CN114875132A - 青光眼的诊断生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了青光眼的诊断生物标志物及其应用,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种;相比于正常对照,PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1在青光眼患者呈现显著性差异,且上述基因尤其是上述基因的组合用于青光眼的诊断具有较高的诊断效能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域,涉及青光眼的诊断生物标志物及其应用。
背景技术
青光眼是全世界不可逆性失明的主要原因(Sharma S, Bollinger K E,Kodeboyina S K, et al. Proteomic Alterations in Aqueous Humor From PatientsWith Primary Open Angle Glaucoma[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2018, 59(6):2635-2643.)。它是一种进行性视神经退行性病变,伴有视网膜神经节细胞(Retinalganglion cells, RGC)丢失、视神经萎缩和视野丧失(Kliuchnikova AA, Samokhina N I,Ilina I Yet al. Human aqueous humor proteome in cataract, glaucoma, andpseudoexfoliation syndrome[J]. Proteomics, 2016 16(13): 1938-46.)。基于虹膜角的开放性或闭合性,两种常见的青光眼类型分为原发性开角型青光眼(Primary openangle glaucoma, POAG)和原发性闭角型青光眼(Primary angle closure glaucoma,PACG )。超过50%的青光眼导致的失明是由PACG引起的,尤其是在亚洲人(Zhang J L, SongXY,Chen Y Y,et al. Novel inflammatory cytokines (IL-36, 37,38) in the aqueoushumor from patients with chronic primary angle closure glaucoma[J]. IntImmunopharmacol, 2019, 71:164-168.)。原发性急性闭角型青光眼(Primary acuteangle closure glaucoma, PAACG)是PACG的一种类型,是东亚地区致盲的重要原因。PAACG发生在前房角突然阻塞,眼压迅速升高到较高水平。原发性慢性闭角型青光眼(Primarychronic angle closure glaucoma, PCACG)是由周围性前粘连(Peripheral anteriorsynechia, PAS)引起的永久性闭角引起的眼压升高。PCACG的患病率随着年龄的增长而增加,并经常与白内障并存。除原发性青光眼外,新生血管性青光眼是一种继发性青光眼,伴有视力损害,最常见于糖尿病、视网膜主要血管阻塞、颈动脉阻塞性疾病。
青光眼是一种复杂的神经退行性眼病,具有多种遗传和非遗传危险因素。高眼压是青光眼的主要危险因素,治疗性降压可显著延缓疾病进展,但有关眼压如何导致RGC死亡和视神经损伤的分子机制仍不明确(Adav S S, Wei J, Qian J, et al. Aqueous humorprotein dysregulation in primary angle-closure glaucoma[J]. Int Ophthalmol,2018.)。此外,据报道,衰老、遗传倾向、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、血管调节障碍、脂质代谢与青光眼有关。然而,青光眼的确切病因仍不清楚,RGC丢失和视神经萎缩的分子机制仍不清楚。因此,确定导致这种疾病的发病机制和进展的因素是至关重要的。虽然现代眼科影像学如光学相干断层成像、超声活体显微镜等的发展为青光眼的早期诊断创造了条件,但是还存在一定的局限性。对青光眼的分子学研究有利于筛查潜在发病人群,对提高青光眼的认知,筛查及防治等工作有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供包含对于青光眼诊断特异性的生物标志物。
本发明目的之二在于,提供利用上述用于诊断青光眼生物标志物的用于诊断青光眼试剂盒。
本发明第一方面提供了检测样品中生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的试剂盒中的应用,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
进一步,与正常对照相比, PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平下调。
进一步,所述试剂包括:
与所述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸;或
与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。
进一步,所述样品选自组织或体液。
进一步,所述样品选自组织。
进一步,所述组织选自小梁网组织。
本发明第二方面提供了一种用于诊断个体的青光眼的试剂盒,所述试剂盒包括检测生物样品的生物标志物水平的试剂,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
进一步,所述试剂包括在mRNA水平或蛋白水平上确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂。
进一步,所述试剂盒括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行确定mRNA水平的试剂。
进一步,所述试剂盒包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
进一步,所述试剂盒还包括从样品中分离核酸或蛋白的试剂。
进一步,所述试剂盒还包含:
容器;和/或
数据载体。
进一步,所述数据载体包含关于如何使用试剂盒进行青光眼检测的说明。
本发明第三方面提供了生物标志物在构建预测青光眼的计算模型中的应用,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
本发明第四方面提供了一种用于确定指示对象是否患有青光眼的装置,所述装置包括:
数字处理器,所述数字处理器执行以下方法:
以生物标志物的表达水平作为输入变量,基于从所述对象的样本中的生物标志物的水平来确定指示所述对象是否具有青光眼的异常表达的生物标志物,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种;
其中,异常表达的生物标志物的确定基于相应生物标志物的参比水平;
其中,所述参比水平反映在健康对象的样品中发现的所述生物标志物的水平;
其中,与健康参比水平相比,生物标志物PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平下调。
本发明的有益效果:
本发明通过检测PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1的表达水平,可以实现青光眼的早期诊断,增加检测的敏感性,提高检测能力和效率,积极采取干预措施。
附图说明
图1显示基因的表达情况图,其中1A是PDGFRL的表达情况图;1B是CLEC2B的表达情况图;1C是EFHD1的表达情况图;1D是RTN1的表达情况图;
图2是基因的诊断效能图,其中,2A是PDGFRL的诊断效能图;2B是CLEC2B的诊断效能图;2C是EFHD1的诊断效能图;2D是RTN1的诊断效能图;2E是PDGFRL、CLEC2B、EFHD1联合RTN1的诊断效能图。
具体实施方式
以下将对本发明进一步详细说明,应理解,所述用语旨在描述目的,而非限制本发明。
术语“和/或”是指并且包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合,以及在备选方案(或)中解释时缺少组合。
本文所用,术语“受试者”是指使用诊断方法筛选并使用本文所述的治疗方法治疗的任何生物体。此类生物体优选地包含但不限于哺乳动物(例如,鼠类、猿类、马类、牛类、猪类、犬类、猫类等),并且最优选地包含人类。
本文所用的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理学分析、组织学分析等识别疾病。具体地,该术语是指青光眼的诊断或检测。
如本文所用,术语“水平”是指本文所述的基因的量(例如以克、摩尔或诸如离子或荧光计数之类的计数所测量的)或浓度(例如绝对浓度或相对浓度)。
如本文所用,术语“水平”还包括缩放的量或值、归一化的量或值、或者缩放且归一化的量或值。优选地,本文确定的水平是表达水平。
参比水平可以是使得能够确定个体是否患有青光眼的任何水平。它可以从(对照)受试者(即与待测试/待诊断个体不同的受试者)或从同一个体获得。在后一种情况下,个体可以针对青光眼进行再测试(例如以纵向监测的形式)。可以确定该个体现在青光眼的影响或仍然未受青光眼的影响。
如本文所用,术语核酸分子的“差异表达”是指暂时的和/或局部的核酸分子表达模式(例如在生物样品、体液样品、细胞内和/或之间,或在血液中)中的定性和/或定量差异。因此,差异表达的核酸分子可定性地改变其表达,包括例如相对于来自健康受试者的样品,在来自疾病受试者的样品中的激活或失活。核酸分子表达中的差异也可为定量的,例如因为表达被调控,即上调,导致核酸分子的量增加;或者下调,导致核酸分子的量减少。核酸分子表达差异的程度仅需要大到足以通过标准表达表征技术来量化,例如,通过定量杂交(例如与微阵列、与珠)、扩增(PCR、RT-PCR、qRT-PCR、高通量RT-PCR)、定量ELISA、下一代测序(例如ABI SOLID、Illumina Genome Analyzer、Roche 454GS FL)、流式细胞术(例如LUMINEX)等。
