LETMD1在脓毒症诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及LETMD1在脓毒症诊断中的应用。
背景技术
脓毒症是任何类型的感染引起的全身炎症反应综合征。在脓毒症发病过程中,全身多种组织器官均参与其中。脓毒症是全世界重症监护室病人死亡的主要原因,且脓毒症治疗费用昂贵,给病人造成了沉重的经济负担。在疾病过程中,除了病原微生物及其相关毒素侵袭机体的组织细胞外,机体的自身免疫反应也参与该病的发展。脓毒症过程中,免疫亢进和免疫抑制同时存在,且抗炎和促炎反应也参与发病。尽管近几年在脓毒症治疗方面研究有很大的进展,但是脓毒症的30天病死率仍然高达47%。脓毒症的临床表现较为多样,且缺乏特有的临床表现,所以目前很多学者均在寻找脓毒症的生物学标记物,以用于脓毒症的诊断及预后评价。
目前发现的生物学标记已经有很多,包括脓毒症疾病过程中各个环节的生物学标记物,如凝血,炎症等,包括CRP、PCT、活化蛋白C(APC),高迁移率族蛋白B(HMGB1)、细胞因子、内毒素、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)及其他新型标志物,且部分已经应用于临床。研究这些物质的临床意义在于(1)区别脓毒症和其他原因引起的SIRS;(2)判断脓毒症的严重程度和不良预后;(3)连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。
脓毒症生物学标志物源于宿主对感染性刺激的反应,理想的标志物应具备高效、易于鉴别炎症病因、可识别潜在病毒或细菌感染、准确反映抗感染疗效的优势。但是目前应用的上述几种标记物,敏感性和特异性均不理想。CRP与疾病严重程度无关,无法预测预后;内毒素测定无临床意义,而内毒素活性分析法诊断G-菌感染和脓毒症有较高阴性预测价值,但不能反映宿主反应,与急性生理和慢性健康评估Ⅱ评分(APACHEⅡ评分)相关性差细胞因子在脓毒症的诊断及预后评估意义较小;骨髓细胞表达激活受体-1(TREM-1)主要见于细菌或真菌所致的急性炎症损伤,非感染性炎症时不表达。TREM-1能较好地判断预后,但预测价值低于PCT,测定肺泡灌洗液中TREM-1对于诊断呼吸机相关性肺炎有很高的灵敏度和特异性;APC因临床证据不足,影响因素较多,测定方法复杂等原因,用于诊断、危险分层及预后判断的临床意义有限。因此寻找敏感和特异性的生物标志物应用于临床诊断、治疗和预后具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一,提供一种分子诊断标志物;
本发明的目的之二,提供一种产品,用以早期诊断脓毒症。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了LETMD1基因及其表达产物在制备诊断脓毒症的产品中的应用。
进一步,所述的产品通过检测样品中LETMD1基因及其表达产物的表达水平来诊断脓毒症。
进一步,检测LETMD1基因及其表达产物的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或微阵列芯片诊断脓毒症的产品。
进一步,所述用RT-PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LETMD1基因的引物;所述用实时定量PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LETMD1基因的引物;所述用免疫检测诊断脓毒症的产品包括:与LETMD1蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断脓毒症的产品包括:与LETMD1基因的核酸序列杂交的探针;所述用微阵列芯片诊断脓毒症的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括与LETMD1蛋白特异性结合的抗体,基因芯片包括与LETMD1基因的核酸序列杂交的探针。
进一步,所述产品包括芯片和/或试剂盒;其中所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。
进一步,所述用实时定量PCR诊断脓毒症的产品至少包括一对特异扩增LETMD1基因的引物。在本发明的一个具体实施方式中,所述用实时定量PCR特异扩增LETMD1基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种诊断脓毒症的产品,所述的产品能够通过检测样品中LETMD1基因的表达水平来诊断脓毒症。
进一步,上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测LETMD1基因转录水平的针对LETMD1基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的LETMD1蛋白的特异性抗体;所述基因检测试剂盒包括用于检测LETMD1基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括LETMD1蛋白的特异性抗体。其中,所述基因芯片可用于检测包括LETMD1基因在内的多个基因(例如,与脓毒症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括LETMD1蛋白在内的多个蛋白质(例如与脓毒症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与脓毒症的标志物同时检测,可大大提高脓毒症诊断的准确率。
进一步,所述基因检测试剂盒包括用于特异性扩增LETMD1基因引物对。在本发明的一个具体实施方式中,所述用于扩增LETMD1基因的引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
在本发明的具体实施方式中,所述基因检测试剂盒还包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对;所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含:PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
在本发明中,“抗体”覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段、组合抗体等,只要它们展现出期望的生物学活性即可。“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位,除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外,此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。
单克隆抗体还包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性即可。
“抗体或抗体片段”指无论自天然生成抗体的任何物种衍生,还是通过重组DNA技术创建;无论自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(诸如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、双抗体)。
在本发明中,术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
在本发明中,术语“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上,所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质,例如,玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质,例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如,DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则,可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片,其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如,来自个体或群体,例如,包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时,样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交,有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中,由此确定核酸中发现的标志物是否存在。还可以使用这一手段通过控制杂交条件以允许区别单一核苷酸,例如,用于SNP鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个多态性标志物的便利性实施方案。
上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
在本发明的上下文中,“LETMD1基因”包括人LETMD1基因序列及其变体。所述序列的“变体”是生物活性的序列,其因为在天然序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失、修饰和/或替换具有与天然序列或野生型序列(或其补体)不同的核苷酸序列。这种变体通常与天然序列或其补体的序列一致性小于100%。然而,生物活性的变体通常与对应的天然存在的序列或其补体具有至少约70%的序列一致性,通常至少约75%、更通常至少约80%、甚至更通常至少约85%、甚至更通常至少约90%、且甚至更通常至少约95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。任何长度的变体核苷酸片段保留对应天然序列的生物活性。变体还包括其中在5’或3’端或在天然序列或其补体内添加一个或多个核苷酸的序列。变体还包括其中一些核苷酸被删除和任选地被一个或多个不同核苷酸替换的序列。
