KR20190125048A - 호흡기 내 마이크로바이옴을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물 - Google Patents

호흡기 내 마이크로바이옴을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로써, 간단한 시료 채취를 통하여 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있는 방법을 제공하며, 신속한 진단을 위한 진단 키트를 개발하는데 활용할 수 있다.

Description

호흡기 내 마이크로바이옴을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물{A composition for the diagnosis of asthma, comprising a reagent for measuring microbiome in the respiratory}
본 발명은 특정 미생물 군집(community)을 측정하는 제제를 포함하는 천식을 진단하기 위한 조성물, 상기 조성물을 이용하는 진단 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
미세먼지는 매우 복잡한 성분을 가진 대기 중에 부유하는 미세입자로, 미세먼지의 노출은 호흡기 및 심혈관계 질환의 발생뿐만 아니라 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 일반적으로 미세입자의 직경은 0.1 내지 2.5㎛이며, 극미세입자는 직경이 0.1㎛ 미만인 물질을 의미한다. 미세먼지 조성은 매우 다양하나, 주로 탄소성분(유기탄소, 원소탄소), 이온성분(황산염, 질산염, 암모늄), 광물성분 등으로 구성되어 있다. 미세먼지는 주로 세기관지에서 염증반응을 일으키며, 이러한 작용은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 등을 일으키거나 악화시키는 것으로 알려져 있다.
마이크로바이옴(microbiome)은 사람의 장, 호흡기, 피부 생식기 등의 인체 상피 세포에 주로 존재하는 모든 미생물들과 이들의 유전정보 전체를 말하는 것으로 단일생명체의 유전정보 전체를 뜻하는 게놈들의 집합체를 의미한다. 이러한 마이크로바이옴은 그 구성에 따라 인간의 건강에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 인체에 서식하는 미생물은 인체에 해를 끼치지 않는 공생균이 대부분이며 이중 일부는 병원균의 성장을 억제하거나, 인간 세포가 만들 수 없는 대사물질을 생성하는 등 유익균이다. 하지만 특정 신체부위에서는 일반 공생균으로 존재하지만 컨디션 및 신체 부위 등의 환경조건에 따라서 병원성을 나타내는 유해균(pathobiont) 역시 존재한다.
최근 유전자 서열분석 기술이 발달하면서, 인체 내 다양한 부위에서 인간 마이크로바이옴(microbiome)의 조사가 가능해졌다.
환경 미생물은 만성 폐 질환의 보호 및 유해 효과 모두와 관련이 있으며, 흡입된 오염 물질을 대사 시키거나, 노출에 대한 염증 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 미생물 군집의 생화학적 및 면역학적 프로파일은 폐 또는 기관지 환경의 건강 지표가 될 수 있다. 장 미생물이 건강에 미치는 영향에 대해서는 상대적으로 잘 연구되어 있으나, 오염 물질 흡입으로 유발되는 염증으로 유도되는 천식에서 미생물의 역할은 대체로 알려져 있지 않다.
대한민국 공개특허 제10-1831416 호
본 발명의 하나의 목적은 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 천식의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 의심개체로부터 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 수준을 측정하는 단계 및 (b) 상기 (a)단계에서 측정한 미생물의 수준을 대조구의 시료와 비교하는 단계를 포함하는 천식 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 이산화타이타늄으로 염증을 유도한 동물모델에서 호흡기의 미생물 수준을 측정하고 대조구 동물 모델의 미생물 수준과 비교하였으며, 염증이 유도된 마우스에서 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deninococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속 미생물의 상대적 존재비가 증가함을 확인하였으며, 반면 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus) 속의 미생물의 상대적 존재비가 감소함을 확인하였다. 이에 따라 폐에서 미생물 군집을 변화를 분석하여 폐 염증성 질환인 천식의 진단에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 천식의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 “천식” 은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다. 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식의 발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식의 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 100㎚ 이하의 이산화타이타늄(나노분진)을 주입한 마우스에서 기도과민성과 염증세포가 증가함을 확인하였으며, 염증 유발시킨 마우스의 폐조직에서 16s rRNA를 분석하여 각 마우스의 폐에서 검출되는 미생물의 상대적 존재비를 생리식염수를 처리한 대조군과 비교 분석하였다. 16s rRNA는 V1 내지 V3 영역을 증폭시켜 분석하였으며, 분석 결과, 염증이 유도된 마우스의 폐조직에서 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deinococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속의 미생물의 상대적 존재비가 증가함을 확인하였으며, 반면 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus) 속의 미생물의 상대적 존재비가 감소함을 확인하였다. 또한 염증세포 수(총세포수, 대식세포수, 호산구 수)와 데이노코쿠스(Deinococcus)의 상대적 존재비가 정의 상관관계를 가짐을 확인하였다.
