CN106520970A

CN106520970A - 用于诊断脑卒中的标志物

Info

Publication number: CN106520970A
Application number: CN201611052431.8A
Authority: CN
Inventors: 何文贞; 许宏武; 陈文杰
Original assignee: First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College
Current assignee: First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College
Priority date: 2016-11-24
Filing date: 2016-11-24
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-24
Also published as: CN106520970B

Abstract

本发明公开了用于脑卒中诊断的标志物，具体地该诊断标志物为ZCCHC2，本发明首次发现了ZCCHC2在缺血性脑卒中患者中表达下调，提示检测ZCCHC2的表达水平可以成为缺血性脑卒中早期诊断的指标之一；同时本发明为缺血性脑卒中的机制研究提供了理论依据。

Description

用于诊断脑卒中的标志物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于诊断脑卒中的标志物，具体地该标志物为ZCCHC2。

背景技术

随着国民经济的快速发展，人们生活条件和生活方式的明显改变，以及迅速到来的人口老龄化，使得我国国民的疾病谱、死亡谱发生了很大的变化，由传统的急性传染性疾病为主逐渐向慢性非传染性疾病转变，脑血管病、心脏病等慢性非传染性疾病成为威胁公众健康和生命的主要疾病。据卫生部统计中心发布的人群监测资料显示，无论是城市或农村，脑血管病近年在全部死因顺位中都呈现明显前移的趋势。城市居民脑血管病死亡已上升至第一、二位，农村地区上升至第二位。世界卫生组织研究表明，我国脑卒中的死亡率约为20-30％，据此到2030年，我国每年将有近400万人死于脑卒中。如果死亡率增长1％，到2030年，我国每年将有近600万人死于脑卒中。

脑卒中包括缺血性及出血性二种类型，缺血性脑卒中又称为脑梗死(IschemicStroke，IS)是脑卒中最主要的类型，大约占全部脑卒中的43％-79％，是单病种致死、致残率最高的疾病，已成为我国单病种质控的关键病种之一，所以积极探讨其发病机理，对缺血性脑卒中进行早期诊断，选用有效并且安全、经济的药物预防或治疗，是降低死亡率、减少医疗花费的关键。

许多流行病学研究已从不同方面表明，IS是一种受环境和遗传因素共同作用的复杂性疾病。众所周知，高龄、吸烟、饮酒、高血压、高血脂、高血糖、心脏病、纤维蛋白原水平异常和凝血机制障碍等是心脑血管疾病的传统危险因素，但这仅能解释约50～60％脑卒中的发生。许多人即使具备上述危险因素未发生脑卒中，而一些不具备上述危险因素的人却发生了脑卒中，提示脑卒中的发病还与其它因素有关。多数关于家族中一级亲属脑血管病发病情况的研究均发现，有卒中或心脏病阳性家族史者较同龄、同性别的阴性家族史者更易患脑卒中，提示家族史是脑血管病的一项独立危险因素；对丹麦孪生子的长期随访也表明，同卵双生子均患脑梗死的危险性是双卵双生子的2倍，说明IS发病与遗传因素密切相关。近年来，由于人类基因组计划的完成，对缺血性脑卒中的研究从分子遗传学角度有了新的突破。

近年来，越来越多研究认为，基因在缺血性脑卒中的发生发展过程中起着重要的调控作用，因此基因与缺血性脑卒中发病风险的关系也备受关注，寻找与缺血性脑卒中相关的基因将有利于脑卒中的预防，对缓解缺血性脑卒中的高发病率和高死亡率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因标志物在缺血性脑卒中诊断中的应用。

本发明提供了ZCCHC2基因或其表达产物在制备诊断卒中的产品中的应用。

优选的，所述卒中为缺血性脑卒中。

更优选的，所述产品通过测定样本中ZCCHC2基因或其同源物的表达水平进行诊断，其中ZCCHC2在患者中表达下调。其中检测测定技术包括但不限于测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定，核酸扩增技术包括但不限于聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增或基于核酸序列的扩增。

本发明提供了一种体外检测样本中ZCCHC2表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。

一方面，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。优选的，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测ZCCHC2基因转录水平的针对ZCCHC2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的ZCCHC2蛋白的特异性抗体或配体。

其中，所述基因芯片可用于检测包括ZCCHC2基因在内的多个基因(例如，与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括ZCCHC2蛋白在内的多个蛋白质(例如与缺血性脑卒中相关的多个蛋白质)的表达水平。

