CN109486939A

CN109486939A - 基因标志物在缺血性心肌病诊断中的应用

Info

Publication number: CN109486939A
Application number: CN201811585231.8A
Authority: CN
Inventors: 李海滨; 曹海育
Original assignee: Third Hospital of Hebei Medical University
Current assignee: Third Hospital of Hebei Medical University
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2018-12-24
Publication date: 2019-03-19

Abstract

本发明公开了基因标志物在缺血性心肌病诊断中的应用，所述基因标志物为TMEM30B，TMEM30B在缺血性心肌病患者中表达上调，通过检测TMEM30B基因的表达水平可以为缺血性心肌病患者提供早期辅助诊断，从而实现早期干预和治疗，提高患者的生存率和生活质量。

Description

基因标志物在缺血性心肌病诊断中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及基因标志物在缺血性心肌病诊断中的应用，具体的所涉及的基因标志物为TMEM30B。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CAHD)是冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，简称冠心病(coronary heart disease,CHD)，也称缺血性心脏病(ischemic heartdisease,IHD)。冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变最常见、最严重的一种类型，是影响人类健康和生活质量的常见疾病之一，也是在世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。相关数据显示：预计到2030年，冠心病的死亡人数将占总死亡人数的13.1％，是世界范围内致残和死亡的首要原因。我国冠心病的发病率和死亡率虽然低于发达国家，但随着进入老龄化社会，IHD的发病率呈逐渐增高趋势。

缺血性心肌病(ischemic cardiomyophathy，ICM)是临床治疗中的一个棘手问题。是冠心病发展至晚期阶段，冠状动脉粥样硬化引起长期心肌缺血，导致心肌弥漫性纤维化，产生与原发性扩张型心肌病类似的临床综合症状。根据ICM的临床表现不同，将ICM分为限制型ICM和扩张型ICM。限制型ICM属于疾病的早期阶段，心肌收缩功能尚好，心肌出现广泛纤维化，但心脏扩大仍不明显，心绞痛已逐渐趋于消失，通常的突出表现是急性左心衰竭发作，而扩张型ICM为疾病的晚期阶段，主要表现是慢性充血性心力衰竭，此时患者心脏已经明显增大。

冠状动脉粥样硬化是多种危险因素相互作用的结果，存在血脂、血糖代谢异常和高血压等多种危险因素，然而有研究发现，即使危险因素控制良好，CHD发病率也存在差异。此外，不同种族冠心病的发生率也不同，可见传统的心血管危险因素并不能完全解释CHD的发生率，其可能与个体遗传背景相关。目前从基因角度去研究冠心病的发病与治疗较少，因此迫切需要寻求一种敏感有效的生物学标志物用于冠心病高风险个体检测，以便能有效地开展冠心病的预警和预防工作，从基因学角度探索治疗缺血性心肌病的新方法有潜在的价值。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供与缺血性心肌病相关的基因标志物，通过检测基因标志物的表达水平可以判断受试者是否患有缺血性心肌病或者患缺血性心肌病的风险，使患者在心肌病早期就能知晓风险，从而针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。且使用基因标志物进行辅助诊断，方便，快速，安全。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测TMEM30B水平的试剂在制备诊断缺血性心肌病产品中的应用。其中，所述TMEM30B基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其片段、同系物、变体或衍生物。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别TMEM30B基因的探针；或

特异性扩增TMEM30B基因的引物；或

特异性结合TMEM30B编码的蛋白的结合剂。

进一步，所述特异性扩增TMEM30B基因的引物对序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示。

本发明提供了一种体外检测样本中TMEM30B表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测TMEM30B基因转录水平的针对TMEM30B基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括TMEM30B蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测TMEM30B基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测TMEM30B蛋白表达水平的试剂、或芯片。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法(反转录PCR法)、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测TMEM30B基因或蛋白表达水平的试剂。

进一步，所述用qRT-PCR法检测TMEM30B基因表达水平的试剂包括如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的特异性扩增TMEM30B基因的引物序列。

本发明提供了上面所述的产品在制备诊断缺血性心肌病工具中的应用。

本发明提供了TMEM30B在构建预测缺血性心肌病计算模型中的应用。

本发明提供了TMEM30B在制备治疗缺血性心肌病的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括TMEM30B的抑制剂，以及药学上可接受的载体。