따라서 데이노코쿠스(Deinococcus) 속 미생물의 수준을 측정하여 천식을 진단할 수 있다.
또한, 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준을 측정함으로써, 천식을 진단할 수 있다.
따라서 본 발명의 조성물은 데이노코쿠스(Deninococcus) 속 미생물을 검출하는 제제를 포함하며, 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물을 검출하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 데이노코쿠스(Deninococcus)는 분류학적으로 데이노코쿠스 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 데이노코쿠스는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 데이노코쿠스와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 프세우도모나스(Pseudomonas)는 분류학적으로 프세우도모나스 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 프세우도모나스는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 프세우도모나스와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 메소히조비움(Mesorhizobium)은 분류학적으로 메소히조비움 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 메소히조비움은, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 메소히조비움과 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 미크로코쿠스(Micrococcus)는 분류학적으로 미크로코쿠스 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 미크로코쿠스는 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 미크로코쿠스와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 브루셀라(Brucella)는 분류학적으로 브루셀라 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 브루셀라는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 브루셀라와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 메틸로박테리움(Methylobacterium)은 분류학적으로 메틸로박테리움 속에 속하는 종(species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 메틸로박테리움은, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 메틸로박테리움과 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 아시네토박터(Acinetobacter)는 분류학적으로 아시네토박터 속에 속하는 종(Species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 아시네토박터는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 아시네토박터와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 엔히드로박터(Enhydrobacter)는 분류학적으로 엔히드로박터 속에 속하는 종(Species)들로 구성된 미생물 또는 그 군집을 말한다. 본 발명에서 엔히드로박터는, 종래에 보고된 균주들 뿐 아니라, 종래에 보고된 엔히드로박터와 16S rRNA 서열 비교시 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 미생물들이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 용어, "검출하는 제제"란, 시료 내에서 천식 진단 마커인 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어, 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등이 될 수 있다.
본 발명에서 마커(marker)란 정상군 개체와 천식을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 구체적으로 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 미생물 군집을 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어, "압타머"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합하는 단일가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형핵산)을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 압타머는 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질과 결합하는 압타머를 의미한다. 압타머의 생성은 당업게에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물에 존재하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
구체적으로, 본 발명에서 검출하는 제제는 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물의 게놈 서열을 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 게놈 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.
본 발명에서 16S rRNA란, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 모든 종에 공통적인 보존 영역(conserved region)과 특정 종을 분류할 수 있는 초가변 영역(hypervariable region)이 존재하므로 염기서열분석을 통하여 미생물을 동정할 수 있다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다. 또한 16S rDNA 는 16S rRNA를 코딩하는 유전자이므로, 16S rDNA를 활용하여 미생물을 동정할 수도 있다.
특이적인 16S rRNA(또는 16S rDNA) 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 서열 증폭 결과 원하는 생성물의 생성 여부를 통하여 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물의 존재를 검출할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 프라이머는 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter)의 속의 미생물에 특이적인 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다
또한, 본 발명에서 미생물을 검출하는 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 또는 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 외, 당업계에 널리 사용되는 분자 및 면역학적 방법이 본 발명의 미생물을 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은, 진단 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적으로 데이노코쿠스속(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 또는 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속의 박테리아에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일수 있다. 프라이머를 포함하는 진단용 키트는 PCR 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함할 수 있다. 예를들어, 상기 PCR용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 또는 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 양태로 (a) 의심개체로부터 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 수준을 측정하는 단계 및 (b) 상기 (a)단계에서 측정한 미생물의 수준을 대조구의 시료와 비교하는 단계를 포함하는 천식 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서, “의심개체”란 천식으로 의심되는 환자의 폐에서 채취된 것으로, 구체적으로 천식 의심 환자에게 채취한 기관지 폐포 세척액(BALF), 또는 폐조직 시료일 수 있다.
