保留供体的脾或它的一部分作为生物样品，用于从它得到供体T-细胞。当从活供体取出器官时，可以采取血液样品，从它得到供体T-细胞。利用它们与同种异体移植物的抗原(包括MHC复合物)的特异性相互作用，可以分离同种异体反应性的T-细胞。能实现同种异体反应性的T-细胞的特异性分离的方法描述在例如PCT公开WO 2005/05721中，其通过引用并入本文。
淋巴细胞是有核的或淋巴系干细胞起源的“白”血细胞(白细胞)。淋巴细胞包括T-细胞、B-细胞天然杀伤细胞等和其它免疫调节细胞。“T-细胞”是一类负责细胞介导的免疫和刺激B-细胞的淋巴细胞。受刺激的B-细胞生成特定抗原的抗体。B-细胞和T-细胞的功能是识别受试者中的非自身抗原。非自身抗原包括病毒、细菌和其它传染物以及同种异体移植物的抗原。
同种异体反应性的T-细胞是响应于同种抗原而激活的T-细胞。与异种抗原反应的T-细胞是异种反应性的T-细胞。异种抗原是来自其它物种或物种的组织的抗原(例如异种移植物)。同种异体反应性的T细胞是移植物排斥免疫应答的前线。它们是外周血单核细胞(PBMC)的子集(～0.1-1％)，其识别在外来移植物上存在的同种异基因抗原。它们可以浸润外来移植物，以启动一系列的抗-移植物免疫应答，这些应答如果不受到抑制，会导致移植物的排斥和衰竭。因此，与标志物的其它来源相比，同种异体反应性的T细胞会提供特异性，或可以起区分器官排斥阶段的标志物的补充来源的作用。
术语“受试者”或“患者”泛指哺乳动物和其它动物，包括人和其它灵长动物、宠物、动物园和耕作动物，包括，但不限于，猫、狗、啮齿动物、大鼠、小鼠、仓鼠、兔子、马、牛、绵羊、猪、山羊、家禽等。受试者包括要检验的受试者，或已经为同种异体移植物排斥的预测、评估或诊断检验过的受试者。受试者以前可能已经使用其它方法评估或诊断过，例如本文所述的方法或目前在临床实践中的方法，或可能被选择作为一般群体(对照受试者)的一部分。
与对照相比，受试者中标志物的变化倍数可以是至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或更多，或其间的任意数量。变化倍数可以代表与对照值相比降低或升高。
一个或超过一个包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多。
“下调(down-regulation)”或“下调(down-regulated)”可以互换地使用，是指标志物(例如基因、核酸、代谢物、转录物、蛋白或多肽)的水平的降低。“上调(up-regulation)”或“上调(up-regulated)”可以互换地使用，是指标志物(例如基因、核酸、代谢物、转录物、蛋白或多肽)的水平的升高。另外，可以上调或下调诸如信号转导或代谢途径等途径。
一旦通过任意方法(基因组、蛋白质组或其组合)将受试者鉴别为慢性排斥者或处于变成慢性排斥者的风险中，可以应用治疗措施，以改变受试者对同种异体移植物的免疫应答。受试者可以更频繁地接受临床值的其它监视，或使用更灵敏的监视方法。另外，可以给受试者施用免疫抑制药物，以降低或增强受试者的免疫应答。尽管需要抑制受试者的免疫应答来预防同种异体移植物的排斥，也需要适当水平的免疫功能来保护免于机会性感染。可以施用给受试者的不同的药物是已知的；参见例如，Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics第11版.第52章，1405-1431页和其中的参考文献；LL Brunton，JS Lazo，KL Parker编。阐述本领域技术人员已知的医学生理学和药理学的一般原理的标准参考文献包括：Fauci等人，编，Harrison′s Principles Of Internal Medicine，第14版，McGraw-Hill Companies，Inc.(1998)。其它预防性和治疗性策略综述在医学文献中——参见，例如Kobashigawa等人2006.Nature Clinical Practice.Cardiovascular Medicine 3：203-21。
因此，本发明另外提供了如本发明所提供的预测、评估或诊断受试者的同种异体移植物排斥的方法，其包含：1)测量一种或超过一种标志物的升高或降低，所述标志物选自CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5；和2)测定受试者的“排斥状态”，其中受试者的“排斥状态”的测定是基于受试者的标志物表达图谱与对照标志物表达图谱的对比。
基因组核酸表达图谱
如本发明提供的诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的方法包含：1)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种标志物的表达图谱，所述标志物选自CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5；2)将一种或超过一种标志物的表达图谱与无排斥者对照图谱进行对比；和3)测定一种或超过一种标志物的表达水平是否相对于对照图谱上调或下调，其中一种或超过一种标志物的上调或下调是排斥状态的指示。
使用基因组学方法，鉴别出了在7个慢性排斥(CR)和6个无慢性排斥/稳定(S)样品之间差别化表达(FDR＜10％)的106个基因。基于更严格的统计截止(FDR＜5％和变化倍数＞2)，进一步鉴别出这些基因中的10个，作为生物标志物集合。使用线性判别分析对该基因组生物标志物集合进行的内部验证表明，10个基因一起，能够以83％的灵敏度和特异性对12个新的“实验”样品进行分类。
本文使用的短语“基因表达数据”、“基因表达图谱”或“标志物表达图谱”是指，关于生物样品中的基因或基因集合的表达的相对或绝对水平的信息。基于该基因编码的RNA(例如mRNA)的水平，可以测定基因的表达水平。或者，基于该基因编码的多肽或其片段的水平，可以测定表达水平。
本文使用的“多核苷酸”、“寡核苷酸”或“核苷酸聚合物”可以包括合成的或混合的核酸聚合物，包括RNA、DNA或RNA和DNA二者，正义链和反义链二者，且可以被化学地或生化地修饰，或可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员会容易地明白的。这样的修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物置换一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨甲酸酯等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如，多肽)和修饰的连接(例如，α异头的多核苷酸等)。还包括在通过氢键合和其它化学相互作用结合指定的序列的能力方面模仿多核苷酸的合成分子。
寡核苷酸包括不同长度的核酸，它们可以用作探针、引物，并在微阵列(阵列)的生产中，用于检测和/或扩增特定的核酸。寡核苷酸可以包含DNA、RNA、PNA或在例如US 5,948,902中所述的其它多核苷酸部分。通过依次添加(5’-3’或3’-5’)激活的单体到生长链(其可以连接至不溶性载体)上，可以合成这样的DNA、RNA或寡核苷酸链。本领域已知许多合成寡核苷酸的方法，所述寡核苷酸用于随后的单独使用或作为不溶性载体的一部分，例如用于阵列中(Bernfield MR.和Rottman FM.J.Biol.Chem.(1967)242(18)：4134-43；Sulston J.等人.PNAS(1968)60(2)：409-415；Gillam S.等人.Nucleic Acid Res.(1975)2(5)：613-624；Bonora GM.等人.Nucleic Acid Res.(1990)18(11)：3155-9；Lashkari DA.等人.PNAS(1995)92(17)：7912-5；McGall G.等人.PNAS(1996)93(24)：13555-60；Alber TJ.等人.Nucleic Acid Res.(2003)31(7)：e35；Gao X.等人.Biopolymers(2004)73(5)：579-96；和Moorcroft MJ.等人.Nucleic Acid Res.(2005)33(8)：e75)。一般而言，取决于使用的方法，在多种条件下，通过逐步添加激活的和受保护的单体合成寡核苷酸。随后，可以去除特异性的保护基以实现进一步延伸，且随后，一旦结束合成，可以去除所有保护基，如果需要，将寡核苷酸从它们的固体载体上取下，以纯化完整链。
“基因”是位于特定染色体上的特定位置中的核苷酸的有序序列，其编码特定的功能产物，且可以包括在编码区附近(编码序列的5’和3’)的不翻译和不转录序列。这样的非编码序列可以含有序列的转录和翻译或内含子的剪接所需的调节序列，例如，或还可以具有除了发生目标突变之外的归因于它们的任意功能。基因也可以包括一个或多个启动子、增强子、转录因子结合位点、终止信号或其它调节元件。基因或转录物可以包含核酸。
术语“微阵列”、“阵列”或“芯片”是指多个确定的核酸探针，它们在确定的位置偶联到基质表面上。所述基质优选地是固体。本领域已经普遍地描述了微阵列，见例如，美国专利号5,143,854(Pirrung)、5,424,186(Fodor)、5,445,934(Fodor)、5,677,195(Winkler)、5,744,305(Fodor)、5,800,992(Fodor)、6,040,193(Winkler)和Fodor等人1991.Science，251：767-777。这些参考文献中的每一篇通过引用整体并入本文。
“杂交”包括这样的反应，其中一种或多种多核苷酸和/或寡核苷酸以有序方式(序列特异性的)相互作用，形成通过氢键合(也称作“Watson-Crick”碱基配对)稳定化的复合物。通过非经典的氢键合，包括Hoogsteen碱基配对，也可能发生不同的碱基配对。在某些热力学的、离子的或pH条件下，三重螺旋可能产生，特别是与核糖核酸。这些和其它不同的氢键合或碱基配对是本领域已知的，且可以参见，例如，Lehninger-Principles of Biochemistry，第3版(Nelson和Cox，编.Worth Publishers，New York.)，其通过引用并入本文。
