CN107312846A

CN107312846A - Capg和ptgis基因在制备脊柱侧弯检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN107312846A
Application number: CN201710567394.2A
Authority: CN
Inventors: 贾冰寒; 王耀; 李睿
Original assignee: Beijing Sai'er Weikang Biomedical Technology Co
Current assignee: Beijing Sai'er Weikang Biomedical Technology Co
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2017-11-03

Abstract

本发明公开了一种用于脊柱侧弯早期筛查的试剂盒。本发明还公开了一种用于脊柱侧弯早期筛查的ELISA试剂盒。利用CAPG和PTGIS基因检测脊柱侧弯不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。

Description

CAPG和PTGIS基因在制备脊柱侧弯检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及CAPG和PTGIS基因在制备脊柱侧弯检测试剂盒中的应用。

背景技术

脊柱侧弯(Scoliosis)，又称脊柱侧凸，是一类以脊柱侧方弯曲并伴有椎体旋转的复杂三维脊柱畸形。根据发病原因，可将其分为3大类：先天性脊柱侧弯、综合症性脊柱侧弯和特发性脊柱侧弯。先天性脊柱侧弯是由脊柱发育畸形导致的；综合症性脊柱侧弯是由神经肌肉疾病、骨骼疾病、结缔组织疾病和神经纤维瘤病等导致的；特发性脊柱侧弯确切病因尚不清楚，相关研究认为基因遗传因素、生长发育和激素、结缔组织病变、肌肉系统的异常、中枢神经系统异常、褪黑素的作用等都可能与AIS的发病有关。其中，青少年特发性脊柱侧弯(Adolescent Idiopathic Scoliosis，AIS)最为常见，占整个脊柱侧弯的80％。青少年特发性脊柱侧弯在10岁-16岁青少年中的发病率较高，是继视力异常、肥胖、包茎和社会心理障碍后的第五大常见病。虽然AIS除表现畸形外通常不引起严重的病理状态，但是重度胸弯可能引起心、肺功能的减退，导致明显的体型上的畸形，甚至影响寿命。

目前治疗方法主要是针对畸形进行矫治，包括临床观察、支具治疗和对侧弯超过45°者进行手术治疗，治疗复杂，常遗留有脊柱畸形和脊柱活动障碍，效果不理想。同时，AIS患者如果不进行筛查，在初次就诊时主弯平均角度为38°，已经接近进行支具治疗的上限。因此，对AIS的早期筛查和诊断可以为患者争取更多保守治疗的机会，减少手术几率。目前AIS的诊断与筛查主要还是依靠对患者外观对称性的体格检查和影像学检查，这会使很多低风险的青少年接受不必要的放射学检查，而且这种筛查手段特异性较差。随着医学遗传学和医学分子生物学研究的不断深入和进步，AIS的医学分子生物学机制的研究也陆续被报道。在对AIS进行分子生物学研究的过程中发现了一些与其相关的生物标记物，如钙调蛋白、外周血中瘦素、血清骨桥蛋白、可溶性CD44、SH3GL1等，但效果和结论仍需进一步验证。因此，从基因表达水平上去研究AIS病因，继续寻找新的、特异性好的AIS早期筛查与诊断的标记物具有重要意义。

发明内容

为了实现青少年特发性脊柱侧弯的早期发现，早期治疗，本发明的目的在于提供一种用于脊柱侧弯早期筛查的试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于脊柱侧弯早期筛查的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测CAPG基因的引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

优选的，所述试剂盒还包括用于检测PTGIS基因的引物包括如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的核苷酸序列。

优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

优选的，所述试剂盒能够通过real-time PCR检测生物学样品中CAPG和PTGIS基因或其表达产物的表达水平来诊断脊柱侧弯，所述CAPG基因和PTGIS基因在生物学样品中表达下调。

进一步地，本发明提供一种用于脊柱侧弯早期筛查的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括抗CAPG和PTGIS蛋白的特异性抗体。

优选的，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。所述CAPG和PTGIS蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab')2、Fv等。只要所述片段能够保留与CAPG或PTGIS蛋白的结合能力即可。

优选的，所述抗体可以从商业途径获取，也可以使用一系列本领域已知的方法来制备。例如，将纯化的人CAPG和PTGIS蛋白或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人CAPG和PTGIS蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。

优选的，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体为单克隆抗体，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为鼠源抗体。本发明使用的抗人CAPG和PTGIS蛋白鼠源单克隆抗体均由上海樊克生物科技有限公司制备。

