KR20220005768A - 마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석 재발 예측 방법 - Google Patents

마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석 재발 예측 방법 Download PDF

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박진석
배재웅
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인하대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석 진단 방법에 관한 것으로, 총담관 담석 환자 및 건강한 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물을 DNA를 추출하고, 이의 마이크로바이오타를 비교하여 총담관 담석에 특이적인 미생물 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)을 규명함으로써, 총담관 담석 재발 예측 방법 및 총담관 담석 재발 예측용 조성물을 제공한다.

Description

마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석 재발 예측 방법{The prediction of common bile duct stone recurrence using microbiome}
본 발명은 마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석의 재발을 예측하는 방법에 관한 것으로, 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 마이크로바이오타 분석하여 총담관 담석에 특이적인 미생물을 규명하고, 이를 통해 총담관 담석 재발의 예측 및 총담관 담석 재발 진단용 조성물을 제공한다.
마이크로비움은 질병의 발생 과정에 관여할 뿐만 아니라 대변 이식 등을 통한 질병 치료를 도모할 수 있다는 것이 밝혀짐에 따라 여러 가지 위장 질환에서 새로운 치료제의 개발 및 바이오마커로서 각광받고 있으며 전 세계적으로 활발히 연구되고 있다.
담낭 담석과 관련된 마이크로 비움은 Helicobacter spp., Salmonella spp. 등의 Proteobacteria와 관련이 있는 것으로 밝혀졌으나 담낭 담석의 치료는 치료적 담낭절제술 이외에 특별한 추가적인 치료가 없고 완치가 가능하므로 임상적인 유용성은 떨어진다. 반면에 총담관 담석을 경우 반복적인 재발에 의하여 환자들의 유병기간을 늘리고 최종적으로는 담관암의 발생을 유발하므로 총담관의 담석의 재발에 관여하는 마이크로비움을 찾아내는 것이 중요하나 아직 임상실험이 진행된 바 없다.
통상적으로 담관에는 담관의 면역작용을 통하여 균이 자랄 수 없는 것으로 믿어졌으나 최근 발표된 논문에 따르면 담관에도 소장에서 자라는 마이크로비움이 낮은 농도로 존재하며 특히 담관암에 관련된 마이크로비움으로 Helicobacter pylori가 제시되었다.
담관 안의 마이크로비움의 분포에 따른 여러 질환이 발생할 수 있을 것으로 추정되며 특히 담낭 담석과 같이 총담관의 재발석에도 마이크로비움이 영향을 미칠 가능성이 있으며 현재는 이에 관련된 연구가 전무하여 총담관의 마이크로비움을 확인하고 병태생리를 파악하는 연구가 필요하다.
한국공개특허공보 제10-2019-0125048호
본 발명은 마이크로바이옴을 이용한 총담관 담석 진단 방법에 관한 것으로, 총담관 담석 환자 및 건강한 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물을 DNA를 추출하고, 이의 마이크로바이오타를 비교하여 총담관 담석에 특이적인 미생물 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)을 규명함으로써, 총담관 담석 진단 방법 및 총담관 담석 재발 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 (1) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 추출된 DNA에 대하여 서열번호 1및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계에서 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 건강한 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 총담관 담석 재발 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 총담관 담석 환자 및 건강한 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물을 DNA를 추출하고, 이의 마이크로바이오타를 비교하여 총담관 담석에 특이적인 미생물 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)을 규명함으로써, 총담관 담석 진단 방법 및 총담관 담석 재발 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 총담관 담석을 진단할 수 있는 특이적 미생물을 검출하기 위해 박테리아 16S rRNA 분석할 수 있는 프라이머 설계를 나타내는 그림이다.
도 2는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군 사이의 답즘으로부터 DNA를 추출한 후 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 3은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군 사이의 답즘으로부터 DNA를 추출한 후 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 4는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군의 담즙에 대한 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 5는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군의 담즙에 대한 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
도 6은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 7은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 8은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 9는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
도 10은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 11은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 12는 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 13은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 (1) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물의 DNA를 추출하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 추출된 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계에서 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 건강한 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)의 상대적 수준(Relative abundance)이 건강한 대조군에 비해 높게 나타나면 총담관 담석이 발병 또는 재발할 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
상기 (2) 단계에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍은 16S rRNA의 V3 내지 V4 지역을 특이적으로 증폭한다.
상기 생물학적 시료는 담즙일 수 있다.
또한, 본 발명은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 총담관 담석 재발 예측용 조성물을 제공한다.
상기 미생물을 검출하는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체일 수 있다. 구체적으로 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등이 될 수 있다.
상기 프라이머는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
상기 프로브는 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptidenucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
상기 압타머는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합하는 단일가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형핵산)을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 압타머는 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질과 결합하는 압타머를 의미한다. 압타머의 생성은 당업게에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