본 발명에서 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 수준의 측정은 의심개체의 시료내의 존재하는 데이노코쿠스(Deninococcus) 속 미생물에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류) 등과 같은 유기 분자의 수준을 측정하는 것을 의미한다.
상기 유기 분자의 수준 측정에는 상기 유기생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체를 이용할 수 있으며, 구체적으로 16s rRNA를 검출하는 프라이머를 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 대조구 시료는 정상 개체의 폐에서 채취된 것으로, 바람직하게는 정상 개체에서 채취한 기관지 폐포 세척액(BALF) 또는 폐조직일 수 있다.
전술한 실시예에서 염증이 유도된 마우스에서 데이노코쿠스(Deninococcus), 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속의 미생물의 수준이 정상 대조구와 비교하여 변화하는 것을 확인하였는바, 의심개체에서 측정한 데이노코쿠스(Deninococcus) 수준을 정상 대조구의 비교하여 천식으로 진단할 수 있으며, 상기 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 염증이 유도된 마우스의 폐에서 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deninococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)가 증가함을 확인하였는바, 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deninococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준이 대조구의 미생물 수준보다 증가하는 경우, 천식으로 진단하는 단계를 더 포함할 있다.
또한 염증이 유도된 마우스의 폐에서 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus) 속의 미생물의 수준이 대조구의 미생물 수준보다 감소하는 것을 확인하였는바, 상기 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus)로 이루어진 군에서 선택되는 미생물의 수준이 대조구의 미생물 수준보다 감소하는 경우, 천식으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기에 기술한 바와 같이 본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로써, 간단한 시료 채취를 통하여 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있는 방법을 제공하고, 신속한 진단을 위한 진단 키트를 개발하는데 활용할 수 있다.
도 1은 이산화타이타늄으로 유도한 마우스 모델 분석에 관한 것으로, 구체적으로 a는 마우스 모델의 이산화타이타늄 유도 방법을 나타낸 것이고, b는 기도과민성 측정결과이며, c는 전체 세포 수 및 대식세포, 호산구, 호중구의 수이고, d는 폐 조직을 H&E 염색한 현미경 이미지이다.
도 2의 a 내지 c는 마우스 모델의 폐에서 미생물의 다양성 지수인 Chao1, Shannon 및 Simpson을 측정한 결과이다. 구체적으로, a는 Chao1 풍부도 추정, b는 Shannon 균등성 및 c는 Simpson의 다양성 측정한 결과이다.
도 2d는 가중치가 적용된 Unifrac 거리 메트릭을 이용하여 폐 마이크로 바이옴의 차이를 조사하기 위한 주요 좌표 분석 플롯이다.
도 2e는 마우스 모델의 폐에서 16s rRNA 유전자 빈도를 분석한 결과이다.
도 2f는 마우스 폐 시퀀스에서 유추된 박테리아 군집(community) 중 주요한 11개의 운영분류단위(operating taxonomic unit, OTU)를 보여 주는 히트 맵으로, 각 마우스는 개별적으로 나타내었다(n=6~8).
도 3은 마우스 모델의 폐 샘플의 박테리아 군집(community) 구성을 분석한 결과이다(a 내지 h). 각 그룹에서 폐 마이크로바이옴(microbiome)의 상대적인 존재비(abundance)는 상자그림(boxplot) 분석으로 나타내었으며 상자는 검은 선으로 표시한 중앙값의 내부 4분위수 값(inner quartile value) 범위를 나타낸다.