如本文所用,术语“敏感性”是指相对于患者总数量(100%)的真阳性患者数量(%)。个体可以是具有青光眼的受试者。敏感性通过以下公式计算:敏感性性=TP/(TP+FN)(TP=真阳性;FN=假阴性)。
如本文所用,术语“特异性”涉及相对于健康受试者总数量(100%)的真阴性个体数量(%)。特异性通过以下公式计算:特异性=TN/(TN+FP)(TN=真阴性;FP=假阳性)。
如本文所用,术语“准确性”指用于样品类型的分类或鉴别的正确性的统计量度。准确性是真实结果(真阳性和真阴性二者)的比例。
如本文所用,术语“AUC”涉及曲线下面积的缩写。特别是,它是指受试者工作特征(ROC)曲线下的面积。如本文所用,术语“受试者工作特征(ROC)曲线”是指针对诊断测试的不同可能的切点的真阳性率相对于假阳性率的绘图。它显示了灵敏性和特异性之间的权衡,取决于所选的切点(灵敏性的任何提高都会伴随特异性的降低)。ROC曲线下的面积是诊断测试的准确性的度量(面积越大越好,最优为1,随机测试的ROC曲线位于对角线,面积为0.5)。
如本文所用,术语“(对照)受试者”是指已知未受青光眼,影响的受试者(阴性对照),即相对于青光眼患者而言是健康的。如本文所用,术语“(对照)受试者”还指已知患青光眼的患者。
术语“生物样品”是指来自个体或(对照)受试者的包含本发明生物标志物的任何生物样品。生物样品可以是体液样品或组织样品。例如,本发明涵盖的生物样品是组织样品、血液(例如全血或血液组分,例如血细胞/细胞组分、血清或血浆)样品、尿液样品、房水或来自其它外周来源的样品。所述生物样品可以混合或合并。所述生物样品可以通过从个体或(对照)受试者中取出生物样品来提供,但也可以通过使用先前分离的样品来提供。例如,可以通过常规血液采集技术从个体或(对照)受试者获取血液样品,或者可以通过活组织检查(biopsy)从个体或(对照)受试者获取组织样品。如果生物样品是从至少一个(对照)受试者获得的,例如从至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500或1,000个(对照)受试者获得,则将其指定为“参比生物样品”。优选地,参比生物样品来自与待测试个体的生物样品相同的来源,例如,两者都是血液样品、尿液样品或组织样品。进一步优选两者来自相同的物种,例如来自人。(替代地或额外地)还优选(对照)受试者的参比生物样品和待测试个体的生物样品的度量是相同的,例如,两者具有相同的体积。特别优选参比生物样品和生物样品来自相同性别和相似年龄的(对照)受试者/个体。
术语 “引物” 为识别靶基因序列的片段,包括正向及反向的引物对,优选地,为提供具有特异性及灵敏性的分析结果的引物对。引物的核酸序列为与存在于试样中的非靶序列不一致的序列,当其为仅扩增包含互补引物结合位点的靶基因序列且不诱发非特异性扩增的引物时,可赋予高特异性。
术语 “探针” 是指可与试样中的所要检测的靶物质特异性结合的物质,是指可通过上述结合特异性确认试样中的靶物质的存在的物质。探针的种类为本领域通常使用的物质,并无限制,优选地,可以为肽核酸(PNA,peptide nucleic acid)、锁核酸(LNA,lockednucleic acid)、肽、多肽、蛋白质、核糖核酸或脱氧核糖核酸,最优选为肽核酸。更具体地,上述探针为生物物质,包括源自生物材料或与其相似或者在体外制造的,例如,可包括酶、蛋白质、抗体、微生物、动植物细胞及器官、神经细胞、脱氧核糖核酸及核糖核酸,脱氧核糖核酸包括互补脱氧核糖核酸(cDNA)、基因组脱氧核糖核酸、寡核苷酸,核糖核酸包括基因组核糖核酸、信使核糖核酸、寡核苷酸,作为蛋白质的例包括抗体、抗原、酶、肽等。
在本发明中使用的术语“反义” 是指反义寡聚体通过碱基互补配对的形成与核糖核酸中的靶序列杂交,通常在靶序列中允许形成信使核糖核酸与核糖核酸:寡聚异源双链,具有核苷酸碱基的序列及亚基间骨架的寡聚体。寡聚体可具有对于靶序列的精确的序列互补性或近似互补性。
术语 “抗体” 是指与抗原特异性结合来引起抗原-抗体反应的物质。出于本发明的目的,抗体是指与本发明的用于诊断青光眼生物标志物特异性结合的抗体。本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体及重组抗体。上述抗体可利用本领域公知的技术来容易制备。例如,多克隆抗体可通过包括向动物注射上述青光眼生物标志物蛋白抗原并从动物采血来获取包含抗体的血清的过程的本领域公知的方法生产。这种多克隆抗体可通过山羊、兔、羊、猴、马、猪、牛、狗等的任意动物制备。并且,单克隆抗体可利用本领域公知的杂交瘤法或噬菌体抗体文库技术来制备。通过上述方法制备的抗体可利用凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析、亲和层析等的方法来分离、纯化。并且,本发明的抗体不仅包括具有2个全长轻链及2个全长重链的完整形态,还包括抗体分子的功能性片段。抗体分子的功能性片段是指至少具有抗原结合功能的片段,包括Fab、F(ab ')、F(ab ')2及Fv等。并且,本发明的抗体可通过商业途径获取。
在本发明中使用的术语 “肽核酸” 是指与脱氧核糖核酸或核糖核酸相似的人工合成聚合物。脱氧核糖核酸具有磷酸核糖骨架,然而,肽核酸具有通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架,由此,对于脱氧核糖核酸或核糖核算的结合力和稳定性大大增加,由此用于分子生物学、诊断分析及反义治疗法。