杂交反应可以在不同“严格性”的条件下进行。杂交反应的严格性包括任意2个核酸分子彼此杂交的难度。可以提高严格性，例如，通过升高进行杂交的温度，通过降低进行杂交的离子浓度，或其组合。在严格的条件下，彼此具有至少60％、65％、70％、75％或更高同一性的核酸分子保持彼此杂交，而具有低同一性百分比的分子不能保持杂交。严格的杂交条件的一个实例是，在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约44-45℃杂交，然后在50℃、55℃、60℃、65℃或其间的温度、在0.2xSSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
2个核酸之间的杂交可以以反平行构型进行——这称作“退火”，且配对的核酸描述为互补的。如果在第一个多核苷酸的一条链和第二个多核苷酸的一条链之间可以发生杂交，则双链多核苷酸可能是“互补的”。一条多核苷酸与另一条多核苷酸的互补程度称作同源性，且根据普遍接受的碱基配对规则，在预期彼此氢键合的相对链中的碱基比例方面是可定量的。
一般而言，序列特异性的杂交包含杂交探针，其能与确定的序列特异性地杂交。这样的探针可以设计为区分相差仅一个或几个核苷酸的序列，从而提供高度特异性。偶联检测和序列辨别的策略是使用“分子信标”，其中杂交探针(分子信标)具有3′和5′报道分子和猝灭剂分子和互补的3′和5′序列，使得不存在插入序列的适当结合靶物，探针将形成发夹环。发夹环使报道分子和猝灭剂紧密靠近，导致荧光体(报道分子)的猝灭，这会减少荧光发射。但是，当分子信标与靶物杂交时，荧光体和猝灭剂充分分开，以允许从荧光体发射荧光。
在杂交中使用的探针可以包括双链DNA、单链DNA和RNA寡核苷酸和肽核酸。在本领域描述了用于鉴别与特定探针杂交的标志物的杂交条件和方法——参见，例如，Brown，T.“Hybridization Analysis of DNA Blots”见Current Protocols in Molecular Biology.FM Ausubel等人编.Wiley&Sons，2003.doi：10.1002/0471142727.mb0210s21。根据本发明使用的合适的杂交探针包括寡核苷酸、多核苷酸或修饰的核酸，其长度为约10至约400个核苷酸，或者约20至约200个核苷酸或约30至约100个核苷酸。
通过与引物或探针杂交，并随后检测该杂交，可以鉴别特定序列。
“引物”包括短的多核苷酸，通常具有游离3′-OH基团，其通过与靶物杂交而结合目标样品中存在的靶物或“模板”，此后促进与靶物互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应”(PCR)是这样的反应，其中使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或”引物集合”、和聚合催化剂(例如DNA聚合酶和典型地热稳定的聚合酶)，用目标多核苷酸制备复制拷贝。PCR方法是本领域熟知的，且教导在，例如，Beverly，SM.Enzymatic Amplification of RNA by PCR(RT-PCR)in Current Protocols in Molecular Biology.FM Ausubel等人，编.Wiley&Sons，2003.doi：10.1002/0471142727.mb1505s56。复制拷贝的合成可以包括，具有标记或标签(例如，荧光分子、生物素或放射性分子)的核苷酸的掺入。使用常规方法，通过这些标签，可以随后检测复制拷贝。
引物也可以用作杂交反应(例如Southern或Northern印迹分析)中的探针(参见，例如，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
本文使用的“探针集合”(或“引物集合”)是指一组寡核苷酸，其可以用于检测一种或多种表达的核酸或表达的基因。检测可以例如，通过扩增(如在PCR和RT-PCR中)，或通过杂交(如在微阵列上)，或通过选择性破坏和保护(如在基于单链或双链核酸的选择性酶降解的测定中)。可以用一种或多种荧光的、放射性的或其它可检测的部分(包括酶)标记探针集合中的探针。探针可以是任意大小，只要探针足够大，能够选择性地检测想要的基因——通常从约15个至约25个或至约30个核苷酸的大小是足够的大小。探针集合可以在溶液中，例如用于多路PCR。或者，探针集合可以结合在固体表面，如在阵列或微阵列中。
在本发明的某些实施方案中提供了探针集合，其用于检测由基因组标志物集合表达的核酸，所述基因组标志物集合包含CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5中的一个或多个。这样的探针集合可以用于测定受试者的排斥状态。探针集合可以包含一个或多个引物对，其用于特异性地扩增(例如PCR或RT-PCR)与CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5中的一个或多个相对应的核酸序列。在本发明的另一个实施方案中，探针集合是微阵列的一部分。
应当理解，许多用于序列辨别和检测的其它方法是本领域已知的，下面进一步详细描述了其中的一些。还应当理解，诸如阵列化的引物延伸微型测序、标签微阵列和序列特异性的延伸等反应，可以在微阵列上进行。一种这样的基于阵列的基因分型平台是基于微球的Tag-it高通量阵列(Bortolin S.等人2004 Clinical Chemistry 50：2028-36)。该方法通过PCR，然后用一般标记的引物进行序列特异性的引物延伸来扩增基因组DNA。然后在Tag-It阵列上分选产物，并使用Luminex xMAP系统检测。
本领域技术人员会明白，序列内核苷酸的任意数字编号都与特定序列有关。同样，根据给序列编号的方式和选择的序列，可以给同一位置分配不同的数字编号。此外，序列突变(例如插入或缺失)可能改变相对位置，并从而改变在突变位点处和附近的特定核苷酸的数字编号。例如，由登录号CH471094.1、AC007068.17、AC91814.10、AY142147.1、BC005254.1、AB015628.1、AL550908.3、BG503026.1、BG540007.1、BG779377.1、X96719.1、DQ892509.2、DQ895723.2表示的序列都代表人CLEC2B核苷酸序列，但是它们之间可能具有一些序列差异和编号差异。作为另一个实例，由登录号NP_005118.2、EAW96127.1、BAA76495.1、BAG36638.1、CAA65480.1、Q92478.2表示的序列都代表人CLEC2B多肽序列，但是它们之间可能具有一些序列差异和编号差异。
当提供了目标基因的一个或多个核酸序列时，选择和/或设计用于特异性地检测任意目标基因(包括任意的上述基因)的表达的探针、引物或探针集合，属于相关领域的技术人员的能力之内。此外，几个探针、引物或探针集合中的任一个，或多个探针、引物或探针集合，可以用于检测目标基因，例如，一个阵列可以包括单个基因转录物的多个探针——本文所述的本发明的方面不限于例证的任何具体探针。
使用核苷酸序列对比程序(对于DNA或RNA序列、或其片段或部分)或氨基酸序列对比程序(对于蛋白、多肽或肽序列、或其片段或部分)，例如在DNASIS中提供的那些(例如，但不限于，使用下述参数：GAP罚分5，顶对角线的数目5，固定的GAP罚分10，k-元组2，浮动缺口10，和窗口大小5)，可以测定序列同一性或序列相似性。但是，用于对比的其它序列比对方法是本领域熟知的，例如Smith&Waterman(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson&Lipman(1988，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444)的算法，和通过这些算法的计算机化执行(例如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)，或通过手工比对和目检。
如果鉴别出了核酸或基因、多肽或目标序列且提供了该序列的一部分或片段(或基因、多肽等的序列)，使用上面例证的程序，可以鉴别出类似的、或基本上类似的其它序列。例如，当构建微阵列或探针序列时，已知序列和位置，使得如果微阵列实验鉴别出“击中”(在特定位置的探针与样品中的一种或多种核酸杂交)，将知道探针的序列(通过微阵列的生产商或制作者，或通过由生产商提供的数据库——例如Affymetrix(人类基因组U133 Plus 2.0阵列的生产商)的NetAffx数据库)。如果没有提供序列来源的同一性，可以通过在基于序列的一个或多个数据库搜索中使用探针序列进行测定。对于通过蛋白质组学测定(例如iTRAQ)鉴别出的肽或肽片段，所述肽或片段的序列可以用于查询如上所述的氨基酸序列数据库。这样的数据库的实例包括由国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information)维持的那些，或由欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)维持的那些。
当它的序列可以与在相同种系发生的物种、属、科或目中发现的其它序列区分开时，可以认为特异性地鉴别出了蛋白或多肽、核酸或其片段或部分。通过序列对比可以鉴别出这样的分化。使用BLAST算法(Altschul等人1009.J.Mol Biol 215：403-410)，可以进行一个或多个序列的对比。BLAST搜索允许将查询序列与特定序列或序列组进行对比，或与更大的序列文库或数据库(例如GenBank或GenPept)进行对比，并且不仅鉴别表现出100％同一性的序列，而且鉴别具有更低程度同一性的那些。例如，关于具有多个同种型(源自例如分开的基因或来自基因的核酸转录物的变体剪接或翻译后加工)的蛋白，当通过特异性地检测在一种同种型中存在且在一种或多种其它同种型中不存在或不可检测的结构、序列或基序，将它与来自相同或不同物种的其它同种型区分开时，可以特异性地鉴别出同种型。
本发明方法的使用，可以由例如执行单个标志物检验的临床实验室或其它检测设备提供给最终用户——将生物样品提供给所述设备，在那里进行单个检验和分析，并应用预测方法；或者，医学从业人员可以从临床实验室接收标志物值，并使用当地的仪器或基于因特网的仪器来使用本发明的预测方法。
统计参数(例如多个中间值、标准误差、标准偏差等)的测定以及本文所述的其它统计分析是已知的，且在相关领域的熟练人员的技能范围内。特定系数、值或指数的使用仅是示例性的，无意对本文公开的本发明的不同方面构成限制。