优选的，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。

优选的，所述试剂盒还包括抗CAPG兔多克隆抗体包被的酶标板、抗PTGIS兔多克隆抗体包被的酶标板、蛋白标准品CAPG和PTGIS、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。优选地，终止溶液成分为2M H₂SO₄。

优选的，所述脊柱侧弯为青少年特发性脊柱侧弯。

本发明的有益效果如下：本发明公开了一种与脊柱侧弯相关的基因CAPG和PTGIS，并进一步证实该CAPG和PTGIS基因或其表达蛋白在青少年特发性脊柱侧弯患者生物学样品中表达下调。利用CAPG和PTGIS基因在青少年中进行脊柱侧弯的普查，解决了现有技术中诊断措施敏感性和特异性差的问题，也减少了X线辐射的损害，能够快速有效的做到AIS的早期诊断，而且为预测诊断AIS的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗AIS提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1本发明中实施例2中脊柱侧弯患者CAPG和PTGIS基因表达下调。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的技术方案具体包括：对20例青少年特发性脊柱侧弯患者样本及15例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因CAPG和PTGIS，现有研究中并没有CAPG、PTGIS和青少年特发性脊柱侧弯相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了CAPG和PTGIS在脊柱侧弯患者生物学样品中表达下调，其相关制剂可用于诊断青少年特发性脊柱侧弯。

本发明的CAPG和PTGIS基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

Genbank登录号：CAPG GeneID:822，PTGIS GeneID:5740来源于人类基因组。

CAPG(capping actin protein，gelsolin like，肌动蛋白调节蛋白)位于2号染色体上，为Gelsolin超家族成员，与Gelsolin同属细胞骨架蛋白中的肌动蛋白结合蛋白。Gelsolin最先于1979年由Yin和Stossel在兔的肺巨噬细胞中发现，它通过与肌动蛋白的相互作用，发挥对肌动蛋白的聚合、解聚和剪切等精确调控功能，并参与细胞内信号传导，与细胞调控等关系密切。作为Ga²⁺依赖性肌动蛋白结合蛋白，CAPG通过对微丝加帽、切割而调控肌动蛋白的长度。已有研究发现，成纤维细胞和内皮细胞中CAPG过表达均可导致细胞的运动性增强。

PTGIS(prostaglandin I2 synthase，前列腺素I合酶)为细胞色素P450超家族成员。细胞色素P450蛋白为单加氧酶，参与药物代谢，胆固醇、类固醇或其他脂质的合成。然而，这种蛋白质是基于序列相似性而不是功能相似性被认为是细胞色素P450超家族成员。内质网的膜蛋白催化前列腺素H2转化为前列腺素(前列腺素I2)，是一种有效的血管扩张剂和血小板聚集抑制剂。前列环素和血栓素A2的生理拮抗剂失衡导致心肌梗塞、中风和动脉粥样硬化的发生。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.利用高通量测序方法对20例脊柱侧弯患者的血液样本CAPG和PTGIS基因的水平与15例对照样本中进行差异比较。

2.qRT-PCR验证脊柱侧弯患者CAPG和PTGIS基因的表达情况

采用RT-PCR方法检测CAPG和PTGIS基因在脊柱侧弯患者和对照组中的表达，并验证了该基因为脊柱侧弯表达下调基因。

3.脊柱侧弯的检测试剂盒组装

本发明的脊柱侧弯的试剂盒包括以下组成部分：

(1)组织样品提取总RNA试剂；

(2)反转录试剂；

(3)定量PCR试剂。

4.脊柱侧弯的ELISA检测试剂盒组装和使用

(1)ELISA实验中常规试剂的配制；

(2)多克隆抗体制备；

(3)酶标板的包被；

(4)酶标抗体的制备；

(5)试剂盒的组装。

5.ELISA试剂盒的临床应用

利用本发明人制备的ELISA试剂盒检测待确诊的脊柱侧弯患者并与实际临床检测相比较以确定了ELISA试剂盒的有效性。具体包括测定受试者血液样本中CAPG和PTGIS蛋白表达量，并与正常血液样本中CAPG和PTGIS蛋白表达量进行比较，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

本发明的CAPG和PTGIS基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本文使用的“脊柱侧弯”未做说明时，一般特指青少年特发性脊柱侧弯。