进一步，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

进一步，所述基因检测试剂盒包括检测ZCCHC2的特异性引物、探针或基因芯片；所述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合ZCCHC2蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。

进一步，基因检测试剂盒至少包括一对ZCCHC2的特异性引物，在本发明的具体实施方式中，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了上述产品在制备缺血性脑卒中的早期诊断工具中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了ZCCHC2基因表达与缺血性脑卒中的发生发展相关，对于揭示缺血性脑卒中的发病机理具有重要的意义

本发明提供了诊断产品，通过检测血液中ZCCHC2的表达水平，从而对缺血性脑卒中实现早发现早治疗，降低缺血性脑卒中的致残率或死亡率。

附图说明

图1显示利用QPCR检测ZCCHC2基因在缺血性脑卒中患者中的表达情况；

图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测ZCCHC2基因的差异表达。

具体实施方式

本发明首次发现了ZCCHC2与缺血性脑卒中的发生发展相关，并验证了血液中的ZCCHC2在缺血性脑卒中诊断中低表达。ZCCHC2可作为缺血性脑卒中的独立预测因子，也可以和其他的基因标志物联合应用。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。

核酸杂交形式的选择不是关键的。多种核酸杂交形式包括但不限于夹心测定和竞争或替代测定。

杂交复合物的检测可需要产信号复合物与靶标和探针多核苷酸或核酸的双螺旋的结合。通常，这种结合通过配体和抗配体相互作用而发生，例如配体偶联的探针和偶联有信号的抗配体之间的相互作用。通过暴露于超声能，信号生成复合物的结合也易于得到加速。

标记也可以允许间接检测杂交复合物。例如，如果标记是半抗原或抗原，可以通过使用抗体来检测样本。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

探针通常被直接标记，例如用同位素、发色团、发光团、色原体，或被间接标记，例如用生物素，链霉亲和素复合物随后可以与生物素结合。因此，本发明测定中所用的可检测的标记可以是一级标记(其中该标记包含可直接检测的元件或能产生直接可检测的元件的元件)或二级标记(其中可检测的标记与一级标记结合，例如，免疫标记中常用的)。通常，标记的信号核酸用于检测杂交。可以通过常用于检测杂交多核苷酸存在的数种方法中的任一种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P标记的探针等的放射自显影法。其它标记包括，例如，能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。还可以使用这一手段通过控制杂交条件以允许区别单一核苷酸，例如，用于SNP鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个多态性标志物的便利性实施方案。

上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

在本发明中，术语“抗体”覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段、组合抗体等，只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。

单克隆抗体还包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性即可。

“抗体或抗体片段”指无论自天然生成抗体的任何物种衍生，还是通过重组DNA技术创建；无论自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(诸如Fab、F(ab’)²、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、双抗体)。

在本发明的上下文中，“ZCCHC2基因”包括人ZCCHC2基因以及人ZCCHC2基因的任何功能等同物的多核苷酸。ZCCHC2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中ZCCHC2基因(NC_000018.10)DNA序列具有70％及以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；在本发明的具体实施方案中，所述ZCCHC2基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，ZCCHC2基因表达产物包括人ZCCHC2蛋白以及人ZCCHC2蛋白的部分肽。所述ZCCHC2蛋白的部分肽含有与缺血性脑卒中相关的功能域。

“ZCCHC2蛋白”包括ZCCHC2蛋白以及ZCCHC2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括ZCCHC2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人ZCCHC2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。在本发明的具体实施方式中，所述ZCCHC2蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

在本发明的上下文中，“诊断缺血性脑卒中”既包括判断受试者是否已经患有缺血性脑卒中、也包括判断受试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险。

术语“样本”包括诸如活检和尸检样本的组织切片以及采集用于组织学目的的冷冻切片。这类样本包括血液、唾液、组织、裂解的细胞、脑活检物、培养的细胞(例如，原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿液等。在本发明的具体实施方式中，所述样本为血液。

实施例

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和缺血性脑卒中患者血液样本，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备及质量分析

2.1 RNA样品的制备

使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；

2)收集血细胞：3000rpm(400g)离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；

3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物；

4)3000rpm离心5min；

5)重复步骤3)和4)两次(共三次)；

6)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μl RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；

7)加350μl RNA稀释液，颠倒混合3-4次；

8)置于70℃水浴中3min；

9)室温下13000g离心10min；

10)将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；

11)向澄清裂解液中加入200μl 95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；

12)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，确认一下RNA Wash Solution已用乙醇稀释，加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；