附图说明

图1是利用QPCR检测TMEM30B基因在缺血性心肌病患者中的表达情况图；其中图A是TMEM30B在血液中的表达情况图；图B是TMEM30B在组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测基因在缺血性心肌病患者和正常人中的差异表达，发现其中具有明显表达差异的基因，探讨其与缺血性心肌病的发生之间的关系，从而为缺血性心肌病的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了缺血性心肌病患者中TMEM30B显著性上调，提示TMEM30B可作为检测指标应用于缺血性心肌病的临床诊断。

TMEM30B基因和蛋白

在本发明的上下文中，“TMEM30B基因”包括人TMEM30B基因以及人TMEM30B基因的任何功能等同物的多核苷酸。TMEM30B基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中TMEM30B基因(ID：161291)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，TMEM30B基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述TMEM30B基因的编码序列是SEQ IDNO.1所示的DNA序列。

本发明的TMEM30B基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达TMEM30B的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

在本发明的上下文中，TMEM30B基因表达产物包括人TMEM30B蛋白以及人TMEM30B蛋白的部分肽。所述TMEM30B蛋白的部分肽含有与缺血性心肌病相关的功能域。

“TMEM30B蛋白”包括TMEM30B蛋白以及TMEM30B蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括TMEM30B蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人TMEM30B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，TMEM30B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述TMEM30B蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是TMEM30B蛋白的融合蛋白。对于与TMEM30B蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留TMEM30B蛋白的生物学活性即可。

本发明的TMEM30B蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留TMEM30B蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

检测技术

本发明的TMEM30B使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3’端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

在本发明中，特异性结合TMEM30B基因编码的蛋白的结合剂特异性结合剂是例如蛋白质TMEM30B的受体、结合蛋白质TMEM30B的凝集素、针对蛋白质TMEM30B的抗体、针对蛋白质TMEM30B的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。

特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。优选的，所述结合剂为TMEM30B特异性抗体。

所述TMEM30B蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TMEM30B蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)²、Fv等。只要所述片段能够保留与TMEM30B蛋白的结合能力即可。

芯片、试剂盒

在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于TMEM30B所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的TMEM30B编码的蛋白的特异性抗体或配体。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明中所述TMEM30B蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述TMEM30B蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)²、Fv等。只要所述片段能够保留与TMEM30B蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测TMEM30B基因或蛋白的表达水平，包含用于TMEM30B检测和/或定量的本发明的配体、和/或芯片。

作为一种可选择的实施方式，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病的发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明中试剂盒或芯片可用于检测包括TMEM30B基因在内的多个基因(例如，与缺血性心肌病相关的多个基因)的表达水平，将缺血性心肌病的多个标志物同时进行检测，可大大提高缺血性心肌病诊断的准确率。

在本发明中，“样本”是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的样本。生物样本的示例非限定性地包括：尿、血液、血清、血浆、脑脊髓液、胸膜液、支气管灌洗、痰、腹腔液、膀胱冲洗、分泌物(例如，乳腺分泌物)、口腔冲洗、拭子(例如，口腔拭子)、分离细胞、组织样本、触碰准备物、以及细针穿刺物。在本发明的具体实施例中，所述样本为血液，组织；更为优选的，所述样本为血液。

本发明提供了TMEM30B在构建预测缺血性心肌病计算模型中的应用。所述计算模型可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因及其蛋白质和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于缺血性心肌病的风险或与有助于评估缺血性心肌病患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有心肌病风险的个体、具有缺血性心肌病的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估缺血性心肌病中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与缺血性心肌病相关的基因标志物

1、样品收集

1)血液样本的收集

分别收集25例正常人血液和缺血性心肌病患者血液样本，EDTA抗凝管静置10min，离心分离血清，-20℃保存备用。

2)组织样本的收集

收集25例缺血性心肌病患者的左心室组织样本，和10例非心肌病死亡人员的左心室组织样本。

缺血性心肌病患者的入组标准：参照Burch(1972年)对ICM的诊断标准和美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级标准来确定：(1)有明确的冠心病(心绞痛发作史、心肌梗死半年以上、心电图及酶学异常)证据；(2)明显的心脏扩大；(3)反复心力衰竭发作。