도 4는 염증세포의 수와 Deinococcus의 상대적인 존재비(abundance)의 관계에 관한 것으로, 구체적으로 총 세포 수, 대식세포 수 또는 호산구 수와 상기 Deinococcus의 상대적 존재비의 상관관계를 분석한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<재료 및 방법>
1. 마우스 모델 연구
본 연구는 순천향대 학교 부천 병원 동물 실험실 운영위원회에 의거하여 수행되었으며, 실험 동물은 특정 병원균이 없는 환경에서 사육하였다. 6 내지 8 주령의 BALB/c 암컷 마우스(n = 8 마리, Orient Bio, 성남, 대한민국)를 연구에 사용하였다. 마우스는 초음파 네뷸라이저(nebulizer)를 사용하여 1 시간 동안 이산화타이타늄(TiO2, 100㎚ 이하)을 200㎍/m3로 5 일 동안 노출시켰으며, 대조그룹 마우스는 생리 식염수에 노출시켰다. 6 일째, 기도과민증(airway hyperreactivity, AHR)을 측정하였고, 7 일째, 마우스의 양쪽 폐에 1.05X 인산염 완충 식염수(PBS)를 넣고 부드럽게 흡입하여 기관지 세척액(bronchial airway lavage, BAL)을 수집하고 분석하였다. 총 세포 수는 혈구계산판(hemocytometer)를 이용하여 측정하였으며, 세포 감별 계산(differential cell count)은 세포원심분리기(cytocentrifugation) 및 Diff-Quik 염색(Dade Diagnostics, Deerfield, IL)을 이용하였다. 폐를 4% 완충 포르말린으로 하룻밤 고정시킨 후, 파라핀으로 포매 하였다. 폐 마이크로 절편(4㎛)은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색(H&E 염색)하여 조직학적 평가에 사용 하였다.
2. 메타콜린(methacholine)에 대한 기도 반응 측정
기도 반응은 위에서 기술된 바와 같이, 마지막 노출 1일 후(6일째), 의식이 있는 마우스를 사용하여 측정하였다. 마우스를 기압 측정용 챔버(barometric plethysmographic chamber)에 넣고, 3 분간 측정하여 평균값을 베이스 라인 측정값으로 계산하였다. 이후 에어로졸화 된 메타콜린의 농도를 5에서 100㎎/㎖로 증가시키면서 챔버 입구를 통해 3분간 분무하고, 3 분간 동안 기압변화를 측정하였다. 각 농도별 분무 후 측정값의 평균을 계산하여 향상된 일시정지(enhanced pause, Penh)를 분석하였다. Penh은 (호기시간/이완시간 - 1) × (최대 호기 유량/최대 흡기 유량)으로 계산되며, 최대 흡기 박스 압력 신호에 대한 최대 만료 비율의 함수를 나타내는 무차원 값이며, 만료 시간의 함수입니다. Penh는 메타콜린(methacholine)에 대한 기도 반응의 척도로 사용하였다. 결과는 메타콜린의 각 농도로 투여 한 후 Penh에서의 퍼센트 증가로 나타내었고, 기준선 Penh(식염수 노출)는 실제 값으로 나타내었다. Penh 값은 각 분무화 후 3 분 동안 평가되고 평균화하였다.
3. 폐 마이크로바이오타(microbiota) 분석
DNA는 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 200㎍ TiO2/m3 (n = 6) 및 식염수 노출(n = 6) 그룹으로부터 폐 조직으로부터 분리하였고, 상기 두 그룹의 DNA 추출물은 시퀀싱 센터로 보냈다. 서열 분석은 Illumina HiSeq 2500을 사용하여 수행 하였다. 16S rRNA의 V1 내지 V3 영역도 또한 PCR에 의해 증폭시켰다.
PCR은 95℃에서 5 분간의 초기 변성, 95℃에서 30 초 변성, 55℃에서 30 초 동안 프라이머 어닐링, 72℃에서 30 초간 연장, 최종 연신 단계는 72℃에서 5 분의 조건으로 수행하였다. 그 후 2% 아가로스 겔 전기 영동을 통해 Gel Doc System (BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 PCR 산물을 시각화하여 확인 하였다.