从例如微阵列实验或复杂的RT-PCR实验得到的庞大基因表达数据库的解释可能是一项艰难的任务，但是通过使用算法和统计工具(其设计为用于以突出系统特征的方式组织数据)，可以得到极大的促进。可视化工具也具有显示差别表达的价值，例如，通过改变颜色的强度和色调(Eisen等人1998.Proc Natl Acad Sci 95：14863-14868)。随着阵列和得到的数据集的复杂性的增加，以及随着处理速度、计算机存储器的提高和它们的成本的相对降低，可利用的算法和统计工具的复杂度已经增加。
基因表达图谱的数学和统计分析可以完成几件事情——在一条途径或生物系统的结构域中表现出协同调节的基因群体的鉴别、两个或多个生物样品之间的相似性和差别的鉴别、区分受试者中的特定事件或过程的基因表达图谱特征的鉴别，等。这可以包括，评估治疗方案的效能或治疗方案中的变化、监视或检测特定病状的发展、区分两种临床上类似的(或几乎相同的)病状等。
聚簇分析方法是已知的，且已经应用于微阵列数据集，例如，分级聚簇分析、自组织图谱、k-工具或确定性退火(Eisen等人，1998 Proc Natl Acad Sci USA 95：14863-14868；Tamayo，P.，等人1999.Proc Natl Acad Sci USA 96：2907-2912；Tavazoie，S.，等人1999.Nat Genet 22：281-285；Alon，U.，等人1999.Proc Natl Acad Sci USA 96：6745-6750)。这样的方法可以用于鉴别表现出协同调节的基因表达图谱中的基因群体，也可以用于鉴别功能未知的新基因，所述基因可能参与与表现出协同调节的其它基因相同的途径或系统。
生物样品中的基因表达模式也可以提供它的功能状态和同一性的特征性的和可接近的分子图像(DeRisi 1997；Cho 1998；Chu 1998；Holstege 1998；Spellman 1998)。因此，具有相关的基因表达模式的两种不同样品可能彼此在生物学上和在功能上类似，反之，表现出显著差异的两个样品，不仅可以通过表现出的复杂表达模式来区分，而且可以指示基因产物或转录物的诊断子集，它们是特定病理状态或其它生理状况(例如同种异体移植物排斥)的指示。
将多个数学和/或统计分析方法应用于微阵列数据集可以指示重要标志物的不同子集，导致关于哪种方法“最好”或“更精确”的不确定性。无论数学，数据集中的根本生物学是相同的。通过将多个数学和/或统计方法应用于微阵列数据集，并评估各自的统计上显著的子集(对于共同标志物至所有)，可以减少不确定性，并鉴别出临床上有关的标志物核心组。
基因组表达图谱标志物(“基因组标志物”)
本发明提供了可用于评估、预测或诊断同种异体移植物排斥(包括慢性同种异体移植物排斥)的标志物核心组，其包含基因组标志物CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5。
在应用于全血CR样品的3个改进的t-检验的至少一个中检测、定量和发现表现出与无排斥移植(NR)对照相比统计上显著的变化倍数的22个基因或转录物(表6)中，10个标志物是在并集中(对于所有3个检验而言是统计上显著的)。在22个的更大集合中，每种标志物的变化倍数是至少2倍，且可以代表目标基因或转录物的升高/上调或降低/下调。
胆碱磷酸转移酶1(CPT，CPT1)基因编码参与脂类代谢且可能调节细胞生长的产物。人CHPT1的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号BC020819、BC050429、NW_001838061和NW_925395)。
C-型凝集素结构域家族2，成员B(CLEC2B，CLECSF2)基因编码C-型凝集素/C-型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。该家族的成员具有共同的蛋白折叠，且具有不同的功能，例如细胞粘附、细胞-细胞信号传递、糖蛋白周转和在炎症和免疫应答中的作用。编码的2类跨膜蛋白可以起细胞激活抗原的功能。人CLEC2B的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号CH471094.1、AC007068.17、AC91814.10、AY142147.1、BC005254.1、AB015628.1、AL550908.3、BG503026.1、BG540007.1、BG779377.1、X96719.1、DQ892509.2、DQ895723.2)。
RPS26(LOC644166/LOC644191/LOC728937/)可以编码与40S核糖体26蛋白类似的核糖体蛋白。与该基因座有关的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号XM001721435.1，AC000134.1)
编码鸟苷酸结合蛋白3(GBP3、DKFZp686E0974、DKFZp686L15228、FLJ10961)的基因编码鸟苷酸结合蛋白家族的成员，且可能与生发中心激酶家族的成员相互作用。人GBP3的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号NW_001838589、NW_921795和NM_018284)。
KLRC1/KLRC2(杀伤细胞凝集素样受体亚家族C，成员1/杀伤细胞凝集素样受体亚家族C，成员2)家族的基因编码优先在NK细胞中表达的跨膜蛋白产物，且可能起NK细胞和某些细胞毒性T-细胞识别MHC I类HLA-E分子的受体的作用。人KLRC1的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_213658、NM_213657、NM_007328、NM_002259，BC012550、NW_001838052和NW_925328)。人KLRC2的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_002260、NW_001838052、NW_925328、BC112039、BC093644和BC106069)。
基因ZCCHC2(锌指，含有2的CCHC结构域)也称作FLJ20281；KIAA1744；MGC13269；DKFZp451A185。人ZCCHC2的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_017742、NW_001838469、NW_927106、NT_025028.13和BC006340)。
PDK4(丙酮酸脱氢酶激酶，同工酶4)的基因是PDK/BCKDK蛋白激酶家族的成员，且编码线粒体蛋白。它通过E1_α亚基的磷酸化抑制线粒体丙酮酸脱氢酶复合物，从而促进葡萄糖代谢的调节。人PDK4的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_002612、NW_001839064、NT_079595、NW_923574和BC040239)。
OSBP2(氧化固醇结合蛋白2)——由该基因编码的膜结合的蛋白含有普列克底物蛋白同源性(PH)结构域和氧固醇结合区。人OSBP2的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_030758、NM_002556、BC118914和AF288742)。
IFIT5的基因产物(干扰素诱导的含有tetratricopeptide重复序列5的蛋白)可能在干扰素调节的信号传递和/或生长中起作用。人IFIT5的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号：NM_012420、BC025786、CR457031、NW_001838005、NW_924884和NT_030059)。
本发明提供了与受试者中同种异体移植物排斥的评估、预测或诊断有关的基因表达图谱。尽管基因表达图谱中的几个元件可能单个地是现有技术已知的，它们的改变的表达水平(与对照相比升高或降低)的特定组合，包含可用于评估、预测或诊断受试者的同种异体移植物排斥的新颖组合。
一旦将受试者鉴别为慢性排斥者或处于变成慢性排斥者的风险中，可以应用治疗措施以改变受试者对同种异体移植物的免疫应答。受试者可以更频繁地接受临床值的其它监视，或使用更灵敏的监视方法。另外，可以给受试者施用免疫抑制药物，以降低或增强受试者的免疫应答。尽管需要抑制受试者的免疫应答来预防同种异体移植物的排斥，也需要适当水平的免疫功能来保护免于机会性感染。可以施用给受试者的不同的药物是已知的；参见例如，Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics第11版.第52章，1405-1431页和其中的参考文献；LL Brunton，JS Lazo，KL Parker编。其它预防性和治疗性策略综述在医学文献中——参见，例如Kobashigawa等人2006.Nature Clinical Practice.Cardiovascular Medicine 3：203-21。
与本发明的生物标志物有关的生物途径
本发明的生物标志物与可能受到免疫过程和受试者对同种异体移植物排斥的应答的特别影响的生物途径有关。不希望受到理论的约束，图3解释了生物标志物KLRC2、KLRC1、PKD4和CHPT1之间的基于途径的关系。
1.NKG2C(KLRC2)→CD94→NKG2A(KLRC1)
2.NKG2C/NKG2A(KLRC2/KLRC1)→SHP1→ESR1→PDK4和CHPT1
3.ESR1→PDK4和CHPT1
因此，KLRC2、KLRC1、PKD4和CHPT1可能在同种异体移植物排斥过程中具有生物作用，且代表治疗靶标。
不希望受到理论的约束，HLA基因/多态性可能影响移植结果(例如排斥，无排斥)。
大规模基因表达分析方法(例如微阵列)已经显示：具有相互作用的基因群体(经常具有两或更多的间隔程度)一起表达，且可能具有共同的调节元件。这样的协同调节的其它实例是本领域已知的，参见，例如，酵母的二峰生长(DiRisi等人1997 Science 278：680-686；Eisen等人1998.Proc Natl Acad Sci 95：14863-14868)。