在本发明中,“适配体” 为寡核酸或肽分子。
为了通过改进在整个疾病谱中对青光眼的进展的评估来克服目前的障碍以更好地进行临床试验设计,对青光眼新的诊断和进展生物标志物存在着迫切的未满足的需求。本发明人鉴定出了作为用于青光眼的生物标志物。特别是,本发明人鉴定出了单一基因和基因组合,能够以高诊断能力来确定青光眼。
因此,在第一方面本发明提供了检测样品中生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的试剂盒中的应用,所述生物标志物选自PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1。
其中,生物标志物例如PDGFRL(platelet derived growth factor receptorlike,gene ID:5157)、CLEC2B(C-type lectin domain family 2 member B,gene ID:9976)、EFHD1(EF-hand domain family member D1,gene ID:80303)、RTN1(reticulon 1,gene ID:6252);包括基因及其编码的蛋白及其同源物,突变,和同等型。该术语涵盖全长,未加工的生物标志物,以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。
在本发明的实施方案中,PDGFRL包含两个转录本,NM_001372073.1、NM_006207.2。在本发明的一个优选的实施方案中,PDGFRL的序列如转录本NM_001372073.1所示。
在本发明的实施方案中,CLEC2B的序列如转录本NM_005127.3所示。
在本发明的实施方案中,EFHD1包含三个转录本,NM_001243252.2、NM_001308395.2、NM_025202.4。在本发明的一个优选的实施方案中,EFHD1的序列如转录本NM_001243252.2所示。
在本发明的实施方案中,RTN1包含三个转录本,NM_001363702.1、NM_021136.3、NM_206852.3,作为一种优选地实施方案,RTN1的序列如转录本NM_001363702.1所示。
在一个实施方式中,将所述至少一个基因与所述至少一个基因的参比水平进行比较。上述比较使得能够确定个体是否具有/患有青光眼。
在一个优选的实施方式中,参比水平是通过测量分离自至少一个未青光眼(健康)的(对照)受试者(例如分离自至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、150、200、250、300、400、500或1000个未患有青光眼的(对照)受试者)的至少一种参比生物样品(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、150、200、250、300、400、500或1000种参比生物样品)而确定的水平。所述至少一个未患有青光眼的受试者可以被认为相对于青光眼患者而言是健康的。
在优选的实施方式中,与正常对照(参比水平)相比, PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平下调。
在优选的实施方式中,通过检测PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和RTN1中的至少两种基因的表达水平来判断受试者是否患有青光眼。
在优选的实施方式中,通过检测PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和RTN1中的至少三种基因的表达水平来判断受试者是否患有青光眼。
在优选的实施方式中,通过同时检测PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和RTN1的表达水平来判断受试者是否患有青光眼。
在本发明中,所述样本包括但不限于组织样品、血液(例如全血或血液组分,例如血细胞/细胞组分、血清或血浆)样品、尿液样品、房水或来自其它外周来源的样品
在本发明的实施方案中,所述样本选自组织样品或房水。
在本发明的具体实施方案中,所述样本选自组织,优选的选自小梁网组织。
在本发明中,为了提高诊断的准确率,可通过使用统计学方法或算法来分析,可利用选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类分析方法、逻辑回归分析方法、方差分析、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分分析方法、马尔可夫毯分析方法、回归特征消除或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法及它们的组合组成的组中的分析方法。
在本发明具体实施方案中,作为上述统计学方法,优选使用逻辑回归分析方法,但并不局限于此。