本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨等样品。用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如椎间盘、关节突、脊髓、椎旁肌或血样)或细胞样品(如成骨细胞、软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多脊柱侧弯症状的受试者、临床诊断为患有脊柱侧弯的受试者、易患脊柱侧弯的受试者(如有脊柱侧弯家族史的受试者、有脊柱侧弯遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感脊柱侧弯或提高患脊柱侧弯可能性的受试者)、怀疑患有脊柱侧弯的受试者、正接受脊柱侧弯治疗的受试者、患有脊柱侧弯和非接受脊柱侧弯治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无脊柱侧弯的受试者(即正常)、已治愈脊柱侧弯的受试者、正在控制其脊柱侧弯的受试者和未诊断为脊柱侧弯的受试者。

实施例1 高通量测序筛选差异表达基因

1、取样

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的脊柱侧弯患者，病例组共收集20例，所有患者均有典型的临床表现，经X线检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集15例。患者均为10岁-18岁的青少年。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、对血液样本进行总RNA提取

采用LS(Invitrogen:10296-010)对采集的血液样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

取收集到的新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

(1)入1mLTrizol，室温保存5分钟；

(2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置3-5分钟；

(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的界面。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下8000rpm离心2分钟。弃去乙醇液体，室温下放置2分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

(5)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、高通量测序

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因CAPG和PTGIS，CAPG和PTGIS基因在脊柱侧弯患者血液样本中表达下调。

实施例2 qRT-PCR验证脊柱侧弯患者CAPG和PTGIS基因的表达情况

1、材料

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的脊柱侧弯患者15例，所有患者均有典型的临床表现，经X线检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集8例。患者均为10岁-18岁的青少年。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

2.1 对血液样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。

2.2 逆转录合成cDNA

采用RT reagent kit(TaKaRa，货号DRR037A)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对0.3μg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用10μL反应体系：5xPrimerScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、OligodTPrimer 0.5μL、Random 6mers 0.5μL、RNA模板为0.3μg和RNase Free dH₂O补至10μL。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3 Real-Time PCR

利用在线引物设计软件，CAPG基因序列参照NCBI:NM_001256139.1，PTGIS基因序列参照NCBI:NM_000961.3，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物如表1所示：

表1 引物序列表

用Premix Ex Taq^TMII(TaKaRa，货号DRR081A)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。荧光定量PCR 20μL反应体系如下：Premix Ex Taq^TMII：10μL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8μL，ROX Reference DyeII(50×)：0.4μL，dH₂O：6μL，模板cDNA：2μL。反应程序在ABI7500上进行，扩增程序为：95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40个循环。

3、统计学分析

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-ΔΔCt×100％，比较CAPG和PTGIS基因在脊柱侧弯患者血液中和对照组血液中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中CAPG和PTGIS基因在脊柱侧弯患者血液中的表达水平分别为对照组血液中的43％和40％，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析CAPG和PTGIS基因在脊柱侧弯患者中表达下调的结果。

实施例3 脊柱侧弯的检测试剂盒组装

本实施例检测脊柱侧弯的试剂盒包括以下组成部分：

(1)血液样品提取总RNA试剂包括TRizol、三氯甲烷、异丙醇、75％乙醇和无酶水；

(2)反转录试剂包括：5x逆转录缓冲液、SuperRT逆转录酶、dNTPS、OligodTPrimer、Random 6mers和RNase Free dH₂O，所述逆转录反应液包含：250mM pH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。进行1次反转录PCR的用量如表2所示，反应程序为：42℃30min，85℃5min。

表2 反转录试剂体系

组分	加入量
		5x逆转录缓冲液	4μL
OligodT Primer(50μM)	0.5μL
		Random 6 mers(100μM)	0.5μL
SuperRT逆转录酶(200U/μL)	1μL
		dNTPs(2.5mM)	4μL
总RNA	1μg
		RNase Free dH2O	至20μL

(3)定量PCR试剂包括：PCR Mix反应体系，实施例2中表1的引物序列。所述PCR Mix反应体系的组分包含反应缓冲液、dNTPs、Mg²⁺、Ex TaqHS酶及Green I。进行1次定量PCR的用量如表3所示。反应程序为95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40个循环。上述试剂均可以在市面上购买。

表3 定量PCR体系

组分	加入量
		PCR Mix反应体系	10μL
上游引物(10μM)	0.5μL
		下游引物(10μM)	0.5μL
模板cDNA	2.0μL
		加入灭菌蒸馏水	至20μL