13)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；

14)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇)，13000g离心1min；

15)加入600μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，13000g，离心1min；

16)清空收集管，向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；

17)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。

2.2 RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

2.3 RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。

3、高通量转录组测序

3.1 RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

3.2转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3.3差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，ZCCHC2基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达量显著低于正常人的表达量。

实施例2 QPCR测序验证ZCCHC2基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择ZCCHC2基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择缺血性脑卒中患者血液和正常人血液各80例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：

(1)取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴；5min后立即冰浴2-3min；

(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至25μl；

(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV；

(4)-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genebank中ZCCHC2基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

ZCCHC2基因：

正向引物为5’-TTCAGTCCATATCATCAGA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GCAACACATCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	1μl
反向引物	1μl
		SYBR Green聚合酶链式反应	12.5μl
体系模板	2μl
		去离子水	补足25μl

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，ZCCHC2基因在缺血性脑卒中患者血液中的表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3蛋白水平验证ZCCHC2的差异表达

按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测ZCCHC2蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做ZCCHC2蛋白条带吸光度定量分析，表达量以ZCCHC2蛋白/β-actin吸光度的比值代表。

结果如图2所示，与正常人相比，缺血性脑卒中患者中ZCCHC2的蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学医学院第一附属医院

<120> 用于诊断脑卒中的标志物

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3537

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atgctgagga tgaagctgcc gctgaagcca acgcaccccg cggagccgcc gcccgaggcg 60

gaggagcccg aggcggacgc gcggccgggc gcgaaggcgc cttcgcgccg ccgccgcgac 120

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ccgccgccgc cccggggact cgggccgcct gttgctggtg gagcggcggc gggggcgggt 240

atgccgggcg gcggcggggg gccctcggcg gcgctgcgcg agcaggagcg ggtatacgag 300

tggttcgggc tggtgctggg ctcggcgcag cgcctggagt tcatgtgcgg gctgctggac 360

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gactaccact acctgcgcga ctcggaggcc aaggccaacg gcctctcgga cccggggccg 480

ctggccgact tccgagagcc cgcggtgcgc tcgcgcctca tcgtctacct ggcgctgctg 540

ggctcggaga accgggaggc cgctggccgt ctgcaccgcc tgctacccca ggtggactcg 600

gtgctcaaaa gcctgcgcgc ggcccggggc gagggctcgc ggggcggcgc ggaggacgag 660

cgcggcgagg acggcgacgg cgagcaggac gccgagaagg acggctcagg cccggaaggc 720

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ctgctcttca ccatggcctc gctgcacccg gctttctcct tccaccagcg ggtcaccctg 840