상기의 증폭산물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제 하였다. 균등한 농도의 정제산물을 혼합하고, 비특이적 증폭산물은 AMpure 비즈 키트(Agencourt Bioscience, MA, USA)를 사용하여 제거하였다. DNA 7500 칩을 사용하여 Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA)에서 정제한 PCR 산물의 크기 및 품질을 분석하였다. 혼합된 증폭산물을 에멀젼 PCR에 적용한 다음 피코타이터 플레이트(PicotiterPlate) 상에 침착 시켰다. 제조사의 지침에 따라 GS 주니어 시스템(Roche, Branford, CT, USA)을 사용하여 Chunlab, Inc. (서울, 대한민국)에서 수행하였다.
두개의 샘플 또는 여러개의 샘플 세트에서 공유되는 박테리아 종(spices)의 조성과 비율을 계산하였으며, 군집(community) 간의 전반적인 계통 발생 거리는 Fast UniFrac을 사용하여 추정하고, 주 좌표계 분석(principal coordinate analysis, PCoA)을 사용하여 시각화하였다. 샘플 간의 운영 분류 단위 (Operational taxonomic unit, OTU)를 비교하기 위해 XOR 분석을 사용하여 공유된 OTU를 확인하였다(CL 커뮤니티 프로그램, Chunlab Inc.).
4. 통계 분석
연속 변수는 Mann-Whitney test를 이용하여 비교하였으며, Chi-square test 또는 Fisher 's exact test를 이용하여 범주 변수를 분석하였다. 데이터는 연속 변수의 경우 중앙값 [4 분위수], 범주 형 변수의 경우 수(%)로 표시하였다. 보정 된 p 값이 0.05보다 작은 경우 통계적으로 유의 하다고 간주하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 버전 22 (SPSS, Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
<결과>
1. 이산화타이타늄(TiO 2 ) 노출 마우스 모델에서 폐 기능 장애 분석
100㎚ 이하의 이산화타이타늄(TiO2) 나노분진에 노출 후 48시간 째의 마우스의 BAL을 분석한 결과 비히클 - 처리 된 대조 마우스와 비교하여 기도 과민성(도 1B) 및 BAL 총 세포 수(도 1c)의 유의한 증가를 나타내었다. 이산화타이타늄(TiO2)은 BAL에서 대식세포가 현저하게 존재하는 염증 세포 증가를 유발했다(도 1b). 또한, 폐 조직학 분석결과, 이산화타이타늄(TiO2)이 폐 간질과 폐포 구획에서 염증 세포 침윤(주로 호중구와 단핵구 세포)과 상피 재 형성을 유도함을 확인하였다(도 1d). 즉, 마우스 모델에서 천식이 유발됨을 확인하였다.
2. 미생물 군집(community) 프로파일링: 파이로 시퀀싱(Pyrosequencing) 결과 및 박테리아 군집(community) 구성 분석
폐 조직으로부터 DNA를 추출하고 16S rRNA 유전자의 영역을 표적으로 하는 범용 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물을 시퀀싱하고 운영 분류 단위로 모으고, 분류학적으로 주석을 달아 폐 미생물 군집(community)의 구성 및 구조를 평가하였다(도 2e). TiO2 그룹의 마우스의 폐 조직에서는 프세우도모나스(Pseudomonas), 브루셀라(Brucella) 및 아시네토박터(Acinetobacter)의 속의 박테리아가 우점함을 확인하였으며, 각 17.6 %, 14.3 % 및 13.9 %를 차지하였다. 또한, 메소히조비움(Mesorhizobium), 엔히드로박터(Enhydrobacter), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 데이노코쿠스(Deinococcus), 리조비움(Rhizobium), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 스핀고비움(Sphingobium), 다이어트지아(Dietzia), 브레분디모나스(Brevundimonas)의 속의 미생물은 각 2 내지 8%의 상대적 존재비를 가짐을 확인하였다.