不希望受到理论的约束，本文所述的其它基因或转录物，例如CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2或IFIT5，可能在同种异体移植物排斥过程中具有生物作用，且代表治疗靶标。
本发明也提供了用于预测或诊断受试者的排斥状态的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于特异性地和定量地检测CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5中的一种或超过一种的试剂，以及关于使用这些试剂的说明书，和分析得到的数据的方法。所述试剂盒可以包含用于特异性地和定量地检测CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5中的一种或超过一种的试剂。所述试剂盒可以单独地用于预测或诊断受试者的排斥状态，或它可以与测定临床变量的其它方法或认为适宜的其它测定法组合地使用。所述试剂盒可以包括，例如，能与标志物选择性地杂交的标记的寡核苷酸。所述试剂盒可以另外包括，例如，能够扩增标志物的区域(例如通过PCR)的寡核苷酸。也可以提供用于将试剂盒的结果与其它测定法的结果进行组合、从而为受试者排斥状态的预测或诊断提供无排斥截止指标的说明书或其它信息。所述试剂盒可以另外包括，用于分离同种异体反应性T-细胞的试剂，和用于分离同种异体反应性细胞的仪器或工具，例如磁珠、血液收集管、缓冲剂等，以及他们的使用说明。
同种异体反应性的T-细胞图谱
在同种异体反应性的淋巴细胞(例如T-细胞或T-淋巴细胞)中表达的核酸的图谱(“同种异体反应性的T-细胞图谱”)也可以用于诊断同种异体移植物排斥。同种异体反应性的T-细胞图谱可以单独使用，或与基因组表达图谱、蛋白质组图谱或代谢组图谱组合使用。
同种异体反应性的T细胞是移植物排斥免疫应答的前线。它们是外周血单核细胞(PBMC)的子集(～0.1-1％)，其识别在外来移植物上存在的同种异基因抗原。它们可以浸润外来移植物，以启动一系列的抗-移植物免疫应答，这些应答如果不受到抑制，会导致移植物的排斥和衰竭。因此，与标志物的其它来源相比，同种异体反应性的T细胞会提供特异性，或可以起区分器官排斥阶段的标志物的补充来源的作用。来自同种异体反应性的T细胞群体的基因表达图谱可以进一步跨不同器官移植物使用，且也可以用于更好地区分器官排斥和其它原因(变态反应、病毒感染等)导致的免疫激活。
同种异体反应性的T-细胞图谱也可以与代谢物(“代谢组学”)、基因组或蛋白质组图谱组合使用。受试者的基因组中的微小改变(例如单碱基变化或多态性)或基因组表达的微小改变(例如有差别的基因表达)，可能导致受试者的小分子代谢物图谱的快速应答。小分子代谢物也可以对环境改变做出快速应答，在环境改变的几秒至几分钟内出现显著的代谢物变化——相反，蛋白或基因表达改变可能需要几小时或几天才能显现。临床变量的列表指出了几种可以用于监视例如心血管病、肥胖症或代谢综合征的代谢物——实例包括胆固醇、高半胱氨酸、葡萄糖、尿酸、丙二醛和酮体。在表3中列出了小分子代谢物的其它非限制性实例。
来自同种异体反应性的T-细胞的标志物可以单独用于诊断同种异体移植物排斥，或可以与来自全血的标志物组合使用。
用于诊断同种异体移植物排斥的蛋白质组图谱
蛋白质组图谱也可以用于诊断同种异体移植物排斥。蛋白质组图谱可以单独使用，或与基因组表达图谱、代谢物图谱或同种异体反应性的T-细胞图谱组合使用。
在某些实施方案中，本发明提供了诊断或测定受试者的慢性同种异体移植物排斥的方法，其包含：1)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种蛋白质组标志物的表达图谱，所述蛋白质组标志物选自由IGFBP3、MST1、CDH5、C1QB、CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽；2)将一种或超过一种蛋白质组标志物的表达图谱与对照图谱进行对比；和3)测定一种或超过一种蛋白质组标志物的表达水平是否相对于对照图谱升高或降低，其中一种或超过一种蛋白质组标志物的升高或降低是慢性排斥状态的指示。
本发明也提供了如本发明提供的预测、评估或诊断受试者的同种异体移植物排斥的方法，其包含：1)测量一种或超过一种蛋白质组标志物的升高或降低，所述蛋白质组标志物选自由IGFBP3、MST1、CDH5、C1QB、CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽；和2)测定受试者的慢性“排斥状态”，其中受试者的“排斥状态”的测定是基于受试者的蛋白质组标志物表达图谱与对照蛋白质组标志物表达图谱的对比。
目前可利用多种蛋白鉴别和定量方法，例如糖肽捕获(Zhang等人，2005.Mol Cell Proteomics 4：144-155)、多维蛋白鉴别技术(Mud-PIT)Washburn等人，2001 Nature Biotechnology(19：242-247)和表面增强的激光解吸电离(SELDI-TOF)(Hutches等人，1993.Rapid Commun Mass Spec 7：576-580)。几种允许定量多种蛋白样品的同位素标记方法，例如用于相对和绝对蛋白定量的同重元素标记(iTRAQ)(Ross等人，2004 Mol Cell Proteomics 3：1154-1169)、同位素编码的亲和标记(ICAT)(Gygi等人，1999 Nature Biotecnology 17：994-999)、同位素编码的蛋白标记(ICPL)(Schmidt等人，2004.Proteomics 5：4-15)和N-末端同位素标记(NIT)(Fedjaev等人，2007 Rapid Commun Mass Spectrom 21：2671-2679；Nam等人，2005.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.826：91-107)，已经变得逐渐普及，这归因于它们的高通量性能，即在生物标志物筛选/鉴别研究中特别有用的一项特征。
使用蛋白组学方法，也证实了血浆样品中14种最丰富的蛋白的去除和iTRAQ-MALDI-TOF/TOF的灵敏度的组合是CR蛋白质组生物标志物的大规模筛选和定量分析的另一个有效方案。简而言之，将受试者的血浆样品(对照和同种异体移植物受体)去除14种最丰富的蛋白，并通过iTRAQ-MALDI-TOF/TOF进行定量分析。该分析导致129种中度至低度丰富的蛋白(组)的鉴别，它们在至少2/3的CR和S样品中被检出。其中，14种具有统计上显著的、有差别的相对浓度(p-值＜0.5)。基于在0.03的p-值截止，进一步选择14种候选物中的10种作为“首选”蛋白。这10种蛋白一起组成蛋白质组生物标志物集合，在内部验证过程中表现出83％的灵敏度和特异性。
因而，尽管单个候选生物标志物可能不能清楚地区分组(有些变化倍数相对较小)，但鉴别出的标志物在一起会实现约83％灵敏度和约83％特异性的分类。
iTRAQ是一种用于检测或测定作为慢性同种异体移植物排斥的蛋白质组标志物的蛋白、肽或其片段的水平的示例性方法。本文所述的其它方法，例如基于免疫学的方法例如ELISA，也可以用于检测或测定蛋白质组标志物的水平。或者，可以产生针对一种或多种蛋白、同种型、前体、多肽、肽、其部分或片段的特异性抗体，并将所述特异性抗体用于检测一种或多种蛋白质组标志物在样品中的存在。选择合适的肽、免疫用于生产抗血清和/或生产和筛选杂交瘤(用于生产单克隆抗体)的动物(例如小鼠，兔子等)的方法，是本领域已知的，且描述在本文公开的参考文献中。
蛋白质组表达图谱标志物(“蛋白质组标志物”)
一种或多种前体、剪接变体、同种型可以由单个基因编码。在表8中，在各个蛋白组代码(PGC)下，提供了基因和编码的同种型、前体和变体的实例。
由CFHR2(补体因子H相关蛋白2)编码的多肽包括与补体因子H在结构上和免疫学上有关的血清蛋白。编码CFHR2的核苷酸序列是已知的(例如GenBAnk登记号NM_005666、BC022283.1、X64877.1和BG566607.1)。由CFHR2编码的多肽的氨基酸序列(例如GenPept登记号P36980、CAA60375)是已知的。
由CPN1(羧肽酶N催化链前体)编码的多肽包括血浆金属蛋白酶，其从肽和蛋白的C末端切割碱性氨基酸，且在调节肽(例如激肽和过敏毒素)的生物活性中起作用。编码CPN1的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_001308、CR608830.1、X14329.1、AW950687.1)。由CPN1编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_001073982、P22792、NP_001295、NP_001299、P15169)。
由APOB(载脂蛋白B-100(前体)，APOB100)编码的多肽包括乳糜微粒和低密度脂蛋白(LDL)的载脂蛋白，且以2种主要形式存在于血浆中：apoB48和apoB100。编码APOB的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_019287、AK290844、NM_000384)。由APOB编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_000375、P41238、AAB60718、I39470)。
由HBB(血红蛋白，β基因座，β珠蛋白)编码的多肽在血液的氧运输中起作用。编码HBB的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_000518、NG_000007、L48217.1)。由HBB编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_000509)。
由HBD(血红蛋白，δ基因座)编码的多肽包括血红蛋白的组分。编码HBD的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号AF339104.2、AY0.4468.1、BC069307.1、BC070282.1、BU664913.1)。由HBD编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号P02042.2、Q4F786、AAH70282.1)。