在本发明的具体再一实例中,当结合多种生物标志物时,为了确认诊断能力提高效果,利用逻辑回归模型输入生物标志物表达量转换信息来推测分类为青光眼的概率。在本发明的具体实施方式中确认了随着生物标志物的数量的增加,青光眼的诊断能力提高。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的基因特异性结合的引物对。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的基因特异性结合的探针。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的基因特异性结合的反义核苷酸。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的抗体。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的相互作用蛋白。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的配体。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的纳米粒子。
在可选择的实施方式中,检测生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂是与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的适配体。
本发明提供了一种用于诊断个体的青光眼的试剂盒,所述试剂盒包括用于检测生物样品中的生物标志物水平的试剂,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
在一些实施方式中,所述试剂包括在mRNA水平确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂。在mRNA水平确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平是指为了诊断青光眼,在从青光眼怀疑患者分离的生物学试样中确认用于诊断青光眼的基因的mRNA存在与否和表达程度的过程,用于测量mRNA的量。
在mRNA水平确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂包括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行确定mRNA水平的试剂。
在一些实施方式中,所述试剂包括在蛋白水平上确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂。在蛋白水平确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平是指为了诊断青光眼,在从青光眼怀疑患者分离的生物学试样中确认用于诊断青光眼的基因的蛋白存在与否和表达程度的过程,用于测量蛋白的量。
在蛋白水平上确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
在优选的实施方式中,所述试剂盒还包括从样品中分离核酸或蛋白的试剂。
在更为优选的实施方式中,所述试剂盒还包含:
容器;和/或
数据载体。
数据载体可以是非电子数据载体,例如图形数据载体,如信息手册、信息表、条形码或访问代码;或电子数据载体,例如软盘、光盘(CD)、数字多用盘(DVD)、微芯片或其它基于半导体的电子数据载体。访问代码可以允许访问数据库(例如Internet数据库、集中式或分散式数据库)。访问代码还可以允许访问使计算机执行计算机用户任务的应用软件或作为设计用于在智能手机和其它移动设备上运行的软件的移动应用程序。
所述数据载体还可包含至少一种参比,例如本文确定的至少一种生物标志物的水平的参比水平。在数据载体包含允许访问数据库的访问代码的情况下,所述至少一种参比(例如所述参比水平)可以存放在该数据库中。
所述数据载体包含关于如何使用试剂盒进行青光眼检测的说明。
所述试剂盒还可以包含从商业和用户的观点来看所期望的材料,包括用于确定上述水平的缓冲液、试剂和/或稀释剂。
在一方面,本发明提供了一种用于确定指示对象是否患有青光眼的装置,所述装置包括:
数字处理器,所述数字处理器执行以下方法:
基于从所述对象的样本中的生物标志物的水平来确定指示所述对象是否具有青光眼的异常表达的生物标志物,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种;
其中,异常表达的生物标志物的确定还基于相应生物标志物的参比水平;
其中,所述参比水平反映在健康对象的样品中发现的所述生物标志物的水平;
其中,与健康参比水平相比,生物标志物PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平下调。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例检测基因在青光眼中表达水平
1、样品收集
研究选取35例青光眼患者和28例正常对照的小梁网组织生物样品。
所有受试者均接受相关的眼科检查,包括眼压、视野、UBM等。排除合并合并有其他眼病如外伤、肿瘤、葡萄膜炎、虹膜新生血管、晶体脱位、代谢性疾病等。
2、QPCR检测生物样品中PDGFRL、CLEC2B、EFHD1、RTN1的表达水平。具体检测步骤如下:
1)提取样本总RNA:
①将1 mL TRIzol在超净台里加入至玻璃匀浆瓶中(提前将匀浆瓶用烘箱180度烘4个小时),将匀浆瓶按到仪器上,称取50-100 mg的组织放入玻璃匀浆瓶内,将转速调至1500转左右,开始在冰水浴中进行匀浆,每研磨30 s,停止30 s,反复3-4 次即可。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
② 将加入TRIzol的样品在室温(15-30℃)放置10 min,使核酸蛋白复合物完全分离。
③ 1 mL TRIzol加入200 μl氯仿,剧烈振荡2 min,每隔1min再晃动两下,5—6 次后,再静止7 min。
④ 4℃,12000 rpm,离心15 min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中。
⑤把上层水相转移到新的EP管中(约400 μl,尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500 μl异丙醇,室温放置10 min。
⑥ 制备75%乙醇,置于冰盒中预冷。
⑦ 4℃,12000 rpm,离心15 min,离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。
⑧ 加入1 mL 75%冷乙醇,震荡洗涤沉淀。4℃, 7500 rpm,离心5 min,小心弃掉上清。
⑨ 将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分,并用10 μl枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA),将EP管室温放置5 min(时间太久,过于干燥会使RNA活性降低),RNA变透明;
⑩ 加入40 μl无RNase的水(DEPC水),用nanodrop检测OD值与浓度,在管上做好标记。
2)逆转录合成mRNA cDNA
采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR116)进行mRNA反转录,首先去除基因组DNA反应,在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0 μl,TotalRNA 2 μg,加Rnase FreeddH2O 使总体积至10 μl,水浴锅中42℃加热3 min,再将10×King RT Buffer 2.0 μl,FastKing RT Enzyme Mix 1.0 μl,FQ-RT Primer Mix 2.0 μl,RNase Free ddH2O 5.0μl,混合后加入上述试管中一起混合共20μl,水浴锅中42℃加热15 min,95℃加热3 min,合成的cDNA需要长期保存时,请于-20℃或更低温度保存。
3)RealTimePCR
①仪器及分析方法
用ABI 7300型荧光定量PCR仪,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
②实验方法:
a.引物设计:根据PDGFRL、CLEC2B、EFHD1、RTN1基因的序列设计合成引物,使用GAPDH作为内参基因。引物序列如下:
针对PDGFRL的引物:
正向引物:5′- GTCACGCTCCACAGGGAAT-3′(SEQ ID NO:1)
反向引物:5′- ACTGGGAACCGCCACATAG-3′(SEQ ID NO:2);
针对CLEC2B的引物:
正向引物:5′- GGGGTGGGGCTTTAAGAGT-3′(SEQ ID NO:3)
反向引物:5′- CAATGCTGTGTGCCCTGAG-3′(SEQ ID NO:4);
针对EFHD1的引物:
正向引物:5′-GCTGGCAAAGCTTTCTGAGAT-3′(SEQ ID NO:5)
反向引物:5′-AGTTGGCCTTGAGTTTCTGGA-3′(SEQ ID NO:6);
针对RTN1的引物:
正向引物:5′- GTGCAGAAAACCGACGAAGG-3′(SEQ ID NO:7)
反向引物:5′- GCAGGCAGTCCGTGTACTT-3′(SEQ ID NO:8);
b.反应体系:
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号:FP205),进行扩增,实验操作按产品说明书进行。RealTime反应体系为:
c.扩增程序:
95℃ 15min,(95℃ 10s,55℃ 30s,72℃ 32 s)×40个循环,95℃ 15s,60℃ 60s,95℃ 15s)。
3、诊断效能分析
使用R中的pROC绘制ROC曲线,分析每个基因及其组合的诊断效能,当对多个基因联合的诊断效能进行分析时,首先对每个基因的表达水平进行逻辑回归分析,然后利用建立好的回归模型计算预测概率。
4、结果
基因的表达情况如图1所示,相比正常对照,PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平显著上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平显著下调。