16S RNA 태그를 분석하여, 군집(community)의 복잡성을 Chao1, Shannon 및 Simpson (1-)의 다양성 지수로 측정하였으며, 분석결과, 군집(community)의 복잡성이 TiO2 처리에 의해 변하지 않음을 확인하였다(도 2a, b 및 c). 군집의 복잡성에 대한 TiO2의 효과는 통계적으로 유의하지 않았지만, 분석결과에서 관찰된 박테리아 성장이 폐의 미생물 생태계에 기여함을 확인하였다.
다음으로, 염증이 유발된 폐에서 미생물 군집의 구성변화를 확인하고자, 폐의 미생물의 군집(community)의 구성을 분석하였다. 주좌표 분석(Principal Coordinates Analysis, PCoA)에 의해 샘플을 구별하는 데 군집의 구조 차이를 측정하는 Yue와 Chandlans 측정을 기초한 매트릭스를 사용하였다(도 2d). 분석 결과, 데이터의 총 변동의 29.3 %가 주 좌표 PC1에 의해 설명 될 수 있음이 확인하였다.
또한, TiO2 노출그룹과 대조그룹 마우스에서 박테리아 미생물의 빈도 분석을 통해 상대적 존재비 차이가 큰 주요 11개의 속(genus)의 박테리아를 확인하였다(도 2f). 상기 11개 속의 박테리아는 프세우도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 브루셀라(Brucella), 메소히조비움(Mesorhizobium), 엔히드로박터(Enhydrobacter), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 리조비움(Rhizobium), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 브레분디모나스(Brevundimonas), 데이노코쿠스(Deinococcus) 및 미크로코쿠스(Micrococcus)로 확인되었다.
다음으로 상기 분석결과를 바탕으로 TiO2 노출그룹과 대조그룹 마우스에서 상대적 존재비 차이가 큰 8개 속(genus)의 박테리아의 선별하였으며, TiO2 노출그룹과 대조그룹 마우스의 존재하는 미생물의 상대적 존재비를 상자그림 분석을 이용하여 비교하였다(도 3a-h). 분석결과, 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus) 속 박테리아의 상대적 존재비가 TiO2 노출그룹에서 대조그룹 마우스보다 감소함을 확인하였다. 반면 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deinococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter) 속의 박테리아의 상대적 존재비가 TiO2 노출그룹에서 증가하는 것을 확인하였다.
구체적으로, TiO2로 기도염증 유발한 마우스의 폐에서 미크로코쿠스(Micrococcus)속은 1.3에서 0.1%로 11배 감소하였으며, 데이노코쿠스(Deinococus)속은 0.8에서 3.38 %로 3.8배 증가함을 확인하였다(P = 0.025).
추가적으로, 기도 염증 세포와 미생물 군집의 관계를 확인하였다. 분석결과, 전체세포, 대식세포 및 호산구의 수가 데이노코쿠스(Deinococcus) 속의 상대적 존재비와 정의 상관 관계를 가짐을 확인하였다(도 4)

Claims (9)

  1. 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 미생물을 검출하는 제제를 포함하는 천식의 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물을 검출하는 제제를 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물을 검출하는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체인 조성물
  4. 제3항에 있어서,
    상기 상기 프라이머는 미생물의 16s rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 조성물.
  5. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 포함하는 천식 진단용 키트.
  6. (a) 의심 개체로부터 데이노코쿠스(Deninococcus) 속의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계에서 측정한 미생물의 수준을 대조구의 시료와 비교하는 단계를 포함하는,
    천식 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 천식 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    브루셀라(Brucella), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 아시네토박터(Acinetobacter), 데이노코쿠스(Deninococcus) 및 엔히드로박터(Enhydrobacter)로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준이 대조구의 미생물 수준보다 증가하는 경우, 천식으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 천식 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    프세우도모나스(Pseudomonas), 메소히조비움(Mesorhizobium) 및 미크로코쿠스(Micrococcus)으로 이루어진 군에서 선택되는 속의 미생물의 수준이 대조구의 미생물 수준보다 감소하는 경우, 천식으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 천식 진단을 위한 정보제공방법.
KR1020180049304A 2018-04-27 2018-04-27 호흡기 내 마이크로바이옴을 측정하는 제제를 포함하는 천식 진단용 조성물 KR102143183B1 (ko)

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