由GC(组特异性的组分，DBP，VDBP，维生素D结合蛋白)编码的多肽包括白蛋白基因家族中的血清蛋白，且在维生素D向靶组织的结合和运输中起作用。编码GC的核苷酸序列是已知的(例如GenBank登记号AK298433、NM_000583、M12654.1和BC022310.1)。由GB编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_000574、AAD14250、P02774)。
由C9编码的多肽包括补体组分C9前体，它是补体系统中的膜攻击复合物(MAC)的最终组分。编码C9的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_001737、BC020721.1、CB157001.1、K02766.1和CB135741.1.)。由C9编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_001728、P02748)。
由IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3，IBP3)编码的多肽包括血液中的IGF2和IGF2的载体。编码IGFBP3的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_000596、NM_000598、NM_001013398)。由IGFBP3编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号P17936、NP_001013416、NP_000589、NP_000587)。
由MST1(巨噬细胞刺激1，肝细胞生长因子-样蛋白，HGFL)编码的多肽包括调节细胞生长、细胞能动性和形态发生的多肽，且在胚胎器官发育、成年器官再生和伤口愈合中起作用。编码MST1的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_020998、DC315638.1、L11924.1、AK222893.1和BM672747.1.)。由MST1编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_066278、P26927)。
由CDH5(钙粘蛋白-5，血管内皮细胞钙粘蛋白，VE-钙粘蛋白)编码的多肽包括内皮粘附分子，且可能在调节内皮功能和血管障碍完整性中起作用。编码CDH5的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NM_001795、DC381809.1、X59796.1、U84722.1、AC132186.3和X79981.1)。由CDH5编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_001786、P33151)。
由C1QB(补体组分1，q亚组分，B链)编码的多肽包括作为补体系统的C1蛋白的第一种亚组分C1q的一部分的多肽，编码C1QB的核酸序列是已知的(例如GenBank登记号NG_007283、NM_000491)。由C1QB编码的多肽的氨基酸序列是已知的(例如GenPept登记号NP_000482.3、P02746.2)。
组合基因组和蛋白质组表达图谱
本发明提供的诊断受试者的慢性同种异体移植物排斥的方法包含：1)测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种标志物的表达图谱，所述标志物选自基因组标志物OSBP2、CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1、ZCCHC2、242907、CLEC2B、PDK4和IFIT5和由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9、IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的蛋白质组标志物；2)将一种或超过一种标志物的表达图谱与无排斥者图谱进行对比；和3)测定一种或超过一种标志物的表达水平是否相对于对照图谱上调或下调，其中一种或超过一种标志物的上调或下调是排斥状态的指示。
如本文所述，将稳健统计检验应用于基因组和蛋白质组平台，以鉴别差别化表达的基因和蛋白。使用鉴别出的候选物，为辨别慢性排斥(CR)和无慢性排斥/稳定(S)样品开发出基因组、蛋白质组、以及组合的生物标志物集合。
采用高通量方案和应用的微阵列+qPCR以及多路iTRAQ+ELISA，来分别鉴别慢性排斥的潜在的全血基因组和血浆蛋白质组生物标志物。
令人感兴趣地，在目前的研究中鉴别出的基因组和蛋白质组生物标志物集合在对CR和S样品进行分类中具有类似的表现水平。10个基因和10个蛋白(组)的同一性之间不存在跨集合的重叠。不同于使用血浆样品的蛋白质组平台，将外周血用于微阵列。因而，外周血中的其它循环组分(例如血细胞、血小板和尤其是白细胞)可能有助于检测的差别化表达的基因。鉴于认为慢性炎症在CAV的发展中起重要作用，来自外周血的单核细胞(MNC)和多形核细胞(PMN)的基因表达的影响也可能是显著的。
基于基因本体论(GO)的分析揭示了慢性心脏同种异体移植物排斥的基因组和蛋白质组集合之间的更大程度的一致性。一般而言，与每个集合有关的GO术语的列表独立地是独特的，但仍然相当类似。在高水平(GO水平3-5)，通过富集分析(p＜0.05)证实了来自基因组和蛋白质组集合的生物标志物参与几个类似的生物学和分子过程。这些过程包括，但不限于：免疫应答、脂类运输、对外界刺激的应答和碳水化合物结合活性。
鉴于基因组和蛋白质组分类器的灵敏度和特异性是类似的，我们也研究了“组合的”生物标志物集合的可能性，并测试了它的分类能力。将逐步的判别分析(SDA)分开应用于基因组和蛋白质组生物标志物集合，以产生来自每个平台的候选物的最佳组合。得到的生物标志物集合包括4个探针集合和4个蛋白组代码(PGC)。
组合的生物标志物集合/分类器表现出分类性能的提高(图6)。当将组合的分类器应用于在基因组和蛋白质组内部验证中使用的相同实验队列时，它能以100％灵敏度和83％特异性(与独立地使用基因组和蛋白质组分类器的83％灵敏度和特异性相比)正确地区分CR和S样品。在我们的组合的集合中观察到的提高的性能部分地归因于下述事实，即通过应用蛋白质组和基因组方案二者，发现跨队列差别化表达的生物标志物可能更少地与平台特异性的偏移有关或受其影响。
重要的是，基因组和蛋白质组集合尽管各自含有生物标志物的独特集合，仍然表现出相当的区分CR和S样品的能力。组合的集合的内部验证结果也突出了与多平台方案有关的潜在优点。
本发明也提供了用于预测或诊断受试者的排斥状态的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于特异性地和定量地检测基因组标志物OSBP2、CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1、ZCCHC2、242907、CLEC2B、PDK4和IFIT5和由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9、IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的蛋白质组标志物的试剂，以及关于使用这些试剂的说明书，和分析得到的数据的方法。所述试剂盒可以单独地用于预测或诊断受试者的排斥状态，或它可以与测定临床变量的其它方法或认为适宜的其它测定法组合地使用。也可以提供用于将试剂盒的结果与其它测定法的结果进行组合、从而为受试者排斥状态的预测或诊断提供无排斥截止指标的说明书或其它信息。
其它实施方案
同种异体反应性的T细胞图谱、代谢组学
同种异体反应性的T-细胞图谱和/或代谢物(“代谢组学”)图谱可以与基因组和/或蛋白质组图谱组合使用。受试者的基因组中的微小改变(例如单碱基变化或多态性)或基因组表达的微小改变(例如有差别的基因表达)，可能导致受试者的小分子代谢物图谱的快速应答。小分子代谢物也可以对环境改变做出快速应答，在环境改变的几秒至几分钟内出现显著的代谢物变化——相反，蛋白或基因表达改变可能需要几小时或几天才能显现。临床变量的列表指出了几种可以用于监视例如心血管病、肥胖症或代谢综合征的代谢物——实例包括胆固醇、高半胱氨酸、葡萄糖、尿酸、丙二醛和酮体。在表3中列出了小分子代谢物的其它非限制性实例。
表3：在从受试者群体得到的血清样品的NMR波谱中鉴别和定量的代谢物
  化合物名称
  葡萄糖   乳酸盐
  谷氨酰胺   丙氨酸
  甘氨酸   脯氨酸
  甘油   缬氨酸
  牛磺酸   赖氨酸
  柠檬酸盐   丝氨酸
  亮氨酸   鸟氨酸
  肌酸酐   酪氨酸
  苯丙氨酸   丙酮酸盐
  组氨酸   肉碱
  谷氨酸盐   醋酸盐
  异亮氨酸   天冬酰胺
  甜菜碱   3-羟基丁酸盐
  肌酸   丙二醇
  2-羟基丁酸盐   甲酸盐
  蛋氨酸   胆碱
  丙酮
多种技术和方法可以用于得到受试者的代谢物图谱。样品制备的细节可以随使用的方法以及目标代谢物而异——例如，为了得到样品中的氨基酸和小的、通常水溶性的分子的代谢物图谱，可以包含用2-10kDa的低分子量截止过滤样品，而为了得到脂类、脂肪酸和其它通常难溶于水的分子的代谢物图谱，可以包含一个或多个有机溶剂萃取和/或干燥和重新溶解残余物的步骤。尽管本文已经指出了一些示例性的检测和/或定量标志物的方法，其它方法是本领域技术人员可获知的，且可容易地用于本申请所述的方法和用途中。
可以用于(单独地或组合地)得到受试者的代谢物图谱的技术和方法的一些实例包括、但不限于，核磁共振(NMR)、气相色谱法(GC)、气相色谱法与质谱法联用(GC-MS)、质谱法、傅里叶变换MS(FT-MS)、高效液相色谱法等。用于得到代谢物图谱的样品制备和技术的示例性方法，可以参见，例如，人类代谢组计划(Human Metabolome Project)网站(Wishart DS等人，2007.Nucleic Acids Research 35：D521-6)。
下面的实施例进一步解释了本发明。但是，应当理解，这些实施例仅用于解释目的，不应当用于以任何方式限制本发明的范围。
方法
受试者和样本