对QPCR的结果进行ROC分析,结果如下表和图2所示,PDGFRL、CLEC2B、EFHD1、RTN1及其组合应用于青光眼的诊断具有较高的准确性,尤其是四者的组合,具有较高的准确性、敏感性以及特异性。
表1 基因的诊断效能
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式,但是,本申请并不限于上述实施方式中的具体细节,在本申请的技术构思范围内,可以对本申请的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本申请的思想,其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第三医学中心
<120> 青光眼的诊断生物标志物及其应用
<141> 2022-04-24
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcacgctcc acagggaat 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgggaacc gccacatag 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggtggggc tttaagagt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caatgctgtg tgccctgag 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctggcaaag ctttctgaga t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agttggcctt gagtttctgg a 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgcagaaaa ccgacgaagg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcaggcagtc cgtgtactt 19
Claims (10)
1.检测样品中生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的试剂盒中的应用,其特征在于,生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括:
与所述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸;或
与所述生物标志物的蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述样品选自组织。
4.一种用于诊断个体的青光眼的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测生物样品的生物标志物水平的试剂,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂包括在mRNA水平或蛋白水平上确定生物标志物PDGFRL、CLEC2B、EFHD1和/或RTN1表达水平的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒括通过聚合酶链反应、实时荧光定量逆转录多聚酶链反应、逆转录聚合酶链反应、竞争性聚合酶链反应、核酸酶保护分析、原位杂交法、核酸微阵列、RNA印迹或DNA芯片的方法进行确定mRNA水平的试剂。
7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括通过免疫印迹、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、放射免疫扩散法、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选、质量分析或蛋白质微阵列的方法进行检测蛋白水平的试剂。
8.根据权利要求4-7任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括从样品中分离核酸或蛋白的试剂。
9.生物标志物在构建预测青光眼的计算模型中的应用,其特征在于,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种。
10.一种用于确定指示对象是否患有青光眼的装置,其特征在于,所述装置包括:
数字处理器,所述数字处理器执行以下方法:
以生物标志物的表达水平作为输入变量,基于从所述对象的样本中的生物标志物的水平来确定指示所述对象是否具有青光眼的异常表达的生物标志物,所述生物标志物包括PDGFRL、CLEC2B、EFHD1或RTN1的一种或多种;
其中,异常表达的生物标志物的确定基于相应生物标志物的参考水平;
其中,所述参考水平反映在健康对象的样品中发现的所述生物标志物的水平;
其中,与健康参考水平相比,生物标志物PDGFRL、CLEC2B在青光眼患者中的表达水平上调,EFHD1、RTN1在青光眼患者中的表达水平下调。
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