상기 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 미생물에 존재하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
상기 16S rRNA는 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 모든 종에 공통적인 보존영역(conserved region)과 특정 종을 분류할 수 있는 초가변 영역(hypervariable region)이 존재하므로 염기서열분석을 통하여 미생물을 동정할 수 있다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다. 또한 16S rDNA는 16S rRNA를 코딩하는 유전자이므로, 16S rDNA를 활용하여 미생물을 동정할 수도 있다.
구체적으로 상기 프라이머는 미생물에 특이적인 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
상기 미생물을 검출하는 제제는 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 또는 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 담석 유무에 따른 담즙 마이크로바이오타(microbiota) 분석
총담관 담석을 진단받은 환자와 건강한 대조군 사이에 담즙 마이크로바이오타를 비교하여 총담관 담석 특이적 미생물을 규명하였다.
환자 및 건강한 대조군으로부터 담즙을 10 mL씩 수득하고, 원심 분리하여 상층액을 버리고, 남은 pellet에서 박테리아 DNA를 추출하였다. 추출된 박테리아 DNA 농도를 측정하여 DNA의 총량 2 ng 이상에서 서얼번호 1 및 2의 프라이머세트를 이용하여 박테리아 16S rRNA의 V3 내지 V4 지역을 특이적으로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 산물을 정제하여 농도를 체크한 후 동일한 농도로 pooling하여 일루미나 MiSeq 장비를 이용하여 염기 서열을 분석하였다.
상기 분석된 염기서열을 QIIME 소프트웨어를 이용하여 분석하고, ??리티 체크를 하여 Q20(99.999%)이하의 서열을 제가하였다. 유사도가 97% 이상인 서열을 모아 하나의 OTUs 그룹으로 묶은 후, Greengenes database에 비교하여 분류군으로 할당하였다.
도 2는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군 사이의 답즘으로부터 DNA를 추출한 후 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 총담관 담석 유무에 다른 바이크로바이오타를 문(phylum) 수준에서 비교한 결과, 가장 많이 검출되는 미생물군은 Proteobacteria이며, Firmicutes, Bacteroidetes, Fusobacteria, Actinobacteria 순서로 검출되었으나, 환자군과 대조군 사이에 유의한 차이가 나타나지 않았다.
도 3은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군 사이의 답즘으로부터 DNA를 추출한 후 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 총담관 담석 유무에 다른 바이크로바이오타를 속(Genus) 수준에서 비교한 결과, Proteobacteria 문에 속하는 Enterobacteriaceae이 가낭 높은 수준으로 검출되었으며, Pseudomondas, Enterococcus 등이 많이 검출되었다. 특히, 총담관 담석 환자에서는 Enterococcus가 건강한 대조군에 비해 LDA(linear discriminant analysis, 선형판별분석)에서 통계적으로 유의하게 높게 나타났다.
도 4는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군의 담즙에 대한 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 5는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군의 담즙에 대한 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
도 6은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 7은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 8은 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 9는 총담관 담석 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
도 10은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 문(phylum) 수준에서 비교한 결과이다.
도 11은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 16s rRNA 메타지노믹 분석하여 미생물의 속(genus) 수준에서 비교한 결과이다.
도 12는 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 알파 다양성을 분석한 그래프이다. Chao1는 추측된 풍부도로 샘플에서 발견되지 않거나 보이지 않은 종이 남아 있을 가능성을 고려하여 발견된 종의 정보를 바탕으로 종에 대한 richness를 추정하고, Shannon는 샘플에 존재하는 종의 다양성을 추정한 값으로 클수록 다양성이 크다는 것을 의미한다.
도 13은 총담관 담석 재발 환자와 건강한 대조군을 성별로 나눠서 베타 다양성을 분석한 그래프이다. NMDS는 개체간 근접성을 시각화하는 통계기법으로, 개체들을 대상으로 변수들을 측정한 후, 개체들 사이의 유사성, 비유사성을 측정하여 개체들을 2차원 공간상에 점으로 표현하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> INHA UNIVERSITY <120> The prediction of common bile duct stone recurrence using microbiome <130> ADP-2020-0236 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s-f <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s-r <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (7)

  1. (1) 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 미생물의 DNA를 추출하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계에서 추출된 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 (2) 단계에서 수득된 PCR 산물의 염기서열을 분석하여 건강한 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,상기 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)의 상대적 수준(Relative abundance)이 건강한 대조군에 비해 높게 나타나면 총담관 담석이 발병 또는 재발할 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 추가로 더 포함하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법.
  3. 제1항에 있어서,상기 (2) 단계에서 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 쌍은 16S rRNA의 V3 내지 V4 지역을 특이적으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서,상기 생물학적 시료는 담즙인 것을 특징으로 하는 총담관 담석 재발 예측을 위한 정보 제공 방법.
  5. 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 엔테로코커스(Enterococcus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(Genus)의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 총담관 담석 재발 예측용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,상기 미생물을 검출하는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체인 것을 특징으로 하는 총담관 담석 재발 예측용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,상기 프라이머는 미생물의 16s rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 것을 특징으로 하는 총담관 담석 재발 예측용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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