agggaacact tggagaggct ccgcgccgcg ctccgcgggg gccccgagga cgcggaggtg 900

gaggtagagc cgtgcaagtt tgccggcccc agggcccaga acaactctgc tcatggtgat 960

tacatgcaaa ataacgagag cagcttaata gagcaagctc caatacctca ggacggactt 1020

accgtggcac ctcacagagc tcagcgagaa gctgtacaca ttgagaagat aatgttgaaa 1080

ggagtccaga gaaaaagagc tgacaaatac tgggagtaca ctttcaaagt aaattggtct 1140

gatctttcag tcacaacagt aacaaaaacc caccaagaac tacaggaatt tctactgaag 1200

cttccaaagg aactgtcttc agagactttt gacaagacca tcttaagagc cctgaatcag 1260

ggttccttga aaagggagga acggcgacat cctgacctag agcccatcct aaggcagcta 1320

ttttcaagtt catcacaagc ttttctacaa agtcagaaag tacacagctt ctttcagtcc 1380

atatcatcag actccctaca cagtatcaat aacttacaat cctctctgaa gacttctaag 1440

atattagaac acttaaaaga agacagctct gaagcttcaa gtcaagaaga agatgtgttg 1500

cagcatgcca taatccacaa gaagcatact gggaaaagtc ccattgtgaa caatattggt 1560

acaagttgtt ctccattgga tgggcttacc atgcaatatt ctgaacagaa tggaattgtg 1620

gattggagga agcaaagctg taccaccatt caacacccag agcactgtgt gacctcggct 1680

gaccagcatt ctgctgaaaa acggagttta tcttcaataa ataagaagaa aggaaagcca 1740

caaacagaaa aggagaaaat taagaaaact gacaacagat tgaatagtag aataaatggt 1800

attagactct ccactcctca gcatgcccat ggtggtactg tgaaagatgt gaatttggac 1860

attggctctg gacatgacac atgtggagaa acatcttcag agagttacag ttctccatct 1920

agtccccgac atgatggaag agaaagtttt gaaagtgaag aagagaaaga cagagacaca 1980

gacagcaatt ctgaggattc tgggaatcca tcaacaacta ggtttacagg ttacggttct 2040

gtcaaccaga ctgtcactgt caagccacct gttcaaattg cttcactagg aaatgagaat 2100

ggaaaccttt tagaagatcc cttaaactca cccaagtatc agcatatttc ttttatgcca 2160

acgttacact gtgtcatgca caatggtgcc cagaagtctg aagttgtcgt tcctgcaccc 2220

aaacccgctg atggcaaaac catagggatg cttgttccta gtcctgttgc tatttctgca 2280

ataagggagt ctgcaaattc aacccctgtt ggaatactag ggccaacagc ttgcactgga 2340

gaatcggaaa agcaccttga gttactggct tcccctttac ctattccatc aaccttcctt 2400

ccacacagta gtactcccgc tttgcatctt acagttcaga ggctaaagtt gccaccacca 2460

cagggatctt ctgagagctg cacagttaac atcccacaac aaccacccgg aagcctgagc 2520

atcgcatcac caaacactgc ctttattcct atccataacc caggtagttt cccaggctct 2580

cctgttgcta ccacggaccc catcacaaaa tctgcatccc aagtggtagg actcaatcaa 2640

atggtgcctc aaattgaggg aaacacaggg acagtccctc agcctaccaa tgtgaaggta 2700

gttcttccag cagctggcct ctcagctgct cagccaccag cttcctaccc cttaccaggc 2760

tctccccttg ctgccggcgt gttacccagc cagaactcca gtgtgctcag cacagcagca 2820

acttctcccc agccagcgag cgcaggtatc agccaggccc aggcaactgt tcctcctgca 2880

gttcctaccc acaccccagg ccctgccccg agcccaagcc ctgccttgac acacagtacc 2940

gcgcagagtg acagcacctc ttacatcagt gctgtgggga acacgaacgc taatgggaca 3000

gtagtgccac cgcagcagat gggctcaggt ccttgtggtt cttgtgggcg aaggtgcagc 3060

tgtgggacca atggaaacct tcagctaaat agttactatt atcctaatcc aatgcctgga 3120

ccaatgtacc gagtcccttc attctttact ctgccatcca tttgcaatgg cagctacctc 3180

aaccaagcac atcagagcaa tggaaaccaa cttccttttt ttctgcctca gactccatat 3240

gcaaatggac tggtacatga cccagtcatg gggagccaag ccaactatgg catgcagcag 3300

atggcaggat ttgggagatt ctatcctgta tatccagcac ctaacgtagt tgccaacacc 3360

agtggttcgg ggcccaagaa gaatgggaat gtctcatgtt acaattgtgg tgtaagcgga 3420

cactatgcac aggactgtaa gcagtcgtcc atggaggcca atcaacaagg cacttacaga 3480

ctgagatacg cacctcccct ccccccttct aatgatacgt tggattctgc agactga 3537

<210> 2

<211> 1178

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Leu Arg Met Lys Leu Pro Leu Lys Pro Thr His Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Pro Pro Glu Ala Glu Glu Pro Glu Ala Asp Ala Arg Pro Gly Ala Lys

20 25 30

Ala Pro Ser Arg Arg Arg Arg Asp Cys Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Pro Pro Ala Gly Pro Ser Arg Gly Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Arg Gly Leu Gly Pro Pro Val Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly

65 70 75 80

Met Pro Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Ala Ala Leu Arg Glu Gln Glu

85 90 95

Arg Val Tyr Glu Trp Phe Gly Leu Val Leu Gly Ser Ala Gln Arg Leu

100 105 110

Glu Phe Met Cys Gly Leu Leu Asp Leu Cys Asn Pro Leu Glu Leu Arg

115 120 125

Phe Leu Gly Ser Cys Leu Glu Asp Leu Ala Arg Lys Asp Tyr His Tyr

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Glu Ala Lys Ala Asn Gly Leu Ser Asp Pro Gly Pro

145 150 155 160

Leu Ala Asp Phe Arg Glu Pro Ala Val Arg Ser Arg Leu Ile Val Tyr

165 170 175

Leu Ala Leu Leu Gly Ser Glu Asn Arg Glu Ala Ala Gly Arg Leu His

180 185 190

Arg Leu Leu Pro Gln Val Asp Ser Val Leu Lys Ser Leu Arg Ala Ala

195 200 205

Arg Gly Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ala Glu Asp Glu Arg Gly Glu Asp