试剂盒还包括：阳性对照为正常人的血液RNA或DNA和阴性对照为ddH₂O。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

利用上述试剂盒中的试剂对受试者样本进行RNA提取、反转录成cDNA、按照最佳反体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中的正常标准品作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者样本中CAPG和PTGIS的表达量相对正常人中CAPG和PTGIS表达量的变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为检测样本阳性。

实施例4 检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒组装和使用

1.ELISA实验中常规试剂：

包被缓冲液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，加蒸馏水至1L；

洗涤缓冲液(pH7.4)：8.0g NaCl；0.2g KH₂PO₄；2.9g Na₂HPO₄·12H₂O；0.2g KCl；0.5mL 0.05％吐温-20，加ddH₂O至1L；

稀释液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g加洗涤缓冲液至100mL；

本发明使用的抗人CAPG和PTGIS蛋白鼠源单克隆抗体均由上海樊克生物科技有限公司制备；

蛋白标准品CAPG和PTGIS为人源重组蛋白均购自上海沪震实业有限公司。

2.多克隆抗体制备：

CAPG和PTGIS抗原的氨基酸组成如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，其可以通过诱导表达得到，也可以通过合成得到。

CAPG和PTGIS抗原通过诱导表达参照常规方法制备：获得编码CAPG和PTGIS的DNA片段，将该片段分别插入pET质粒载体中，然后转化入大肠杆菌中构建重组表达菌株(pET-CAPG/BL21和pET-PTGIS/BL21)，再利用IPTG进行诱导表达，通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化融合蛋白，得到氨基酸组成如SEQ IDNO:7所示的CAPG抗原和氨基酸组成如SEQ IDNO:8所示的PTGIS抗原，纯度鉴定合格后即可用作抗原免疫动物；将纯化后的CAPG和PTGIS蛋白溶解在1×PBS，取适量的蛋白溶液与弗氏完全佐剂(Sigma)混匀乳化，取2Kg大耳白兔，背部皮下多点注射抗原。2周后，取适量的蛋白溶液与弗氏不完全佐剂(Sigma)混匀乳化，在皮下，进行第二次免疫。以后每隔3周，进行第三、四次免疫；经4次免疫后检测免疫兔静脉血滴度，达到1:50000以上后，对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血，离心分离后收集兔免疫血清；采用Protein A亲和层析柱对抗CAPG和PTGIS蛋白的兔免疫血清进行纯化，制备抗CAPG和PTGIS蛋白的多克隆抗体，检测多克隆抗体的滴度、特异性、灵敏性等，得到抗血清CAPG和PTGIS蛋白抗体。

3.酶标板的包被：

所述抗CAPG和PTGIS兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗CAPG和PTGIS兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。

4.酶标抗体的制备：

取抗CAPG和PTGIS蛋白鼠源单克隆抗体，分别与HRP进行偶联，得到酶标记抗体。取一定量的酶标记抗体加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/mL(可根据具体的条件而定)，2-8℃避光保存。

5.试剂盒的组装：

检测脊柱侧弯的ELISA试剂盒包括表4中的组分：

表4 ELISA检测试剂盒

为方便使用，该试剂盒还可包含阳性对照：正常人AB血清或胎牛血清500μL和阴性对照：1％PBS 1mL。

该试剂盒的使用方法如下：

(1)分别取CAPG和PTGIS标准蛋白浓度分别为900pg/mL，600pg/mL，300pg/mL，150pg/mL，75pg/mL溶液50μL加入包被抗体的酶标板绘制标准曲线；

(2)分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔，在酶标板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

(3)用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

(4)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；

(5)每孔加入酶标试剂50μL；

(6)温育，洗涤，步骤同上；

(7)每孔先加入TMB底物溶液A 50μL，再加入TMB底物溶液B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(8)每孔加终止液50μL，终止反应；

(9)以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，计算各血清样本中蛋白含量。

实施例5 ELISA试剂盒的临床检测

1、病例

选取20例待筛查的脊柱侧弯患者，取样来源于2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的的病人。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

标本处理用血清分离胶真空采血管采集静脉血2mL，先室温3000r/min离心10min，转移上层血清，再于4℃、16000×g离心10min，吸取上层无细胞血清分装每管200μL，置-70℃保存。上述操作于标本采集后2h内完成。以试剂盒中正常人AB血清为阳性对照，使用实施例4中ELISA试剂盒检测血液样本中CAPG和PTGIS蛋白表达量相对正常人AB血清变化。