在移植标准操作程序中，根据生物标志物登记受试者。受试者在温哥华圣保罗医院(St.Paul’s Hospital，Vancouver)等待心脏移植，由研究协调者获取血细胞(BC)，39位经同意的受试者在研究中登记。全部心脏移植受到英属哥伦比亚移植中心(BCT)的监督，且所有受试者接受标准的免疫抑制治疗。在移植之前(基线)和移植后第1、2、3、4、8、12、26周和每隔6个月直到3年，从经同意的受试者采取血样。另外，在移植后1至5年之间的单个时间点，从经同意的受试者采取血样。将血样收集在PAXGeneTM试管中，放在冰浴中递送，在-20℃冷冻一天，然后在-80℃储存，直到RNA提取。
评审心脏移植受试者的数据，选择25位受试者进行分析。总共选择40个血样用于RNA提取和微阵列分析，所述血样来自移植后1至13年之间的单个或时间序列样品。也处理了4个基线血样。
登记了2类受试者：正在等待移植的受试者(从新)，和在2005年3月至2008年2月之间来进行他们的年度检查的受试者(现有)。对于从新受试者，从移植前(基线)和移植后第1、2、3、4、8、12、26周、每隔6个月直到3年，以及在疑似排斥的时刻，收集系列血液和尿样品。对于现有受试者，在移植后至少一年，在常规的移植后检查过程中收集单个样品。来自健康个体的血样用作基因组(全血)和蛋白质组(血浆)分析的对照。
从新和现有移植受试者都接受basilimax诱导，随后是由环孢菌素、泼尼松和麦考酚酸莫酯组成的标准的三联免疫抑制治疗。对于女性，用他罗利姆替换环孢菌素，且在肾病损的情况下，用西罗莫司替换。在移植后3个月内具有2R或3R ISHLT排斥等级发作的受试者接受甲泼尼龙。
根据圣保罗心脏中心(St.Paul’s Heart Centre)建立的心脏同种异体移植物血管病的长期监督程序的指南，使用多巴酚丁胺负荷超声心动图、冠状血管造影术和血管内超声(IVUS)，常规地进行慢性排斥(CR)的筛选。在与血样收集日期相对应的时间点，基于图表评论(即，血管造影术和/或IVUS测量)进行慢性排斥的诊断。为了该研究的目的，基于临床确认鉴别出CR和稳定的(S)，并分别定义为≥50％和≤25％狭窄。
分析群体
该研究的目标是，鉴别出能区分慢性排斥(CR)[临床确认和超过50％狭窄]和稳定的(S)[临床确认和小于25％狭窄]样品的全血基因组和血浆蛋白质组生物标志物。选择总共25个血样用于基因组和蛋白质组分析，所述血样在移植后第1年至第5年之间从17位患者(11位从新，6位现有)收集。将受试者样品分成训练和检验队列。训练队列由在移植后1年(7个CR和6个S)和2年(1个CR)从13位患者收集的13个样品组成。实验队列由12个样品(6个CR和6个S)组成。这些样品中的7个(2个CR和5个S)是在更晚的时间点从5位训练队列受试者收集的，5个(4个CR和1个S)是从4位非训练队列受试者收集的。在训练和检验队列之间对比患者的统计数据(表4)。
表4.心脏移植受试者队列的统计数据
Figure BPA00001257880100471
RNA提取和微阵列分析
使用PAXgeneTM血液RNA试剂盒[目录号762134]在解冻的样品上进行RNA提取以分离总RNA。常规地从2.5ml全血分离出4-10μgRNA，并使用Agilent BioAnalyzer证实RNA的质量。在干冰上包装含有1.5μg RNA的样品，RIN数＞5，且A240/A280＞1.9，并由联邦快递(Federal Express)运送到Microarray Core(MAC)Laboratory，Children’s Hospital，Los Angeles，CA，用于Affymetrix微阵列分析。在CAP/CLIA认可的MAC实验室，由单个技术人员进行微阵列分析。初生态RNA用于双链cDNA合成。然后用生物素标记cDNA，片段化，并与杂交混合液混合，并在GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0阵列上杂交。用Affymetrix系统扫描阵列，每批48个，从合并的正常全血制备内部RNA对照。使用Affymetrix 1.16.0版和affyPLM 1.14.0版BioConductor包(Bolstad，B.，Low Level Analysis of High-density Oligonucleotide Array Data：Background，Normalization and Summarization.2004，University of California，Berkeley；Irizarry等人.2003.Biostatistics 4(2)：249-64)，检查微阵列的质量问题。用来自相同时间点的不同RNA等份试样重复具有较低质量的阵列。
蛋白组学：
血浆处理、去除、胰蛋白酶消化和iTRAQ标记
将血样收集在EDTA试管中，立即在冰上储存，并在2小时内处理血浆，然后储存。通过离心从每个全血样品得到血浆，分成等份，并在-70℃储存，直到进行蛋白质组分析。使用iTRAQ试剂，从每个样品制备100微克总蛋白。简而言之，通过免疫亲和色谱法(Genway Biotech；San Diego，CA)，将血浆样品去除14种最丰富的血浆蛋白(白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、IgG、IgA、IgM、触珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-酸性糖蛋白、α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白-I、载脂蛋白-II、补体C3和载脂蛋白B)，用测序级改良的胰蛋白酶(Promega；Madison，WI)进行胰蛋白酶消化，并根据生产商(Applied Biosystems；Foster City，CA)的说明书用iTRAQ试剂进行标记。合并标记的样品，并酸化至pH 2.5-3.0。通过强阳离子交换色谱法(PolyLC Inc.，Columbia，MD USA)分离iTRAQ标记的肽。合并得到的标记的肽，通过反相色谱法(Michrom Bioresources Inc.，Auburn，CA USA)进一步分离，并使用Probot microfration收集器(LC Packings，Amsterdam，荷兰)直接印迹在384spot MALDI ABI 4800平板上，每个实验4个平板。
质谱法和数据处理
通过由4000series Explorer3.5版软件控制的4800MALDI TOF/TOF分析仪(Applied Biosystems；Foster City，CA)分析印迹在MALDI平板上的肽。质谱仪设定在阳离子模式，MS/MS碰撞能量为1keV。对于每次MS/MS运行，收集最大1400冲击/波谱，造成总质量时间范围是35-40小时。通过具有集成的新的ParagonTM搜索算法(Applied Biosystems)和Pro GroupTM算法的ProteinPilotTM软件v2.0(Applied Biosystems/MDS Sciex，Foster City，CA USA)进行肽的鉴别和定量。针对国际蛋白指数(IPI HUMAN v3.39)(Kersey等人，2004.Proteomics4：1985-1988)进行数据库搜索。前体耐受性设定为150ppm，iTRAQ片段耐受性设定为0.2Da。为胰蛋白酶切割设定鉴别参数，通过MMTS进行半胱氨酸烷基化，特殊因子设定在脲变性，ID聚焦于生物修饰。检测的蛋白阈值设定在85％置信区间。
蛋白质组分析
Pro GroupTM算法(Applied Biosystems)将来自ParagonTM算法的肽证据组合进样品中的蛋白的综合总结中。
将从每个iTRAQ运行鉴别出的蛋白的集合组织进蛋白组，以避免冗余。每个iTRAQ运行包含3个受试者样品和1个合并的对照样品——对照始终用iTRAQ试剂114标记，而受试者样品用试剂115、116和117随机标记。使用对应的肽比例，通过Protein Pilot估计每个蛋白组的相对蛋白水平(标记115、116和117分别相对于114的水平)。由于每个蛋白组可能由超过一种鉴别的蛋白组成，采用称作蛋白组代码算法(PGCA)的内部算法来连接跨所有iTRAQ实验的蛋白组。PGCA将识别码分配给每个iTRAQ运行中的所有蛋白组，并将共同码分配给跨运行的类似蛋白组。然后将也称作蛋白组代码(PGC)的后一种代码用于跨不同iTRAQ运行地匹配蛋白。该过程确保为了对比目的跨所有实验运行的有关蛋白和蛋白家族的共同的标识符命名法。
统计分析
使用IVUS、血管造影术、多巴酚丁胺负荷超声心动图和/或临床评论，诊断移植后第1年的来自慢性排斥(n＝6)或稳定进程(n＝7)受试者的单个时间点样品。该“清洁队列”用于发现慢性排斥诊断生物标志物集合。
使用“漏斗”方案(它使用R2.6.0版来执行)进行基因组和蛋白质组数据的统计分析。
步骤1：预筛
●筛选微阵列上的全部探针集合，得到预筛后的探针集合；
●筛选PGCA文库中的全部蛋白组，得到预筛后的蛋白组。
步骤2：稳健t-检验
●对全部预筛后的探针集合和蛋白组进行稳健t-检验，分别得到差别化表达的(DE)探针集合或DE蛋白组。
步骤3：集合选择
●进一步分析DE探针集合或蛋白组，分别得到基因组生物标志物集合或蛋白质组生物标志物集合。
步骤4：降维
●合并基因组和蛋白质组生物标志物集合，得到组合的生物标志物集合。
使用SAS9.1版，R 2.6.1版和BioConductor 2.1版(Gentleman，R.，等人，Genome Biology，2004.5：p.R80)进行统计分析。稳健多阵列平均(RMA)(Bolstad，等人Bioinformatics，2003.19(2)：185-93页)技术用于背景校正、标准化和总结，可在Affymetrix BioConductor包中得到。然后进行噪音极小化；将在至少3个样品中具有始终低于50的表达值的探针集合视作噪音，并从进一步分析中排除。使用3种不同的适度化的T-检验，分析剩余的探针集合。2种方法可在微阵列数据线性模型(limma)BioConductor包中得到——稳健拟合与eBayes相组合，且最小二乘拟合与eBayes相组合。第3种统计分析方法，微阵列统计分析(SAM)，可在相同的BioConductor包中得到。如果基因在所有3种方法中的假发现率(FDR)＜0.05，且在所有3种适度化的T-检验中变化倍数＞2(对于同种异体反应性的T-细胞，变化倍数＞1.6)，则认为该基因是统计上显著的(Smyth，G.，Limma：linear models for microarray data，in Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor，R.Gentleman，等人.，编.2005，Springer：New York)。通过应用逐步判别分析(SDA)鉴别生物标志物集合基因，在统计上显著的探针集合上正向选择。线性判别分析(LDA)用于训练和检验作为分类器的生物标志物集合。