210 215 220

Gly Asp Gly Glu Gln Asp Ala Glu Lys Asp Gly Ser Gly Pro Glu Gly

225 230 235 240

Gly Ile Val Glu Pro Arg Val Gly Gly Gly Leu Gly Ser Arg Ala Gln

245 250 255

Glu Glu Leu Leu Leu Leu Phe Thr Met Ala Ser Leu His Pro Ala Phe

260 265 270

Ser Phe His Gln Arg Val Thr Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Leu Arg

275 280 285

Ala Ala Leu Arg Gly Gly Pro Glu Asp Ala Glu Val Glu Val Glu Pro

290 295 300

Cys Lys Phe Ala Gly Pro Arg Ala Gln Asn Asn Ser Ala His Gly Asp

305 310 315 320

Tyr Met Gln Asn Asn Glu Ser Ser Leu Ile Glu Gln Ala Pro Ile Pro

325 330 335

Gln Asp Gly Leu Thr Val Ala Pro His Arg Ala Gln Arg Glu Ala Val

340 345 350

His Ile Glu Lys Ile Met Leu Lys Gly Val Gln Arg Lys Arg Ala Asp

355 360 365

Lys Tyr Trp Glu Tyr Thr Phe Lys Val Asn Trp Ser Asp Leu Ser Val

370 375 380

Thr Thr Val Thr Lys Thr His Gln Glu Leu Gln Glu Phe Leu Leu Lys

385 390 395 400

Leu Pro Lys Glu Leu Ser Ser Glu Thr Phe Asp Lys Thr Ile Leu Arg

405 410 415

Ala Leu Asn Gln Gly Ser Leu Lys Arg Glu Glu Arg Arg His Pro Asp

420 425 430

Leu Glu Pro Ile Leu Arg Gln Leu Phe Ser Ser Ser Ser Gln Ala Phe

435 440 445

Leu Gln Ser Gln Lys Val His Ser Phe Phe Gln Ser Ile Ser Ser Asp

450 455 460

Ser Leu His Ser Ile Asn Asn Leu Gln Ser Ser Leu Lys Thr Ser Lys

465 470 475 480

Ile Leu Glu His Leu Lys Glu Asp Ser Ser Glu Ala Ser Ser Gln Glu

485 490 495

Glu Asp Val Leu Gln His Ala Ile Ile His Lys Lys His Thr Gly Lys

500 505 510

Ser Pro Ile Val Asn Asn Ile Gly Thr Ser Cys Ser Pro Leu Asp Gly

515 520 525

Leu Thr Met Gln Tyr Ser Glu Gln Asn Gly Ile Val Asp Trp Arg Lys

530 535 540

Gln Ser Cys Thr Thr Ile Gln His Pro Glu His Cys Val Thr Ser Ala

545 550 555 560

Asp Gln His Ser Ala Glu Lys Arg Ser Leu Ser Ser Ile Asn Lys Lys

565 570 575

Lys Gly Lys Pro Gln Thr Glu Lys Glu Lys Ile Lys Lys Thr Asp Asn

580 585 590

Arg Leu Asn Ser Arg Ile Asn Gly Ile Arg Leu Ser Thr Pro Gln His

595 600 605

Ala His Gly Gly Thr Val Lys Asp Val Asn Leu Asp Ile Gly Ser Gly

610 615 620

His Asp Thr Cys Gly Glu Thr Ser Ser Glu Ser Tyr Ser Ser Pro Ser

625 630 635 640

Ser Pro Arg His Asp Gly Arg Glu Ser Phe Glu Ser Glu Glu Glu Lys

645 650 655

Asp Arg Asp Thr Asp Ser Asn Ser Glu Asp Ser Gly Asn Pro Ser Thr

660 665 670

Thr Arg Phe Thr Gly Tyr Gly Ser Val Asn Gln Thr Val Thr Val Lys

675 680 685

Pro Pro Val Gln Ile Ala Ser Leu Gly Asn Glu Asn Gly Asn Leu Leu

690 695 700

Glu Asp Pro Leu Asn Ser Pro Lys Tyr Gln His Ile Ser Phe Met Pro

705 710 715 720

Thr Leu His Cys Val Met His Asn Gly Ala Gln Lys Ser Glu Val Val

725 730 735

Val Pro Ala Pro Lys Pro Ala Asp Gly Lys Thr Ile Gly Met Leu Val

740 745 750

Pro Ser Pro Val Ala Ile Ser Ala Ile Arg Glu Ser Ala Asn Ser Thr

755 760 765

Pro Val Gly Ile Leu Gly Pro Thr Ala Cys Thr Gly Glu Ser Glu Lys

770 775 780

His Leu Glu Leu Leu Ala Ser Pro Leu Pro Ile Pro Ser Thr Phe Leu