排除标准：合并其他类型心脏疾病，包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、克山病、病毒性心肌炎、先天性心脏病、风湿性心脏病、缩窄性心包炎和心脏淀粉样变性；合并冠心病并发症，包括室壁瘤、室间隔穿孔、乳头肌功能不全等。随机选取4例组织标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部样本中进行大样本验证实验。

2、RNA样品的制备及质量分析

利用QIAGEN公司的组织RNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA，具体步骤参考说明书。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

3、构建cDNA文库

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA，利用Illumina的TruseqRNAsample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

4、上机测序

使用Hiseq4000测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，采用metaMA包分析，当FDR<0.05时，认为mRNA显著差异表达。

6、结果

测序结果显示，与非心肌病的样本相比，TMEM30B基因在缺血性心肌病患者组织中的表达量显著增加。

实施例2 QPCR测序验证TMEM30B基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择TMEM30B基因进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提总RNA，血液RNA提取试剂盒提取血液的RNA，具体步骤参考说明书。

3、逆转录：

1)加入dNTP mixture1μl，Oligo dT primer 1μl，总RNA 2μg，加Rnase FreeddH₂O使总体积至10μl，在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，反应完成后置于4℃。

2)构建20μl反应体系，继续加入5×Primer Script Buffer 4μl，RNaseInhibitor0.5μl，Prime Script RTase 0.5μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃15～30min，95℃5min，反应完成之后，置于冰上。

3)水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，-20℃储存备用。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据Genebank中TMEM30B基因和管家基因GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由生工合成。

TMEM30B基因的引物对序列如下：

正向引物序列为5’-CGTCAACATCACCTACAACTA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物序列为5’-CACGAGATGCTGCTGAAG-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因的引物序列对如下：

正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

2)PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green PCR master mix10μl，cDNA 1μl，ddH₂O 7μl。

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃30s，72℃15s)×40个循环，65℃～95℃，温度升高速度0.5℃/5s。在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

以GAPDH为内参，计算缺血性心肌病与非缺血性心肌病样本中TMEM30B的实验结果，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与非心肌病的样本相比，缺血性心肌病患者组织和血液中的TMEM30B的表达水平都显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示TMEM30B可作为缺血性心肌病早期诊断的检测分子。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河北医科大学第三医院

<120> 基因标志物在缺血性心肌病诊断中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgacctgga gcgccacggc ccggggcgcc caccagcccg acaacaccgc cttcactcag 60

cagcgcctcc ccgcctggca gccgctgctg tcggccagca tcgcgctgcc gctcttcttc 120

tgcgcgggcc tggccttcat cggcctgggc ctgggcctct actactcctc caacggcatc 180

aaggagctgg agtacgacta tacaggcgac ccgggcaccg gtaactgctc ggtgtgcgcc 240

gcggctggcc agggccgggc gctgccgccc ccctgctcgt gcgcctggta cttctcgctg 300

cccgagctct tccagggccc agtgtacctc tactacgagc tgaccaactt ctaccagaac 360

aaccggcgct acggcgtgtc ccgcgacgac gcgcagctga gcggactccc cagcgcgctg 420

cgccaccctg tcaacgagtg cgccccctac cagcgcagcg cggccggcct gcccatcgcg 480

ccctgcggcg ccatcgccaa cagcctcttc aacgactcct tctcgctttg gcaccagcgc 540

cagcccggcg ggccctacgt cgaggtgccg ctcgaccgct ccggcatcgc ctggtggacc 600

gactaccacg tcaagttccg caacccgccg ctggtcaacg gcagcctggc gttggccttc 660

cagggcacgg cgcccccgcc caactggcgc cggccagtct acgagctcag ccccgacccc 720

aacaacaccg gcttcatcaa tcaggacttc gtggtgtgga tgcgcacggc ggcgctgccc 780

acgttccgca aactgtacgc gcgcatccgc cagggcaact actcggccgg gctgccgcgg 840

ggcgcctacc gcgtcaacat cacctacaac tacccggtgc gcgcgttcgg cggccacaag 900

ctcctcatct tcagcagcat ctcgtggatg ggtggcaaga accccttcct gggcatcgcc 960

tacctggtcg tcggctccct ctgcatcctc accggctttg tcatgctggt cgtctacatt 1020

cgctaccagg accaggacga cgacgacgag gagtga 1056

<210> 2

<211> 351

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Thr Trp Ser Ala Thr Ala Arg Gly Ala His Gln Pro Asp Asn Thr