基因组学
在步骤1中，稳健多阵列平均(RMA)技术用于背景校正、标准化和总结(Affy BioConductor包1.6.7版)。为了减少噪音，从进一步分析中排除在所有样品中始终具有低表达值的探针集合。利用limma BioConductor包1.9.6版，使用稳健适度化的t-检验，分析剩余的探针集合(步骤2)。具有假发现率(FDR)＜10％的探针集合，视作统计上显著的。通过应用更严格的截止标准，FDR＜5％且变化倍数＞2，鉴别生物标志物集合基因(步骤3)。使用线性判别分析(LDA)进行内部验证，以估计基因组集合的区分CR和S样品的能力。
蛋白组学
在步骤1中，从进一步分析中排除在每个组内的至少2/3患者(即，7个AR中的5个和6个NR中的4个)中没有检出的PGC。利用limma BioConductor包1.9.6版，使用稳健适度化的t-检验，分析剩余的蛋白组(步骤2)。鉴别出在CR和S样品之间具有有差别的相对浓度(相对于合并的对照水平)的蛋白组代码，并考虑用于蛋白质组生物标志物集合。然后在步骤3中应用更严格的截止(p-值＜0.03)，以选择生物标志物集合蛋白。使用线性判别分析(LDA)进行内部验证，以估计蛋白质组集合的区分CR和S样品的能力。在LDA中，使用从训练队列的其它样品计算出的平均相对浓度，推导(imputate)在患者样品和/或合并的对照中未检出的每种蛋白的相对浓度。
功能强化
使用FatiGO(Al-Shahrour等人，2007.Nucleic Acids Research 35：W91-96)检查鉴别出的差别化表达的基因和蛋白(步骤2)的功能强化，FatiGO可在Babelomics的3版中得到(Al-Shahrour等人，2006.Nucleic Acids Research W472-476)，它是为功能分析设计的基于网络的工具套件。
组合的分析
为了建立组合的生物标志物集合，使用在抛弃一个(leave-one-out)交叉确认中使分类精确度最大化的逐步判别分析(SDA)(Weihs，C.，Ligges，U.，Luebke，K.和Raabe，N.(2005).klaR Analyzing German Business Cycles.In Baier，D.，Decker，R.和Schmidt-Thieme，L.(编).Data Analysis and Decision Support，335-343，Springer-Verlag，Berlin)，分开地鉴别蛋白子集和探针集合(步骤3)。然后将得到的蛋白子集和探针集合合并成组合的生物标志物集合。使用线性判别分析(LDA)进行内部验证，以估计组合的集合的区分CR和S样品的能力。在SDA和LDA中，对于在某些患者样品和/或合并的对照中未检出的每种蛋白，使用来自训练队列中其它样品的平均相对浓度作为替换。
实施例1
在标准化和预筛后，剩下25,215个探针集合，且包含在随后的使用训练队列样品的分析中(步骤2)。使用稳健检验，鉴别出共106个探针集合具有FDR＜10％。为这些探针集合构建热图，以观察CR和S样品之间的相对表达水平(图4)。另外，进行过表达分析，以观察差别化表达的基因包括的生物学和分子过程的类型，并与在微阵列上存在的其它基因进行对比。鉴别出了显著富集的基因本体论(GO)术语，具有p-值＜0.05的那些已经总结在表5中。
表5.通过基因组表达图谱的富集分析(FatiGo)鉴别出的统计上显著的基因本体论术语。P-值＜0.05。显示的GO术语(生物学过程和分子功能)是在GO水平3和5之间。
  过程或应答   基因本体论术语(GO术语)
  免疫应答   GO：0006955
  对生物刺激的应答   GO：0009607
  体液免疫应答   GO：0006959
  对其它生物的应答   GO：0051707
  脂类代谢过程   GO：0006629
  抗微生物体液应答   GO：0019730
  细胞脂类代谢过程   GO：0044255
  脂类运输   GO：0006869
  碳水化合物结合   GO：0030246
  核糖体的结构组分   GO：0003735
  糖结合   GO：0005529
  二酰甘油结合   GO：0019992
从106个生物标志候选物中，鉴别出22个差别化表达的探针集合，它们每个在来自慢性排斥患者(CR)的样品和来自清洁队列(无排斥患者(NR))的样品之间表现出至少2-倍差异(表6)。使用更严格的标准(FDR＜5％和变化倍数＞2)，鉴别出10个探针集合的子集。这些10个探针集合组成基因组生物标志物集合——CHPT1、LOC644166/LOC644191/LOC728937/RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2、IFIT5，并允许将每个样品分类为CR或NR。生物标志物集合探针集合/基因中的一个(OSBP2)相对于S在CR中下调，而其它(CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、IFIT5)则上调。242907_at(未知的4)是未命名的靶标，其表现出至少2倍升高。
进行了内部验证，以估计基因组生物标志物集合的联合分类12个新样品(6个CR和6个S)的能力。一个CR和一个S样品被错误分类，这对应着基因组慢性心脏同种异体移植物排斥生物标志物集合的83％灵敏度和特异性。
Figure BPA00001257880100541
Figure BPA00001257880100551
Figure BPA00001257880100561
实施例2生物学途径
使用生物信息学和基于文献的方案的组合，已经基于选择的差别化表达的基因鉴别出了不同的途径。不希望受到理论的约束，在我们现有的结果中也已经阐明了它们之间的相互作用。图3解释了生物标志物NKG2A(KLRC1)、NKG2C(KLRC2)、PDK4和CHPT1之间基于途径的关系。
不希望受到理论的约束，生物标志物基因和/或基因产物之间的相互作用可以包括：
1.NKG2C(KLRC2)→CD94→NKG2A(KLRC1)
NKG2C(KLRC2)→CD94(Ding等人1999.Scand.J Immunol 49：459-65；Gunturi等人2004.Immunol.Res 30：29-34)
CD94→NKG2A(KLRC1)(Brooks等人1997.J Exp Med 185：795-800；Brooks等人1999.J.Immunol.162：305-13；Dulphy等人2002.Int Immunol 14：471-9)
2.NKG2C/NKG2A(KLRC2/KLRC1)→SHP1→ESR1→PDK4和CHPT1
NKG2C/NKG2A(KLRC2/KLRC1)→SHP1(Lin Chua等人2002.Cell Immunol.219：57-70；Le Drean等人1998.Eur J Immunol 28：264-76)
SHP1→ESR1(Grimaldi等人2002.109：1625-33)
3.ESR1→PDK4和CHPT1
(Araki等人2006.FEBS J.273：1669-80；Laganiere等人2005.Proc Natl Acad Sci USA.102：11651-6)
实施例3：蛋白质组分析结果
在训练队列所包含的13个样品中的至少一个中发现了总共～2500个蛋白组代码(PGC)。预筛这些PGC(步骤1)——在7个CR和6个S样品中的至少2/3(即，5个CR和6个S样品)中检出的PGC用于进一步分析。统计分析鉴别出129种分析的蛋白中的14种，其具有差别的相对浓度，p-值＜0.05(步骤3)。构建了热图以观察这些显著的PGC的区分CR和S样品的性能(图5)。也进行了过表达分析以研究属于这些蛋白组代码的所有蛋白的生物学和分子功能。在表7中显示了具有p-值＜0.05的显著富集的GO术语。
表7.通过蛋白质组表达图谱的富集分析(FatiGo)鉴别出的统计上显著的基因本体论术语。P-值＜0.05。显示的GO术语(生物学过程和分子功能)是在GO水平3和5之间。
  过程或应答   基因本体论术语(GO术语)
  对外界刺激的应答   GO：0009605
  防御反应   GO：0006952
  免疫应答   GO：0006955
  免疫效应物过程   GO：0002522
  体液免疫应答   GO：0006959
  先天免疫应答   GO：0045087
  对创伤的应答   GO：0009611
  运输   GO：0006810
  适应性免疫应答   GO：0002250
  一氧化氮代谢过程   GO：0046209
  免疫系统过程的调节   GO：0002682
  炎症应答   GO：0006954
  维生素运输   GO：0051180
  白细胞介导的免疫   GO：0002443
  与宿主相互作用   GO：0051701
  氧运载体活性   GO：0005344
  氧结合   GO：0019825
  脂类运载体活性   GO：0005319
  维生素运载体活性   GO：0051183
  类固醇结合   GO：0005496
  碳水化合物结合   GO：0030246
  离子结合   GO：0043167
  血红素结合   GO：0020037
  维生素D结合   GO:0005499
  血红蛋白结合   GO:0030492
从14个生物标志候选物中，使用更严格的标准(p-值＜0.03)鉴别出10个PGC，并组成蛋白质组生物标志物集合(表8)。6个生物标志物集合PGC(CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC、C9)相对于S在CR中升高，4个(IGFBP3、MST1、CDH5、C1QB)降低。
表8.蛋白质组慢性心脏同种异体移植物排斥生物标志物集合.