785 790 795 800

Pro His Ser Ser Thr Pro Ala Leu His Leu Thr Val Gln Arg Leu Lys

805 810 815

Leu Pro Pro Pro Gln Gly Ser Ser Glu Ser Cys Thr Val Asn Ile Pro

820 825 830

Gln Gln Pro Pro Gly Ser Leu Ser Ile Ala Ser Pro Asn Thr Ala Phe

835 840 845

Ile Pro Ile His Asn Pro Gly Ser Phe Pro Gly Ser Pro Val Ala Thr

850 855 860

Thr Asp Pro Ile Thr Lys Ser Ala Ser Gln Val Val Gly Leu Asn Gln

865 870 875 880

Met Val Pro Gln Ile Glu Gly Asn Thr Gly Thr Val Pro Gln Pro Thr

885 890 895

Asn Val Lys Val Val Leu Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ala Ala Gln Pro

900 905 910

Pro Ala Ser Tyr Pro Leu Pro Gly Ser Pro Leu Ala Ala Gly Val Leu

915 920 925

Pro Ser Gln Asn Ser Ser Val Leu Ser Thr Ala Ala Thr Ser Pro Gln

930 935 940

Pro Ala Ser Ala Gly Ile Ser Gln Ala Gln Ala Thr Val Pro Pro Ala

945 950 955 960

Val Pro Thr His Thr Pro Gly Pro Ala Pro Ser Pro Ser Pro Ala Leu

965 970 975

Thr His Ser Thr Ala Gln Ser Asp Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Ala Val

980 985 990

Gly Asn Thr Asn Ala Asn Gly Thr Val Val Pro Pro Gln Gln Met Gly

995 1000 1005

Ser Gly Pro Cys Gly Ser Cys Gly Arg Arg Cys Ser Cys Gly Thr

1010 1015 1020

Asn Gly Asn Leu Gln Leu Asn Ser Tyr Tyr Tyr Pro Asn Pro Met

1025 1030 1035

Pro Gly Pro Met Tyr Arg Val Pro Ser Phe Phe Thr Leu Pro Ser

1040 1045 1050

Ile Cys Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Gln Ala His Gln Ser Asn Gly

1055 1060 1065

Asn Gln Leu Pro Phe Phe Leu Pro Gln Thr Pro Tyr Ala Asn Gly

1070 1075 1080

Leu Val His Asp Pro Val Met Gly Ser Gln Ala Asn Tyr Gly Met

1085 1090 1095

Gln Gln Met Ala Gly Phe Gly Arg Phe Tyr Pro Val Tyr Pro Ala

1100 1105 1110

Pro Asn Val Val Ala Asn Thr Ser Gly Ser Gly Pro Lys Lys Asn

1115 1120 1125

Gly Asn Val Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Val Ser Gly His Tyr Ala

1130 1135 1140

Gln Asp Cys Lys Gln Ser Ser Met Glu Ala Asn Gln Gln Gly Thr

1145 1150 1155

Tyr Arg Leu Arg Tyr Ala Pro Pro Leu Pro Pro Ser Asn Asp Thr

1160 1165 1170

Leu Asp Ser Ala Asp

1175

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcagtccat atcatcaga 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaacacatc ttcttctt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.ZCCHC2基因或其表达产物在制备诊断卒中的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卒中为缺血性脑卒中。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中ZCCHC2基因或其同源物的表达水平进行诊断。

4.一种体外检测样本中ZCCHC2表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述基因芯片包括针对ZCCHC2的特异性引物或探针，所述蛋白质芯片包括特异性结合ZCCHC2编码的蛋白的抗体或配体。

7.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述基因检测试剂盒包括检测ZCCHC2的特异性引物、探针或基因芯片；所述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合ZCCHC2蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。

9.根据权利要求6或8所述的产品，其特征在于，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

10.权利要求4-9任一项所述的产品在制备缺血性脑卒中的早期诊断工具中的应用。