3、结果

结果显示，待筛查的20例前脊柱侧弯患者的血液样本中有7例患者样本中CAPG和PTGIS蛋白表达量和正常人AB血清中表达量无显著差异；有13例患者血液样本中CAPG和PTGIS蛋白表达量是正常人AB血清中表达量的60％以下，其中有9例患者血液样本中CAPG和PTGIS蛋白的表达量是正常人AB血清表达量的40％以下。经临床进一步检测，20例待筛查的患者中确诊9例前脊柱侧弯，这9例前脊柱侧弯患者与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前脊柱侧弯的诊断试剂盒可以明确区分出前脊柱侧弯患者，并以此为临床提供诊断线索。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京赛尔维康生物医学科技有限公司

<120> CAPG和PTGIS基因在制备脊柱侧弯检测试剂盒中的应用

<130> p16zjcw19

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagggcctcg gagcaag 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactccacac caccttcctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgcttgat agcgtgctga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcttcagccg tttcccatcc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 7

<211> 348

<212> PRT

<213> CAPG抗原

<400> 7

Met Tyr Thr Ala Ile Pro Gln Ser Gly Ser Pro Phe Pro Gly Ser Val

1 5 10 15

Gln Asp Pro Gly Leu His Val Trp Arg Val Glu Lys Leu Lys Pro Val

20 25 30

Pro Val Ala Gln Glu Asn Gln Gly Val Phe Phe Ser Gly Asp Ser Tyr

35 40 45

Leu Val Leu His Asn Gly Pro Glu Glu Val Ser His Leu His Leu Trp

50 55 60

Ile Gly Gln Gln Ser Ser Arg Asp Glu Gln Gly Ala Cys Ala Val Leu

65 70 75 80

Ala Val His Leu Asn Thr Leu Leu Gly Glu Arg Pro Val Gln His Arg

85 90 95

Glu Val Gln Gly Asn Glu Ser Asp Leu Phe Met Ser Tyr Phe Pro Arg

100 105 110

Gly Leu Lys Tyr Gln Glu Gly Gly Val Glu Ser Ala Phe His Lys Thr

115 120 125

Ser Thr Gly Ala Pro Ala Ala Ile Lys Lys Leu Tyr Gln Val Lys Gly

130 135 140

Lys Lys Asn Ile Arg Ala Thr Glu Arg Ala Leu Asn Trp Asp Ser Phe

145 150 155 160

Asn Thr Gly Asp Cys Phe Ile Leu Asp Leu Gly Gln Asn Ile Phe Ala

165 170 175

Trp Cys Gly Gly Lys Ser Asn Ile Leu Glu Arg Asn Lys Ala Arg Asp

180 185 190

Leu Ala Leu Ala Ile Arg Asp Ser Glu Arg Gln Gly Lys Ala Gln Val

195 200 205

Glu Ile Val Thr Asp Gly Glu Glu Pro Ala Glu Met Ile Gln Val Leu

210 215 220

Gly Pro Lys Pro Ala Leu Lys Glu Gly Asn Pro Glu Glu Asp Leu Thr

225 230 235 240

Ala Asp Lys Ala Asn Ala Gln Ala Ala Ala Leu Tyr Lys Val Ser Asp

245 250 255

Ala Thr Gly Gln Met Asn Leu Thr Lys Val Ala Asp Ser Ser Pro Phe

260 265 270

Ala Leu Glu Leu Leu Ile Ser Asp Asp Cys Phe Val Leu Asp Asn Gly

275 280 285

Leu Cys Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Lys Gly Arg Lys Ala Asn Glu Lys

290 295 300

Glu Arg Gln Ala Ala Leu Gln Val Ala Glu Gly Phe Ile Ser Arg Met

305 310 315 320

Gln Tyr Ala Pro Asn Thr Gln Val Glu Ile Leu Pro Gln Gly His Glu

325 330 335

Ser Pro Ile Phe Lys Gln Phe Phe Lys Asp Trp Lys

340 345

<210> 8

<211> 500

<212> PRT

<213> PTGIS抗原

<400> 8

Met Ala Trp Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ser Arg Arg Arg Thr Arg Arg Pro Gly Glu Pro Pro Leu

20 25 30

Asp Leu Gly Ser Ile Pro Trp Leu Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Gly Lys