LETMD1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中LETMD1基因(NC_000012.12)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;在本发明的具体实施方案中,所述LETMD1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
本发明的LETMD1基因可以是天然的或是人工合成的,或者使用可以表达LETMD1的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体,包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。真核表达载体可以是任何适当的表达载体,包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体,比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中,LETMD1基因表达产物包括人LETMD1蛋白以及人LETMD1蛋白的部分肽。所述LETMD1蛋白的部分肽含有与脓毒症相关的功能域。
“LETMD1蛋白”包括LETMD1蛋白以及LETMD1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括LETMD1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人LETMD1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。在本发明的具体实施方式中,所述LETMD1蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
在本发明的上下文中,“诊断脓毒症”既包括判断受试者是否已经患有脓毒症、也包括判断受试者是否存在患有脓毒症的风险。
在本发明中,术语“样品”,可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自受试者或对象直接使用,或者进行预处理,如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理,以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。
在本发明中,术语“受试者”是指动物界的任何成员,通常是哺乳动物。术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物,包括人、其他高等灵长类、家畜和农畜以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。通常,哺乳动物是人。
本发明的优点和有益效果:
区别脓毒症和其他原因引起的SIRS;(2)判断脓毒症的额严重程度和不良预后;(3)连续监测以判断病人对某种治疗方法的反应。
本发明首次发现了与脓毒症相关的分子标志物LETMD1基因,对于区别脓毒症和其他原因引起的SIRS具有重要的意义。
本发明提供了一种早期诊断产品和手段,通过检测LETMD1的表达水平,来判断受试者是否患有脓毒症,从而指导临床医生给患者提供预防方案或者治疗方案,降低脓毒症恶化的风险。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LETMD1基因在脓毒症患者中的表达情况。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与脓毒症相关的基因标志物
1、样品收集
各收集10例健康人血液和脓毒症患者血液样本,上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备及质量分析
2.1RNA样品的制备
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下:
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血,放进无菌离心管中;
2)收集血细胞:3000rpm离心5min,小心地从样品顶部吸走上清;
3)加1ml血细胞裂解液,小心吸放4-5次,重悬沉淀物;
4)3000rpm离心5min;
5)重复步骤3)和4)两次(共三次);
6)避开细胞沉淀物,小心吸走几乎所有上清,只保留100μl上清液;确认一下BME已经加到RNA裂解液中,然后加175μl RNA裂解液到细胞中,吸放重悬并裂解细胞;
7)加350μl RNA稀释液,颠倒混合3-4次;
8)置于70℃水浴中3min;
9)室温下13000g离心10min;
10)将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中;
11)向澄清裂解液中加入200μl 95%乙醇,用移液枪吸放3-4次以混合;将此混合物转移到离心柱装配体中,13000g离心1min;
12)从离心柱装配体上拿下离心柱,弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管上,确认一下RNA Wash Solution已用乙醇稀释,加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体,13000g离心1min;
13)弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管上,将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上;
14)室温下孵育15min,向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇),13000g离心1min;
15)加入600μl RNA洗涤液(已加入乙醇),13000g,离心1min;
16)清空收集管,向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇),高速离心2min;
17)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上,向膜上加100μl无核酸酶水,将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外,13000g离心1min,丢弃离心柱,盖好盛有RNA的洗脱管,存于-70℃。
2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求,可以用于文库构建及测序。
3、高通量转录组测序
3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段,然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配,H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载,并作为参考基因组,利用TopHat与基因组匹配时,允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点,最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库,根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理,Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff,Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度,检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值<0.01,测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示,LETMD1基因在脓毒症患者血液中的表达量显著低于健康人中的表达量。
实施例2QPCR测序验证LETMD1基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择LETMD1基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择脓毒症患者血液和健康人血液各80例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下:
(1)取总RNA 2μg进行逆转录,加入Oligo(dT)2μl,充分混匀;70℃水浴;5min后立即冰浴2-3min;
(2)构建25μl反应体系,其中包括5×逆转录缓冲液5μl,dNTP(2.5mM)5μl,RNasin40U/μl,M-MLV 200U/μl,补无核酶水至25μl;
(3)42℃水浴60min后,95℃水浴5min以灭活M-MLV;
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中LETMD1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下:
LETMD1基因:
正向引物为5’-AAGGCAGATGTGAAGAACT-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GGAAATGACGACCCAAGA-3’(SEQ ID NO.4)。
GAPDH基因:
正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5);
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系:
其中,SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 |
体积 |
正向引物 |
1μl |
反向引物 |
1μl |
SYBR Green聚合酶链式反应 |
12.5μl |
模板 |
2μl |
去离子水 |
补足25μl |
(3)PCR反应条件:95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示,与健康人的血液相比,LETMD1基因在脓毒症患者血液中的表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。