Figure BPA00001257880100591
Figure BPA00001257880100601
类似于基因组分析，进行了内部验证以估计蛋白质组生物标志物集合的分类12个新样品(6个CR和6个S)的能力。这些样品在与基因组内部验证中的样品相同的时间点取自相同的患者。使用分类器(基于生物标志物集合而开发)，一个CR和一个S样品被错误分类，导致蛋白质组慢性心脏同种异体移植物排斥生物标志物集合的83％的灵敏度和特异性。
实施例4：组合分析结果
基因组和蛋白质组内部验证的结果显示了两个集合的区分CR和S样品的相同性能。这样，我们检查了由探针集合/基因和蛋白二者组成的“组合的”生物标志物集合的有效性。使用逐步判别分析(SDA)分别地鉴别出了4个探针集合/基因(CLEC2B、CHPT1、242907_at、GBP3)和4个PGC(CFHR2、CPN1、C1QB、GC)(表9)。
表9.组合的慢性心脏同种异体移植物排斥生物标志物集合.
Figure BPA00001257880100602
Figure BPA00001257880100611
也使用与前面部分所述相同的实验队列评价了组合的集合。组合的集合的性能优于基因组或蛋白质组集合的性能。基于组合的集合建立的分类器仅错误分类一个S样品，导致100％灵敏度和83％特异性(与基因组和蛋白质组分类器的83％灵敏度和特异性相比)。
构建了striplot作为辅助总结和对比基因组、蛋白质组和组合的慢性心脏同种异体移植物排斥生物标志物集合的内部验证结果的观察工具(图6)。为了简化观察，将所有3个分类器的线性判别(LD)变量的值重新定中心位，以将分类截止线校正为0。‘HP4’、‘H4’和‘组合的’分别代表基因组、蛋白质组和组合的分类器。分别使用空心星形和实心星形显示了训练集合中的CR和S样品的LD变量值的中心(或分类器‘评分’)。实心圆形和实心正方形分别对应着实验队列中的每个S和CR样品的LD变量/分类器评分。具有正LD变量的样品分类为CR。实心和空心星形(分别是训练队列中CR和S样品的平均LD变量)之间的距离解释了该集合的联合区分CR和S的能力。用实心圆形和实心正方形解释了每个集合在联合分类新样品中的性能。
全部引文通过引用并入本文，如同特别地且单独地指出每篇单个出版物通过引用并入本文，也如同在本文中予以完整阐述。本文的参考文献的引用不应当解释为或视作承认这些参考文献是本发明的现有技术。
已经通过实施例描述了本发明的一个或多个目前优选的实施方案。本发明包括基本上如本文所述的和参考实施例和附图的所有的实施方案、改进和变化。本领域技术人员会明白，可以做出许多变化和改进，而不脱离权利要求书所界定的本发明的范围。这些改进的实例包括，替换本发明的任意方面的已知等效方案以便以基本上相同的方式达到相同的结果。

Claims (20)

1.测定受试者的慢性同种异体移植物排斥状态的方法，该方法包含下述步骤：
a.测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱，所述基因组标志物选自：CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4、OSBP2和IFIT5；
b.将一种或超过一种基因组标志物的表达图谱与对照图谱进行对比；和
c.测定一种或超过一种基因组标志物的表达水平是否相对于对照图谱升高或降低；
其中一种或超过一种基因组标志物的升高或降低是受试者的慢性排斥状态的指示。
2.权利要求1的方法，其中OSBP2相对于无排斥者图谱升高，且CHPT1、RPS26、GBP3、KLRC1/KLRC2、ZCCHC2、242907_at、CLEC2B、PDK4和IFIT5相对于对照图谱降低。
3.权利要求1的方法，其中所述对照图谱获自无排斥的同种异体移植物受体受试者或非同种异体移植物受体受试者。
4.权利要求1的方法，另外包括：得到一个或多个临床变量的值。
5.权利要求1的方法，另外包括：在步骤a)中，测定选自表6的一种或多种标志物的表达。
6.权利要求1的方法，其中通过检测与所述一种或超过一种标志物相对应的RNA序列来测定所述一种或超过一种基因组标志物的表达图谱。
7.权利要求1的方法，其中通过PCR测定所述一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱。
8.权利要求1的方法，其中通过杂交测定所述一种或超过一种基因组标志物的基因组表达图谱。
9.权利要求9的方法，其中所述杂交是与寡核苷酸杂交。
10.测定受试者的慢性同种异体移植物排斥状态的方法，该方法包含下述步骤：
a.测定来自受试者的生物样品中的一种或超过一种蛋白质组标志物的蛋白质组表达图谱，所述蛋白质组标志物选自由IGFBP3、MST1、CDH5、C1QB、CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽；
b.将所述一种或超过一种蛋白质组标志物的表达图谱与对照图谱进行对比；和
c.测定所述一种或超过一种蛋白组标志物的表达水平是否相对于对照图谱升高或降低；
其中所述一种或超过一种蛋白质组标志物水平的升高或降低是受试者的慢性排斥状态的指示。
11.权利要求10的方法，其中由CFHR2、CPN1、APOB、HBB、GC和C9编码的多肽的水平相对于对照图谱升高，且由IGFBP3、MST1、CDH5和C1QB编码的多肽的水平相对于对照图谱升高。
12.权利要求10的方法，其中所述对照图谱获自无排斥的同种异体移植物受体受试者或非同种异体移植物受体受试者。
13.权利要求10的方法，另外包括：得到一个或多个临床变量的值。
14.权利要求10的方法，其中通过免疫测定法测定蛋白质组表达图谱。
15.权利要求10的方法，其中通过ELISA测定蛋白质组表达图谱。
16.权利要求10的方法，其中通过质谱法测定蛋白质组表达图谱。
17.权利要求10的方法，其中通过同位素或同重元素标记方法测定蛋白质组表达图谱。
18.权利要求1的方法，其中所述对照是自体对照。
19.权利要求10的方法，其中所述对照是自体对照。
20.使用基因组和蛋白质组标志物的组合集合测定受试者的慢性同种异体移植物排斥状态的方法，该方法包含：
a)测定来自受试者的生物样品中的CHPT1、GBP3、242907_at和CLEC2B基因组标志物的基因组表达图谱；
b)测定生物样品中蛋白质组标志物的蛋白质组表达图谱，所述蛋白质组标志物选自由CFHR2、CPN1、GC和C1QB编码的多肽；
c)将基因组和蛋白质组表达图谱与对照图谱进行对比；和
d)测定基因组和蛋白质组标志物的基因组或蛋白质组表达水平是否相对于对照图谱升高或降低，其中基因组标志物CLDC2B、CHPT1、242907_at、GB3的升高和由CFHR2、CPN1和GC编码的多肽的升高以及由C1QB编码的多肽的降低是受试者的慢性排斥状态的指示。
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