35 40 45

Asp Ala Ala Ser Phe Leu Thr Arg Met Lys Glu Lys His Gly Asp Ile

50 55 60

Phe Thr Ile Leu Val Gly Gly Arg Tyr Val Thr Val Leu Leu Asp Pro

65 70 75 80

His Ser Tyr Asp Ala Val Val Trp Glu Pro Arg Thr Arg Leu Asp Phe

85 90 95

His Ala Tyr Ala Ile Phe Leu Met Glu Arg Ile Phe Asp Val Gln Leu

100 105 110

Pro His Tyr Ser Pro Ser Asp Glu Lys Ala Arg Met Lys Leu Thr Leu

115 120 125

Leu His Arg Glu Leu Gln Ala Leu Thr Glu Ala Met Tyr Thr Asn Leu

130 135 140

His Ala Val Leu Leu Gly Asp Ala Thr Glu Ala Gly Ser Gly Trp His

145 150 155 160

Glu Met Gly Leu Leu Asp Phe Ser Tyr Ser Phe Leu Leu Arg Ala Gly

165 170 175

Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Ile Glu Ala Leu Pro Arg Thr His Glu Ser

180 185 190

Gln Ala Gln Asp Arg Val His Ser Ala Asp Val Phe His Thr Phe Arg

195 200 205

Gln Leu Asp Arg Leu Leu Pro Lys Leu Ala Arg Gly Ser Leu Ser Val

210 215 220

Gly Asp Lys Asp His Met Cys Ser Val Lys Ser Arg Leu Trp Lys Leu

225 230 235 240

Leu Ser Pro Ala Arg Leu Ala Arg Arg Ala His Arg Ser Lys Trp Leu

245 250 255

Glu Ser Tyr Leu Leu His Leu Glu Glu Met Gly Val Ser Glu Glu Met

260 265 270

Gln Ala Arg Ala Leu Val Leu Gln Leu Trp Ala Thr Gln Gly Asn Met

275 280 285

Gly Pro Ala Ala Phe Trp Leu Leu Leu Phe Leu Leu Lys Asn Pro Glu

290 295 300

Ala Leu Ala Ala Val Arg Gly Glu Leu Glu Ser Ile Leu Trp Gln Ala

305 310 315 320

Glu Gln Pro Val Ser Gln Thr Thr Thr Leu Pro Gln Lys Val Leu Asp

325 330 335

Ser Thr Pro Val Leu Asp Ser Val Leu Ser Glu Ser Leu Arg Leu Thr

340 345 350

Ala Ala Pro Phe Ile Thr Arg Glu Val Val Val Asp Leu Ala Met Pro

355 360 365

Met Ala Asp Gly Arg Glu Phe Asn Leu Arg Arg Gly Asp Arg Leu Leu

370 375 380

Leu Phe Pro Phe Leu Ser Pro Gln Arg Asp Pro Glu Ile Tyr Thr Asp

385 390 395 400

Pro Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Phe Leu Asn Pro Asp Gly Ser Glu

405 410 415

Lys Lys Asp Phe Tyr Lys Asp Gly Lys Arg Leu Lys Asn Tyr Asn Met

420 425 430

Pro Trp Gly Ala Gly His Asn His Cys Leu Gly Arg Ser Tyr Ala Val

435 440 445

Asn Ser Ile Lys Gln Phe Val Phe Leu Val Leu Val His Leu Asp Leu

450 455 460

Glu Leu Ile Asn Ala Asp Val Glu Ile Pro Glu Phe Asp Leu Ser Arg

465 470 475 480

Tyr Gly Phe Gly Leu Met Gln Pro Glu His Asp Val Pro Val Arg Tyr

485 490 495

Arg Ile Arg Pro

500

Claims

1.一种用于脊柱侧弯早期筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测CAPG基因的引物包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测PTGIS基因的引物包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

4.如权利要求1～3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用real-time PCR检测样本中CAPG基因和/或PTGIS基因的表达水平，所述CAPG基因和PTGIS基因在生物学样品中表达下调。

5.一种用于脊柱侧弯早期筛查的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗CAPG和PTGIS蛋白的特异性抗体。

6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述CAPG和PTGIS蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。

8.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括抗CAPG兔多克隆抗体包被的酶标板、抗PTGIS兔多克隆抗体包被的酶标板、蛋白标准品CAPG和PTGIS、TMB底物溶液、稀释液、洗涤缓冲液、终止溶液。

9.如权利要求1～8任一项所述试剂盒，其特征在于，所述脊柱侧弯为青少年特发性脊柱侧弯。