1 5 10 15

Ala Phe Thr Gln Gln Arg Leu Pro Ala Trp Gln Pro Leu Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Ile Ala Leu Pro Leu Phe Phe Cys Ala Gly Leu Ala Phe Ile Gly

35 40 45

Leu Gly Leu Gly Leu Tyr Tyr Ser Ser Asn Gly Ile Lys Glu Leu Glu

50 55 60

Tyr Asp Tyr Thr Gly Asp Pro Gly Thr Gly Asn Cys Ser Val Cys Ala

65 70 75 80

Ala Ala Gly Gln Gly Arg Ala Leu Pro Pro Pro Cys Ser Cys Ala Trp

85 90 95

Tyr Phe Ser Leu Pro Glu Leu Phe Gln Gly Pro Val Tyr Leu Tyr Tyr

100 105 110

Glu Leu Thr Asn Phe Tyr Gln Asn Asn Arg Arg Tyr Gly Val Ser Arg

115 120 125

Asp Asp Ala Gln Leu Ser Gly Leu Pro Ser Ala Leu Arg His Pro Val

130 135 140

Asn Glu Cys Ala Pro Tyr Gln Arg Ser Ala Ala Gly Leu Pro Ile Ala

145 150 155 160

Pro Cys Gly Ala Ile Ala Asn Ser Leu Phe Asn Asp Ser Phe Ser Leu

165 170 175

Trp His Gln Arg Gln Pro Gly Gly Pro Tyr Val Glu Val Pro Leu Asp

180 185 190

Arg Ser Gly Ile Ala Trp Trp Thr Asp Tyr His Val Lys Phe Arg Asn

195 200 205

Pro Pro Leu Val Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ala Phe Gln Gly Thr Ala

210 215 220

Pro Pro Pro Asn Trp Arg Arg Pro Val Tyr Glu Leu Ser Pro Asp Pro

225 230 235 240

Asn Asn Thr Gly Phe Ile Asn Gln Asp Phe Val Val Trp Met Arg Thr

245 250 255

Ala Ala Leu Pro Thr Phe Arg Lys Leu Tyr Ala Arg Ile Arg Gln Gly

260 265 270

Asn Tyr Ser Ala Gly Leu Pro Arg Gly Ala Tyr Arg Val Asn Ile Thr

275 280 285

Tyr Asn Tyr Pro Val Arg Ala Phe Gly Gly His Lys Leu Leu Ile Phe

290 295 300

Ser Ser Ile Ser Trp Met Gly Gly Lys Asn Pro Phe Leu Gly Ile Ala

305 310 315 320

Tyr Leu Val Val Gly Ser Leu Cys Ile Leu Thr Gly Phe Val Met Leu

325 330 335

Val Val Tyr Ile Arg Tyr Gln Asp Gln Asp Asp Asp Asp Glu Glu

340 345 350

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

cgtcaacatc acctacaact a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

cacgagatgc tgctgaag 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.检测TMEM30B水平的试剂在制备诊断缺血性心肌病产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别TMEM30B基因的探针；或

特异性扩增TMEM30B基因的引物；或

特异性结合TMEM30B基因编码的蛋白的结合剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增TMEM30B基因的引物序列对如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示。

4.一种体外检测样本中TMEM30B表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测TMEM30B基因转录水平的针对TMEM30B基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括TMEM30B蛋白的特异性抗体或配体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测TMEM30B基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测TMEM30B蛋白表达水平的试剂、或芯片。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测TMEM30B基因或蛋白表达水平的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述用qRT-PCR法检测TMEM30B基因表达水平的试剂包括如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的特异性扩增TMEM30B基因的引物序列。

8.权利要求4-7任一项所述的产品在制备诊断缺血性心肌病的工具中的应用。

9.TMEM30B在构建预测缺血性心肌病计算模型中的应用。

10.TMEM30B在制备治疗缺血性心肌病的药物组合物中的应用。